T.C. ERCİYES ÜNİVERSİTESİ ECZACILIK FAKÜLTESİ

1 T.C. ERCİYES ÜNİVERSİTESİ ECZACILIK FAKÜLTESİ MONOKLONAL ANTİKORLARLA KANSER TEDAVİSİ Hazırlayan Özge ATEŞLİ Danışman Yrd. Doç. Dr. Dilşad ONBAŞILI Farmasötik Biyoteknoloji Anabilim Dalı Bitirme Tezi Mayıs 2013 KAYSERİ

i BİLİMSEL ETİĞE UYGUNLUK Bu çalışmadaki tüm bilgilerin, akademik ve etik kurallara uygun bir şekilde elde edildiğini beyan ederim. Aynı zamanda bu kurallar ve davranışların gerektirdiği gibi, bu çalışmanın özünde olmayan tüm materyal ve sonuçları tam olarak aktardığımı ve referans gösterdiğimi belirtirim. Özge ATEŞLİ

ii YÖNERGEYE UYGUNLUK Monoklonal antikorlarla kanser tedavisi adlı bitirme ödevi Erciyes Üniversitesi Lisansüstü Tez Önerisi ve Tez Yazma Yönergesi ne uygun olarak hazırlanmıştır. Hazırlayan Özge ATEŞLİ Danışman Yrd. Doç. Dr. Dilşad ONBAŞILI Farmasötik Biyoteknoloji Anabilim Dalı Başkanı Yrd. Doç. Dr. Dilşad ONBAŞILI

iii Monoklonal antikorlarla kanser tedavisi adlı Bitirme Ödevi Erciyes Üniversitesi Lisansüstü Tez Önerisi ve Tez Yazma Yönergesi ne uygun olarak hazırlanmış ve Farmasötik Biyoteknoloji Anabilim Dalında Bitirme Ödevi olarak kabul edilmiştir. Tezi Hazırlayan Özge ATEŞLİ Danışman Yrd. Doç. Dr. Dilşad ONBAŞILI Farmasötik Biyoteknoloji Anabilim Dalı Başkanı Yrd. Doç. Dr. Dilşad ONBAŞILI ONAY : Bu bitirme ödevinin kabulü Eczacılık Fakültesi Dekanlığı nın... tarih ve.. sayılı kararı ile onaylanmıştır. / / Prof. Dr. Müberra KOŞAR Dekan

iv TEŞEKKÜR Bitirme ödevimi hazırlarken çalışmalarımı yönlendirmesinde, araştırmalarımın her aşamasında bilgi, öneri ve yardımlarını esirgemeyerek akademik ortamda olduğu kadar insani ilişkilerinde de sonsuz desteğiyle gelişmeme katkıda bulunan danışman hocam Sayın Yrd. Doç. Dr. Dilşad ONBAŞILI ya ve Sayın Arş. Gör. Berrak ALTINSOY a, çalışmam süresince emek ve desteği için arkadaşım Erhan TURAN a, yaşamımın her döneminde bana duydukları güven için aileme en derin duygularla teşekkür ederim. Özge ATEŞLİ Kayseri, Mayıs 2013

v MONOKLONAL ANTİKORLARLA KANSER TEDAVİSİ Özge ATEŞLİ Erciyes Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi Farmasötik Biyoteknoloji Anabilim Dalı Bitirme Ödevi, Mayıs 2013 Danışman: Yrd. Doç. Dr. Dilşad ONBAŞILI ÖZET Vücut, son derece farklı hücrelerden ve moleküllerden oluşan bir savunma sistemi tarafından korunmaktadır. Bu sistemde yer alan elemanlar öncelikle organizmanın kalıtsal yapısına yabancı, antijen olarak isimlendirilen her türlü hücre dışı madde ve mikroorganizmanın vücuda girmesini engellemektedir. Antikorlar ise antijenik uyarım sonucu B hücrelerinin değişimi ile oluşan plazma hücreleri tarafından sentezlenen antijenleri bularak onların yok edilmesini sağlayan immünoglobulinler olarak adlandırılmaktadırlar. Hibridoma teknolojisinin gelişmesiyle monoklonal antikorlar gerek tanı gerekse tedavi konusunda özellikle de kanserde yeri doldurulamaz hale gelmiştir. Monoklonal antikorlar tümör hücrelerindeki spesifik antijenlere karşı üretilmektedirler ve bu özellikleriyle hedeflenmiş silahlara benzetilmektedirler. Monoklonal antikorlar eczacılıkta hastalıkların teşhisi, tedavisi ve profilaksisi için kullanılmaktadır. Son 20 yıl içinde onlarca monoklonal antikor, ya tümör-spesifik immün cevapları geliştiren veya aktive eden ya tümör hücre içi sinyal iletim aşamalarını bozan ya özellikle malign hücrelere toksin dağıtan ya da tümör-stroma etkileşimini bloke eden bu dolaylı antineoplastik etki kapasiteleri için geliştirilmiş ve karakterize edilmiştir. Bu derlemede amaç, monoklonal antikorların kanser tedavisindeki kullanımının araştırılmasıdır. Anahtar Kelimeler: Monoklonal antikor, kanser tedavisi, alemtuzumab, rituksimab, trastuzumab

vi MONOCLONAL ANTIBODIES IN CANCER THERAPY Özge ATEŞLİ Erciyes University, Faculty of Pharmacy Department of Pharmaceutical Biotechnology Graduation Project, May 2013 Advisor: Yrd. Doç. Dr. Dilşad ONBAŞILI ABSTRACT Body is protected by a defense system which is formed ultra different cells and molecules. Elements which are hold a place in this system primarily prevent from entering all kinds of extracellular subtance and microorganism known as antigen which is foreign to the structure of hereditary organism into the body. Antibodies which find antigens and provide destruction of them are called as immunoglobulins which is synthesized by plasma cells which are formed with change of B cells as a result of antigenic stimulation. With the development of hybridoma technology, monoclonal antibodies have become an irreplaceable especially in the diagnosis and treatment of cancer. Monoclonal antibodies are produced against tumor-specific antigens and are liken to targeted weapons. Monoclonal antibodies are used for diagnosis, treatment and prophylaxis of diseases at pharmacy. During the past 20 years, monoclonal antibodies have been developed and characterized for their capacity to mediate antineoplastic effects, either as they activate/enhance tumor-specific immune responses, either as they interrupt cancer cell-intrinsic signal transduction cascades, either as they specifically delivery toxins to malignant cells or as they block the tumor-stroma interaction. In this review the purpose is researching usage of monoclonal antibodies in cancer therapy. Key Words: Monoclonal antibody, cancer therapy, alemtuzumab, rituximab, trastuzumab

vii İÇİNDEKİLER BİLİMSEL ETİĞE UYGUNLUK... i YÖNERGEYE UYGUNLUK... ii KABUL ONAY... iii TEŞEKKÜR... iv ÖZET... v ABSTRACT... vi İÇİNDEKİLER... vii TABLOLAR LİSTESİ... ix ŞEKİLLER LİSTESİ... x KISALTMALAR... xi 1. GİRİŞ VE AMAÇ... 1 2. GENEL BİLGİLER... 4 2.1.LENFOİD SİSTEM ve İMMÜN CEVAP... 4 2.1.1.Lenfositler... 5 2.1.1.1.B Lenfositler... 5 2.1.1.2.T Lenfositler... 5 2.1.1.2.1.Sitotoksik T lenfositleri... 6 2.1.1.2.2.Yardımcı T lenfositler... 6 2.1.1.3.Doğal Öldürücü Hücreler (Naturak killer=nk)... 7 2.1.2.Mononükleer fagositik sistem... 7 2.1.3.Polimorfonüklear granülositler... 9 2.1.3.1.Nötrofiller... 9 2.1.3.2.Bazofiller ve Mast Hücreleri... 9 2.1.3.3.Eozinofiller... 9 2.1.4.Major Histokompatibilite Kompleksi... 10 2.1.4.1.Sınıf-I Molekülleri... 10

viii 2.1.4.2.Sınıf-II Molekülleri... 10 2.1.4.3.Sınıf-III Molekülleri... 11 2.1.5.Kompleman Sistemi (Tamamlayıcı Sistem)... 11 2.1.6.Sitokinler... 13 2.2. TÜMÖR İMMÜNOLOJİSİ... 17 2.2.1. Tümör Antijenleri... 18 2.2.2. Efektör Mekanizmalar... 18 2.2.3. Kanserin İmmün Sistemden Kaçış Mekanizmaları... 20 2.3.ANTİKORLAR... 20 2.3.1. Monoklonal Antikor... 22 2.3.2. Monoklonal Antikorlar ile Kanser Tedavisi... 28 3. TARTIŞMA VE SONUÇ... 36 KAYNAKLAR... 41 ÖZGEÇMİŞ... 46

ix TABLOLAR LİSTESİ Tablo 2.1. mab veya mab ile ilişkili terapötikler için uluslararası son ekler... 27 Tablo 2.2. Günümüzde kanser tedavisi için onaylı monoklonal antikorlar... 33 Tablo 2.3. Faz III-IV çalışmalarda kanser tedavisi için değerlendirme aşamasında olan monoklonal antikorlar... 34

x ŞEKİLLER LİSTESİ Şekil 2.1. Bağışık yanıtta rol alan hücrelerin etkileşimi... 7 Şekil 2.2. Klasik ve alternatif kompleman yollarının aktivasyonları ve membran atak kompleksi (C5b-9) oluşumunun basamakları... 12 Şekil 2.3. GM-CSF ve T hücre yanıtları... 16 Şekil 2.4. İmmün sistemin doğuştan ve kazanılmış bölümlerinin ana bileşenlerinin ve hedeflerinin şematik özeti... 17 Şekil 2.5. Antikorun yapısı... 21 Şekil 2.6. Monoklonal antikorların üretimi.... 26 Şekil 2.7. Panitumumab ın etki mekanizması... 28 Şekil 2.8. Tümör hücreleri, stroma hücreleri, perisitler ve endotel hücreleri arasındaki intraselüler sinyalizasyon... 29 Şekil 2.9. CD20 monoklonal antikorlarının etki mekanizmaları... 30 Şekil 2.10. Katumaksomab ın öne sürülen etki mekanizması... 31

xi KISALTMALAR ADCC ADCP AIDS CDC CMV CTL DC-CK DNA EGF EGFR EpCAM Fab Fc FcγR FcRn GM-CSF HAT HER HGPRT HLA IFN : Antikor bağımlı hücresel sitotoksisite : Antikor bağımlı hücresel fagositoz : Edinilmiş yetersiz bağışıklık sistemi sendromu : Kompleman bağımlı sitotoksisite : Sitomegalovirüs : Sitotoksik T lenfositleri : Dendritik hücre sitokini : Deoksiribonükleik asit : Epitelyal büyüme faktörü : Epitelyal büyüme faktörü reseptörü : Epitelyal hücre adhezyon molekülü : Antikorun antijen bağlama parçası : Antikorun sabit parçası : Fc γ reseptörü : Fc neonatal reseptör : Granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör : Hipoksantin, Aminopterin, Timidin : İnsan büyüme faktörü reseptörü : Hipoksantin-guanin fosforiboziltransferaz : İnsan lökosit antijenleri : İnterferon

xii Ig IGFR IL ITAM ITIM LAK LGL mab MAC M-CSF MHC NK NO NSCLC O 2 PDGF PEG PET/CT PMNL RANKL RNA RIT-Z : İmmünoglobulin : İnsülin benzeri büyüme faktörü : İnterlökin : İmmünoreseptör tirozin bazlı aktivasyon motifleri : İmmünoreseptör tirozin bazlı inhibitör motifleri : Lenfokinle aktive edilmiş öldürücü hücreler : İri granüllü lenfositler : Monoklonal antikor : Membran atak kompleksi : Makrofaj koloni uyarıcı faktör : Major histokompatibilite kompleksi : Doğal öldürücü hücreler : Nitrik oksit : Küçük hücreli olmayan akciğer kanseri : Oksijen : Platelet kaynaklı büyüme faktörü : Polietilen glikol : Pozitron emisyon tomografisi/bilgisayarlı tomografi : Polimorfonüklear lökosit : Reseptör aktifleştirici nükleus kappa ligandı : Ribonükleik asit : Zevalin ile radyoimmünoterapi

xiii SCLC TCGF TCR TGF TNF VEGF : Küçük hücreli akciğer kanseri : T hücresi büyüme faktörü : T hücre reseptörü : Değişiklik yapan büyüme faktörü : Tümör nekrozis faktör : Vasküler endotelyal büyüme faktörü

1 1. GİRİŞ VE AMAÇ Doğadaki bütün canlılar kendilerinden olmayan doku, hücre ve moleküllere karşı savunma sistemlerine sahiptirler. Örnek olarak bakteriler fajlara (bakteri virüslerine) karşı kendilerini bu saldırganların DNA ve RNA larını parçalayan enzimler üreterek korumaktadırlar. Yüksek canlılarda ise çok daha karmaşık bir bağışıklık sistemi bulunmaktadır. Omurgalılarda bağışıklık sistemi çok sayıda farklı hücre ve molekül içermektedir (1). Bağışıklık eski çağlardan bu yana insanların ilgi noktası olmuş ve bazı bağışıklama yöntemleri geliştirilmiştir. Örneğin Türkler, çiçek hastalığı geçirenlerin yaralarındaki kabukları toz haline getirerek burunlarından çekip ya da kollarını ateşe tutulmuş bir bıçakla çizerek oluşturdukları yaraya bu kabukları bulaştırdıkları bilinmektedir. Erlich ve Elie Metchnikoff un kendilerine 1905 Nobel Ödülü nü getiren çalışmalarının bağışıklık sisteminin anlaşılmasında öncü niteliğe sahiptirler. Günümüzde bağışıklık sisteminin geniş ölçüde aydınlatıldığı söylenebilir ve bu sistemi oluşturan unsurlardan hastalıkların tanısında, tedavisinde geniş ölçüde yararlanılmaktadır (1). Bu sistemde yer alan elemanlar öncelikle organizmanın kalıtsal yapısına yabancı, antijen olarak isimlendirilen her türlü hücre dışı madde ve mikroorganizmanın vücuda girmesini engellemektedir. Antijenler, organizmaya girdiğinde kendisine karşı bir bağışık yanıt oluşmasına yol açan ve bu yanıt sonucunda oluşan ürün ile özgül olarak birleşebilen maddeler olarak tanımlanmaktadır (1,2). Antijenler, deri, solunum ve sindirim sistemi gibi engelleri aşarak, organizmaya dahil olduklarında, savunma sistemi hemen harekete geçer. Kemik iliği, timus, lenf bezleri ve dalak gibi özelleşmiş merkezlerde yer alan fagositler, makrofajlar, lenfositler (B ve T hücreleri) gibi savunma hücreleri ve molekülleri devreye girerler. İlk aşamada, öncü hücreler olan fagositler ve makrofajlar antijenleri yok etmeye çalışırlar; etkili olamadıkları durumda B hücresi ve T hücresi olarak adlandırılan lenfositler devreye girerler. Antijen varlığını haber alan T

2 hücreleri, savunma sisteminin yönetimini ellerine alarak, diğer hücreleri uyarırlar. Sitotoksik T hücreleri antijenleri yok etmek için uğraş verirken, savunmadan sorumlu B hücreleri de bağışıklığın akıllı molekülleri olarak adlandırılan antikorları sentezlemeye başlarlar. Antikorlar, antijenik uyarım sonucu B hücrelerin değişimi ile oluşan plazma hücreleri tarafından sentezlenen antijenleri bularak onların yok edilmesini sağlayan immünoglobulinler olarak adlandırılmaktadırlar. Bu moleküllerin üstünlüğü, üç boyutlu bir yapıda, tıpkı anahtar-kilit arasındaki uyumu andıracak şekilde, antijene özgün olarak bağlanmaktır. Böylece antikorlar, organizmaya giren antijenlere bağlanarak onları etkisiz hale getirirler veya kompleman sistemini ve diğer savunma hücrelerini harekete geçirerek antijenleri yok ederler (1,3). Hastalıklarla savaşta antikorların büyük miktarlarda ve saf olarak elde edilmesi klasik yöntemlerle oldukça zordur. 1975 yılında Köhler ve Milstein ın geliştirdiği hibridoma yöntemiyle, hedef yapıda yer alan bir antijenik bölgeye (epitop) karşı limitsiz miktarda monoklonal antikor (mab) üretmek mümkün olmuştur. Monoklonal antikorlar hibrit hücreler tarafından üretilen homojen antikor topluluklarıdır. Bu yöntemle araştırmacılar, 1984 yılında tıp alanında Nobel ödülünü kazanmışlardır. Bu teknoloji ile, antikorların saf halde ve oldukça büyük miktarlarda üretilmesi olanaklı hale gelmiştir. Bu yöntem basitçe şöyledir: Öncelikle, istenen antikorları doğal olarak üreten hücreler elde edilir. Daha sonra bu hücrelere sonsuz bölünme yeteneği kazandırılır ve kültür ortamında, istenen antikoru üretecek hibrit hücreler geliştirilir. Örneğin, myeloma, kemik iliğinde oluşan ve hücre kültüründe üretilmeye uygun olan bir tümör tipidir. Myeloma hücreleri, antikor üretme yeteneğine sahip olan dalak hücreleri ile kaynaştırıldıklarında, oluşan hücreler büyük miktarlarda mab üretirler (1,4). Monoklonal antikorlar günümüzde çok çeşitli tanı ve tedavi yöntemlerinde kullanılmaktadırlar. Kanser tedavisi için ilk onayı 1997 yılında alan rituksimab (MabThera, Rituxan ) tedavide klinik süreci başlatmış ve günümüzde kanser tedavisinde kullanılan mab ların sayısı alemtuzumab (MabCampath, Campath-1H ), bevasizumab (Avastin ), brentuksimab vedotin (Adcentis ), katumaksomab (Removab ), setuksimab (Erbitux ), denosumab (Prolia ), gemtuzumab ozogamisin (Mylotarg ), ibritumomab (Zevalin ), ipilimumab (Yervoy ), ofatumumab (Arzerra ), panitumumab (Vectibix ), rituksimab (MabThera, Rituxan ), tositumomab (Bexxar ) ve trastuzumab (Herceptin ) ile 14 e ulaşmıştır. Bu mab lar

3 kronik lenfositik lösemi, glioblastoma multiforme, kolorektal, böbrek ve akciğer kanseri, Hodgkin lenfoma, non-hodgkin lenfoma, anaplastik büyük hücreli lenfoma, EpCAM pozitif malign assitli durumlar, baş-boyun kanseri, prostat kanseri, melanoma, mide veya gastroözofageal adenokarsinoması gibi kanser tedavilerinde kullanılmaktadırlar. Bu derlemede immün sistem hücreleri de anlatılarak günümüzdeki monoklonal antikorlar ve bu antikorlarla kanser tedavisinin araştırılması amaçlanmıştır.

4 2. GENEL BİLGİLER 2.1.LENFOİD SİSTEM ve İMMÜN CEVAP İmmünite; vücuda giren yabancı maddelerin nötralize edilmesi, dışarıya atılması veya metabolize edilmesi için vücudun geliştirdiği savunma mekanizmasıdır. Mikroorganizmalara, malignensilere ve otoimmün fenomenlere karşı konağın savunma mekanizmalarını içeren bir kompleks sistem olan immün sistem başlıca hücresel immünite, hümoral immünite, fagositik sistem ve kompleman sistemi olmak üzere dört ana unsurdan meydana gelmiştir. İmmün sistemi oluşturan hücrelerin iki ana farklılaşma şekli vardır: Lenfoid seri: Lenfositleri yapar. Myeloid seri: Fagositleri ve diğer hücreleri yapar. Lenfoid seride hücresel immüniteden sorumlu T-lenfositler ve hümoral immüniteden sorumlu B-lenfositler olmak üzere fonksiyonları farklı iki ana hücre grubu vardır. Fagositler grubunda ise monositler ve polimorf nükleuslu lökositler (nötrofiller, eozinofiller ve bazofiller) iki temel hücreyi oluştururlar.bütün bu hücre sistemleri birbirlerine son derece bağlı olmalarına rağmen fonksiyonları farklıdır. Bu iki hücre sistemine ek olarak aksesuar hücreler immün cevabın oluşmasında önemli rol oynarlar.bir antijene karşı immün cevap oluşabilmesi T ve B lenfositleri, monositler ve MHC (major histocompatibility complex) ürünleri arasındaki kompleks bir reaksiyon serisinin gerçekleşmesine bağlıdır. Bunlardan başka diğer hücre tipleri de immün cevabın oluşumuna katılabilmektedir. Bu hücreler arasında dentritik hücreler, NK (natural killer) hücreleri, Langerhans (dendritik) hücreleri ve endotelyal hücreler bulunmaktadır. Lenfoid sistemin lenfoid dokuları primer (santral) ve sekonder (periferik) olmak üzere ikiye ayrılırlar. Santral lenfoid organları kemik iliği, timustur. Periferik lenfoid organlar ise lenf nodları, dalak, tonsiller ve Peyer plakları gibi intestinal lenfoid dokulardır (5).

5 2.1.1.Lenfositler İmmün yanıtta birincil akyuvarlar lenfositlerdir. Kemik iliğindeki kök hücrelerden gelmektedir. Antijen tanıyan ve dolaşımda bulunan uzun ömürlü hücrelerdir. İki ana lenfosit çeşidi B hücreler ve T hücrelerdir (6). Yarı ömrü 5-7 gün gibi kısa ama genellikle daha büyük olanlar B-lenfositler olarak tanımlanırken; küçük ama yarı ömrü aylar ve yıllar gibi uzun olanlar ise T-lenfositler olarak tanımlanırlar (5). Üçüncü tip lenfosit doğal katil hücre (NK-natural killer) dir. Bu tip lenfosit doğuştan gelen bağışıklığın bir parçasıdır. NK hücreleri (bağışıklık tepkisinin ilk evrelerinde) yabancı olarak gördükleri hücreleri karakteristik antijenleri tanımaya gerek görmeden yok eder. Birçok bağışıklık yetersizliği hastalıklarında (AIDS dahil olmak üzere) NK hücreleri anormal çalışır (6). 2.1.1.1.B Lenfositler İki ana B lenfosit çeşidi bulunmaktadır. İlk çeşit, antijen tarafından uyarılınca plazma hücresine dönüşür. (Plazma hücreleri antijenlerle savaşacak karakteristik antikorları üretir.) İkinci çeşit, B hafıza (B memory) hücresidir. Bu tip hafıza hücreleri daha önce karşılaşılan antijen bilgisini saklar. Antijen varken, bu hücre kendini klonlar veya bölünerek çoğalır. Bütün yeni oluşmuş hücreler eskiden karşılaşılan antijenler hakkında bilgiye sahiptir. Plazma hücreleri antikor adı verilen proteinleri üretir. Antikorlar, aynı zamanda kan serumundaki immünoglobulin olarak adlandırılırlar (6). 2.1.1.2.T Lenfositler T lenfositler hücresel tipte bağışık yanıttan sorumludur. Kemik iliğinde yapılan T öncü hücreler timusta olgun T lenfosit haline gelirler. Bu olgunlaşma sırasında T lenfosit yüzeyinde pek çok reseptör yerleşir. 1980 sonrası hücre yüzey molekülleri üzerindeki çalışmalar artmış ve pek çok reseptör çeşidi gösterilmiştir. Ancak bunların

6 isimlendirilmesi sorun yaratmış ve karışıklığı önlemek için kan hücreleri ile ilgili yüzey reseptörler numaralanmış ve CD ile ifade edilmişlerdir. CD 2, CD 4, CD 8 gibi (7). T-hücre yüzeyinde yüzey immünglobulin bulunmaz. Bunun yerine antijenleri özgül olarak tanıyan T hücre reseptörü = TCR bulunur. Bir T lenfositi sadece tek bir çeşit antijen için TCR taşır ve B lenfositlerinde olduğu gibi immün sistemde zaman içinde karşılaşma ihtimali olan onbinlerce çeşit antijene yanıt verebilecek onbinlerce çeşit T lenfositi bulunur (7). Bağışık yanıttaki rolleri açısından T-hücre topluluğunun homojen (tek tip) olmadığı ve yapı ve işlev özelliği farklı olan alt grupların bulunduğu bilinmektedir. Tüm T lenfositlerde bulunan ortak yüzey molekülleri (CD2, CD3, CD5 gibi) yanında bu alt gruplardaki farklı yüzey moleküller onların ayırdedilmesinde kullanılır (7). T-lenfositler başlıca iki alt gruba ayrılırlar: 2.1.1.2.1.Sitotoksik T lenfositleri (CTL) Bu hücrelerin yüzeyinde CD8 molekülleri bulunur. Organizmaya giren yabancı hücreleri, organizmada şekillenen tümör hücrelerini, virüsle enfekte hücreleri ve vücuda ait bazı hücreleri öldürme yeteneğine sahip bir direkt saldırı hücresidir (8). Sitotoksik T lenfositler, normal olmayan hücreleri kolayca tanıyarak onları ekstraselüler bir mekanizma ile öldürür. Bu hücrelerin fagositoz aktiviteleri yoktur. Bu nedenle intraselüler öldürme yeteneğine sahip değildirler (8). Sitotoksik T lenfositler, antijen sunan hücrelerin ve hedef hücrelerin yüzeylerindeki MHC-I molekülü ile birleşmiş olan endojenik peptid antijenleri kendilerinde bulunan αβ TCR ler yardımıyla tanıyarak uyarılırlar. Bu uyarımdan sonra sitotoksik T lenfositleri perforin olarak isimlendirilen ve hedef hücrenin membranında nokta şeklinde geniş yuvarlak boşluklar oluşturan maddeler sentezlerler (8). 2.1.1.2.2.Yardımcı T lenfositler T lenfositlerin büyük bir çoğunluğunu yardımcı T lenfositler oluşturmaktadır. Yüzeylerinde CD3 ve CD4 reseptörlerini taşıyan yardımcı T lenfositler, antijen sunan hücreler tarafından işlenerek MHC-II molekülleri ile birlikte hücre yüzeyinde

7 kendilerine sunulan yabancı peptid yapıdaki antijenleri kendilerinde bulunan αβ TCR ler yardımıyla tanır ve uyarılırlar. Bu uyarımlar sonucunda bir farklılaşma ve gelişme aşamasına geçerek, çeşitli gen düzenlemelerine bağlı olarak sitokin sentezleyecek kapasiteye ulaşırlar (8). Şekil 2.1. Bağışık yanıtta rol alan hücrelerin etkileşimi (7) 2.1.1.3.Doğal Öldürücü Hücreler (Naturak killer=nk) Sitoplazmalarındaki azurofilik granüllerden dolayı ve diğer lenfositlerden daha büyük olmaları nedeniyle iri granüllü lenfositler (LGL=Large granular lymphocyte) olarak da isimlendirilirler. NK hücrelerde bulunan temel CD molekülleri CD16 ve CD56 dır. LGL morfolojisi gösteren dinlenme halindeki NK hücreleri, hedef hücreye bağlandıkları zaman sitolitik granülleri salgılarlar. Hedef hücre membranındaki monomerleri polimerize ederek silindirik transmembran porları oluştururlar ve bu da hedef hücrenin ozmotik lizisine neden olur. Ayrıca NK hücreleri, NK sitotoksik faktör olarak isimlendirilen IL-3, GM-CSF (granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör), M-CSF, IFNα, β, γ, TNF-α, β gibi eriyebilen sitokinleri de salarlar (9). 2.1.2.Mononükleer fagositik sistem Mononükleer fagositik sistem immün sistemin ikinci büyük hücre grubunu oluşturur ve primer fonksiyonu fagositoz olan hücrelerden oluşur. Mononükleer fagositik sistemin bütün hücreleri kemik iliğinden gelişir. Önce monositler oluşur, dolaşımda sadece

8 birkaç gün kalırlar. Bağ dokuya geçerek makrofajları oluştururlar. Makrofajların belli başlı fonksiyonları şunlardır (10): Fagositoz Makrofajlar bakteri, makromolekül, antijen gibi yabancı maddelerle, hasarlı, ölü hücre ve artıklarını fagosite ederler. Makrofajların hücre membranında değişik maddeler için spesifik reseptörler bulunur. Makrofajların yabancı partikülleri ve hasarlı dokuları tanımasında fosfolipid ve şeker reseptörlerinin rolü vardır. Bunlar içinde mannoz reseptörü, membran CD14 reseptörü, toll-like reseptör ailesi sayılabilir. Makrofajlar, antikorları ise yüzeylerindeki Fc reseptörleri ile tanırlar. Kompleman için de yüzeylerinde kompleman reseptörleri bulunur (10). Salgılama Makrofajlar biyolojik olarak aktif olan pek çok madde salgılarlar. En önemlileri arasında TNF-α, interlökin-1β, IFN α, β, IL-6, 10, 12, fibroblast büyüme faktörü, prostaglandinler, kemokinler, nitrik oksit bulunmaktadır. Makrofajlar salgıladıkları tümör nekrozis faktör ile malign tümör hücrelerini öldürürler (10). Antijen sunma İmmün regülasyonda antijenik uyarıyı, antijen sunan hücre olarak T hücrelerine arz ederek immün cevabın oluşmasına katkıda bulunur. Antijen sunma işlevinin ilk basamağı; antijen alımı, yıkımı ve MHC moleküllerine yüklenmesini içeren antijen sunumudur. Antijen sunumunun kapasitesi makrofajların molekülleri non-spesifik ve reseptör-aracılı fagosite etmeleriyle ilişkilidir. Antijen alımını izleyen dönemde antijenin proteolitik peptidlere işlenmesi ve MHC sınıf I ve sınıf II moleküllere yüklenmesi gerçekleşmektedir. Peptid-MHC kompleksi birlikteliğinde T hücre uyarımı sekonder lenfoid organların T hücre alanlarında gerçekleşmektedir. T hücreler peptid- MHC kompleksine ko-stimülatör moleküllerin (CD80, CD86 gibi) varlığında T hücre reseptörü aracılığıyla bağlanırlar. T hücre aktivasyonuyla proliferasyon ve diferansiyasyon için gerekli olan yeni gen ekspresyonu indüklenmektedir. Son olarak CD4+ T hücre yanıtının fonksiyonel olarak polarizasyon aracılığıyla tip 1 ve tip 2

9 diferansiyasyon yolaklarına dönüşmesidir. Bu yanıtların gelişiminde antijen sunan hücrelerin salıverdikleri sitokinlerin rolü vardır (11). 2.1.3.Polimorfonüklear granülositler Polimorfonüklear granülositler veya lökositler (PMNL), kemik iliğinde dakikada yaklaşık 80 milyon hızda üretilmekte olup 2-3 günlük ömürleri vardır. İsminden de anlaşılacağı gibi olgun polimorflarda multilobüle çekirdek ve pek çok granüller bulunur. Bu granüllerin histolojik boyalarla boyanma karakteristiğine göre nötrofil, bazofil ve eozinofil olarak 3 ana grupta incelenirler (12). 2.1.3.1.Nötrofiller Nötrofiller, kandaki lökositlerin % 55-65 ini, dolaşımdaki polimorfların ise % 90 ını oluştururlar. Güçlü fagositik aktiviteleri vardır. Bunlar immün ve immün olmayan mekanizmalar ile aktive olabilir. Salgıladıkları sitokin ve granül materyalleri ile etki ederler (12). 2.1.3.2.Bazofiller ve Mast Hücreleri Bazofiller dolaşımda çok küçük miktarlarda bulunmaktadırlar. Büyük granüllerle dolu ve zayıf fagositik aktiviteye sahiptirler. Mast hücreleri ise dolaşımda bulunmazlar, dokularda; mukozal ve bağ doku olmak üzere iki çeşittirler. Bu hücrelerin fagositik aktiviteleri yoktur. Uyarıldıkları zaman histamin, prostaglandin ve lökotrien gibi mediyatörleri ortama verirler, IgE bağlayabilirler. Bu özelliklerinden dolayı anaflaktik allerjiden sorumludurlar (12). 2.1.3.3.Eozinofiller Eozinofiller, dolaşımdaki lökositlerin % 2-5 ini oluştururlar. Bu hücreler, mast hücreleri ve bazofillerden salınankemotaktik faktörler ile enflamasyon alanına doğru yönelirler. Fagositik aktiviteleri zayıftır. Allerjik ve paraziter olaylarda bölgesel ve sistemik sayıları artar (12).

10 2.1.4.Major Histokompatibilite Kompleksi İlk kez lökositlerde gösterilmiş olmalarından dolayı İnsan Lökosit Antijenleri-Human Leukocyte Antigens (HLA) olarak adlandırılan, HLA antijenlerinin oluşması, organizmada Majör Histokompatibilite Kompleksi-Major Histocompatibility Complex Gen Region (MHC) ismi verilen bir gen bölgesinin kontrolü altındadır. Üç ana gruba ayrılan bu bölgede MHC Sınıf-I (HLA-A, -B, -C, -E, -F, -G) MHC Sınıf-II (HLA-DR, - DP, -DQ, -DO, -DN) ve MHC Sınıf-III (C2, C4A, C4B, PF, TNF-α,β) antijenleri bulunmaktadır (13). 2.1.4.1.Sınıf-I Molekülleri Sınıf-I molekülleri fizyolojik rollerine uygun olarak bütün çekirdekli hücrelerde mevcutturlar. Bir antijenin CD8 (killer) T lenfositlerce tanınabilmesi ancak Sınıf-I molekülü ile bir arada tutulmuş olmasına bağlıdır. Bu olgu HLA restriksiyonu olarak adlandırılır. Örnek olarak, bir virüs bir hücreyi enfekte ettiği zaman, viral antijenler peptid fragmanlarına ayrılırlar. Daha sonra Sınıf-I molekülleri tarafından bağlanarak CD8 killer T hücrelerine sunulurlar (14). Belirli bir T lenfositin antijen reseptörü, belirli bir viral peptidi ancak belirli bir Sınıf-I molekülü varlığında tanıyabilir. Bu reseptörler farklı Sınıf-I molekülü ile bağlı özgün bir peptidi özgün bir Sınıf-I molekülü ile bağlamış farklı bir viral peptidi veya bağlı olmayan bir Sınıf-I molekülünü tanımazlar. Tanıma gerçekleştiğinde killer T lenfositler (CD8) viral antijen taşıyan hedef hücreyi öldürürler (14). 2.1.4.2.Sınıf-II Molekülleri Sınıf-II MHC moleküllerinin ana işlevi CD4 T-lenfositlere ekzojen kaynaklardan elde edilmiş işlenmiş antijen sunmaktır. Böylece MHC Sınıf-II molekülleri antijen spesifik immün yanıtın başlatılması için kritik öneme sahiptir. Antijen sunumu yanında giderek artan kanıtlar gösteriyor ki MHC Sınıf-II molekülleri ayrıca sık apoptozise götüren intraselüler sinyal yolaklarını aktive etmektedirler (15).

11 2.1.4.3.Sınıf-III Molekülleri Sınıf III molekülleri immün fonksiyonlarla salınan çeşitli proteinlerdir. Sınıf-III genlerinin Sınıf-I ve Sınıf-II genleri ile aynı fonksiyonları paylaşmadığı açıktır. MHC Sınıf-III antijenleri Sınıf-I ve Sınıf-II antijenleri arasındaki bölgede bulunurlar. Klasik kompleman yolunun C2, C4a ve C4b, alternatif yolun properdin faktörü ile 21- hidroksilaz gibi enzimler ile TNF gibi sitokinlerin sentez edildiği bölgedir (17). 2.1.5.Kompleman Sistemi (Tamamlayıcı Sistem) Doğal bağışıklık sistemi enfeksiyon ajanlarına karşı ani immün cevapta çok önemli rol oynar. Kompleman sistemi, doğal immün sistemin bir parçası olarak sonradan kazanılmış bağışıklıkla birlikte patojenlerin öldürülmesi ve immün komplekslerin temizlenmesinde görevlidir (16). Tanımlanan tamamlayıcı bileşenleri düzenlemek için, her faktöre keşfedilme sırasına göre bir numara atanmıştır; örneğin; C1, C2, C3 ve C4 gibi. Daha sonraki çalışmalarda bu faktörlerin reaksiyon verme sırasının, keşfedilme sırasıyla aynı olmadığı görülmüştür. 1930 lu yılların sonlarına doğru ilk dört bileşenin reaksiyon sırası şu şekilde değiştirilmiştir. C1, C4, C2, C3. Bu tamamlayıcı zincir, insanları patojenik mikroorganizmaların saldırılarından koruyan güvenlik ağının bir parçası olarak düşünülmüştür. Enfeksiyonla ilişkili bir uyarıcı, kompleman yanıtın başlangıç noktası olarak kabul edilmiştir. Koruyucu yanıt, bulaşıcı hastalık perspektifinden oluşturulduğu için, C1-C4-C2-C3 dizisi, kompleman sisteminin klasik yol (classical pathway) girişi olarak adlandırılmıştır (16). Daha sonraki çalışmalar bu klasik yolun dışında bir etki mekanizması daha olduğunu göstermiştir. Bu çalışmalar, alternatif yolu (alternative pathway) tanımlayacak öncü çalışmalar idi. Bu çalışmalardan bir diğeri de Dr. Louis Pillemer in daha önceden isimlendirilememiş olan serum proteini properdin i tanımlamasıdır. Bu protein antikor varlığına gereksinim duymadan komplemanı aktive ederek bakteri ve mayaya bağlanmaktadır (16).

12 Şekil 2.2. Klasik ve alternatif kompleman yollarının aktivasyonları ve membran atak kompleksi (C5b-9) oluşumunun basamakları (17). Komplemanın başlıca biyolojik aktiviteleri şunlardır; fagositozu güçlendirmek, anafilatoksik etki, kemotaksis, viral nötralizasyon, sitoliz, immün modülasyonu (12).

13 2.1.6.Sitokinler Sitokinler; lenfositler, iltihabi hücreler ile endotelyal hücreler gibi immün sistem hücreleri arasındaki etkileşmeleri düzenleyerek aktivitelerini yönlendiren polipeptit yapısında kısa etkili ve çözünür moleküllerdir (18). Salgılandıkları zaman organizmada sistemik (endokrin) ve/veya salgılandıkları hücre etrafındaki hücrelere (parakrin) veya doğrudan salgılandıkları hücreler üzerine (otokrin) etkide aracılık ederler (12). Lenfosit kaynaklı sitokinler lenfokin, makrofaj/monosit kaynaklı sitokinler monokin, lökositlere etki eden monokin ve lenfokinler ise interlökin (IL) diye adlandırılırlar (18). Kemokin ise kemotaktik ve sitokin parçalarının birleştirilmesiyle üretilen makrofaj ve monositleri enfeksiyon bölgesine çekebilen bir grup sitokindir (12). Görevleri şunlardır: Lenfoid hücrelerinin aktivasyonunu, çoğalmasını ve farklılaşmasını sağlamak (spesifik immünite) İmmün cevabı şiddetlendirerek veya baskılayarak regüle etmek Enflamasyon olaylarına katılan hücreleri aktive etmek, olay yerine toplayarak orada tutmak (non-spesifik immünite) Kemik iliğine etki ederek hemopoietik regülasyona katılmak Bazı hipofiz hormonlarının ve diğer biyolojik maddelerin sentez ve salınmalarına sebep olmak (12). Bazı önemli sitokinler: İnterlökin 1 Esas olarak makrofajlar tarafından üretilen ve pek çok hedef hücrenin farklılaşmasını ve özgül ürünler sentezlemesini sağlaması yanında T hücrelerini farklılaşma ve IL-2 üretme yönünden aktif hale getiren bir proteindir. Endojen pirojen olup santral sinir sistemi üzerine IL-1 in etkisi ile ateş ortaya çıkar. Prostaglandin sentezi gibi enflamatuar yanıtları indükler, lökositlerin endotel hücrelerinde adezyonunu sağlar ve vasküler geçirgenliği artırarak PMNL ve makrofajların bölgeye göçüne neden olur (12).

14 İnterlökin 2 T hücresi büyüme faktörü de denilen (TCGF) IL-2, T lenfositlerinin hücre siklusunun G1 fazından S fazına ilerlemesinden sorumlu olan sitokindir. IL-2, CD4+ T hücreleri tarafından üretilir az olarak da CD8+ T hücreleri tarafından üretilir. IL-2, kendisini üreten hücrelere etki edip kendi oluşumunu sağlar, bu onun otokrin büyüme faktörü görevini gösterir. Ayrıca parakrin büyüme faktörü olarak da etkisi bulunur. IL-2, T lenfositleri için otokrin büyüme faktörüdür ve IFN-γ, lenfotoksin gibi T hücresinden kökenini alan sitokinlerin sentezini uyarır. NK hücrelerinin büyümesini uyarır ve onların sitolitik işlevlerini artırır. Bunu lenfokinle aktive edilmiş öldürücü hücreler (LAK) üreterek yapar. Ayrıca IL-2, insan B lenfositlerine etki ederek hem büyüme faktörünün hem de antikor sentezi uyaranı olarak etki gösterir (19). İnterlökin 4 ve 5 CD4+ T lenfositleri tarafından üretilirler ve B hücrelerinin üreme ve farklılaşması üzerine etkilidirler. IL-4 ayrıca MHC Sınıf II ekspresyonunu atırır ve IL-3 ile birlikte mast hücrelerinin gelişiminde sinerjik rol oynar (8,12). İnterlökin 6 Başlıca makrofajlar daha az olarak da B, T, endotel hücreleri ve fibroblastlar tarafından üretilir. B hücreleri üzerinde gelişmeyi sağlayıcı etki gösterir. IL-1 ile birlikte bir kofaktör olarak olarak IgM sentezletir, IL-5 ile birlikte IgA sentezini uyarır (20). İnterlökin 8 IL-8 in hedef hücreleri ise nötrofiller ve T hücreleridir. Nötrofillerin mobilizasyonunu, aktivasyonunu ve degranülasyonunu sağlar, angiogenezde rolü vardır. IL-8 lökositlerin vasküler endotele stabil olarak bağlanması için adezyonunda rol oynar. İkincil olarak infeksiyon alanında konsantrasyon artışı vasıtasıyla nötrofillerin migrasyonunda gradyan sağlar (21).

15 İnterlökin 10 İnterlökin-10 insan immün cevabında bulunan en önemli antiinflamatuar sitokindir. Primer olarak T lenfositleri, monositler, makrofajlar, B lenfositleri ve nötrofiller tarafından sentezlenirler. IL-10 koruyucu aktivitesini IL-1β, TNF-α, IL-8, IFN γ, IL-6 ve prostaglandin metabolitleri gibi inflamasyon mediyatörlerini inhibe ederek gösterir. Çeşitli tümörlerde seviyesinin arttığı görülmüştür (22). İnterlökin 12 IL-12 hem doğal hem de kazanılmış bağışıklıkta önemli rol oynayan bir sitokindir. Özellikle B hücreleri, dendritik hücreler ve makrofajlar olmak üzere birçok farklı hücre tarafından üretilmekte olup, T ve NK hücrelerinin sitotoksisitesini artırmakta, başta IFN-γ, TNF-α, GM-CSF, M-CSF, IL-3, IL-8 olmak üzere birçok sitokin ile kemokinin salgılanmasını uyarmaktadır (23). Tümör nekroz faktörü Esas olarak makrofajlar (TNF-α) ve T lenfositler (TNF-β) tarafından sentezlenerek nötrofillerin fagositoz ve öldürme etkinliklerini aktifleştirir (12). Granülosit makrofaj-koloni stimüle edici faktör GM-CSF, aktive T hücreleri, endotelyal hücreler, fibroblastlar ve makrofajlar tarafından sentez edilen, glikoprotein yapısında bir büyüme faktördür (24). PMNL ve eozinofillerde myeloproliferasyon, PMNL ve makrofaj kemotaksisi ve makrofajlardaki sitokin sentezini artırmaktadır. GM-CSF nin ayrıca apoptozise karşı koruma, reaktif oksijen üretim artışı ve nötrofillerde bakterisidal aktivite artışı yapması gibi rolleri de vardır (24).

16 Şekil 2.3. GM-CSF ve T hücre yanıtları (24) TGF-β (Değişiklik yapan büyüme faktörü-β) Trombositler, T ve B lenfositler tarafından üretilir, B hücre proliferasyonunu engelleyici etkileri vardır. IgA üretiminde ise uyarıcı etkisi vardır (20). İnterferonlar İnterferonlar, geniş biyolojik etkiye sahip, birçok indükleyicilerin varlığında salgılanan son derece etkili sitokinlerdir. Yapısal, biyokimyasal ve antijenik özellikleriyle üç alt gruba ayrılırlar. IFN-α monositler, TNF-α, IL-1 ve virüslerin uyarısıyla üretilmektedir. IFN-β fibroblastlardan ve epitelyal hücrelerden IFN-γ ise CD4+ ve CD8+ T hücreleri, NK hücreleri ve makrofajlarda üretilmektedir. İnterferonlar çeşitli hücrelerin yüzeylerindeki reseptörlere bağlanarak etkilerini gösterirler. Reseptöre bağlanan IFN molekülü, hücrede antiviral, antiproliferatif ve immünomodülatör etki göstermektedir (25).

17 Şekil 2.4. İmmün sistemin doğuştan ve kazanılmış bölümlerinin ana bileşenlerinin ve hedeflerinin şematik özeti (9) 2.2. TÜMÖR İMMÜNOLOJİSİ Son yıllarda immünoloji alanında elde edilen gelişmeler, organizma ve tümör etkileşimine de yansımıştır. Bilinen immünolojik mekanizmalar çerçevesinde tümör immünolojisi üç ana başlık altında incelenebilir: Tümör antijenleri, efektör mekanizmalar ve kanserin immüniteden kaçış mekanizmaları (26).

18 2.2.1. Tümör Antijenleri Yapılan çalışmalar tümör hücresinde bazı antijenlerin varlığını ortaya koymuştur. Üç gruba ayrılır. Tümör assosiye antijenler: Kanser hücrelerinde olduğu gibi normal doku hücrelerinde de bulunabilen antijenler bu grupta incelenir. Tümör spesifik antijenler: Bu grup sadece tümör hücresine özgüdür, normal hücrede bulunmaz.tümör spesifik transplantasyon antijenleri: Konakta immün cevabı uyaran, tümör büyümesine karşı direncin ve tümör rejeksiyonuyla sonuçlanan bir dizi reaksiyonun oluşmasına sebep olan antijenlerdir (26). 2.2.2. Efektör Mekanizmalar Sitotoksik T-lenfositleri (CTL) CTL-tümör hücresi etkileşiminde ilk adım, hedef hücredeki tümör antijeninin kendisine özgün CTL-reseptörü tarafından tanınmasıdır. Bu tanınmanın gerçekleşmesi ve bundan sonraki sitolitik etkinin ortaya çıkabilmesi için tümör antijeninin tümör hücresinin sınıf- I MHC antijeni ile algılanması gerekmektedir. Aynı olay yardımcı T hücrelerinde de benzer biçimdedir fakat sınıf-ii MHC ile gerçekleşmektedir. Buna MHC ile sınırlı tanıma (MHC-Restricted recognition) denmektedir. Hedef hücreyle temasa geçen CTL polarizasyon gösterir. CTL sitoplazmasında bulunan sitolitik granüller temas yerinde toplanır. Hedef hücre tamamen granüllerler kaplanır ve membranında oluşan delikler nedeniyle lizise uğrar. CTL granülleri aynı zamanda hedef hücre DNA sını da tahrip edebilir (26). Makrofajlar Makrofajların tümör immünitesinde önemli bir rolü vardır. Antijen sunucu hücreler olarak görev yaparak tümör hücrelerinin lizisinde rol alan efektör mekanizmaları uyarırlar. Makrofajlar MHC sınıf II molekülleri ile tümör antijenlerini yardımcı T hücrelere sunarlar. Makrofajlar, yardımcı T hücrelerinden salınan INF-γ, granülositmakrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF), TNF, IL-4 gibi makrofaj aktive edici faktörler (MAF) ile aktive olur. TNF, NO, O 2, proteazlar gibi inflamatuvar mediyatörlerin ortama salınmasıyla tümör hücreleri sitolitik olarak makrofajlarca elimine edilirler. Ayrıca makrofajlar, Fc reseptörleri veya kompleman reseptörleri ile

19 antikorlar tarafından bağlanmış tümör hücrelerini yakalayarak antikor bağımlı hücre aracılı sitotoksisite (Antibody dependent cell mediated cytotoxicity=adcc) mekanizmasıyla da öldürürler (27). NK hücreler NK hücreleri birçok tümör hücresini hedefleyerek yok eden hücrelerdir. NK hücreleri tümör hücrelerini sitolitik olarak öldürürler. NK hücreleri tümör hücrelerinin MHC moleküllerine bağlanmazlar. NK hücreleri MHC sınıf I molekülleri olmayan veya bu molekülü çok az miktarda bulunduran tümör hücrelerini tanırlar. Tümör hücre yüzeyindeki NK reseptörlerine bağlanarak aktive olurlar. Tümör hücresinde deliklere ve hasara yol açarlar. Antikorlarla çevrili tümör hücrelerini Fc reseptörleri ile tanıyarak ADCC ile tümörleri yok ederler (27). LAK hücreleri İnterlökin 2 adlı lenfokinle aktive edilen lenfositler, tümör hücrelerini lizise uğratabilme yeteneğini kazanırlar. Bunlara lenfokince aktive edilmiş öldürücü hücreler anlamına gelen LAK adı verilir (26). B lenfositler Tümör lizisinin antikora bağımlı yoldan gerçekleştirilmesinde iki mekanizma görev yapar; i) Komplemana bağımlı sitotoksisite ve ii) Antikora bağımlı sitotoksisite. Birincisinde tümör hücresinin yüzeyinde bulunan Fc reseptörlerine komplemanı fikse eden antikorlar bağlanır. Kompleman aktivasyonuyla tümör hücre membranında Membran Atak Kompleksi (MAC) oluşur. Delikler açılır ve lizis olur. Alternatif mekanizma olan ADCC ile NK hücreler, makrofajlar, granülositler gibi fagositer hücreler hücre lizisine aracılık ederler. Anti-tümör antikorlarla kaplanmış tümör hücreleri Fc bölgelerinden Fc reseptörleri bulunduran NK hücrelerine tutunurlar. NK hücreleri tümör hücrelerini lizis ile yok ederler. ADCC mekanizması kompleman bağımlı sitotoksisiteye kıyasla tümör eliminasyonunda daha etkili bir mekanizmadır (27).

20 2.2.3. Kanserin İmmün Sistemden Kaçış Mekanizmaları Kanser hücresinin immün efektör mekanizmalardan kaçmasını sağlayacak çeşitli yollar bulunmaktadır. Tümör hücresi membranındaki antijenik değişimler: Tümör hücresi antijenleri immün sistemi uyaracak miktarda sentez edilmez veya çok kısa sürede modülasyon göstererek immüniteden kaçar. Antijen-antikor kompeksleri: Dolaşımdaki antijenler, antikorlar ile kompleksler oluşturarak immün yanıtın ortaya çıkmasını engelleyebilirler. Bu antijen-antikor kompleksleri katil hücrelerin Fc reseptörlerine bağlanarak onları bloke ederler. Böylece antikora bağımlı hücresel sitotoksisite reaksiyonlarını engellerler. Spesifik ve non-spesifik supresör hücreler: Tümör assosiye antijenlerin bazıları spesifik supresör T-lenfosit gruplarının oluşmasına yol açmaktadır. Tümör tarafından oluşturulan supresyon: Bazı tümörler salgıladıkları prostaglandinler aracılığı ile immün yanıtı baskılayabilmektedirler. Bazen tümör hücrelerince lenfoit dokunun istila edilmesi, immün yanıtı gerçekleştirecek hücrelerin azalması ile sonuçlanmaktadır. Diğer faktörler: İmmün sistemi etkileyen bazı genetik ve edinsel hastalıklar sonucu maligniteye eğilim artmaktadır. Örneğin yardımcı T-hücre sayısının azaldığı AIDS hastalığında malignite oranı yüksektir (26). 2.3.ANTİKORLAR Antikorlar kendi ağır zincir bölgesinin dizisini esas alan beş sınıfa ayrılır: IgM, IgD, IgE, IgA ve IgG. IgG, kanser immünoterapisinde en sık kullanılanlardır. Antikorlar, antijen bağlayan parçası (Fab) ve sabit parçası (Fc) olmak üzere iki ayrı işlevsel bölgeye ayrılırlar (28). Fab, antikorun antijen bağlama bölgesini oluşturan ve antijen spesifitesini sunan tamamlayıcılığı belirleyen çok değişken üç bölgeyi içerir. Antikorların immün efektör fonksiyonları, kompleman-bağımlı sitotoksisiteyi (CDC) başlatma yeteneğinde olan, Fc

21 γ-reseptörlerine (FcγR) ve neonatal Fc reseptörlerine (FcRn) bağlanan Fc parçası ile bağlantılıdır (28). Şekil 2.5. Antikorun yapısı (29) Ig nin alt sınıflarından olan IgG1 ve IgG3, klasik kompleman yolunun güçlü aktivatörlerindendir. Hücre yüzeyine iki ya da daha fazla IgG bağlanması, C1r nin enzimatik aktivitesinin ve daha sonraki kompleman proteinlerinin aktivasyonunu takiben C1q nun Fc parçasına yüksek afiniteli bağlanmasına yol açar. Bu aşamanın sonucu, MAC tarafından tümör hücre lizislerinde ve tümör hücre yüzeyinde porların oluşturulmasıdır. Buna ek olarak, son derece kemotaktik kompleman molekülleri C3a ve C5a nın üretimi makrofaj, nötrofil, bazofil, mast hücreleri ve eozinofil gibi immün efektör hücrelerinin alımına ve aktivasyonuna yol açar (28). Fcγ reseptörleri, immünoreseptör tirozin bazlı aktivasyon motifleri (ITAMs) aracılığıyla aktivasyon sinyallerini aktarabilir veya immünoreseptör tirozin bazlı inhibitör motifleri (ITIMs) aracılığıyla inhibe edici sinyal sağlayabilir. Majör inhibitör Fcγ reseptörü tek zincir FcγRIIB (CD32 olarak bilinen) dir. Oysa Fc-bağımlı uyarıcı sinyaller FcγRI (CD64 olarak bilinen) ve FcγRIIIA (CD16A olarak bilinen) tarafından aktarılır, her ikisi

22 de sinyal aktarımını başlatmak için ITAM içeren γ zinciri gerektirir. FcγRI makrofajlar, dendritik hücreler, nötrofiller ve eozinofiller tarafından eksprese edilen yüksek afiniteli bir reseptördür. FcγRIIIA NK lar, dendritik hücreler, makrofajlar ve mast hücreleri tarafından eksprese edilen primer aktive edici Fcγ reseptörüdür (28). Tümör hücrelerine IgG antikorlarının bağlanması, Fcγ reseptörlerini ekprese eden NK lar, nötrofiller, mononükleer fagositler ve dendritik hücreler gibi immün efektör populasyon tarafından hedeflerin tanınmasını sağlar. Bu hücreler üzerinde Fcγ reseptörlerinin çapraz bağlanması tümör hücre tahribatını arttırır. Tümör hücresinin lizisini takiben antijen sunan hücreler MHC Sınıf II molekülleri üzerindeki tümör kaynaklı peptitleri sunabilir ve CD4+ T hücrelerin aktivasyonunu artırabilir. Buna ek olarak, çapraz-sunum olarak bilinen CD8+ T hücrelerinin aktivasyonuyla sonuçlanan bir işlemde, tümör kaynaklı peptitler MHC sınıf I moleküllerine sunulabilirler (28). 2.3.1. Monoklonal Antikor Monoklonal antikorlar hibrit hücreler tarafından üretilen homojen antikor topluluklarıdır. Bu antikorlar, bağışıklanmış fare veya ratlardan elde edilen dalak hücreleri ile myeloma adı verilen lenfoit tümör hücrelerinden geliştirilen melez hücreler tarafından üretilirler. Her iki tip hücrenin özelliklerini taşıyan hibridomalar, doku kültürlerinde çok miktarda mab oluştururlar (30). 1975 te Georges Köhler ve Cèsar Milstein Nature de hibridoma teknolojisi tarafından üretilen bir işlem yayınlamışlardır. Bu işlem, B hücresi tarafından üretilen spesifik bir antikor ile bir myeloma hücresi arasındaki füzyondan çıkan hibrit hücre hatlarıdır. Bunu yaparken, Köhler ve Milstein aynı özellikte, monoklonal denilen çok miktarda antikor üreten bir yöntem sağlamışlardır (31). 1984 yılında, bu atılım buluş sayesinde, Köhler ve Milstein, immünolojiye olan katkıları sebebiyle Niels Jerne ile tıp ve fizyoloji dalında Nobel ödülü almışlardır (31). Monoklonal antikorların üretiminde rekombinant DNA teknolojisi ve hibridoma teknolojisi kullanılmaktadır. Rekombinant DNA teknolojisi, genetik rekombinasyon olaylarının yapay olarak gerçekleştirilmesi esasına dayanan ve istenilen herhangi bir gen ya da ürünün çoğaltılmasını mümkün kılan bir yöntemdir. Rekombinant DNA

23 teknolojisi, bugün dev adımlarla ilerlemekte olan bir gen mühendisliği konusudur. Bu teknoloji ile çeşitli amaçlar için adeta ısmarlama genler ve proteinlerin üretimi mümkün olmaktadır (32). Rekombinant DNA teknolojisinde izlenen basamaklar kısaca şöyledir: Çoğaltılması istenen gen önce orijinal kromozomdan restriksiyon endonükleaz enzimi yardımıyla kesilerek alınır ve plazmid ya da faj gibi bir vektöre integre edilir. Sonra bu vektör transformasyon yoluyla bir bakteri ya da maya içine sokulur ve daha sonra bu mikroorganizmaların kültürü yapılarak istenen gen veya protein gerekli miktarlarda elde edilir (32). Bir antijen (bakteri, virüs, hücre veya molekül) epitop adı verilen birçok antijenik bölge içerir. Her epitop ayrı bir antikor tipi tarafından tanınır. Bir antijen organizmaya girdiğinde her epitop için bir grup B-lenfosit hücresi özgül antikor üretmeye ve bölünerek çoğalmaya başlar. Böylece her epitop için özgül antikor üreten bir B-lenfosit kolonisi oluşur. Bir antijene karşı değişik B-lenfosit kolonileri oluştuğu için elde edilen antikora poliklonal (çok kolonili) antikor adı verilir. Köhler ve Milstein ın geliştirdikleri teknik, bir tek epitopa özgü (monoklonal) antikorların, hem de sınırsız miktarlarda elde edilebilmelerine olanak sağlayarak, moleküler biyolojiye önemli bir hız kazandırmış durumdadır (33). Bu hibridoma tekniğinin temelinde üç bilgi bulunur: B-lenfositler tek bir epitopa özgü antikor üretip salgılayan, yaşam süreleri birkaç günle sınırlı kan hücreleridir. Tümör hücreleri bölünerek çoğalma kontrolünü kaybetmiş, hızla üreyen ölümsüz hücrelerdir. Belli koşullarda aynı organizmaya ait değişik hücreler birleştirilerek her iki hücrenin özelliklerini taşıyabilen melez hücreler (hibridoma) elde edilebilir (33). Monoklonal antikorlar, antijen üzerinde bulunan ve epitop denilen antijenik determinantlardan bir tanesine hedeflendikleri için enfeksiyon hastalıklarının veya tümörlerin tanı ve tedavisinde etkin olarak kullanılırlar. Hibridoma teknolojisi ile fare kaynaklı olan ilk mab lardan sonra rekombinant DNA teknolojisi ile elde edilen insan kaynaklı veya bir kısmı insana özgü bölgeler içeren tipleri üretilmektedir (34).

24 Sağlıklı bir insanın serumundan fraksiyonlanan IgG nin elektroforetik tekniklerle ayrıştırılması sonucunda, 10 5-10 6 farklı IgG molekülünün var olduğu bulunmuştur. Buna rağmen, miyolemal hastalıklardan muzdarip olan sağlıksız bir bireyin serumundan elde edilen IgG fraksiyonu ise çok daha az sayıda IgG molekülleri içermektedir ve bu moleküllerin büyük bir çoğunluğunu ise tek bir tip IgG molekülü oluşturmaktadır. Böyle bireylerin dolaşım sistemlerinde sirküle eden lenfositlerin çoğu, miyolema hücreleridir ki bunlar, neoplastik B lenfositlerinin tek bir klonunu içermektedirler (35). Monoklonal antikor üretimi fare ve ratların B-lenfositi myeloma tümörlerinden elde edilen hücre hatlarının geliştirilmesi ile mümkün olmuştur. Myeloma hücreleri kendi çeşitli Ig lerini sentezleme yeteneğini kaybetmişlerdir. Monoklonal antikor üretiminde, fare ve rat myeloma hücreleri kullanılmaktadır. Rat myeloma hücreleri, daha büyük olmaları ve daha kolay kaynaşmaları nedeniyle fare myeloma hücrelerine tercih edilirler (30). Normal B lenfositlerine benzemeyen miyolema hücreleri ise hızlı bir şekilde bölünmeye devam eder ve hiçbir antijenin stimüle etkisi bulunmadan tek bir tip Ig molekülünü salgılarlar. Normal B lenfositleri in vitro koşullarda birkaç saatten fazla canlı kalamamalarına rağmen, miyolemalar diğer neoplastik hücreler gibi hücre kültür ortamlarında ölümsüz (immortal) olarak kalabilirler (35). Normal memeli hücreleri iki farklı yoldan DNA moleküllerini sentezlerler: De novo (yeni baştan sentez) metabolik yolu ile nükleik asitler, pürin ve pirimidin bazlarından, deoksiriboz ve inorganik fosfattan oluşturulurlar. Kurtarma metabolik yolunda ise, benzer nükleotidlerin dönüştürülmesi ile doğru nükleik asitlerin sentezi sağlanır. De novo metabolik yolu aminopterin ile tamamen inhibe olmaktadır. HGPRT enzimi (hipoksantin-guanin fosforiboziltransferaz) içeren hücreler ise kurtarma metabolik yolunu kullanarak, aminopterin içeren besi ortamlarında canlı kalabilirler. Buna rağmen, kurtarma metabolik yolunun işletilerek canlılığın sürdürülebilmesi için ortama hipoksantin ve timidin eklenmek zorundadır. Bu maddelerin eklendiği besiyeri ise HAT besiyerleri (hipoksantin, aminopterin, timidin) olarak adlandırılırlar. Böylece HAT besiyeri, HGPRT enzimi içeren hücrelerin, bu besiyerinde seçici olarak büyümelerini sağlarken; HGPRT içermeyen (HGPRT - ) hücrelerin büyümelerini engelleyecektir. Fare

25 miyolema hücrelerinin HGPRT - olan klonları seçilir ve bunlar HAT besiyerinde canlılıklarını sürdüremezler ve çoğalamazlar. HGPRT - olan miyolema klonları seçilirken bunların, istenmeyen Ig leri çok az miktarda veya hiç üretmeyenleri seçilmelidir. Günümüzde, mab üretiminde kullanılan standart metot ise Şekil 6 da verilmiştir. Uygun bir antijen ile aşılanmış olan farenin dalak hücreleri ise, duyarlı hale getirilmiş olan B lenfositlerinin süspansiyon kaynağı olarak kullanılır. In vitro koşullarda büyüyen, duyarlı B lenfosit hücreleri ve HGPRT üreten miyolema hücreleri, füzyon oluşturmak amacıyla, hücrelere toksik olan %30-50 (w/v) polietilenglikol (PEG) içeren ortamda birkaç dakika süre ile karıştırılır (35). Standart bir füzyon için ortamda 1 x 10 8 lenfosit ve 2 x 10 7 myeloma hücresinin bulunması gereklidir. Hücreler mikrotitrasyon kapları içindeki kültür vasatında 37 C de inkübe edilir.daha sonra, bu füzyon karışımı ise HAT besiyeri içeren kültür ortamlarına aktarılır (30). Lenfositler ve füzyon oluşturan lenfositler, in vitro koşullarda kültürlerinin yapılamamasından dolayı çok kısa bir sürede ölürler. Miyolema hücreleri ve füzyon oluşturmuş olan hücreleri ise HGPRT içermedikleri için HAT besiyerinde bulunan aminopterin tarafından zehirleneceklerdir. Sadece B lenfositleri ile HGPRT pozitif olan miyolema hücrelerinin füzyonları sonucunda oluşan hibridomalar bu ortamda canlı kalacaklardır. Çünkü, miyolema hücreleri, hibrit hücrelere in vitro koşullarda yaşama özelliğine aktarırken, B lenfositleri ise bu hibrit hücrelerin HAT besiyerlerinde üreyebilmeleri için gerekli olan HGPRT enzimini aktaracaklardır. 10-14 gün sonra ise kültür ortamında canlı kalan hücreler sadece hibridomalardan ibaret olacaklardır. Buna rağmen, bu hibridomaların birçoğu ya istenmeyen Ig leri üretebilir ya da hiçbir Ig üretmeyebilir. Ne yazık ki, bu hibridomalardan hiç Ig üretmeyenler, Ig üretenlere oranla çok hızlı büyümektedirler. Bu nedenle, hibridoma oluşumunu takip eden 7-14 gün boyunca, her bir kültürün devamlı olarak istenilen Ig yi üretip üretmediğinin test edilmesi ve üretmeyenlerin elimine edilmesi gerekmektedir (35). Füzyon işleminden sonra oluşan hibridlerin tümünün antikor sentezleme yeteneğinde olup olmadıkları bilinmemektedir. Bu nedenle, kullanılan antijene karşı hibridomalar tarafından üretilen antikorlar, hücrelerin ürediği besiyerinin üst sıvısında aranırlar. Füzyon işlemi rastgele olduğundan, antikor sentezleyen hibridlerin oranı % 1-50 arasında değişir. Antikorların üst sıvıdaki varlıklarının 2-3 gün gibi kısa bir sürede