Ampliquality HPV-HS Kod 03-28A Kod 03-28R

Transkript

1 KULLANICI KILAVUZU Ampliquality HPV-HS Kod 03-28A Kod 03-28R Human Papillomavirus Yüksek duyarlı tarama ve tiplendirmesi için kit

2

3 1. ÜRÜN BİLGİSİ KİT İÇERİĞİ REAKTİFLERİ SAKLAMA KOŞULLARI KULLANIM İÇİN ÖNLEMLER GÜVENLİK KURALLARI Genel güvenlik kuralları Kit hakkında güvenlik kuralları KİT İÇERİĞİNDE OLMAYAN GEREKLİ MATERYALLER Reaktifler Cihazlar Materyaller REAKTİF HAZIRLAMA GİRİŞ TEST PRENSİBİ ÜRÜN TANIMI ÖRNEK TOPLAMA, MANİPULASYON VE ÖN-MUAMELESİ Sitolojik örnekler Sitolojik örneklerin ön-muamelesi Histolojik örnekler taze ya da donmuş histolojik örneklerin ön-muamelesi Formalin-fikse ve parafine-gömülü histolojik örneklerin önmuamelesi TARAMA PROTOKOLÜ DNA ekstraksiyonu DNA amplifikasyonu TST gen amplifikasyonu HPV DNA Direk amplifikasyonu (1. amplifikasyon) Amplifikasyon ürünlerinin görüntülenmesi Page 1

4 Agaroz jel elektroforezi Örnek yükleme Sonuçların yorumlanması: TST gen amplifikasyonu ve HPV DNA nın 1. amplifikasyonu HPV DNA nın nested amplifikasyonu (2. amplifikasyon) amplifikasyon sonuçlarının yorumlanması TİPLENDİRME PROTOKÖLÜ Restriksiyon enzimleriyle sindirim ile Tiplendirme (RLFP) Amplifikasyon ürünlerinin görüntülenmesi Yüksek çözünürlükte agaroz jel elektroforezi (HR) Tiplendirme sonuçlarının yorumlanması SORUN GİDERME TEST LİMİTLERİ TEST PERFORMANSI Özgünlük Duyarlılık REFERANSLAR İLGİLİ ÜRÜNLER Page 2

5 1. ÜRÜN BİLGİSİ Bu kullanıcı kılavuzu aşağıdaki ürünleri içerir: HPV-HS (kod 03-28A) Human Papillomavirus genotiplerinin belirlenmesi için kit. Kit DNA amplifikasyonu ve agaroz jel elektroforezi ile görüntüleme için rekatifler içerir. Kod Ürün Pkg 03-28A-25 HPV-HS 25 test 03-28A-50 HPV-HS 50 test HPV-HS BIO amplifikasyon reaktifleri (kod 03-28R) Human Papillomavirus genotiplerinin belirlenmesi için kit. Kit DNA amplifikasyonu için reaktifler içerir. Kod Ürün Pkg 03-28R-25 HPV-HS amplifikasyon reaktifleri 25 test 03-28R-50 HPV-HS amplifikasyon reaktifleri 50 test Page 3

6 2. KİT İÇERİĞİ NOT: Kit içeriğinde farklı kodlarda (A ve R) farklı komponentler bulunur. (kısaltma: X= kit içeriğinde bulunan komponent; 0= kit içeriğinde bulunmayan komponent) KUTU P 20 C DE SAKLANIR kod 03-28A kod 03-28R AÇIKLAMA ETİKET TÜP (T) YA DA KAPAK RENGİ 25 test 50 test X X X X X X X X Tek-doz premiks Direk HPV amplifikasyonu için Tek-doz premiks TST amplifikasyonu için Tek-doz premiks HPV nested amplifikasyon için Thermostabil Taq DNA polymerase AB Taq 5 U/μL Renksiz (T) Mavi (T) Sarı (T) Kırmızı 1 X 100 μl 1 X 200 μl X X Restriksiyon enzim A Enzim A Yeşil 1 X 15 μl 1 X 27,5 μl X X Restriksiyon enzim B Enzim B Mor 1 X 15 μl 1 X 27,5 μl KÜÇÜK ÇANTA 20 C DE SAKLANIR kod 03-28A kod 03-28R AÇIKLAMA ETİKET TÜP (T) YA DA KAPAK RENGİ 25 test 50 test X X HPV 16 genom parçası İçeren plazmid DNA HPV 16 Pozitif kontrol Mavi 1 X 30 μl 1 X 50 μl X X HPV 31 genom parçası İçeren plazmid DNA HPV 31 Pozitif kontrol Mavi 1 X 30 μl 1 X 50 μl X X HPV 6 genom parçası İçeren plazmid DNA HPV 6 Pozitif kontrol Mavi 1 X 30 μl 1 X 50 μl Page 4

7 KUTU F +2 / +8 C DE SAKLANIR kod 03-28A kod 03-28R AÇIKLAMA ETİKET TÜP (T) YA DA KAPAK RENGİ 25 test 50 test X 0 Elektroforez yükleme buffer 6 X Blue Mavi 1 X 375 μl 1 X 750 μl X 0 Ethidium Bromide solusyonu (2,5 mg/ml) Ethidium Bromide TOKSİK R S 36/37 45 Kırmızı 1 X 250 μl 1 X 470 μl X 0 DNA Moleküler Ağırlık Markır MW Markır Sarı 1 X 300 μl 1 X 700 μl KUTU A +15 / +25 C DE SAKLANIR kod 03-28A kod 03-28R AÇIKLAMA ETİKET TÜP (T) YA DA KAPAK RENGİ 25 test 50 test X 0 Moleküler biyoloji için agaroz AGAROZ 1 X 14g 1 X 30g X 0 X 0 Yüksek rezolusyon elektroforez için Agaroz Elektroforez buffer TRIS-Acetate-EDTA, ph 8 HR AGAROZ 1 X 20g 1 X 38g 50X TAE 1 X 100 ml 1 X 200 ml Page 5

8 3. REAKTİFLERİ SAKLAMA KOŞULLARI Kitin herbir komponenti, tekli kutuların etiketlerinde belirtilen talimatlara gore saklanmalıdır. Özellikle: KUTU P Küçük çanta KUTU F KUTU A -20 C de saklanır -20 C de saklanır +2 / +8 C DE SAKLANIR +15 / +25 C DE SAKLANIR Önerilen sıcaklıkta saklandığında, tüm test reaktifleri son kullanım tarihine kadar stabil kalır. 4. KULLANIM İÇİN ÖNLEMLER Kit; moleküler biyoloji tekniklerini diagnostikte uygulama eğitimi almış ve tecrübesi olan araştırmacı tarafından kullanılmalıdır; Kit prosedürüne başlamadan önce kullanım kılavuzunu dikkatlice ve tamamen okuyun; Ürünleri ısı kaynağından uzakta tutun; Son kullanım tarihi geçmiş kitparçalarını kullanmayın; Saklama koşulları, kutu bütünlüğü ya da metod uygulaması ile ilgili herhangi bir şüpheniz olduğunda, AB ANALITICA teknik destek ile bağlantı kurun: laboratorio@abanalitica.it; Nükleik asitlerin amlifikasyonunda, araştırmacı aşağıdaki özel önlemleri almalıdır: Filtreli uç kullanın; Biyolojik örnekler, ekstrakte edilmiş DNA, kit içeriğindeki referans DNA ve tüm amplifikasyon ürünleri, amplifikasyon reaktiflerinden farklı bir yerde saklanmalıdır. PCR öncesi ve sonrası için farklı alanlar hazırlayın ve iki alan arasında materyal (pipetler, uçlar, tüpler, vs.) paylaşımı yapmayın. Page 6

9 Sık sık eldiven değiştirin. Benç yüzeyini %5 sodyum hipoklorit ile temizleyin. Kullanmadan once PCR premiksi oda ısısında eritin; Taq DNA polymerase ekleyin ve oda ısısında ya da buz kabında oldukça hızlı DNA purifiye edin. Yukarıdaki önelmelerin aynısı restriksiyon reaksiyonu hazırlama içinde geçerlidir. 5. GÜVENLİK KURALLARI 5.1. Genel Güvenlik Kuralları Reaktifler ve klinik örnekler ile çalışırken tek kullanımlık eldiven kullanın ve çalışma bitiminde ellerinizi yıkayın. Ağızla pipetleme yapmayın. Bilinen hiçbir diagnostik metod enfektif ajalnların yok olduğunu garanti etmez. Tüm klinik örnekleri potansiyel enfeksiyonu ajanı olarak kabul edip o şekilde kullanmak gerekir; Klinik örnekler ile direk temasta olan cihazların kontaminasyonlu olduğu ve bu şekilde kullanılması gerektiği göz önüne alınmalıdır. Örneklerin kazara etrafa dökülmesi durumunda, %10 Sodyum Hipoklorit ile temizleyin. Temizlenmiş materyaller, kontamine ürünler için olan özel konteynerlere atılmalıdır. Klinik örnekler, materyaller ve kontamine ürünler aşağıdaki dekontaminasyondan sonra atılmalıdır: 30 dakika %5 Sodyum Hipoklorit (1 volüm %5 Sodyum Hipoklorit solusyonu herbir 10 volüm kontaminasyonlu sıvı için) solusyonuna batırılmalı YA DA en az 2 saat 121 C de otoklavlanmalı (NOT: Sodyum Hipoklorit içeren solusyonları otoklavlamayın!!) Page 7

10 5.2. Kit Hakkında Güvenlik Kuralları Bu kit kullanımı için riskler tekli komponentler ile ilişkilidir: Tehlikeli Komponentler: ETHIDIUM BROMIDE (03-28A kit içinde bulunur) 3,8-diamino-1-ethyl-6-phenylphenantridiumbromide <2% Risk tanımı: T (Toksik) RİSK İBARESİ VE S İBARESİ R 23 ve R 68 S 36/37 45 İnhalasyon için toksik. Geri dönülmez etkiler riski. Laboratuar giysisi ve tek kullanımlık eldiven kullanın. Kaza veya rahatsızlık durumlarında, doktora başvurun ve paket etiketini gösterin. R ve S ibareleri kit ile sağlanan konsantre ürünlere işaret etmektedir. Özellikle Ethidium Bromide için, agaroz jelde dilusyona kadar. Konsantre Ethidium Bromide uygulamasında kimyasal dağıtıcı buharlı kabin kullanın. Seyreltilmiş Ethidium solusyonu ile çalışırken daima laboratuar giysisi ve tek kullanımlık eldiven giyin. Bu ürünler genel çöplere atılamaz. Kurutucu sistem kullanılmamalıdır. Atılım için yasal kuralları takip edin. Ethidium Bromide kaza ile dökülmesi durumunda Sodyum Hipoklorit ve su ile temizleyin. İstenildiğinde ürünlerin Materyal Güvenlik Data Sheetleri gönderilebilir. Page 8

11 6. KİT İÇERİĞİNDE BULUNMAYAN GEREKLİ MATERYALLER 6.1. Reaktifler DNA ekstraksiyonu için reaktifler; Steril DNase ve RNase free su; Distile su; Agaroz jel elektroforezi için reaktifler (sadece 03-23R kiti için gerekli) 6.2. Cihazlar Laminar flow kabini (kontaminasyondan korunmak için amplifikasyon premikse TAQ polymerase eklenirken kullanılması önerilir; ekstrakte DNA eklenirken başka bir laminar flow kabini kullanılması önerilebilir); Mikropipetler (aralık: 0,2-2 µl; 0,5-10 µl; 2-20 µl; µl; µl); Thermalcycler; Mikrosantrifüj (max rpm); Tartı; Manyetik ısıtıcı ya da mikrodalga; Kimyasal kabin (Ethidium Bromide uygulamasında kullanılması önerilir); Agaroz minijel için yatay elektroforez haznesi; Güç kaynağı ( V); UV Transilluminator; Foto kamera ya da imaj analizör Materyaller Tek kullanımlık eldivenler; Tek kullanımlık filtreli uçlar (aralık: 0,2-2 µl; 0,5-10 µl; 2-20 µl; µl; µl); TAE dilusyonu için dereceli silindirler (1L); Agaroz jel hazırlamak için pyrex şişe ya da Becker; Parafilm. Her bir reaksiyon için ml küçük mikro test tüpleri. Page 9

12 7. REAKTİFLERİ HAZIRLAMA 1 L TAE Buffer (1X) hazırlamak için: 20 ml 50X TAE (sadece kod A içinde bulunur) ile 980 ml distile suyu karıştırın. Page 10

13 8. GİRİŞ Human Papillomavirus (HPV) özellikle bölge-spesifiktir: Host hücrelerinin farklılaşmasının derecesi ile ilişkili aktiviteye sahip geçirgen hücreler içinde viral partiküllerin sentezi ve üretimine neden olan çok katmanlı skuamoz epitelyumi enfekte eder. HPV partikülleri sirküler, çift-iplikli DNA ve farklı HPV tiplerinde farklı olabilen yapısal proteinler içerir: En çok görülen protein L1 (kapsid yapısal protein) dir. Ayrıca, virus replikasyon siklusunun ilk fazında eksprese olan E (erken ve prekosiyöz) isimli proteinler vardır. E1 ve E2 proteinleri viral replikasyonun başlangıcında çalışır ve viral genomun transkripsiyonunu düzenlerken, E5, E6 ve E7 gibi diğer proteinler enfekte hücrelerin proliferasyon ve neoplastik transformasyonuna neden olarak HPV onkojenik gücünden sorumludurlar (Stoler M.H., 1997). Şimdiye kadar 100 farklı HPV tipi tanımlanmıştır; bunların arasından 35 den fazlası ano-genital bölgeyi (kondilomlar) enfekte eder ve yaklışık 20 si genital karsinoma ile ilişkilidir. HPV dizisi varlığı skuamoz hücreli invaziv servikal karsinomaların %90 dan fazlasında, kondilomlarda ve sıklıkla intraepitelyum servikal karsinomalarda tanımlanmıştır (Broker TR ve ark., 1986). Patoloji temelinde (selim ya da malignan) en sık ilişkili olduğu HPV tipleri düşük, orta ve yüksek malignan riskte ayırt edilebilir. HPV 6, 11, 34, 40, 42, 43, 44, 53, 54, 70 ve 74 onkojenik düşük risk, genotip 16, 18, 31, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 ve 68 onkojenik yüksek risk olarak tanımlanır (Zur Hausen H., 1996). Avrupada servikal kanser HPV tip 16 ile %50 den fazla, HPV tip 18 ile %10-15, HPV tip 31 ile %7-8 ile ilişkili iken, kalan %20 si daha az genel tipler ile ilişkilidir. Servikal kanserin erken tanısı için temel metod, daima HPV tiplendirmesine de izin veren sito-histolojik tanının duyarlılık ve özgünlüğünü artırmaya yardımcı moleküler biyolojik testler ile ilişkili olan Pap Testtir. Dahası, devamlı ASCUSlu (Atipik Skuamoz Hücre Belirsiz Anlam) ya da düşük derece lezyonlu hastalarda direk moleküler biyoloji testleri ile viral DNA varlığının belirlenmesi gereklidir. Bu bayanlarda yüksek onkojenik risk ile bir viral alttipin varlığı ya da yokluğunun tanımlanma olasılığı ya olası hastalık ya da spontane duraksamanın belirtisi olabilir. HPV in vitro kültür için iyi bir teknik olmadığından (Beutner KR, 1997) HPV enfeksiyonu için tanı DNA amplifikasyonu ile viral dizilerin araştırılmasına dayanır. Page 11

14 9. TEST PRENSİBİ PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) literatürlerde ilk DNA amplifikasyonu metodudur. (Saiki RK ve arkadaşları, 1985). Thermostable DNA polymerase ile DNA nın spesifik bir parçasının (hedef dizi) in vitro amplifikasyon reaksiyonu olarak tanımlanabilir. Reaksiyonda nükleik asitin üç segmenti yer alır: Amplifiye olması için çift iplikli DNA kalıbı (hedef DNA) ve iki tek iplikli oligonükleotid primerler kalıp DNA ya spesifik olarak dizayn edilmiştir. DNA polymerase primerler tarafından işaretlenen bölgeden sentez işlemine başlar ve solusyonda serbest olarak bulunan tamamlayıcı nükleotidlerin (dntpler) eklenmesi ve bağlanması ile orjinal çift iplikli hedef DNA bölgesi ile aynı olan yeni çift iplikli DNA molekülünü sentezler. Çeşitli sikluslardan sonra, hedef diziye uygun olan milyonlarca DNA molekülü oluşturabilir. Bu testin duyarlılığı, laboratuar tanısında uygulamaya olanak sağlar. Amplifikasyon reaksiyonunun geniş biyolojik örneklerde uygulanabilmesinin yanında, PCRın oldukça küçük DNA segmentlerini de amplifiye edebilmesinden başlangıç DNAsı kısmi olarak yıkılabilir. 10. ÜRÜN TANIMI HPV genotipleri ile ilişkili farklı onkojenik özellikler, yüksek duyarlı virus varlığı ile HPV tiplerini belirleyebilen ve yüksek ve düşük risk HPV tanımlayabilen diagnostik test gerektirir. Bu kitin tarama stratejisi viral genomun L1 bölgesinde amplifikasyonu öngörür. L1 bölgesi HPV genomu içinde kısmen korunmuştur ve farklı viral genotiplerin dejenere primer çiftlerini kullanarak belirlemeye izin verir (Karlsen F. et al., 1996). Nested amplifikasyon taramanın duyarlılık ve etkisini artırır ve biyoptik formalin fikse ve parafine gömülü örnekler için uygundur. Bu metodda sitolojik örneklerden (servikal swablar, oral hücreler) ve doku örneklerinden (taze, donmuş ya da formalin-fikse ve parafine gömülü biyopsiler) ekstrakte DNA kullanılabilir ve yaklaşık 32 HPV tipi belirleyebilir. Başarılı olarak amplifikasyon ürünleri restriksiyon enzimleriyle sindirim ile tiplendirilebilir. Bu enzimler bilinen dizinin spesifik pozisyonlarında çift iplikli DNA yı keser. L1 amplifiye dizisi inceleme altında HPV tipleri hakkında çeşitlidir. Sindirim örülen HPV tipini doğru olarak tanımlayan restriksiyon profilini oluşturur. Page 12

15 Bu metod kullanılarak HPV nin aşağıdaki tipleri belirlenebilir: 3, 4, 6, 10, 11, 16, 18, 29, 31, 33, 35, 40, 42, 44, 45, 51, 52, 54, 55, 56, 57, 58, 62, 66, 67, 68, 69, 70, 77, 84, 86 ve 87. Kit, bölge 22q13.1 de TST geni, thiosulfate sulfurtransferase (rhodanese), amplifikasyonu ile amplifiye olan ekstrakte DNA nın uygunluğu değerlendirilebilir. TST gen amplifikasyonunda negatif bir sonuç ya ekstrakte DNA da amplifikasyon rekasiyonunun inbitörlerinin varlığını ya da DNAnın oldukçayıkıldığını gösterir. Bu metod, olası yanlış negatif sonuçları tanımlamakta kullanıcıya yardımcı olur. Ekstra zaman gerektirmez, çünkü TST gen amplifikasyonu HPV ilk amplifikasyonu ile aynı dönemde uygulanır. Kit, amplifikasyon ve HPV DNA 6, 16 ve 31 tiplendirmesi için pozitif kontroller içerir. Bu kontroller kullanıcı için tehlikeli değildir çünkü viral genomun bir parçasını içeren plazmidik DNA dır. Pozitif kontrolün başarılı amplifikasyonu reaksiyonun doğru çalıştığını garanti eder. Pozitif kontrolün sindirimi ile elde edilen restriksiyon profili örnek restriksiyon analizi ve profil yorumlamada referanstır. Bu kit premiks formatındadır: Amplifikasyon için tüm reaktifler pre-mikstir ve Taq polymerase ve ekstrakte DNA eklenebilecek şekilde tekdoz test tüplerinde alikuatlanmıştır. Bu premiks formatı, kullanıcı için zaman kazancı ile amplifikasyon öncesi manipulasyon aşamalarını azaltır; reaktiflerin tekrar tekrar dondurup çözülmesini engeller ve hepsinden öte, bu format kontaminasyon riskini minimize eder, risk yanlış pozitif sonuçlara neden olur. Bu nedenle, daima uygun amplifikasyon kontrollerini kullanmayı önerir. Page 13

16 11. ÖRNEK TOPLAMA, MANİPULASYON VE ÖN- MUAMELESİ Sitolojik örnekler Sitolojik örnekler servikal swab, oral hücreler vs içerir. Örnekler kazıcı ya da steril sito-fırça kullanılarak elde edilir. Toplanan hücreler uygun transport medyumlarında seyreltilir (1XPBS, fizyolojik solusyon ya da diğer medyumlar). Örnek +2 / +8 C de maksimum 48 saat için saklanabilir; sonra nukleik asit ekstraksiyonu ile kullanmak için daha iyidir. Kısa bir zaman içinde örneklerin ekstraksiyonunun yapılması mümkün değilse, örnekler -20 C de saklanmalıdır. %95 ethanol, methanol ve/veya formalinden yapılmış fiksatif medyumlar ve süzülmüş msteryal toplamak için şişe sağlanması (örn. THIN PREP) ile depolanır, üretici tarafından sağlanan saklama koşullarından biri yapılmalıdır. AB ANALITICA, sitolojik örnek toplama için HPV-SCK kit (kod ) kullanılmasını önerir Sitolojik örneklerin ön-muamelesi Örnek selülaritesi düşük olduğunda DNA ekstraksiyonuna başlamadan önce örnekleri tekrar tekrar santrifüjleyerek konsantre yapmak gereklidir. Örnek suspansiyonu için steril PBS kullanılabilir. Eğer görülürse mukus ve kırmızı kan hücrelerinin uzaklaştırılmasında da yararlıdır Histolojik örnekler Histolojik örnekler taze, donmuş, formalin fikse ve parafine gömülü deri biyopsileridir. Taze biyopsiler toplamadan birkaç dakika içinde çalışılmalı veya likit nitrojen ile hızlıca dondurulmalıdır ve sonra enzimatik sindirimi takiben steril kesici kullanarak mekanik kesilmeye kadar -80 C de saklanmalıdır, Proteinaz K ile sindirim ile takip etmelidir. Page 14

17 Taze ya da donmuş histolojik örneklerin ön-muamelesi Taze ya da donmuş histolojik örneklerde (yaklaşık 50 mg a kadar), steril kesici kullanarak dokunun hemen mekanik sindiriminin yapılması önerilir. Bu uygulamayı cam üzerinde yapın ve kesilmiş dokuları bir test tüpüne aktarın. Sonra dokuyu Proteinaz K ile sindirin. Bu durumda histolojik örneklerin formalinde fikse ve parafinde gömülü olmasına göre parafini uzaklaştırmak ile başlayın ve sonra örneğin sindirimi ile devam edin Formalin-fikse ve parafine-gömülü histolojik örneklerin önmuamelesi Fikse ve parafine gömülü biyopsilerde Lilie formülü olarak %10 sodyum ve potasyum tuzları ile ph 7 de formalin buffer kullanmanızı öneririz. Buffer olmayan Bouin, Holland ve diğer asidik fiksatifler (osmik asit gibi) olan formalinde fikse edilmiş dokular sonraki nukleik asit ekstraksiyonu için uygun değildir, çünkü bu maddeler dokuda sindirilemeyen çapraz-bağlar meydana getirirler. Page 15

18 12. TARAMA PROTOKOLÜ DNA ekstraksiyonu DNA ekstraksiyonu tam ve saf DNA elde edebilen herhangi bir metod ile yapılabilir. Bu durumda TST ve HPVamplifikasyonu (10 μl) için paragraf 12.2 de belirtilen ekstraksiyon miktarı AB ANALITICA metodu ile elde edilen ürünler için referanstır. Alternatif ekstraksiyon metodları kullanıldığında, eğer amplifikasyon için DNA solusyon miktarı 10 μl den düşükse su ekleyerek amplifikasyon miks miktarı ayarlanmalıdır DNA AMPLİFİKASYONU TST gen amplifikasyonu Her bir premiks tüpüne (mavi tüpler) ekleyin: AB Taq Ekstrakte DNA 0,5 μl 10 μl HPV DNA sının direk amplifikasonu (1. amplifikasyon) Her bir premiks tüpüne (renksiz tüpler) ekleyin: AB Taq Ekstrakte DNA 0,5 μl 10 μl Analiz etmek için örneklerin yanında daima bir negatif kontrol (mikse DNA yerine su ekleyin) ve 10 µl pozitif kontrol (kit içinde bulunur) amplifiye edilmelidir. Page 16

19 Kısa bir süre santrifüj edin ve test tüplerini (TST ve HPV) aşağıdaki programda thermalcyclera koyun: Taze sitolojik ve histolojik örneklerden ekstrakte DNA için: 1 cycle 95 C 5 min 35 cycles 95 C 56 C 72 C 30 sec 30 sec 60 sec Parafine-gömülü histolojik örneklerden ekstrakte DNA için: 1 cycle 95 C 5 min 40 cycles 95 C 56 C 72 C 60 sec 60 sec 120 sec 1 cycle 72 C 5 min Amplifikasyon fragman uzunluğu: TST: HPV: 202 bp bp Page 17

20 12.3. Amplifikasyon ürünlerinin görüntülenmesi Agaroz jel elektroforezi %2 agaroz jel hazırlayın: 1 g HR Agaroz tartın ve 50 ml 1X TAE içine dökün. Solusyonu berrak oluncaya kadar manyetik ısıtıcı ya da mikrodalga içine bırakın. Jelin soğumasına izin verin (3-5 dakika), sonra 10 μl 2.5 mg/ml Ethidium Bromide solusyonu ekleyin. DİKKAT! Ethidium Bromide güçlü bir mutajenik ajandır: Daima eldiven kullanın ve bu reaktifle ya da içeren jel ile çalışırken tercihen kimyasal güvenlik kabini altında çalışın. Jeli tarakları ile birlikte uygun bir dökme tankına koyun ve oda ısısında soğuyana kadar bekleyin ya da jel katı hale gelene kadar buzdolabına koyun. Jel katılaştığında tarakları dikkatlice alın (jel kuyucuklarına zarar vermemeye dikkat edin) ve trayi elektroforez tankına geçirin. Jeli tamamen kaplayacak şekilde (jel yüzeyinin 1-2mm üzerinde) uygun miktarda 1X TAE buffer dökün. Page 18

21 Örnek yükleme Test tüpünde ya da direk parafilmde aşağıdakileri karıştırın: 2 µl 6X Blue* 10 µl PCR ürünü ya da DNA Moleküler Ağırlık Markır (MW Markır)* Miksi jel kuyucuklarına yükleyin; güç kaynağını açın ve voltajı V a ayarlayın. Çalışma sonunda, jeli UVtransilluminatore koyun ve amplifikasyon ürünlerinin boyutunu referans DNA Moleküler Ağırlık Markır ile karşılaştırarak sonuçları analiz edin. * = 6X Blue ve DNA Moleküler Ağırlık Markır 03-28A kit içinde bulunur; Başka bir yükleme buffer ya da DNA Moleküler Ağırlık Markır kullanıldığında sağlayıcı bilgilerini takip edin. DNA Moleküler Ağırlık Markırı (MW Markır, 03-28A kitinde bulunur): , 404, 331, 242, 190, 147, 111, 110, 67, 34x2, 26 bp. %2 agaroz jelde bp bantlar genellikle tam olarak çözülmez ve tek bir bant olarak görülür; 26 ve 34 bp bantları %2 agaroz jelde bazen görünmek için çok küçük olur (düşük moleküler ağırlıklarından dolayı). NOT: UV ışınları deri ve en önemlisi gözler için tehlikelidir: daima eldiven ve koruyucu gözlük kullanın ya da UV transilluminatorün koruyucu ekranını kullanın. Page 19

22 Sonuçların yorumlanması: TST gen amplifikasyonu ve HPV DNA nın 1. amplifikasyonu Agaroz jel elektroforezinden sonra, kontroller aşağıdaki sonuçları göstermelidir: KONTROL SONUÇ YORUM HPV pozitif kontrol POZİTİF* Amplifikasyon doğru çalışır. Negatif kontrol NEGATİF Kontaminasyon yokluğu (*Dikkat: İlk amplifikasyondan sonra HPV pozitif kontrol görülmeyebilir, çünkü kontaminasyonlardan korumak için kitte seyreltilmiştir). Agaroz jelde DNA bandlarının yorumlanması için aşağıdaki tabloya bakın: SONUÇ SONUÇ YORUM TST band yok Örnek amplifikasyon için uygun değildir (DNA ekstraksiyonunu tekrar edin) TST band HPV band (1. amplifikasyondan sonra) TST band HPV band (1. amplifikasyondan sonra) var yok var var Amplifiye olabilir örnek Doğru örnek negativitesi değeri için ikinci amplifikasyon ile devam edin Amplifiye olabilir örnek HPV pozitif örnek HPV band varlığında ya dayokluğunda nested amplifikasyon ile devam etmenizi öneririz. Gerçekte, düşük sayıda viral genoma sahip örnek olduğunda bunun pozitivitesi sadece nested amplifikasyon ile belirlenebilir. Her durumda, reverse hibridizasyon ile HPV tiplendirmesi için nested amplifikasyon gereklidir. Page 20

23 HPV DNA nested amplifikasyonu (2. amplifikasyon) Her bir premiks tüpüne (yeşil tüpler) ekleyin: AB Taq 0,5 μl 1. amplifikasyon ürünü* 1 μl * * Eğer agaroz jel elektroforezinden sonra direk amplifikasyon ürünü yoğun bir band gösterirse, nested amplifikasyonda bu üründen 0.5 μl kullanmanızı öneririz. HPV direk amplifikasyonunda kullanılan negatif kontrol ve pozitif kontrolü de yeniden amplifiye edin. Gerektiğinde nested amplifikasyonun negatif kontrolünü de yapmak mümkündür (nested mikse ilk amplifikasyon ürünü yerine 1 µl distile su ekleyin). Kısa bir süre santrifüj edin ve test tüplerini aşağıdaki programda thermalcyclera koyun: 1 cycle 95 C 5 min 35 cycles 94 C 45 C 72 C 30 sec 30 sec 30 sec 1 cycle 72 C 5 min Amplifikasyon fragman uzunluğu: bp Amplifikasyon programının sonunda, %3 agaroz jel ile nested amplifikasyon ürünlerini görünür hale getirin. 1,5 g Agaroz tartın ve 50 ml 1X TAE içine dökün. Bilgileri takip edin: paragraf Page 21

24 amplifikasyon ürünlerinin yorumlanması Agaroz jel elektroforezinden sonra, kontroller aşağıdaki sonuçları göstermelidir: KONTROL SONUÇ YORUM HPV pozitif kontrol POZİTİF Hem direk hem nested amplifikasyon doğru çalışır Negatif kontrol NEGATİF Birinci amplifikasyonda kontaminasyon yokluğu Nested amplifikasyonun negatif kontrolü NEGATİF İkinci amplifikasyonda kontaminasyon yokluğu Sonra, band paterninin yorumlanması için aşağıdaki tabloyu izleyin: DNA bandı SONUÇ YORUM HPV DNA band 1. ve 2. amplifikasyonda yokluğu HPV DNA band 2.amplifikasyonda varlığı Örnek HPV negatiftir Örnek HPV pozitiftir Page 22

25 Fig. 2: Nested amplifikasyon ürünlerinin %3 agaroz jel elektroforezi ile görüntülenmesi. Fig. 1: 1. DNA Moleküler Ağırlık Markır 2. HPV pozitif örnek 3. Pozitif kontrol 13. TİPLENDİRME PROTOKOLÜ Restriksiyon enzimiyle sindirim ile tiplendirme (RFLP) Nested amplifikasyondan elde edilen her bir pozitif örneği iki farklı test tüpünde karıştırın: Nested amplifikasyon ürünü 10,0 µl Enzim A 0,5 µl Nested amplifikasyon ürünü 10,0 µl Enzim B 0,5 µl Kısa bir süre santrifüj edin ve 37 C de thermalcyclerda bütün gece inkübe edin. Page 23

26 13.2. Restriksiyon ürünlerinin görüntülenmesi Yüksek çözünürlükte agaroz jel elektroforezi (HR) Restriksiyon bandlarının görüntülenmesi için %4 HR agaroz jel hazırlayın. 2 g HR Agaroz tartın ve 50 ml 1X TAE içine dökün. Bilgileri takip edin: paragraf DİKKAT! Bu jelin hazırlanması daha fazla dikkat ve sabır gerektirir: HR agaroz tartıp, TAE içinde (ön-ısıtmalı değil) homojen bir suspensiyon olana kadar oda ısısında karştırarak çözmek gerekir. Solusyonu berrak oluncaya kadar manyetik ısıtıcı ya da mikrodalga içine bırakın. Eğer solusyon kaynar ve konteynerden taşarsa mikrodalgayı kapatmak ya da solusyonu manyetik ısıtıcıdan almak gerekir; tekrar berrak oluncaya kadar ısıtın. Page 24

27 Tiplendirme sonuçlarıınn yorumlanması: Restriksiyon sonuçlarının yorumlanması için aşağıdaki tabloya bakın (tab. 1). Populasyonda en sık görülen genotipleri gösterir: Tablo 1: En sık bulunun HPV genotipleri HPV Genotip Enzim A İle restriksiyon (bp) Enzim B İle restriksiyon (bp) Sindirilmemiş boyut (bp) HPV 6 30,42, HPV 11 33, HPV 16 30, 43, 70 90, HPV 18 30, 38, 77 37, 50, HPV 31 30, , 15, 39, HPV 33 30, 39, 70 50, HPV 35 30, 42,70 11, 39, HPV 56 18, 30, 40, 51 25, 50, Page 25

28 Metod populasyonda nadiren bulunan HPV genotiplerini de tanımlar ve tiplendirir (tab. 2) Tablo 2: Nadir bulunan HPV genotipleri HPV Genotip Enzim A İle restriksiyon (bp) Enzim B İle restriksiyon (bp) Sindirilmemiş boyut (bp) HPV 3 104, 30 89, 34, HPV , 50, HPV , 30 95, HPV , HPV , HPV , 30 85, 39, HPV , HPV 45 70, 45, 21 58, 50, HPV , 29 55, 50, HPV , 50, HPV , 33 70, 66, HPV 55 58, 57, HPV 56 49, 42, 30, 18 64, 50, HPV HPV 58 89, 38, 12 89, HPV 62 91, 30, HPV , 44, HPV , 30 89, HPV 69 97, 30, 18 80, HPV , 30 95, HPV , HPV , HPV , HPV , 29 88, 39, Page 26

29 NOT: Tarama aşamasında restriksiyon analizi ile bulunan pozitif HPV örnekleri sindirilmemiş ürünler ya da yardımcı enfeksiyonlar ile dahi yorumlanamayan oldukça kompleks restriksiyon paternleri verebilir. Herhangi bir problem ile karşılatığınızda AB ANALITICA teknik destek ile bağlantıya geçin: Fig. 2: Restriksiyon sinidirimi ve %4 HR agaroz jel elektroforezi ile pozitif HPV örnek 1 ve 2 nin tiplendirilmesi 1: DNA Moleküler Ağırlık Markır 2: Enzim A ile 1 örneğinin restriksiyonu 3: Enzim B ile 1 örneğinin restriksiyonu 4: Enzim A ile 2 örneğinin restriksiyonu 5: Enzim B ile 2 örneğinin restriksiyonu 1 örneği HPV-6 pozitiftir 2 örneği HPV-16 pozitiftir Page 27

30 14. SORUN GİDERME Amplifikasyon ürünü ya da pozitif kontrol DNA bandı yoksa TAQ polymerase premikse doğru eklenememiştir - -Uygun volümde pipet ve uçlar kullanın (pipet aralığı 0,2-2 μl); - -Görsel olarak TAQ polymerasın premikse difüze olduğunu gözleyin: Bu basittir, çünkü enzim, yüksek bir densiteye sahip olan gliserolde çözülür; - Alternative olarak, tüp duvarına konulmuş olan TAQ polymerasın görsel olarak teyit edin, sonra kısa bir süre santrifüj edin. Thermalcycler doğru olarak programlanmamıştır - Thermalcycler programının uygunluğunu ve kullanıcı kılavuzundaki sıcaklık profilini kontrol edin. Kit uygun şekilde çalışmaz - Premiks, enzimler ve referans DNAyı -20 C de saklayın; - -Premiks ve reaktifleri tekrar tekrar dondurup/çözdürmekten sakının. Test edilen örneklerde ya TST ya da HPV için amplifikasyon bandı yoktur, fakat Pozitif kontrol için iyi bir band vardır Ekstraksiyon aşaması sırasında olası problemler: - Ekstraksiyon metodunun uygun olduğundan ve tüm bilgileri doğru şekilde takip ettiğinizden emin olun; - Ekstraksiyon kitinin sorun giderme bölümüne başvurun; - Yeni bir örnek ile doğru şekilde tekrar DNA ekstraksiyonu yapın. Amplifikasyon inhibe olmuştur - Başlangıç örneğini distile su ve TE ile seyreltin; - Küçük miktarda klinik örnekten DNA ekstraksiyonunu tekrar edin; Page 28

31 Amplifiye ürünlerin agaroz jelde görüntülenmesinden sonra aspesifik ürün ya da ekstraband görülmesi Thermalcycler sıcaklık değişimlerini çok yavaş yapın - Thermalcycler değişikliklerini uygulayın. Amplifikasyon reaksiyonunun hazırlanması oda ısısında çok uzun zaman alır. - Oda ısısında çalışma zamanınızı hızlandırın; - Buz üzerinde çalışın. Ekstrakte ürünler saflaşmamıştır - Örnekleri iyi saflaştıran bir ekstraksiyon sistemi kullanın. Başlangıç örnekleri yıkılmış DNA içerir - Ekstraksiyon aşamasını başka bir başlangıç klinik örneği kullanarak tekrarlayın; - Örneğin uygun yolla toplanıp saklandığından emin olun. Daha fazla detaylı bilgi için AB ANALITICA teknik destek ile irtibata geçin. laboratorio@abanalitica.it, faks (+39) , ya da tel. (+39) Page 29

32 15. TEST LİMİTLERİ Kit performansı aşağıdaki durumlarda azalır: Klinik örnekler bu analize uygun değildir (doğru saklanmamış histolojik örnekler için nötral formalin fiksatifinden farklı bir fiksatif kullanın). Amplifikasyon reaksiyonunun inhibitörlerinin görülmesi ya da uygun olmayan ekstraksiyon sistemi kullanılması nedeniyle DNA amplifiye olmaz. 16. TEST PERFORMANSI Özgünlük En önemli bilgi bankasındaki primer dizi sıralaması spesifik olmayan dizilerin yokluğunu gösterir ve en az 32 viral genotipin amplifikasyonunu garanti eder. Diğer patojenik mikroorganizmaların genomik DNA ya da nukleik asitleri ile çapraz reaksiyon görülmemiştir Duyarlılık Farklı çalışmalar HPV L1 bölgesinde (amplifiye ürün: bp) viral genomun kopyasına kadar direk amplifikasyonun duyarlılığını gösterir. Sonraki amplifikasyon aşaması (nested amplifikasyon) en az 10 da bir faktör ile metodun duyarlılığını artırır. Bibliyografik bilgiler nested metodu kullanılarak koilositosik lezyonların duyarlılığını direk amplifikasyonda %0 dan nested amplifikasyonda %81.8 e ve CIN I lezyonu için %6.8 den %79.78 e yükselttiğini rapor etmiştir. Ortalama, nested PCR HPV görülmesi belirlemesini %3.4ten %80.7ye artırabilir (Congresso Nazionale Associazione Microbiologi Italiani, Bari June 2001, ABSTRACT G066). Page 30

33 17. REFERANSLAR Beutner KR, Amer J. Med., 102,9-15, 1997 Broker TR, Botcham M, DNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pp.17-36, 1985 Congresso Nazionale Associazione Microbiologi Italiani, Bari giugno 2001, ABSTRACT G066 Consensus Guidelines, Bethesda 2001 Karlsen F, Kalantari M, Jenkins A, et al., J. Clin. Microb., 34, , 1996 Munoz N, Bosch FX, de Sanjosè S et al, N Engl J Med 348, , Saiki RK, S Scharf, F Faloona, KB Mullis, GT Horn, HA Erlich and N Arnheim, Science 230, , 1985 Stoler M H, Pathology Case Reviews 2:1, 8-16, 1997 Page 31

34 18. İLGİLİ ÜRÜNLER HPV-HL (kod 03-31) Yüksek/düşük risk onkojenikler ile ilişkili Human Papillomavirus genotiplerinin belirlenmesi için kit (HPV-HL, kod 03-31). Kod Ürün Pkg 03-31A HPV-HL 25 / 50 test R HPV-HL amplifikasyon reaktifleri 25 / 50 test. HPV-SCK (kod 03-33) Human Papillomavirus belirlemek için örnek toplama kiti. Kod Ürün Pkg 03-33R-10 HPV-SCK 100 test Page 32

35

36 AB ANALITICA srl Via Svizzera PADOVA, (ITALY) Tel Fax info@abanalitica.it