REF A Helicobacter pylori Belirlemek için kit

Transkript

1 KULLANICI KILAVUZU HP REF A Helicobacter pylori Belirlemek için kit

2

3 1. KİT İÇERİĞİ 3 2. REAKTİFLERİ SAKLAMA KOŞULLARI 4 3. KULLANIM İÇİN ÖNLEMLER 4 4. GÜVENLİK KURALLARI Genel güvenlik kuralları Kit hakkında güvenlik kuralları 7 5. KİT İÇERİĞİNDE BULUNMAYAN GEREKLİ MATERYALLER Reaktifler Cihazlar Materyaller 8 6. REAKTİF HAZIRLAMA 9 7. GİRİŞ TEST PRENSİBİ ÜRÜN TANIMI ÖRNEK TOPLAMA, MANİPULASYON VE ÖN-MUAMELESİ Gastrik özsu Histolojik örnekler: taze ya da donmuş biyopsiler Histolojik örnekler: formalin fikse ve parafine gömülü biyopsiler Tükürük ve oral kavite örnekleri DNA EKSTRAKSİYON PROTOKOLÜ DNA Ekstraksiyonu 14 pag 1

4 12. DNA AMPLİFİKASYONU ß-Globin DNA amplifikasyonu Helicobacter pylori (urea+ ve caga+) DNA amplifikasyonu AMPLİFİKASYON ÜRÜNLERİNİN GÖRÜNTÜLENMESİ Agaroz jel elektroforezi Örnek yükleme SONUÇLARIN YORUMLANMASI: SORUN GİDERME TEST LİMİTLERİ TEST PERFORMANSI Özgünlük Duyarlılık BİBLİYOGRAFİK REFERANSLAR SİPARİŞ İÇİN BİLGİLER İlgili ürünler 24 pag 2

5 1. KİT İÇERİĞİ BKUTU P -20 C DE SAKLANIR AÇIKLAMA HP urea+ ve caga+ genlerinin multipleks amplifikasyonu için tekdoz premiks tüpleri ETİKET TÜP (T) RENGİ YA DA KAPAK 25 test 50 test 8 test Sarı (T) BG tekdoz premiks tüpleri Mavi (T) Hot start thermostabil Taq DNA polymerase AB SuperTAQ 5 U/μL Kırmızı 1 x 50 μl 1 x 90 μl 1 x 18 μl KÜÇÜK ÇANTA HP caga+ gen parçası içeren Plazmid DNA HP urea+ gen parçası içeren Plazmid DNA HP pozitif kontrol caga+ HP pozitif kontrol urea+ -20 C DE SAKLANIR Mavi 1 x 15 μl 1 x 25 μl 1 x 5 μl Mavi 1 x 15 μl 1 x 25 μl 1 x 5 μl KUTU F +2 / +8 C DE SAKLANIR Elektroforez için yükleme buffer 6X Mavi Mavi 1 x 300 μl 1 x 500 μl 1 x 100 μl Ethidium Bromide solusyonu (2,5 mg/ml) Ethidium Bromide toksik R S 36/37 45 Kırmızı 1 x 190 μl 1 x 330 μl 1 x 100 μl DNA Moleküler Ağırlık Markır MW Markır Sarı 1 x 250 μl 1 x 500 μl 1 x 90 μl KUTU A +15 / +25 C DE SAKLANIR Agarose Molecular Biology grade AGAROZ 1 x 21 g 1 x 42 g 1 x 8 g Elektroforez buffer TRIS-Acetate-EDTA, ph 8,00 50X TAE 1 x 75 ml 1 x 150 ml 1 x 25 ml pag 3

6 2. REAKTİFLERİ SAKLAMA KOŞULLARI Kitin herbir komponenti, tekli kutuların etiketlerinde belirtilen talimatlara gore saklanmalıdır. Özellikle: KUTU P Küçük çanta KUTU F KUTU A -20 C de saklanır -20 C de saklanır +2 / +8 C de saklanır +15 / +25 C de saklanır Önerilen sıcaklıkta saklandığında, tüm test reaktifleri son kullanım tarihine kadar stabil kalır. 3. KULLANIM İÇİN ÖNLEMLER Kit; moleküler biyoloji tekniklerini diagnostikte uygulama eğitimi almış ve tecrübesi olan araştırmacı tarafından kullanılmalıdır; Kit prosedürüne başlamadan önce kullanım kılavuzunu dikkatlice ve tamamen okuyun; Ürünleri ısı kaynağından uzakta tutun; Son kullanım tarihi geçmiş kit parçalarını kullanmayın; Saklama koşulları, kutu bütünlüğü ya da metod uygulaması ile ilgili herhangi bir şüpheniz olduğunda, AB ANALITICA teknik destek ile bağlantı kurun: laboratorio@abanalitica.it. Nükleik asitlerin amlifikasyonunda, araştırmacı aşağıdaki özel önlemleri almalıdır: Filtreli uç kullanın; Biyolojik örnekler, ekstrakte edilmiş DNA, kit içeriğindeki pozitif kontrol ve tüm amplifikasyon ürünleri, amplifikasyon reaktiflerinden farklı bir yerde saklanmalıdır. pag 4

7 PCR öncesi ve sonrası için farklı alanlar hazırlayın ve iki alan arasında materyal (pipetler, uçlar, tüpler, vs.) paylaşımı yapmayın. Sık sık eldiven değiştirin. Benç yüzeyini %5 sodyum hipoklorit ile temizleyin. Kullanmadan once PCR premiksi oda ısısında eritin; Taq DNA polymerase ekleyin ve oda ısısında ya da buz kabında oldukça hızlı DNA purifiye edin. 4. GÜVENLİK KURALLARI 4.1. Genel Güvenlik Kuralları Reaktifler ve klinik örnekler ile çalışırken tek kullanımlık eldiven kullanın ve çalışma bitiminde ellerinizi yıkayın. Ağızla pipetleme yapmayın. Bilinen hiçbir diagnostik metod enfeksiyon ajanlarının yokolduğunun garantisini vermediğinden, herbir klinik örneğin potansiyel enfeksiyonlu olduğu göz önünde bulundurulup, bu şekilde çalışılması gereklidir. Klinik örnekler ile direk temasta olan cihazların kontaminasyonlu olduğu ve bu şekilde kullanılması gerektiği göz önüne alınmalıdır. Örneklerin kazara etrafa dökülmesi durumunda, %10 Sodyum Hipoklorit ile temizleyin. Temizlenmiş materyaller, kontamine ürünler için olan özel konteynerlere atılmalıdır. Klinik örnekler, materyaller ve kontamine ürünler aşağıdaki dekontaminasyondan sonra atılmalıdır: YA DA 30 dakika %5 Sodyum Hipoklorit (1 volüm %5 Sodyum Hipoklorit solusyonu herbir 10 volüm kontaminasyonlu sıvı için) solusyonuna batırılmalı en az 2 saat 121 C de otoklavlanmalı (NOT: Sodyum Hipoklorit içeren solusyonları otoklavlamayın!!) pag 5

8 pag 6

9 4.2. Kit Hakkında Güvenlik Kuralları Bu kit kullanımı için riskler tekli komponentler ile ilişkilidir: Tehlikeli Komponentler: ETHIDIUM BROMIDE 3,8-diamino-1-ethyl-6-phenylphenantridiumbromide <2% Risk tanımı: T (Toksik) RİSK İBARESİ VE S İBARESİ R 23 ve R 68 S 36/37 45 İnhalasyon için toksik. Geri dönülmez etkiler riski. Laboratuar giysisi ve tek kullanımlık eldiven kullanın. Kaza veya rahatsızlık durumlarında, doktora başvurun ve paket etiketini gösterin. R ve S ibareleri kit ile sağlanan konsantre ürünlere işaret etmektedir. Özellikle Ethidium Bromide için, agaroz jelde dilusyona kadar. Konsantre Ethidium Bromide uygulamasında kimyasal dağıtıcı buharlı kabin kullanın. Seyreltilmiş Ethidium solusyonu ile çalışırken daima laboratuar giysisi ve tek kullanımlık eldiven giyin. Bu ürünler genel çöplere atılamaz. Kurutucu system kullanılmamalıdır. Atılım için yasal kuralları uygulayın. Ethidium Bromide kaza ile dökülmesi durumunda Sodyum Hipoklorit ve su ile temizleyin. İstenildiğinde ürünlerin Güvenlik data sheet (MSDS) gönderilebilir. pag 7

10 5. KİT İÇERİĞİNDE BULUNMAYAN GEREKLİ MATERYALLER 5.1. Reaktifler Steril DNase ve RNase free su; Distile su; 5.2. Cihazlar Laminar flow kabini (kontaminasyondan korunmak için amplifikasyon premikse TAQ polymerase eklenirken kullanılması önerilir; ekstrakte DNa eklenirken başka bir laminar flow kabini kullanılması önerilebilir); Mikropipetler (aralık: 0,2-2 µl; 0,5-10 µl; 2-20 µl); Thermalcycler; Tartı; Manyetik ısıtıcı ya da mikrodalga; Mikrosantrifüj (max rpm); Kimyasal kabin (Ethidium Bromide uygulamasında kullanılması önerilir); Agaroz minijel için yatay elektroforez haznesi; Güç kaynağı ( V); UV Transilluminator; Foto kamera ya da imaj analizör Materyaller Tek kullanımlık eldivenler; Tek kullanımlık filtreli uçlar (aralık: 0,2-2 µl; 0,5-10 µl; 2-20 µl); Graduated cilinders (1L) for TAE diluition; Agaroz jel hazırlamak için pyrex şişe ya da Becker; Parafilm. Restriksiyon için steril 0.2 ya da 0.5 ml mikrotüpler pag 8

11 6. REAKTİF HAZIRLAMA 1 L TAE Buffer (1X) hazırlamak için: 20 ml 50X TAE ile 980 ml distile suyu karıştırın. pag 9

12 7. GİRİŞ Helicobacter pylori (HP) ilk kez 1983 de izole edilmiştir. Gastric mukoz tabakada ya da midenin epitelyal çizgisine yapışık bulunan bir gram negatif spiral-şekilli bakteriumdur. Kronik gastrit ve peptik ülserin, atropik gastrit, gastrik kanser ve MALT lenfomada gelişen hastalıkların büyük etiyolojik ajanı olduğu göz önüne alınmalıdır (M. Kilmartin, 2002). Yaklaşık dünya populasyonunun ½-1/3 ü H. Pylori ile enfektedir ve tüm çalışmalar yaşla insidansın arttığına ve gelişmiş ülkelerde yüksek sıklıkta olduğuna katılmaktadır. Gerçekte gastroenterolojik patolojiler ve H.pylori ile enfekte kişilerin sayısı arasında direk bir korelasyon yoktur. Bu tutarsızlık insan populasyonları, çevresel faktörler, yaşam biçimleri ve farklı H.pylori soyları arasındaki genetik farklılıklara bağlıdır (Konturek, 2001; Chrisholm, 2001). Gastrik seviyede ana hasarlı olay, hostun gastrik epitelyumunda hücresel büyümede çeşitli değişikliklere ve enflamasyona neden olan nötrofil ve makrofajların aktivasyonuna sebep olan caga geni ile ilişkili protein damarlanmasının bir ürünüdür. Helicobacter pylori, yemeklere ve uyarılmış peptidlere karşı gastrin üretimini artırarak ve inhibitör stimulusun etkisini harekete geçirerek gastrik asit sekresyonunda rol oynar. Bu mekanizmalar, enfekte hedefte gastrik peptik ve duodenal ülsere yol açarak mukoza hasarına neden olur. HP bakterisi mide asitlerinde yaşamını sürdürebilir ve üreyebilir, çünkü üreyibikarbonat ve amonyuma dönüştüren üreaz isimli enzimi salgılar. Bu bakteriyi midede asitlerden koruyan bir nötralize çevre bulutu yaratır. Günümüz çalışmaları dental plağın Helicobacter pylori enfeksiyonunun kaynağı olabileceğini bulmuştur. Mide yanında, Helicobacter pylori gastrik mukozayı enfekte edebilecek oral kavite kolonizasyonu yapabilir. Diğer belirtiler göstermiştir ki; H.pylori oral kavitede ülserasyon gelişiminde bulunabilir. Bu hastalarda, H.pylori aftöz ülserasyonlar, dil, tükrük ve dental plaktan örneklerde bulunur. (Birek, 1999; Shankaran, 1995; Masood Siddiq, 2004; Berroteran, 2002; Siddiq, 2004). H. pylori enfeksiyonu tanımlamak için çeşitli metodlar vardır, hem invasiv (özofagogastroduodenoskopi, gastrik biyopsi, histoloji, kültürde hızlı üreaz testi) hem de invaziv olmayan (seroloji, 13C-üre nefes testi, PCR). PCR tekniği en duyarlı ve bu bakterinin tanısı için en hızlısıdır. pag 10

13 8. TEST PRENSİBİ PCR metodu (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) literatürde DNA amplifikasyonu için tanımlanan ilk metoddur (Saiki RK ve arkadaşları, 1985). Thermostable DNA polymerase ile DNA nın spesifik bir parçasının (hedef dizi) in vitro amplifikasyon reaksiyonu olarak tanımlanabilir. Reaksiyonda üç nükleik asit segmenti bulunur: Amplifiye olması için çift iplikli DNA kalıbı (hedef DNA) ve iki tek iplikli oligonükleotid primerler kalıp DNA ya spesifik olarak dizayn edilmiştir. DNA polymerase primerler tarafından işaretlenen bölgeden sentez işlemine başlar ve solusyonda serbest olarak bulunan tamamlayıcı nükleotidlerin (dntpler) eklenmesi ve bağlanması ile orjinal çift iplikli hedef DNA bölgesi ile aynı olan yeni çift iplikli DNA molekülünü sentezler. Çeşitli sikluslardan sonra, hedef diziye uygun olan milyonlarca DNA molekülü oluşturabilir. Bu testin duyarlılığı, laboratuar tanısında uygulamaya olanak sağlar. Amplifikasyon reaksiyonunun geniş biyolojik örneklerde uygulanabilmesinin yanında, PCRın oldukça küçük DNA segmentlerini de amplifiye edebilmesinden başlangıç DNAsı kısmi olarak yıkılabilir. pag 11

14 9. ÜRÜN TANIMI Bu kitin metodu, H.pylori genomunun cag A ve urease A genlerinde multipleks amplifikasyondan oluşur. Multipleks amplifikasyon cag A + ve urease A + soylarının aynı tüpünde belirleme sağlar. Farklı amplifikasyon fragman boyutu agaroz jel elektroforezi ile onların arasındaki farkı sağlar. HPenfeksiyonu belirlemesi, gastrik biyopsi, gastrik özsu, tükürük, oral kaviteden örnekler (dil, yanak, dental plak) gibi farklı klinik örneklerden başlayabilir. Bu metod, β-globin geni (amplifikasyonun internal kontrolü) amplifikasyonu ile amplifikasyon için ekstrakte DNAnın uygunluğunu da değerlendirmeyi sağlar. β-globin gen amplifikasyonunda negatif bir sonuç ya ekstrakte DNAda amplifikasyon reaksiyonunun inhibitörlerinin görüldüğünü ya da DNAnın oldukça yıkıldığını işaret eder. Bu metod, olası yanlış negatif sonuçları tanımlamakta kullanıcıya yardımcı olur. Kit, cag A + ve urea +amplifikasyonunun pozitif kontrolünü de sağlar. Pozitif kontrol amplifikasyonu başarılı ise bu rekasiyonun doğru çalıştığını garanti eder. Bu kontroller kullanıcı için tehlikeli değildir, çünkü HP genomunun sadece bir parçasını içeren plazmid DNAdırlar. Bu kit premiks formatındadır: Amplifikasyon için tüm reaktifler pre-mikstir ve Taq polymerase ve ekstrakte DNA eklenebilecek şekilde tekdoz test tüplerinde alikuatlanmıştır. Bu premiks formatı, kullanıcı için zaman kazancı ile amplifikasyon öncesi manipulasyon aşamalarını azaltır; reaktiflerin tekrar tekrar dondurup çözülmesini engeller ve hepsinden öte, bu format kontaminasyon riskini minimize eder, risk yanlış pozitif sonuçlara neden olur. Yine de, daima uygun amplifikasyon kontrollerinin kullanılmasını öneririz. pag 12

15 10. ÖRNEK TOPLAMA, MANİPULASYON VE ÖN- MUAMELESİ Gastrik özsu 3-5 ml gastrik özsu toplayın ve örnek ph 7 ye ulaşana kadar NaOH (1M) solusyon ekleyin, sonra 4.000rpmde 15 dakika santrifüj edin. Supernatantı atın ve pelleti tutun, ekstraksiyon protokolünün önerdiği bir bufferda suspense edin Histolojik örnekler: taze ya da donmuş biyopsiler Histolojik örnekler taze, donmuş ya da formalin fiske ve parafine gömülü biyopsilerdir. Biyopsi örneği toplanması rutin olarak yapılmalıdır. Taze biyopsi birkaç dakika içinde hemen çalışılabilir ya da likit nitrojende batırılarak hızlıca dondurulabilir. Enzimatik sindirim ile takiben steril kesici kullanılarak mekanik sindirime kadar -80 C de saklanabilir. Taze ya da donmuş histolojik örneklerde (yaklaşık 50 mg a kadar), steril kesici kullanarak dokunun hemen mekanik sindiriminin yapılması önerilir. Bu operasyonu cam slayt üzerinde yapın ve 1XPBS buffer alikuatı ekleyin. Sonra Pasteur pipeti kullanarak doğranmış dokuyu tüpe aktarın ve örnek sindirimi ile devam edin Histolojik örnekler: formalin fikse ve parafine gömülü biyopsiler Fikse ve parafine gömülü biyopsilerde Lilie formülü olarak %10 sodyum ve potasyum tuzları ile ph 7 de formalin buffer kullanmanızı öneririz. Buffer olmayan Bouin, Holland ve diğer asidik fiksatifler (osmik asit gibi) olan formalinde fikse edilmiş dokular sonraki nukleik asit ekstraksiyonu için uygun değildir, çünkü bu maddeler dokuda sindirilemeyen çapraz-bağlar meydana getirirler. Bu durumda, histolojik örnek fikse edilir ve parafine gömülür, ilk olarak parafin uzaklaştırılır ve enzimatik sindirim yapılır. pag 13

16 10.4. Tükürük ve oral kavite örnekleri Bu tür biyolojik örnekler için, örnek toplama genel sterilite önlemleri takip edilerek rutin olarak yapılmalıdır. Örnekler, transport buffer eklenerek steril kutularda taşınmalıdır. Taze örnekler birkaç dakika içinde hemen çalışılmalı ya da birkaç gün -2 C/- 8 C de saklanmalıdır. Örnekler -20 C de dondurulabilir. Tükürük örneği ( μl) 1 ml steril bidistile su ile seyreltilir; sonra rpm de 15 dakika santrifüj edilir ve supernatant elimine edilir. Pellet kullanılan ekstraksiyon metoduna uygun bir buffer ile suspense edilir. 11. DNA EKSTRAKSİYON PROTOKOLÜ DNA ekstraksiyonu Gastrik özsu, histolojik taze ya da donmuş örneklerden DNA ekstraksiyonu için AB ANALITICA, CLEAN DNA kit (AB ANALITICA, kod ), HP kiti ile standardize edilmiş, kullanmanızı önerir. Bu metod, analiz için klinik örneklerin sindirimini sağlayan proteinase K kullanılmasını gerektirir. Tükürük ve oral kavite örneklerinden DNA ekstraksiyonu için AB ANALITICA VIRAL DNA kiti (AB ANALITICA, kod ), HP kiti ile standardize edilmiş, kullanmanızı önerir. Saf DNA sağlayan başka bir ekstraksiyon metodu da kullanabilirsiniz. Bu durumda, β-globin (20 μl) ve Helicobacter pylori (5 μl) amplifikasyonu için paragraf ve de belirtilen ekstrakt miktarı AB ANALITICA metodu ile elde edilen ekstrakta referanstır. Dokudan ekstrakte DNA için en az 200 ng DNA amplifiye edilmesi önerilir. pag 14

17 12. DNA AMPLİFİKASYONU ß-Globin DNA amplifikasyonu Her bir premiks tüpüne (mavi tüpler) ekleyin: AB Taq Ekstrakte DNA 0,2 μl 20 μl Analiz etmek için örneklerin yanında daima bir negatif kontrol (mikse DNA yerine su ekleyin) ve bir pozitif kontrol (bir genomik DNA) amplifiye edilmelidir Helicobacter pylori (urea+ ve caga+) DNA amplifikasyonu Her bir sarı premiks tüpüne ekleyin: AB Taq Ekstrakte DNA 0,2 μl 5 μl Analiz etmek için örneklerin yanında daima bir negatif kontrol (mikse DNA yerine su ekleyin) ve bir pozitif kontrol (bir genomik DNA) amplifiye edilmelidir. Kısa bir süre santrifüj edin ve ß-Globin ve H. pylori ure A + ve cag A + test tüplerini aşağıdaki program ile thermalcyclera koyun: 1 cycle 95 C, 5 min. 95 C, 30 sec 40 cycles 58 C, 30 sec 72 C, 30 sec 1 cycle 72 C, 7 min. ß-Globin fragman uzunluğu: 268 bp HP ure A + fragman uzunluğu: 323 bp HP cag A + fragman uzunluğu: 194 bp pag 15

18 12.3. AMPLİFİKASYON ÜRÜNLERİNİN GÖRÜNTÜLENMESİ Agaroz jel elektroforezi %3 agaroz jel hazırlanması: 1,5 g Agaroz tartın ve 50 ml 1X TAE içine dökün. Solusyonu berrak oluncaya kadar manyetik ısıtıcı ya da mikrodalga içine bırakın. Jeli el ile dokunabilecek kadar soğumaya bırakın (3-5 dakika) ve 10 µl Ethidium Bromide (2,5 mg/ml) ekleyin. NOT: Ethidium Bromide güçlü bir mutajenik ajandır: Daima eldiven kullanın ve bu reaktifle ya da içeren jel ile çalışırken tercihen kimyasal güvenlik kabini altında çalışın. Jeli tarakları ile birlikte uygun bir dökme tankına koyun ve oda ısısında soğuyana kadar bekleyin ya da jel katı hale gelene kadar buzdolabına koyun. Jel katılaştığında, dikkatlice tarakları çıkarın (jel kuyucuklarına zarar vermemeye dikkat edin), tankı elektroforez haznesine alın ve jelin üzerini tamamen kaplayana kadar uygun miktarda TAE buffer ekleyin (yaklaşık jel yüzeyinin 1-2mm üzerinde) Örnek yükleme Test tüpünde ya da direk parafilmde aşağıdakileri karıştırın: 2 μl 6X Blue 10 μl PCR ürünü Ya da moleküler ağırlık markır (MW markır) Jel kuyucuklarına miksi yükleyin. Her bir sırada en az bir kuyucuğa DNA Moleküler Ağırlık Markır yükleyin. Güç kaynağını açın ve voltajı V ayarlayın dakika jeli yürütün ve sonra UV transilluminatore koyun; amplifikasyon ürünlerinin boyutunu referans Moleküler Ağırlık Markırı ile karşılaştırarak analiz edin. pag 16

19 DNA Moleküler Ağırlık Markır (MW): Fragman boyutları: , 404, 353, 242, 190, 147, 110, 89, 67, 34, 26 bp. NOT: %2 agaroz jelde bp bantlar genellikle tam olarak çözülmez ve tek bir bant olarak görülür; 26 ve 34 bp bantları bazen görünmek için çok küçük olur (düşük moleküler ağırlıklarından dolayı). NOT: UV ışınları deri ve en önemlisi gözler için tehlikelidir: daima eldiven ve koruyucu gözlük kullanın ya da UV transilluminatorün koruyucu ekranını kullanın. pag 17

20 13. SONUÇLARIN YORUMLANMASI ß-Globin ve Helicobacter pylori urea+ ve caga+ genlerinin amplifikasyonu Agaroz jel elektroforezinden sonra, kontroller aşağıdaki sonuçları göstermelidir: KONTROL SONUÇ YORUM Pozitif kontrol POZİTİF Amplifikasyon doğru çalışır. Negatif kontrol NEGATİF Kontaminasyon yokluğu Sonra, band paterninin yorumlanması için aşağıdaki tabloyu izleyin: DNA bandı SONUÇ YORUM ß-Globin ß-Globin ure A cag A ß-Globin ure A cag A ß-Globin ure A cag A ß-Globin ure A cag A yok var yok yok var var yok var yok var var var var Örnek amplifikasyon için uygun değildir (DNA ekstraksiyonunu tekrar edin) H. pylori (ure A - ve cag A - ) için Amplifiye edilebilir ve negatif örnek H. pylori (ure A + and cag A - ) için Amplifiye edilebilir ve pozitif örnek H. pylori (ure A + ve cag A - ) için Amplifiye edilebilir ve pozitif örnek H. pylori (ure A + ve cag A - ) için Amplifiye edilebilir ve pozitif örnek pag 18

21 Figür 1: %3 Agaroz jel elektroforezi 1. DNA MW Markır 2. Negatif kontrol 3.ve 4. H. pylori ure A + (323 bp band) ve cag + (194 bp band) için pozitif örnek Her iki örnekte H. Pylori sitotoksik soylarından biriiçin pozitiftir. pag 19

22 14. SORUN GİDERME 1. Hem amplifikasyon ürünü hem de pozitif control DNA bandı yoksa TAQ polymerase premikse doğru eklenememiştir -Uygun volümde pipet ve uçlar kullanın (pipet aralığı 0,2-2 μl); -Görsel olarak TAQ polymerasın premikse difüze olduğunu gözleyin: Bu basittir, çünkü enzim, yüksek bir densiteye sahip olan gliserolde çözülür; Alternatif olarak, tüp duvarına konulmuş olan TAQ polymerasın görsel olarak teyit edin, sonra kısa bir süre santrifüj edin. Thermalcycler doğru olarak programlanmamıştır Thermalcycler programının uygunluğunu ve kullanıcı kılavuzundaki sıcaklık profilini kontrol edin. Kit uygun şekilde çalışmaz -Premiks, TAQ polymerase ve pozitif kontrolü -20 C de saklayın; -Premiks ve reaktifleri tekrar tekrar dondurup/çözdürmekten sakının. 2. Test edilen örnekte pozitif kontrol için iyi bir bant vardır fakat ne β- globin ne de H. pylori için amplifikasyon bandı yoktur Ekstraksiyon aşaması sırasında olası problemler: Ekstraksiyon metodunun uygun olduğundan ve tüm bilgileri doğru şekilde takip ettiğinizden emin olun; Ekstraksiyon kitinin sorun giderme bölümüne başvurun; Yeni bir örnek ile doğru şekilde tekrar DNA ekstraksiyonu yapın. Amplifikasyon inhibe olmuştur Başlangıç örneğini distile su ve TE ile seyreltin; Küçük miktarda klinik örnekten DNA ekstraksiyonunu tekrar edin; Uygun ekstraksiyon sistemi kullanın. pag 20

23 3. Amplifiye ürünlerin agaroz jelde görüntülenmesinden sonra aspesifik ürün ya da ekstraband görülmesi Thermalcycler sıcaklık değişimlerini çok yavaş yapın Thermalcycler değişikliklerini uygulayın. Amplifikasyon reaksiyonunun hazırlanması oda ısısında çok uzun zaman alır. Oda ısısında çalışma zamanınızı hızlandırın; Buz üzerinde çalışın. Ekstrakte olanlar purifiye edilmiştir İyi bir örnek purifikasyonu sağlayan ekstraksiyon sistemi kullanın. Başlangıç örnekleri yıkılmış DNA içerir Ekstraksiyon aşamasını başka bir başlangıç klinik örneği kullanarak tekrarlayın; Örneğin uygun yolla toplanıp saklandığından emin olun. Spesifik olmayan fragmanlar bazen H. Pylori amplifikasyonunda görülmektedir. Bu fragmanlar başlangıç örneğine göredir, fakat sonuç analizi ile ilişkili değildir. Daha fazla detaylı bilgi için AB ANALITICA teknik destek ile irtibata geçin( pag 21

24 15. TEST LİMİTLERİ Kit performansı aşağıdaki durumlarda azalır: Klinik örnekler bu analize uygun değildir (doğru saklanmamış histolojik örnekler için nötral formalin fiksatifinden farklı bir fiksatif kullanın). Amplifikasyon reaksiyonunun inhibitörlerinin görülmesi ya da uygun olmayan ekstraksiyon sistemi kullanılması nedeniyle DNA amplifiye olmaz. Kit önerilen sıcaklıkta saklanmamıştır. 16. TEST PERFORMANSI Özgünlük En önemli bilgi bankasındaki primer dizisi spesifik olmayan dizilerin yokluğunu gösterir ve Helicobacter pylori DNA amplifikasyonunu garanti eder. Diğer patojenik mikroorganizmaların genomik DNA ya da nukleik asitleri ile çapraz reaksiyon görülmemiştir Duyarlılık Araştırma çalışmaları göstermiştir ki; PCR analizi çok duyarlı bir sistem olduğundan histoloji ile %100 uyumlu sonuçlar verir. Diagnostik duyarlılık başlangıç klinik örneğine bağlıdır: Gastrik özsu için %95, gastrik biyopsiler için yaklaşık %75-80 ve tükürük için %25-30 a ulaşır. pag 22

25 17. BİBLİYOGRAFİK REFERANSLAR F. Navaglia et al. Helicobacter pylori Cytotoxic Genotype Is Associated with Peptic Ulcer and Influences Serology. The American Journal of Gastroenterology; vol. 93, N. 2, 1998 D. Basso et al. Gastric Juice Polymerase Chain Reaction: An Alternative to Histology in the Diagnosis of Helicobacter pylori Infection. Helicobacter, vol. 1, N. 3, 1996 P. C. Konturek et al. Cancerogenesis in Helicobacter pylori infected stomach role of growth factors, apoptosis and cyclooxygenases. Med Sci Monit, 7 (5): , 2001 S. A. Chisholm et al. PCR-based Diagnosis of Helicobacter pylori Infection and Real-Time Determination of Clarithromycin resistance Directly from Human Gastric Biopsy Samples. J. Clin.. Microb. Vol. 39, N. 4, 2001 C. M. Kilmartin, Dental Implications of Helicobacter pylori. Journal of the Canadian Dental Association, vol. 68, N. 8, 2002 N. Uemura et al. Helicobacter pylori infection and the development of gastric cancer. N Engl J Med; 345 (11): 784-9, 2001 M. Blaser. Helicobacter pylori and related organisms. In: Mandell G. Principles and practice of infectious diseases. 5th ed. Churchill Livingstone; p: , 2000 C. Birek et al. Detection of Helicobacter pylori in oral apthous ulcers. J Oral Pathol Med; 28 (5),: , 1999 K. Shankaran, H. G. Desai. Helicobacter pylori in dental plaque. J Clin Gastroenterol, 21 (2): 82-4, 1995 Masood Siddiq et al. Evidence of Helicobacter pylori infection in dental plaque and gastric mucosa. JCPSP, vol. 14, N. 4, 2004 A. Berroteran et al. Detection of Helicobacter pylori DNA in the oral cavity and gastroduodenal system of a Venezuelan population. J Med Microbiol, 51 (9): , 2002 pag 23

26 18. SİPARİŞ İÇİN BİLGİLER HP: Helicobacter pylori belirlemek için kit. Kod 03-11A Kit; DNA ekstraksiyonu, amplifikasyon ve agaroz jel elektroforezi ile görüntüleme için gerekli tüm reaktifleri, örnek amplifikasyonunun internal kontrolü ve pozitif kontrol içerir. Hedef bölge: ure A ve cag A Kod Ürün Pkg 03-11A-25 HP 25 test 03-11A-50 HP 50 test İlgili ürünler HP: Helicobacter pylori belirlemek için kit. Kod 03-11R Kit; DNA amplifikasyonu için reaktifler, örnek amplifikasyonunun internal kontrolü ve pozitif kontrol içerir. Hedef bölge: ure A ve cag A Kod Ürün Pkg 03-11A-25 HP 25 test 03-11A-50 HP 50 test pag 24

27 pag 25

28 AB ANALITICA srl - Via Svizzera PADOVA, (ITALY) Tel Fax info@abanalitica.it