AMPLIQUALITY CMV REF A ref R

Transkript

1 KULLANICI KILAVUZU AMPLIQUALITY CMV REF A ref R Human Cytomegalovirus Belirlemek için kit 0123

2

3 1. ÜRÜN BİLGİSİ KİT İÇERİĞİ REAKTİFLERİ SAKLAMA KOŞULLARI KULLANIM İÇİN ÖNLEMLER GÜVENLİK KURALLARI Genel güvenlik kuralları kit hakkında güvenlik kuralları KİT İÇERİĞİNDEOLMAYAN GEREKLİ MATERYALLER Reaktifler Cihazlar Materyaller REAKTİF HAZIRLAMA GİRİŞ TEST PRENSİBİ ÜRÜN TANIMI ÖRNEK TOPLAMA, MANİPULASYON VE ÖN-MUAMELE Biyolojik sıvılar Kan EKSTRAKSİYON PROTOKOLÜ DNA ekstraksiyonu DNA amplifikasyonu BG DNA amplifikasyonu Cytomegalovirus DNA nın direk amplifikasyon (1. amplifikasyon): 17 pag. 1

4 12.3. Amplifikasyon ürünlerinin görüntülenmesi Agaroz jel elektroforezi Örnek Yükleme SONUÇLARIN YORUMLANMASI: BG DNA amplifikasyonu ve CMV ilk amplifikasyonu Cytomegalovirus DNA amplifikasyonu (nested PCR) SONUÇ YORUMLAMA: Cytomegalovirus DNA ikinci amplifikasyonu SORUN GİDERME TEST LİMİTLERİ TEST PERFORMANSI Özgünlük Duyarlılık BİBLİYOGRAFİK REFERANSLAR pag. 2

5 1. ÜRÜN BİLGİSİ Bu manuel aşağıdaki ürünler ile ilişkilidir: CMV: UL122 bölgesinde (IE2 ekson 4) DNA amplifikasyonu ile Cytomegalovirus belirlemek için kit. Kit; DNA ekstraksiyonu, amplifikasyon ve agaroz jel elektroforezi ile görüntüleme için gerekli tüm reaktifleri, örnek amplifikasyonunun internal kontrolü ve pozitif kontrol içerir. Kod Ürün Pkg 03-22A-25 CMV 25 test 03-22A-50 CMV 50 test CMV-amplifikasyon reaktifleri UL122 bölgesinde (IE2 ekson 4) DNA amplifikasyonu ile Cytomegalovirus belirlemek için kit. Kit; DNA amplifikasyonu için reaktifler, örnek amplifikasyonunun internal kontrolü ve pozitif kontrol içerir. Kod Ürün Pkg 03-22R-25 CMV-amplifikasyon reaktifleri 25 test 03-22R-50 CMV-amplifikasyon reaktifleri 50 test pag. 3

6 2. KİT İÇERİĞİ NOT: Kit içeriğinde farklı kodlarda farklı komponentler bulunur. (kısaltma: X= kit içeriğinde bulunan komponent; 0= kit içeriğinde bulunmayan komponent) KUTU P 20 C DE SAKLANIR Kod 03-22A Kod 03-22R AÇIKLAMA ETİKET TÜP (T) RENGİ YA DA KAPAK 25 test 50 test 8 test X X Tekdoz premiks tüpleri Direk CMV amplifikasyonu için Kırmızı (T) X X Nested CMV amplifikasyonu için tekdoz premiks Yeşil (T) X X Tekdoz premiks β globin gen amplifikasyonu için Mavi (T) X X Thermostabil Hot start Taq DNA polymerase AB SUPERTA Q 5 U/μL Kırmızı 1 x 40μL 1 x 80μL 1 x 20μL KÜÇÜK ÇANTA 20 C DE SAKLANIR Kod 03-22A Kod 03-22R AÇIKLAMA ETİKET TÜP (T) RENGİ YA DA KAPAK 25 test 50 test 8 test X X Cytomegalovirus genomu parçası içeren Plazmid DNA CMV pozitif kontrol Mavi 1 x 30 μl 1 x 50 μl 1 x 10 μl KUTU F +2 / +8 C DE SAKLANIR Kod 03-22A Kod 03-22R AÇIKLAMA ETİKET TÜP (T) RENGİ YA DA KAPAK 25 test 50 test 8 test X 0 X 0 Elektroforez için yükleme buffer Ethidium Bromide solusyonu (2,5 mg/ml) 6X Blue Mavi 1X250μL 1X450μL 1X100μL Ethidium Bromide toksik R S 36/37 45 Kırmızı 1X170μL 1X250μL 1X100μL pag. 4

7 X 0 DNA Moleküler Ağırlık Markır Markır PM Sarı 1X200μL 1X400μL 1X70μL KUTU A +15 / +25 C DE SAKLANIR Kod 03-22A Kod 03-22R AÇIKLAMA ETİKET TÜP (T) RENGİ YA DA KAPAK 25 test 50 test 8 test X 0 X 0 Agarose Molecular Biology grade Elektroforez buffer TRIS-Acetate-EDTA, ph 8,00 AGAROZ 1X20g 1X40g 1X6g 50X TAE 1X60mL 1X125mL 1X30mL 3. REAKTİFLERİ SAKLAMA KOŞULLARI Kitin herbir komponenti, tekli kutuların etiketlerinde belirtilen talimatlara gore saklanmalıdır. Özellikle: KUTU P Küçük çanta KUTU F KUTU A -20 C de saklanır -20 C de saklanır +2/+8 C de saklanır +15 / +25 C de saklanır Önerilen sıcaklıkta saklandığında, tüm test reaktifleri son kullanım tarihine kadar stabil kalır. pag. 5

8 4. KULLANIM İÇİN ÖNLEMLER Kit; moleküler biyoloji tekniklerini diagnostikte uygulama eğitimi almış ve tecrübesi olan araştırmacı tarafından kullanılmalıdır; Kit prosedürüne başlamadan önce kullanım kılavuzunu dikkatlice ve tamamen okuyun; Ürünleri ısı kaynaklarından uzakta tutun; Son kullanım tarihi geçmiş kit parçalarını kullanmayın; Saklama koşulları, kutu bütünlüğü ya da metod uygulaması ile ilgili herhangi bir şüpheniz olduğunda, AB ANALITICA teknik destek ile bağlantı kurun: Nükleik asitlerin amlifikasyonunda, araştırmacı aşağıdaki özel önlemleri almalıdır: Filtreli uç kullanın; Biyolojik örnekler, ekstrakte edilmiş DNA, kit içeriğindeki pozitif kontrol ve tüm amplifikasyon ürünleri, amplifikasyon reaktiflerinden farklı bir yerde saklanmalıdır. PCR öncesi ve sonrası için farklı alanlar hazırlayın ve iki alan arasında materyal (pipetler, uçlar, tüpler, vs.) paylaşımı yapmayın. Sık sık eldiven değiştirin. Benç yüzeyini %5 sodyum hipoklorit ile temizleyin. Kullanımdan önce PCR premiksi oda ısısında eritin. Taq polymerase ve ekstrakte DNA yı hızlı bir şekilde oda ısısında ve buzkalıbı üzerinde ekleyin. pag. 6

9 5. GÜVENLİK KURALLARI 5.1. Genel Güvenlik Kuralları Reaktifler ve klinik örnekler ile çalışırken tek kullanımlık eldiven kullanın ve çalışma bitiminde ellerinizi yıkayın. Ağızla pipetleme yapmayın. Bilinen hiçbir diagnostik metod enfeksiyon ajanlarının yokolduğunun garantisini vermediğinden, herbir klinik örneğin potansiyel enfeksiyonlu olduğu göz önünde bulundurulup, bu şekilde çalışılması gereklidir. Klinik örnekler ile direk temasta olan cihazların kontaminasyonlu olduğu ve bu şekilde kullanılması gerektiği göz önüne alınmalıdır. Örneklerin kazara etrafa dökülmesi durumunda, %10 Sodyum Hipoklorit ile temizleyin. Temizlenmiş materyaller, kontamine ürünler için olan özel konteynerlere atılmalıdır. Klinik örnekler, materyaller ve kontamine ürünler aşağıdaki dekontaminasyondan sonra atılmalıdır: 30 dakika %5 Sodyum Hipoklorit (1 volüm %5 Sodyum Hipoklorit solusyonu herbir 10 volüm kontaminasyonlu sıvı için) solusyonuna batırılmalı YA DA en az 2 saat 121 C de otoklavlanmalı (NOT: Sodyum Hipoklorit içeren solusyonları otoklavlamayın!!) 5.2. Kit Hakkında Güvenlik Kuralları Bu kit kullanımı için riskler tekli komponentler ile ilişkilidir: Tehlikeli Komponentler: ETHIDIUM BROMIDE (03-22A kit içinde bulunur) 3,8-diamino-1-ethyl-6-phenylphenantridiumbromide <2% Risk tanımı: T (Toksik) pag. 7

10 RİSK İBARESİ VE S İBARESİ ETHIDIUM BROMIDE R 23 ve R 68 S 36/37 45 İnhalasyon için toksik. Geri dönülmez etkiler riski. Laboratuar giysisi ve tek kullanımlık eldiven kullanın. Kaza veya rahatsızlık durumlarında, doktora başvurun ve paket etiketini gösterin. R ve S ibareleri kit ile sağlanan konsantre ürünlere işaret etmektedir. Özellikle Ethidium Bromide için, agaroz jelde dilusyona kadar. Konsantre Ethidium Bromide uygulamasında kimyasal dağıtıcı buharlı kabin kullanın. Seyreltilmiş Ethidium solusyonu ile çalışırken daima laboratuar giysisi ve tek kullanımlık eldiven giyin. Bu ürünler genel çöplere atılamaz. Kurutucu sistem kullanılmamalıdır. Atılım için yasal kuralları uygulayın. Ethidium Bromide kaza ile dökülmesi durumunda Sodyum Hipoklorit ve su ile temizleyin. İstenildiğinde ürünlerin Güvenlik data sheet (MSDS) gönderilebilir.. pag. 8

11 6. KİT İÇERİĞİNDE BULUNMAYAN GEREKLİ MATERYALLER 6.1. Reaktifler DNA ekstraksiyonu için reaktifler; Steril DNase ve RNase free su; Distile su; Agaroz jel elektroforezi ile DNA görüntülemesi için reaktifler (03-22R kitiiçin gerekli) Cihazlar Laminar flow kabini (kontaminasyondan korunmak için amplifikasyon premikse TAQ polymerase eklenirken kullanılması önerilir; ekstrakte DNa eklenirken başka bir laminar flow kabini kullanılması önerilebilir); Mikropipetler (aralık: 0,2-2 µl; 0,5-10 µl; 2-20 µl); Thermalcycler; Mikrosantrifüj (max rpm); Tartı; Manyetik ısıtıcı ya da mikrodalga; Kimyasal kabin (Ethidium Bromide uygulamasında kullanılması önerilir); Agaroz minijel için yatay elektroforez haznesi; Güç kaynağı ( V); UV Transilluminator; Foto kamera ya da imaj analizör Materyaller Tek kullanımlık eldivenler; Tek kullanımlık filtreli uçlar (aralık: 0,2-2 µl; 0,5-10 µl; 2-20 µl); TAE dilusyonu için dereceli silindirler (1L); Agaroz jel hazırlamak için pyrex şişe ya da Becker; Parafilm. pag. 9

12 7. REAKTİF HAZIRLAMA 1L 1XTAE buffer hazırlama: 20 ml 50X TAE ile 980 ml distile suyu karıştırın. pag. 10

13 8. GİRİŞ Cytomegalovirus (CMV) enfeksiyonunun biyoloji ve patogenezini anlamak gelişen hücre kültür teknikleri ve moleküler biyoloji ile hızla gelişmektedir. Populasyon arasında enfeksiyon yayılımının devamlı olarak arttığı (%40-100), fakat semptomatik olarak belirgin enfeksiyonun (sitomegalik hastalık) çeşitliliği ve sayısı immunuyuşan ve immun-olgunlaşmamış (gelişmemiş yenidoğan, transplantlar, malign tümörler, splenektomi, transfüzyonlar, HIV enfeksiyonları, yaşlılık) olguların artmış sayısının sonucu olarak büyük bir artış gösterir (Vancikova Z. and Dvorak P., 2001). Sağlıklı olgularda CMV enfeksiyonu genellikle asemptomatiktir. Cytomegalovirus, Herpesviridae ailesi üyesi olan bir virustur: İnsanın da içinde olduğu çeşitli hayvan türlerini enfekte eden yaygın bir ajandır ve oldukça tür-spesifiktir. CMVvirus oldukça yavaş bir replikatif siklusa sahiptir ve nuklear ve sitoplazmik inklüzyon cisimleri üretir. Enfeksiyon sırasında 240 kb ölçülen çiftiplikli doğrusal genoma sahiptir, hostta yüksek immunojenik protein ile 3-5 eknonukleaz aktivitesi ile ilişkili bir spesifik DNA polimerazın alfa-spesifik tipi sentezlenir. CMV genomu latent fazda host hücrelerinde yaşamını sürdürebilir (başarılı reaktivasyon olasılığı ile), başka bir deyişle devamlı bir enfeksiyona ya da litik siklusa neden olabilir; üretken enflamasyon sırasında viral genom dizisinin ardışık ekspresyonu üç kategoride sınıflandırılan genler ile zaman-ayarlıdır: Hemen erken (IE ya da alfa), erken (E ya da beta) ve geç (L ya da gama) (Mocarski ES, 1996). CMV enfeksiyonlu hastalarda, virus akciğerler, karaciğer, böbrek, gastrointestinal alan gibi farklı organlarda replike olur ve tükürük, süt, sprematik sıvı, idrar, servikal ve vajinal sekresyonlar, gözyaşı, kan ve feçesden salgılanır. Etkilenen bölgeler bağışıklığa bağlı olarak farklıdır (tablo 1). CMV sitopatik etkilere sahiptir: İntraselüler inklüzyonlar içeren sitomegalik hücre formları ile doku hasarına neden olur. pag. 11

14 Tab 1. immunbaskılı hastalarda CMV hastalığı. (Razonable and Emery, 2004) Semptom Yenidoğan SOT HSCT AIDS Ateş ya da Hepatit Gastrointestinal semptomlar Retinit Pnömoni + ++ Ensefalopati ++ + Sağırlık ++ Poliradikülopati + Addison hastalığı + semptomları Transplant reddi + Ateroskleroz + Ölüm SOT: Katı Organ Transpantı; HSCT: Hematopoetik kök Hücre Transplantı; AIDS: Kazanılmış Bağışıklık Kaybı Sendromu Geçmişte, CMV tanısı için standart metod hücre kültüründen çeşitli tekniklerle virus izolasyonu ve periferik kan lökositlerinden pp65 antijeni araştırılması idi (Razonable ve ark., 2002a). Terapi özellikle sitomegalik hastalıktan korunmak için esas olduğundan, moleküler teknikler gibi daha duyarlı ve üretken uygulamalar gereklidir. pag. 12

15 9. TEST PRENSİBİ PCR metodu (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) literatürde DNA amplifikasyonu için tanımlanan ilk metoddur (Saiki RK ve arkadaşları, 1985). Thermostable DNA polymerase ile DNA nın spesifik bir parçasının (hedef dizi) in vitro amplifikasyon reaksiyonu olarak tanımlanabilir. Reaksiyonda üç nükleik asit segmenti bulunur: Amplifiye olması için çift iplikli DNA kalıbı (hedef DNA) ve iki tek iplikli oligonükleotid primerler kalıp DNA ya spesifik olarak dizayn edilmiştir. DNA polymerase primerler tarafından işaretlenen bölgeden sentez işlemine başlar ve solusyonda serbest olarak bulunan tamamlayıcı nükleotidlerin (dntpler) eklenmesi ve bağlanması ile orjinal çift iplikli hedef DNA bölgesi ile aynı olan yeni çift iplikli DNA molekülünü sentezler. Çeşitli sikluslardan sonra, hedef diziye uygun olan milyonlarca DNA molekülü oluşturabilir. Bu testin duyarlılığı, laboratuar tanısında uygulamaya olanak sağlar. Amplifikasyon reaksiyonunun geniş biyolojik örneklerde uygulanabilmesinin yanında, PCRın oldukça küçük DNA segmentlerini de amplifiye edebilmesinden başlangıç DNAsı kısmi olarak yıkılabilir. pag. 13

16 10. ÜRÜN TANIMI Bu kitte önerilen metod UL122 bölgesinde viral DNA amplifikasyonunu içerir. Bu metod β-globin (BG) geni amplifikasyonu (amplifikasyon kontrolü) ile ekstrakte DNAnın uygunluğunu da değerlendirmeyi sağlar. BG gen amplifikasyonunda negatif bir sonuç ya ekstrakte DNAda amplifikasyon reaksiyonunun inhibitörlerinin görüldüğünü ya da DNAnın oldukça yıkıldığını işaret eder. Bu metod, Cytomegalovirus için olası yanlış negatif sonuçları tanımlamakta kullanıcıya yardımcı olur. Kit, amplifikasyon için bir de amplifikasyonun pozitif kontrolünü sağlar. Pozitif kontrol amplifikasyonu başarılı ise bu rekasiyonun doğru çalıştığını garanti eder. Bu kontroller kullanıcı için tehlikeli değildir, çünkü Cytomegalovirus genomunun sadece bir parçasını içeren plazmid DNAdırlar. Bu kit premiks formatındadır: Amplifikasyon için tüm reaktifler pre-mikstir ve Taq polymerase ve ekstrakte DNA eklenebilecek şekilde tekdoz test tüplerinde alikuatlanmıştır. Bu premiks formatı, kullanıcı için zaman kazancı ile amplifikasyon öncesi manipulasyon aşamalarını azaltır; reaktiflerin tekrar tekrar dondurup çözülmesini engeller ve hepsinden öte, bu format kontaminasyon riskini minimize eder, risk yanlış pozitif sonuçlara neden olur. Yine de, daima uygun amplifikasyon kontrollerinin kullanılmasını öneririz. pag. 14

17 11. ÖRNEK TOPLAMA, MANİPULASYON VE ÖN- MUAMELESİ CMV free, epizomal ve integral formda olabilir ve bu izolasyon ve uygun virus tanımlaması için kullanılacak protokol seçiminde belirteçtir. CMV DNA spermatik sıvılar, anne sütü, vajinal ve servikal salgılar, tükürük, serum gibi çeşitlibiyolojik sıvılardan direk ekstrakte edilebilir. İdrar ya da likör (CSF) den başlanırsa hücrelerin pellette zenginleştirilmesiiçin örneğin santrifüjü ile başlanması gereklidir. Bazen supernatant test edilebilir. Lökositlerde (PBL) ya da mononuklear hücrelerde (PBMC) CMV araştırılması için perik kandan başlanırsa bir lenfosit pellet elde etmek için ilave bir aşama (FICOLL metodu ya da kırmızı kan hücreleri lizisi ile) gereklidir. CMV DNA tam kandan da ekstrakte edilebilir Biyolojik sıvılar Serviks ve vajinal swab durumlarında, örnek toplama küçük bir swab ya da küçük bir steril fırça (sito-fırça) kullanılarak yapılır. Toplanan hücreler uygun transport medyumlarında seyreltilir (1XPBS, fizyolojik solusyon ya da diğer medyumlar). Örnek +2 / +8 C de maksimum 48 saat için saklanabilir; sonra nukleik asit ekstraksiyonu ile kullanmak için daha iyidir. Kısa bir zaman içinde örneklerin ekstraksiyonunun yapılması mümkün değilse, örnekler -20 C de saklanmalıdır. Örnek selülaritesi düşük olduğunda DNA ekstraksiyonuna başlamadan önce örnekleri tekrar tekrar santrifüjleyerek konsantre yapmak gereklidir. Örnek suspansiyonu için steril PBS kullanılabilir. Eğer görülürse mukus ve kırmızı kan hücrelerinin uzaklaştırılmasında da yararlıdır. Steril bir konteynıra seminal sıvı toplayın ve birkaç saat (maksimum gece boyu) +4 C de saklayın; alternatif olarak DNA ekstraksiyonu için uygun birmedyum eklenerek dondurulabilir. İdrar steril bir konteynıra toplanmalı ve maksimum 24 saat +2/+8 C de saklanmalı ve uygulanmalıdır. Moleküler tekniklerin uygulanması daha iyi bir tanı ve CMV enfeksiyonu ile ilişkili Merkezi SinirSistemi sendromlarının tanımlanmasını sağlar. Bu durumda, örnek seçimi likördür (CSF). pag. 15

18 Likör örneği kısa bir süre içinde çalışılacaksa oda ısısında ya da +2/+8 C de saklanabilir; alternatif olarak örnek dondurulabilir Kan Uzun zamandır hangi kan kompatımanının CMV analizi için en iyiolacağı tartışılmaktadır. Olası çalışmalar (Razonable ve ark., 2002b) 17 SOT (Solid Organ Transplant) ve HCST (Hematopoetik Kök Hücre Transplant) hastalarının 4 kan kompartımanını karşılaştırmıştır ve bu örnek tiplerinin hepsi hem tanı ve hem tedavi izlenmesine yardımcı olmak için CMV araştırmak için uygun olsa dahi, CMV düşük kopya sayısında görüldüğünde tam kanın daha duyarlı olduğu görülmüştür. Daha sonra diğer yayınlar da bu bilgiyi doğrulamıştır (Weinbeerg ve ark., 2002, Cortez ve ark., 2003, Mengelle ve ark., 2003). IHMF (Uluslar arası Herpes Yönetim Forumu) yönergesi eğer mümkün ise transplante hastalarda CMV araştırması için tam kan kullanılmasını önerir (Razonable and Emery, 2004). Örnek toplama genel sterilite önlemlerini takip etmelidir ve örnekler transport medyum olmayan steril kutulara transport edilmelidir. Kan EDTAlı olarak alınmalıdır. Heparin gibi diğer koagülasyon ajanları TAQ polymerase ın güçlü inhibitörleridir ve bu yüzden amplifikasyon reaksiyonunun verimliliğini bozar. Taze kan +2/+8 C de saklanabilir (toplanmadan 4 saat içinde kullanılmalıdır); eğer DNA hemen ekstrakte edilmeyecekse örnek -20 C de dondurulmalıdır. Eğer araştırmacı lökosit pelletinden analize başlamayı tercih ediyorsa, lenfosit izolasyonu için Ficoll-Hypaque metodu ya da eritrosit lizis protokolü kullanılabilir. Alternatif olarak, buffy coat tam kanın oda ısısında 3300 x g de 10 dakika santrifüjü ile hazırlanabilir. Santrifüjden sonra, üç farklı fraksiyon elde edilebilir: Temiz üst faz plazmadır, orta faz konsantre lökosit içeren buffy coattır, en alt faz eritrositlerdir. pag. 16

19 12. EKSTRAKSİYON PROTOKOLÜ DNA ekstraksiyonu Saf ve integral DNA ekstrakte eden herhangi bir diğer ekstraksiyon yöntemi de kullanılabilir. Paragraf 12.2 de BG ve CMV amplifikasyonu için belirtilen ekstrakte DNA miktarının AB ANALITICA metodları ile elde edilen ekstraktlara atıfta bulunduğunun hatırlanması gerekir. Alternatif ekstraksiyon metodları kullanıldığında, eğer amplifikasyon için DNA solusyon miktarı 10 μl den düşükse su ekleyerek amplifikasyon miks miktarı ayarlanmalıdır DNA AMPLİFİKASYONU BG DNA amplifikasyonu Her bir örnek için her bir premiks tüpüne (mavi tüp) ekleyin: 0,2 µl AB Super-Taq 10 µl Ekstrakte DNA CMV DNA sının direk amplifikasonu (1. amplifikasyon) Her bir örnek için her bir premiks tüpüne (kırmızı) ekleyin: 0,2 µl AB Super-Taq 10 µl Ekstrakte DNA Her bir deneyde bir negatif kontrol (mikse DNA yerine distile su ekleyin) ve bir pozitif kontrol (10 μl pozitif kontrol kit içeriğinde bulunur) bulunması önemlidir. pag. 17

20 Kısa bir süre santrifüj edin, tüpleri (BG ve CMV) aşağıdaki programda thermalcyclera koyun: 1 cycle 95 C 5 min 40 cycles 95 C 56 C 72 C 60 sec 60 sec 60 sec 1 cycle 72 C 5 min Amplifikasyon ürünlerinin uzunluğu: CMV BG 472 bp 268 bp Amplifikasyon ürünlerinin görüntülenmesi: Agaroz jel elektroforezi %3 agaroz jel hazırlayın: 1,5 g Agaroz tartın ve 50 ml 1X TAE içine dökün. Solusyonu berrak oluncaya kadar manyetik ısıtıcı ya da mikrodalga içine bırakın. Jeli el ile dokunabilecek kadar soğumaya bırakın ve 10 µl Ethidium Bromide (2.5 mg/ml) ekleyin. NOT: Ethidium Bromide güçlü bir mutajenik ajandır; daima eldiven giyin ve bu reaktifle uygulama yaparken kimyasal güvenlik kabininin içinde çalışın. Jeli tarakları ile birlikte uygun bir dökme tankına koyun ve oda ısısında soğuyana kadar bekleyin ya da jel katı hale gelene kadar buzdolabına koyun. Jel katılaştığında, dikkatlice tarakları çıkarın (jel kuyucuklarına zarar vermemeye dikkat edin), tankı elektroforez haznesine alın ve jelin üzerini tamamen kaplayana kadar uygun miktarda 1X TAE buffer ekleyin (yaklaşık jel yüzeyinin 1-2mm üzerinde). pag. 18

21 Örnek yükleme Test tüpünde ya da direk parafilmde aşağıdakileri karıştırın: 2 μl 6X Mavi* 10 μl Amplifikasyon ürünü ya da Moleküler ağırlık markırı (PM*markır) Miski jel kuyucuklarına yükleyin; güç kaynağını açın ve voltajı V arasına ayarlayın. 40 dakika jeli yürütün ve sonra UV transilluminatore koyun; amplifikasyon ürünlerinin boyutunu referans Moleküler Ağırlık Markırı ile karşılaştırarak analiz edin. *: * =6X mavi ve PM markır 03-22A kitinde bulunur; başka bir yükleme buffer ya da Moleküler Ağırlık Markırı kullanmak için sağlayıcısının belirlediği talimatları uygulayın. DNA Moleküler Ağırlık Markırı (PM Markır, 03-22A kitinde bulunur) Fragman boyutları: , 404, 353, 242, 190, 147, 110, 89, 67, 34, 26 bp. NOT: %3 agaroz jelde bp bantlar genellikle tam olarak çözülmez ve tek bir bant olarak görülür; 26 ve 34 bp bantları bazen görünmek için çok küçük olur (düşük moleküler ağırlıklarından dolayı). NOT: UV ışınları deri ve en önemlisi gözler için tehlikelidir: daima eldiven ve koruyucu gözlük kullanın ya da UV transilluminatorün koruyucu ekranını kullanın. pag. 19

22 12.4. SONUÇLARIN YORUMLANMASI BG DNA amplifikasyonu ve CMV ilk amplifikasyonu Kontroller aşağıdaki sonuçları göstermelidir: KONTROL SONUÇ YORUM Pozitif kontrol POZİTİF PCR amplifikasyonu doğrudur Negatif kontrol NEGATİF Kontaminasyon yokluğu Sonra, band paterninin yorumlanması için aşağıdaki tabloyu izleyin: DNA bandı SONUÇ YORUM BG gen bandı yok Örnek amplifikasyon için uygun değildir (DNA ekstraksiyonunu tekrar edin) BG gen bandı CMV band BG gen bandı CMV band var yok var var Amplifiye olabilir örnek Doğru örnek negativitesi değeri için ikinci amplifikasyon ile devam edin Amplifiye olabilir örnek CMV için pozitif örnek pag. 20

23 12.5. CMV nested amplifikasyon (2. DNA amplifikasyonu) Her bir yeşil premiks tüpüne ekleyin: 0,2 µl AB Super-Taq 1 µl İlk amplifikasyon ürünü Bu aşamada, CMV direk amplifikasyonunda bulunan negatif ve pozitif kontrollerin kullanılması önemlidir. Bu yararlı geldiğinde, direk amplifikasyon ürünü yerine nested mikse 1 µl steril su ekleyerek nested amplifikasyon için bir negatif kontrol de içermesi mümkündür. Kısa sure santrifüj edin, sonra tüpleri aşağıdaki thermalcycler programına koyun: 1 cycle 95 C 5 min 35 cycles 95 C 62 C 72 C 30 sec 30 sec 30 sec 1 cycle 72 C 5 min Nested amplifikasyon: CMV fragman uzunluğu: 183 bp Amplifikasyon çalışması sonucunda, %3 agaroz jel elektroforezi ile nested amplifikasyon ürünleri görüntülenir. 1,5 g Agaroz tartın ve 50 ml 1X TAE içine dökün. Paragraf 12.3 te belirtilen bilgileri takip edin. pag. 21

24 12.6. SONUÇLARIN YORUMLANMASI: Cytomegalovirus DNA nın ikinci amplifikasyonu Kontroller aşağıdaki sonuçları göstermelidir: KONTROL SONUÇ YORUM Pozitif kontrol Negatif kontrol Negatif kontrol Nested amplifikasyon POZİTİF NEGATİF NEGATİF İlk ve ikinci amplifikasyon doğrudur Birinci amplifikasyonda kontaminasyon yokluğu İkinci amplifikasyonda kontaminasyon yokluğu Sonra, band paterninin yorumlanması için aşağıdaki tabloyu izleyin: DNA bandı SONUÇ YORUM ilk ve ikinci amplifikasyonda CMV yok bandı İkinci amplifikasyonda var CMV bandı Cytomegalovirus için negatif örnek Cytomegalovirus için pozitif örnek Fig. 1: Amplifikasyon ürünlerinin %3 agaroz jel elektroforezi. 1 DNA Moleküler Ağırlık Markır (MW) 2 CMV-DNA için pozitif kontrol 3 CMV pozitif örnek 4 Negatif kontrol pag. 22

25 13. SORUN GİDERME 1. Hem amplifikasyon ürünü hem de pozitif kontrol DNA bandı yoksa TAQ polymerase premikse doğru eklenememiştir -Uygun volümde pipet ve uçlar kullanın (pipet aralığı 0,2-2 μl); -Görsel olarak TAQ polymerasın premikse difüze olduğunu gözleyin: Bu basittir, çünkü enzim, yüksek bir densiteye sahip olan gliserolde çözülür; Alternative olarak, tüp duvarına konulmuş olan TAQ polymerasın görsel olarak teyit edin, sonra kısa bir süre santrifüj edin. Thermalcycler doğru olarak programlanmamıştır: -Thermalcycler program uygunluğunu ve kullanım kılavuzundaki sıcaklık profili uygunluğunu kontrol edin ; sonra doğru program ile amplifikasyonu tekrar edin. Kit uygun şekilde çalışmaz -Premiks, TAQ polymerase ve pozitif kontrolü -20 C de saklayın; -Premiks ve reaktifleri tekrar tekrar dondurup/çözdürmekten sakının. 2. Test edilen örnekte pozitif kontrol için iyi bir bant vardır fakat ne BG ne de Cytomegalovirus için amplifikasyon bandı yoktur Ekstraksiyon aşaması sırasında olası problemler: Ekstraksiyon metodunun uygun olduğundan ve tüm bilgileri doğru şekilde takip ettiğinizden emin olun; Ekstraksiyon kitinin kullanıcı kıalvuzundaki sorun giderme kısmına başvurun Yeni bir örnek ile doğru şekilde tekrar DNA ekstraksiyonu yapın. Amplifikasyon inhibe olmuştur Başlangıç örneğini distile su ve TE ile seyreltin; Küçük miktarda klinik örnekten DNA ekstraksiyonunu tekrar edin; pag. 23

26 Uygun ekstraksiyon sistemi kullanın. 3. Amplifiye ürünlerin agaroz jelde görüntülenmesinden sonra aspesifik ürün ya da ekstraband görülmesi Thermalcycler sıcaklık değişimlerini çok yavaş yapın Thermalcycler değişikliklerini uygulayın. Amplifikasyon reaksiyonunun hazırlanması oda ısısında çok uzun zaman alır. Oda ısısında çalışma zamanınızı hızlandırın; Buz üzerinde çalışın. Başlangıç örnekleri yıkılmış DNA içerir Ekstraksiyon aşamasını başka bir başlangıç klinik örneği kullanarak tekrarlayın; Örneğin uygun yolla toplanıp saklandığından emin olun. Daha fazla detaylı bilgi için AB ANALITICA teknik destek ile irtibata geçin( pag. 24

27 14. TEST LİMİTLERİ Kit performansı aşağıdaki durumlarda azalır: Klinik örnek bu analiz için uygun değildir (yanlış transport medium ya da yanlış örnek saklama); Amplifikasyon reaksiyonunun inhibitörlerinin görülmesi ya da uygun olmayan ekstraksiyon sistemi kullanılması nedeniyle DNA amplifiye olmaz; Kit önerilen sıcaklıkta saklanmamıştır. 15. TEST PERFORMANSI Özgünlük En önemli bilgi bankasındaki primer dizi sıralaması spesifik olmayan dizilerin yokluğunu gösterir ve Cytomegalovirus amplifikasyonunu garanti eder. Diğer patojenik mikroorganizmaların genomik DNA ya da nukleik asitleri ile çapraz reaksiyon görülmemiştir Duyarlılık Diğer nested PCR tanı metodları ile referans olarak kitin duyarlılığının 50 DNA kopyasından az olduğu kabul edilir. pag. 25

28 16. BİBLİYOGRAFİK REFERANSLAR Cortez KJ, Fisher SH, Fahle GA et al. J Infect Dis 188, , Mengelle C, Sandres-Saune K, Pasquier C et al. J Clin Microbiol 41, , Mocarski ES. Virology (Fields BN, Knipe DM, Howley PM, eds). Philadelphia: Lippincott-Raven, 1996, Razonable RR, Brown RA, Wilson J et al. Transplantation 73, , 2002b. Razonable RR and Emery VC. Herpes 11(3), 77-86, Razonable RR, Paya CV, Smith TF. J Clin Microbiol 40, , 2002a. Saiki RK, Scharf S, Faloona F et al. Science 230, , Vancikova Z and Dvorak P. Curr Drug Targets Immune Endocr Metabol Disord 1, , Weinberg A, Schissel D, Giller R. J Clin Microbiol 40, , pag. 26

29 pag. 27

30 pag. 28

31 pag. 29

32 AB ANALITICA srl - Via Svizzera PADOVA, (ITALY) Tel Fax info@abanalitica.it