BCL2 KOD A Bcl-2 geninde t(14;18) (q32;q21) Translokasyonunu belirlemek için kit

Transkript

1 KULLANICI KILAVUZU BCL2 KOD A Bcl-2 geninde t(14;18) (q32;q21) Translokasyonunu belirlemek için kit

2

3 1. KİT İÇERİĞİ 3 2. REAKTİFLERİ SAKLAMA KOŞULLARI 4 3. KULLANIM İÇİN ÖNLEMLER 4 4. GÜVENLİK KURALLARI Genel güvenlik kuralları Kit hakkında güvenlik kuralları 6 5. KİT İÇERİĞİNDE OLMAYAN GEREKLİ MATERYALLER Reaktifler Cihazlar Materyaller 7 6. REAKTİFLERİ HAZIRLAMA 8 7. GİRİŞ 9 8. TEST PRENSİBİ ÜRÜN TANIMI ÖRNEK TOPLAMA, MANİPULASYON VE ÖN-MUAMELESİ Periferik kan ya da kemik iliği Histolojik örnekler Histolojik örneklerin ön-muamelesi AMPLİFİKASYON PROTOKOLÜ DNA EKSTRAKSİYONU Periferik ya da kemik iliği kanından DNA ekstraksiyonu Histolojik örneklerden DNA ekstraksiyonu MBR BÖLGESİ DNA AMPLİFİKASYONU Direk amplifikasyon (1. amplifikasyon) 15 Pag. 1

4 Nested amplifikasyon (2. amplifikasyon) AMPLİFİKASYON ÜRÜNLERİNİN GÖRÜNTÜLENMESİ Agaroz jel elektroforezi Örnek yükleme DNA AMPLİFİKASYON SONUÇLARININ YORUMLANMASI (MBR bölgesi) mcr BÖLGESİNDE DNA AMPLİFİKASYONU Direk Amplifikasyon (1. amplifikasyon) Nested amplifikasyon (2. amplifikasyon) DNA AMPLİFİKASYON SONUÇLARININ YORUMLANMASI (mcr bölgesi) SORUN GİDERME TEST LİMİTLERİ TEST PERFORMANSI Özgünlük Duyarlılık BİBLİYOGRAFİK REFERANSLAR Yararlı web siteleri SİPARİŞ İÇİN BİLGİLER İLGİLİ ÜRÜNLER 28 Pag. 2

5 1. KİT İÇERİĞİ AÇIKLAMA KUTU P BCL-2 tekdoz premiks tüpleri MBR direk amplifikasyonu için BCL-2 tekdoz premiks tüpleri MBR nested amplifikasyonu için BCL-2 tekdoz premiks tüpleri mcr direk amplifikasyonu için Tekdoz premiks tüp BCL2 mcr nested amplifikasyonu için Thermostabil Taq DNA polimerase ETİKET AB Taq 5 U/μL TÜP (T) RENGİ YA DA KAPAK 20 C DE SAKLANIR 25 test 50 test 8 test Renksiz (T) Yeşil (T) Kırmızı (T) Sarı (T) Kırmızı 1 x 50 μl 1x100 μl 1 x 16 μl KÜÇÜK ÇANTA Yeniden düzenlenen BCL-2- MBR İçeren plazmid DNA Pozitif kontrol BCL-2-MBR 20 C DE SAKLANIR Mavi 1 x 30 μl 1 x 60 μl 1 x 10 μl KUTU F +2 / +8 C DE SAKLANIR Örnek yükleme için elektroforez buffer 6X Blue Mavi 1 x 300 μl 1 x 600 μl 1 x 100 μl Ethidium Bromide solusyonu (2,5 mg/ml) Ethidium Bromide toxic R S 36/37 45 Kırmızı 1 x 150 μl 1 x 250 μl 1 x 80 μl DNA Moleküler Ağırlık Markır MW Markır Sarı 1 x 150 μl 1 x300 μl 1 x 50 μl KUTU A +15 / +25 C DE SAKLANIR Agarose Molecular Biology grade AGAROZ 1 x 14 g 1 x 26 g 1 x 5 g Elektroforez buffer TRIS-Acetate-EDTA ph: 8,00 50X TAE 1 x 60 ml 1 x 100 ml 1 x 20 ml Pag. 3

6 2. REAKTİFLERİ SAKLAMA KOŞULLARI Kitin herbir komponenti, tekli kutuların etiketlerinde belirtilen talimatlara gore saklanmalıdır. Özellikle: KUTU P Küçük çanta KUTU F KUTU A -20 C de saklanır -20 C de saklanır +2/+8 C de saklanır +15 / +25 C de saklanır Önerilen sıcaklıkta saklandığında, tüm test reaktifleri son kullanım tarihine kadar stabil kalır. 3. KULLANIM İÇİN ÖNLEMLER Kit; moleküler biyoloji tekniklerini diagnostikte uygulama eğitimi almış ve tecrübesi olan araştırmacı tarafından kullanılmalıdır; Kit prosedürüne başlamadan önce kullanım kılavuzunu dikkatlice ve tamamen okuyun; Ürünleri ısı kaynağından uzakta tutun; Son kullanım tarihi geçmiş kit parçalarını kullanmayın; Saklama koşulları, kutu bütünlüğü ya da metod uygulaması ile ilgili herhangi bir şüpheniz olduğunda, AB ANALITICA teknik destek ile bağlantı kurun: laboratorio@abanalitica.it. Nükleik asitlerin amlifikasyonunda, araştırmacı aşağıdaki özel önlemleri almalıdır: Filtreli uç kullanın; Biyolojik örnekler, ekstrakte edilmiş DNA, kit içeriğindeki pozitif kontrol ve tüm amplifikasyon ürünleri, amplifikasyon reaktiflerinden farklı bir yerde saklanmalıdır. Pag. 4

7 PCR öncesi ve sonrası için farklı alanlar hazırlayın ve iki alan arasında materyal (pipetler, uçlar, tüpler, vs.) paylaşımı yapmayın. Sık sık eldiven değiştirin. Benç yüzeyini %5 sodyum hipoklorit ile temizleyin. Kullanımdan önce PCR premiksi oda ısısında eritin. Taq polymerase ve ekstrakte DNA yı hızlı bir şekilde oda ısısında ve buzkalıbı üzerinde ekleyin. 4. GÜVENLİK KURALLARI Genel Güvenlik Kuralları Reaktifler ve klinik örnekler ile çalışırken tek kullanımlık eldiven kullanın ve çalışma bitiminde ellerinizi yıkayın. Ağızla pipetleme yapmayın. Bilinen hiçbir diagnostik metod enfeksiyon ajanlarının yokolduğunun garantisini vermediğinden, herbir klinik örneğin potansiyel enfeksiyonlu olduğu göz önünde bulundurulup, bu şekilde çalışılması gereklidir. Klinik örnekler ile direk temasta olan cihazların kontaminasyonlu olduğu ve bu şekilde kullanılması gerektiği göz önüne alınmalıdır. Örneklerin kazara etrafa dökülmesi durumunda, %10 Sodyum Hipoklorit ile temizleyin. Temizlenmiş materyaller, kontamine ürünler için olan özel konteynerlere atılmalıdır. Klinik örnekler, materyaller ve kontamine ürünler aşağıdaki dekontaminasyondan sonra atılmalıdır: 30 dakika %5 Sodyum Hipoklorit (1 volüm %5 Sodyum Hipoklorit solusyonu herbir 10 volüm kontaminasyonlu sıvı için) solusyonuna batırılmalı YA DA en az 2 saat 121 C de otoklavlanmalı (NOT: Sodyum Hipoklorit içeren solusyonları otoklavlamayın!!) Pag. 5

8 Kit Hakkında Güvenlik Kuralları Bu kit kullanımı için riskler tekli komponentler ile ilişkilidir: Tehlikeli Komponentler: 3,8-diamino-1-ethyl-6-phenylphenantridiumbromide (Ethidium Bromide) <2% Risk tanımı: T (Toksik) RİSK İBARESİ VE S İBARESİ ETHIDIUM BROMIDE R 23 ve R 68 S 36/37 45 İnhalasyon için toksik. Geri dönülmez etkiler riski. Laboratuar giysisi ve tek kullanımlık eldiven kullanın. Kaza veya rahatsızlık durumlarında, doktora başvurun ve paket etiketini gösterin. R ve S ibareleri kit ile sağlanan konsantre ürünlere işaret etmektedir. Özellikle Ethidium Bromide için, agaroz jelde dilusyona kadar. Konsantre Ethidium Bromide uygulamasında kimyasal dağıtıcı buharlı kabin kullanın. Seyreltilmiş Ethidium solusyonu ile çalışırken daima laboratuar giysisi ve tek kullanımlık eldiven giyin. Bu ürünler genel çöplere atılamaz. Kurutucu sistem kullanılmamalıdır. Atılım için yasal kuralları uygulayın. Ethidium Bromide kaza ile dökülmesi durumunda Sodyum Hipoklorit ve su ile temizleyin. İstenildiğinde Ethidium Bromide Güvenlik data sheet (MSDS) gönderilebilir. Pag. 6

9 5. KİT İÇERİĞİNDE BULUNMAYAN GEREKLİ MATERYALLER 5.1 Reaktifler Steril DNase ve RNase free su; Distile su; 5.2 Cihazlar Laminar flow kabini (kontaminasyondan korunmak için amplifikasyon premikse TAQ polymerase eklenirken kullanılması önerilir; ekstrakte DNA eklenirken başka bir laminar flow kabini kullanılması önerilebilir); Mikropipetler (aralık: 0,2-2 µl; 0,5-10 µl; 2-20 µl); Thermalcycler; Mikrosantrifüj (max rpm); Tartı; Manyetik ısıtıcı ya da mikrodalga; Kimyasal kabin (Ethidium Bromide uygulamasında kullanılması önerilir); Agaroz minijel için yatay elektroforez haznesi; Güç kaynağı ( V); UV Transilluminator; Foto kamera ya da imaj analizör. 5.3 Materyaller Tek kullanımlık eldivenler; Tek kullanımlık filtreli uçlar (aralık: 0,2-2 µl; 0,5-10 µl; 2-20 µl); TAE dilusyonu için dereceli silindirler (1L); Agaroz jel hazırlamak için pyrex şişe ya da Becker; Parafilm. Pag. 7

10 6. REAKTİF HAZIRLAMA 1L 1XTAE buffer hazırlama: 20 ml 50X TAE ile 980 ml distile suyu karıştırın. Pag. 8

11 7. GİRİŞ Lösemi ve lenfoma çalışmaları bazı neoplastik patolojilerin temelinde moleküler mekanizmaların anlaşılmasını sağlar. Ön-B fazında genelde lenfoid hücrelerde eksprese olan BCL-2 geni hücre gelişiminde öenmli bir rol oynar: Ön-B ya da olgunlaşmamış B hücreleri fonksiyonel immunglobulin reseptörünü eksprese etmediğinde ya da B hücrelerinin normal gelişimi sırasında korunurken self-antijen için reseptörler eksprese olduğunda apoptozis sürecini başlatır. Foliküler Lenfomaların (FL) %80 den fazlası t(14;18) kromozom translokasyonunun varlığı ile karakterizedir. Moleküler seviyede, bu translokasyon, bcl-2/igh olarak adlandırılan kimerik bir gen oluşumu ile kromozom 14q32 de İmmunglobulin ağır zincir (IgH) geninin kontrolü altında normalde kromozom 18q21 de localize olan bcl-2 proto-onkogenine dönüşür. Bazı olgularda, bu bcl-2 aşırı ekspresyonuna ve BCL-2 protein aşırı üretimine neden olur. Bu bilgiler, geniş bir hematolojik neoplazi olan Foliküler Lenfomanın (FL) etiyolojisini açıklamayı sağlar (Amerika da Non-Hodgkin Lenfoma (NHL) yetişkin hastalarının üçte ikisi etkilenmiştir). Translokasyon t(14;18) B hücrelere yayılan NHLnin %30 unda ve bazı kronik lenfatik lenfomalarda da görülür. Fonksiyonlar kimerik gen bcl-2/igh a ve geleneksel kemoterapiye FL nin kısmi direnci hakkında çeşitli sorulara cevap verebilen BCL-2 protein ekspresyonu artışına dayanır. Neoplastik ajanlara direnç gösteren kimerik gen bcl-2/igh varlığı gösteren çeşitli tümör modellerinde bazı in-vitro kanıtlar vardır. BCL-2 aşırı ekspresyonu malignan B-hücrelerinin hayatını uzatır. Dahası, çeştli çalışmalar, protein aşırı ekspresyonunun apoptotik ilerlemede bir ertelemeye neden olduğunu ve bu ertelemenin alternatif kimyasal direnç mekanizmasını destekleyen terapiden DNA hasarını tamir etmek için neoplastik hücrelerden daha çok süre ayrılabildiğini hipotez olarak sunmaktadır. Bcl-2 geni yeniden düzenlenmeleri tipik bir paterne sahiptir. Bcl-2 geninde kırılmaların neredeyse %70 i üçüncü ekson seviyesinde Büyük Kırılma Bölgesi (MBP) isimli 150 bp bölgede lokalizedir. Diğer kırılma noktaları (%10- Pag. 9

12 20) üçüncü eksonda 20 kb aşağı akım yönünde Küçük Küme Bölgesinde (mcr) lokalizedir. Bcl-2 transalokasyonu, bcl-2 geninde ya da kırılma noktasında prob kullanılarak Southern Blot ile moleküler seviyede kolayca belirlenebilir. Southern Blot tekniği donmuş dokudan ekstrakte edilen büyük miktarda yüksek moleküler ağırlıklı DNA ya ihtiyaç duyar ve eğer neoplastik hücre miktarı %5 den düşük ise translokasyonu belirleyemez. Kimerik gen bcl-2/igh moleküler klonlaması (Tsujimoto ve ark. 1984; Bakshi ve ark. 1985; Clearly and Sklar, 1985), translokasyon t(14;18) içeren lenfoma hücrelerinin varlığının yüksek duyarlılığı ile ve formalin-fikse, parafine-gömülü dokulardan yıkılmış DNA amplifikasyonu olasılığı ile belirlemeye izin veren DNA amplifikasyon testlerinin gelişimine yol göstermiştir. Nukleik asit amplifikasyon tekniklerinin özelliği, bu tip lenfoma ve lösemilerin tanı ve prognozu için yararlı bilgiler edinmemize ve dahası kemoterapiden sonra terapi etkileri ile minimal rezidüel hastalığın (MRD) izlenmesine izin vermesidir. MRD, genel sitomorfolojik tekniklerin belirleme sınırının altında olan kemoterapinin farklı fazları sırasında organizmada bireysel olarak neoplastik hücrelerin kotası olarak tanımlanmıştır. Eğer şiddetli kemoterapi, gözlenen bu tip patolojilerde ilerlemeye katkıda bulunuyorsa, olguların önemli bir kısmında tedaviden sonra çeşitli zamanlarda hastalık tekrarı görülebilir. Nüksetme, tedaviye dirençli hücre kotasının devam eden ekspresyonudur, olası analitik tekniklerin sınırlı duyarlılığına göre önceden belirlenemez. Nukleik asit amplifikasyon tekniği MRD izlenmesinde geniş uygulama için yeni perspektifler açmıştır. FL hastalarında, periferik kan ve kemik iliğinde kimerik gen bcl-2/igh nin klirensi tekrar etme riskinin azalması ve uzun cevap ile ilişkilidir (Gribben ve ark., 1994; Freedman ve ark., 1999). Pag. 10

13 8. TEST PRENSİBİ PCR metodu (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) literatürde DNA amplifikasyonu için tanımlanan ilk metoddur (Saiki RK ve arkadaşları, 1985). Thermostable DNA polymerase ile DNA nın spesifik bir parçasının (hedef dizi) in vitro amplifikasyon reaksiyonu olarak tanımlanabilir. Reaksiyonda üç nükleik asit segmenti bulunur: Amplifiye olması için çift iplikli DNA kalıbı (hedef DNA) ve iki tek iplikli oligonükleotid primerler kalıp DNA ya spesifik olarak dizayn edilmiştir. DNA polymerase primerler tarafından işaretlenen bölgeden sentez işlemine başlar ve solusyonda serbest olarak bulunan tamamlayıcı nükleotidlerin (dntpler) eklenmesi ve bağlanması ile orjinal çift iplikli hedef DNA bölgesi ile aynı olan yeni çift iplikli DNA molekülünü sentezler. Çeşitli sikluslardan sonra, hedef diziye uygun olan milyonlarca DNA molekülü oluşturabilir. Bu testin duyarlılığı, laboratuar tanısında uygulamaya olanak sağlar. Amplifikasyon reaksiyonunun geniş biyolojik örneklerde uygulanabilmesinin yanında, PCRın oldukça küçük DNA segmentlerini de amplifiye edebilmesinden başlangıç DNAsı kısmi olarak yıkılabilir. Pag. 11

14 9. ÜRÜN TANIMI Tarnslokasyon t(14;18) belirlemek için bu kitte kabul edilen moleküler strateji nukleik asidin nested amplifikasyonundan oluşur. Eğer translokasyonel olay kimerik bcl 2 geninin oluşumunu tanımlarsa, bcl 2 geni için spesifik olarak dizayn edilmiş primer kullanımı sadece amplifikasyon ürünlerinin elde edilmesine izin verir. Ig HEAVY CHAIN REAGION bcl-2 GENE NO AMPLIFICATION TRANSLOCATION t(14;18) AMPLIFICATION Fig. 1: DNA amplifikasyonu ile translokasyon t(14;18) belirlenmesi. Primerlerden biri Ig ağır zincirinin geninde spesifik bir diziye homolog iken diğeri bcl-2 genindeki diziye homologtur. Amplifikasyon ürünü, sadece eğer iki dizi arasında birleşme olan bir translokasyon var ise elde edilir. Nested amplifikasyon MRD çalışmalarında uygulama için uygun duyarlılılıkta metodu garanti eder. Bu metod ile MBR ve mcr bölgelerinde kırılma noktalarının translokasyonları tanımlanabilir. Fragman belirlemesi agaroz jel elektroforezi ile yapılır. Kit, amplifikasyon için bir de amplifikasyonun pozitif kontrolünü sağlar. Pozitif kontrol amplifikasyonu başarılı ise bu rekasiyonun doğru çalıştığını garanti eder. Bu kontroller kullanıcı için tehlikeli değildir, çünkü plazmid DNA dırlar. Bu kit premiks formatındadır: Amplifikasyon için tüm reaktifler pre-mikstir ve Taq polymerase ve ekstrakte DNA eklenebilecek şekilde tek doz test tüplerinde alikuatlanmıştır. Bu premiks formatı, kullanıcı için zaman kazancı ile amplifikasyon öncesi manipulasyon aşamalarını azaltır; reaktiflerin tekrar tekrar dondurup Pag. 12

15 çözülmesini engeller ve hepsinden öte, bu format kontaminasyon riskini minimize eder, risk yanlış pozitif sonuçlara neden olur. Yine de, daima uygun amplifikasyon kontrollerinin kullanılmasını öneririz. Pag. 13

16 10. ÖRNEK TOPLAMA, MANİPULASYON VE ÖN- MUAMELESİ Periferik kan ve kemik iliği Örnek toplama tüm genel sterilite önlemlerini takip etmelidir. Kan EDTAlı olarak alınmalıdır. Heparin gibi diğer koagülasyon ajanları TAQ polymerase ın güçlü inhibitörleridir ve bu yüzden amplifikasyon reaksiyonunun verimliliğini bozar. Taze kan kısa bir süre için +2/+8 C de saklanabilir; eğer DNA ekstraksiyonu kısa bir süre içinde yapılmayacaksa örnek dondurulmalıdır. Histolojik örnekler Histolojik örnekler taze, donmuş, formalin fikse ve parafine gömülü deri biyopsileridir. Taze biyopsiler toplamadan birkaç dakika içinde çalışılmalı veya likit nitrojen ile hızlıca dondurulmalıdır ve sonra enzimatik sindirimi takiben steril kesici kullanarak mekanik kesilmeye kadar -80 C de saklanmalıdır, Proteinaz K ile sindirim ile takip etmelidir. Fikse ve parafine gömülü biyopsilerde Lilie formülü olarak %10 sodyum ve potasyum tuzları ile ph 7 de formalin buffer kullanmanızı öneririz. Buffer olmayan Bouin, Holland ve diğer asidik fiksatifler (osmik asit gibi) olan formalinde fikse edilmiş dokular sonraki nukleik asit ekstraksiyonu için uygun değildir, çünkü bu maddeler dokuda sindirilemeyen çapraz-bağlar meydana getirirler. Histolojik örneklerin ön-muamelesi Taze ya da donmuş histolojik örneklerde (yaklaşık 50 mg a kadar), steril kesici kullanarak dokunun hemen mekanik sindiriminin yapılması önerilir. Bu muameleyi cam slaytlar üzerinde yapın. Sonra Pasteur pipeti kullanarak doğranmış dokuyu tüpe aktarın ve örnek sindirimi ile devam edin. Bu durumda, histolojik örnek fikse edilir ve parafine gömülür, ilk olarak parafin uzaklaştırılır ve enzimatik sindirim yapılır. Pag. 14

17 11. AMPLİFİKASYON PROTOKOLÜ DNA EKSTRAKSİYONU Periferik kan ve kemik iliğinden DNA ekstraksiyonu Periferik kan ve kemik iliğinden DNA ekstraksiyonu için, AB ANALITICA MICROGENO DNA kitini (kod ), kit ile standardize edilmiş, kullanmanızı önerir. Saf ve integral DNA ekstrakte eden herhangi bir diğer ekstraksiyon yöntemi de kullanılabilir. Histolojik örneklerden DNA ekstraksiyonu Histolojik örneklerden (taze, donmuş, formalin-fikse ve parafinegömülübiyopsiler) DNA ekstraksiyonu için, AB ANALITICA CELAN DNA kit (kod ), kit ile standardize edilmiş, kullanmanızı önerir. Saf ve integral DNA ekstrakte eden herhangi bir diğer ekstraksiyon yöntemi de kullanılabilir. Bu durumda, paragraf 11.2 de DNA amplifikasyonu için ekstrakte miktarın AB ANALITICA metodu ile elde edilene referans olması gerektiğini göz önünde bulundurun. Alternatif ekstraksiyon metodları kullanıldığında, eğer amplifikasyon için DNA solusyon miktarı belirtilenden düşükse su ekleyerek amplifikasyon miks miktarı ayarlanmalıdır. MBR BÖLGESİ DNA AMPLİFİKASYONU Direk amplifikasyon (1. amplifikasyon) Her bir premiks tüpüne (renksiz tüpler) ekleyin: YA DA AB Taq Ekstrakte DNA (kandan) H 2 O Ekstrakte DNA (dokudan) 0,25 μl 5 μl 5 μl 10 μl Her bir deneyde kontaminasyonları izlemek için bir negatif kontrol (mikse ekstrakte DNA yerine distile su ekleyin) ve bir pozitif kontrol (herhangi genomik DNA) içermesi önemlidir. Pag. 15

18 Kısa sure santrifüj edin, sonra tüpleri aşağıdaki thermalcycler programına koyun: 1 cycle 94 C 2 min 30 cycles 94 C 55 C 72 C 1 min 1 min 1 min 1 cycle 72 C 10 min 2. amplifikasyon (MBR bölgesi amplifikasyonu) ile devam edin. Nested amplifikasyon (2. amplifikasyon) Her bir premiks tüpüne (yeşil tüpler) ekleyin: AB Taq İlk amplifikasyon ürünü 0,25 μl 5 μl Direk amplifikasyonda kullandığınız negatif ve pozitif kontrolleri de tekrar amplifiye edin. Gerektiğinde nested amplifikasyonun negatif kontrolünü de yapmak mümkündür (nested mikse ilk amplifikasyon ürünü yerine 5 µl distile su ekleyin). Kısa bir süre santrifüj edin ve test tüplerini aşağıdaki programda thermalcyclera koyun: 1 cycle 94 C 2 min 40 cycles 94 C 57 C 72 C 1 min 1 min 1 min 1 cycle 72 C 10 min Tarnsloke bcl-2/igh (MBR bölgesi) amplifikasyon fragman uzunluğu: Aralık: 120 bp-350 bp Pag. 16

19 AMPLİFİKASYON ÜRÜNLERİNİN GÖRÜNTÜLENMESİ Agaroz jel elektroforezi %3 agaroz jel hazırlanması: 1,5 g Agaroz tartın ve 50 ml 1X TAE içine dökün. Solusyonu berrak oluncaya kadar manyetik ısıtıcı ya da mikrodalga içine bırakın. Jeli el ile dokunabilecek kadar soğumaya bırakın ve 10 µl Ethidium Bromide ekleyin. NOT: Ethidium Bromide güçlü bir mutajenik ajandır; daima eldiven giyin ve bu reaktifle uygulama yaparken kimyasal güvenlik kabininin içinde çalışın. Jeli tarakları ile birlikte uygun bir dökme tankına koyun ve oda ısısında soğuyana kadar bekleyin ya da jel katı hale gelene kadar buzdolabına koyun. Jel katılaştığında, dikkatlice tarakları çıkarın (jel kuyucuklarına zarar vermemeye dikkat edin), tankı elektroforez haznesine alın ve jelin üzerini tamamen kaplayana kadar uygun miktarda TAE buffer ekleyin (yaklaşık jel yüzeyinin 1-2mm üzerinde). Örnek yükleme Test tüpünde ya da direk parafilmde aşağıdakileri karıştırın: 2 μl 6X Mavi 10 μl Nested amplifikasyon ürünü (MBR bölgesi) Ya da DNA moleküler ağırlık markır (MW markır) Miski jel kuyucuklarına yükleyin; güç kaynağını açın ve voltajı V arasına ayarlayın dakika jeli yürütün ve sonra UV transilluminatore koyun; amplifikasyon ürünlerinin boyutunu referans Moleküler Ağırlık Markırı ile karşılaştırarak analiz edin. *DNA Moleküler Ağırlık Markır (MW): Fragman boyutları: , 404, 353, 242, 190, 147, 110, 89, 67, 34, 26 bp. NOT: %3 agaroz jelde bp bantlar genellikle tam olarak çözülmez ve tek bir bant olarak görülür; 26 ve 34 bp bantları bazen görünmek için çok küçük olur (düşük moleküler ağırlıklarından dolayı). Pag. 17

20 NOT: UV ışınları deri ve en önemlisi gözler için tehlikelidir: daima eldiven ve koruyucu gözlük kullanın ya da UV transilluminatorün koruyucu ekranını kullanın. DNA AMPLİFİKASYONU (MBR bölgesi) SONUÇLARININ YORUMLANMASI Agaroz jel elektroforezinden sonra, kontroller aşağıdaki sonuçları göstermelidir: KONTROL SONUÇ YORUM Pozitif kontrol Negatif kontrol Negatif kontrol Nested amplifikasyonda var yok yok 1. ve 2. amplifikasyon doğrudur Kontaminasyon yokluğu (1. amplifikasyonda) Kontaminasyon yokluğu (2. amplifikasyonda) Sonra, band paterninin yorumlanması için aşağıdaki tabloyu izleyin: BAND SONUÇ YORUM DNA bandı 120 bp-350 bp aralığında DNA bandı 120 bp-350 bp aralığında yok var MBR bölgesinde t(14;18) İçin negatif örnek. Aynı ekstraktı 11.5 de belirtildiği gibi amplifiye etmeye çalışın. MBR bölgesinde t(14;18) İçin pozitif örnek. Daha fazla detaylı bilgi için AB ANALITICA teknik destek ile irtibata geçin. Pag. 18

21 Fig. 2: %3 Agaroz jel elektroforezi 1. DNA MW Markır 2-6. t(14;18) (q32; q21) için pozitif örnek 7. MBR direk PCR için negatif kontrol 8. MBR nested PCR için negatif kontrol Pozitif örneklerin amplifikasyonu aralık 120 bp-350 bp de amplifikasyon ürünü verir. mcr BÖLGESİNDE DNA AMPLİFİKASYONU Direk amplifikasyon (1. amplifikasyon) Her bir premiks tüpüne (kırmızı tüpler) ekleyin: AB Taq Ekstrakte DNA (kandan) H 2 O 0,25 μl 5 μl 5 μl YA DA Ekstrakte DNA (dokudan) 10 μl Pag. 19

22 Her bir deneyde kontaminasyonları izlemek için bir negatif kontrol (mikse ekstrakte DNA yerine distile su ekleyin) ve bir pozitif kontrol içermesi önemlidir. Kısa sure santrifüj edin, sonra tüpleri aşağıdaki thermalcycler programına koyun: 1 cycle 94 C 2 min 30 cycles 94 C 58 C 72 C 1 min 1 min 1 min 1 cycle 72 C 10 min Nested amplifikasyon (mcr bölgesi amplifikasyonu) ile devam edin. Nested amplifikasyon (2. amplifikasyon) Her bir test tüpüne (sarı tüpler) ekleyin: AB Taq İlk amplifikasyon ürünü 0,25 μl 5 μl Direk amplifikasyonda kullandığınız negatif ve pozitif kontrolleri de tekrar amplifiye edin. Gerektiğinde nested amplifikasyonun negatif kontrolünü de yapmak mümkündür (nested mikse ilk amplifikasyon ürünü yerine 5 µl distile su ekleyin). Pag. 20

23 Kısa bir süre santrifüj edin ve test tüplerini aşağıdaki programda thermalcyclera koyun: 1 cycle 94 C 2 min 40 cycles 94 C 58 C 72 C 1 min 1 min 1 min 1 cycle 72 C 10 min Tarnsloke bcl-2/igh (mcr bölgesi) amplifikasyon fragman uzunluğu: Aralık: 120 bp-350 bp Amplifikasyon sonunda, nested amplifikasyon ürünlerini paragraf 11.3 teki bilgileri takip ederek görüntüleyin. Sonuç yorumlama için paragraf 11.4e bakın. DNA AMPLİFİKASYONU (mcr bölgesi) SONUÇLARININ YORUMLANMASI Agaroz jel elektroforezinden sonra, kontroller aşağıdaki sonuçları göstermelidir: KONTROL SONUÇ YORUM Pozitif kontrol var 1. ve 2. amplifikasyon doğrudur Negatif kontrol Negatif kontrol Nested amplifikasyonda yok yok Kontaminasyon yokluğu (1. amplifikasyonda) Kontaminasyon yokluğu (2. amplifikasyonda) Pag. 21

24 Sonra, band paterninin yorumlanması için aşağıdaki tabloyu izleyin: BAND SONUÇ YORUM DNA bandı 120 bp-350 bp aralığında DNA bandı 120 bp-350 bp aralığında yok var Mcr bölgesinde t(14;18) için Negatif örnek Mcr bölgesinde t(14;18) için Pozitif örnek Pag. 22

25 12. SORUN GİDERME 1. Hem amplifikasyon ürünü hem de pozitif kontrol DNA bandı yoksa TAQ polymerase premikse doğru eklenememiştir -Uygun volümde pipet ve uçlar kullanın (pipet aralığı 0,2-2 μl); -Görsel olarak TAQ polymerasın premikse difüze olduğunu gözleyin: Bu basittir, çünkü enzim, yüksek bir densiteye sahip olan gliserolde çözülür; Alternatif olarak, tüp duvarına konulmuş olan TAQ polymerasın görsel olarak teyit edin, sonra kısa bir süre santrifüj edin. Thermalcycler doğru olarak programlanmamıştır: -Thermalcycler program uygunluğunu ve kullanım kılavuzundaki sıcaklık profili uygunluğunu kontrol edin, sonra doğru program ile amplifikasyonu tekrar edin. Kit uygun şekilde çalışmaz -Premiks, TAQ polymerase ve pozitif kontrolü -20 C de saklayın; -Premiks ve reaktifleri tekrar tekrar dondurup/çözdürmekten sakının. 2. Amplifiye ürünlerin agaroz jelde görüntülenmesinden sonra aspesifik ürün ya da ekstra band görülmesi Thermalcycler sıcaklık değişimlerini çok yavaş yapın Thermalcycler değişikliklerini uygulayın. Amplifikasyon reaksiyonunun hazırlanması oda ısısında çok uzun zaman alır. Oda ısısında çalışma zamanınızı hızlandırın; Buz üzerinde çalışın. Pag. 23

26 Ekstrakte olanlar purifiye edilmiştir İyi bir örnek purifikasyonu sağlayan ekstraksiyon sistemi kullanın. Başlangıç örnekleri yıkılmış DNA içerir Ekstraksiyon aşamasını başka bir başlangıç klinik örneği kullanarak tekrarlayın; Örneğin uygun yolla toplanıp saklandığından emin olun. Daha fazla detaylı bilgi için AB ANALITICA teknik destek ile irtibata geçin. Pag. 24

27 13. TEST LİMİTLERİ Kit performansı aşağıdaki durumlarda azalır: Kan örneği bu analiz için uygun değildir (antikoagülan olarak heparin kullanın); Klinik örnekler bu analize uygun değildir (doğru saklanmamış örnekler için nötral formalin fiksatifinden farklı bir fiksatif kullanın). 14. TEST PERFORMANSI Özgünlük En önemli bilgi bankasında uygulanan primer dizisi spesifik olmayan dizilerin yokluğunu değerlendirir. Genomik DNA ile çapraz reaksiyon görülmemiştir. Duyarlılık Bazı bibliyografik referanslar göstermiştir ki; transloke bcl-2 DNA tanımlaması için bir nested amplifikasyon sistemi her 10 6 sağlıklı hücrede 1 transloke hücre belirlenmesine izin verir. Pag. 25

28 15. BİBLİYOGRAFİK REFERANSLAR Nadel B, Marculescu R, Le T, Rudnicki M, Bocskor S, Jager U. Leuk Lymphoma 42 (6): , 2001 Tsujimoto Y, finger LR, Yunis J, Norwell PC, Croce CM. Science 226:1097, Bakshi A, Jensen JP, Goldman P, Wright JJ, McBride OW, Epstein AL, Korsmeyer SJ. Cell 41: 899, Clearly ML and Sklar J. Proc Natl acad Sci USA 81: 593, Gribben JG, Neuberg D, Barber M, Moore J, Pesek KW, Freedman AS, Nadler LM. Blood 83 (12): , Freedman AS, Neuberg D, Mauch P, Soiffer RJ, Anderson KC, Fisher DC, Schlossman R et al. Blood 10 (94): , Saiki RK, S Scharf, F Faloona, KB Mullis, GT Horn, HA Erlich and N Arnheim, Science 230, , Gribben JG, Freedman AS, Neuberg D, Roy DC, Blake KW, Woo SD, Grossbard ML et al. N engl J Med 325: 1525, Yararlı web siteleri Pag. 26

29 16. SİPARİŞ İÇİN BİLGİLER BCL-2 Büyük Kırılma Bölgesi (MBR) ve küçük küme bölgesinde (mcr)dna amplifikasyonu ile bcl-2 gen t(14;18)(q32;q21) taranslokasyonu belirlemek için kit. (Kod 04-28A) Kit; direk ve nested amplifikasyon ve agaroz jel elektroforezi ile görüntüleme için gerekli tüm reaktifleri ve pozitif kontrol içerir. Hedef bölge: Büyük Kırılma Bölgesi (MBR) ve küçük küme bölgesi (mcr). Kod Ürün Pkg 04-28A-25 BCL-2 25 test 04-28A-50 BCL-2 50 test Pag. 27

30 17.1 İLGİLİ ÜRÜNLER BCL-2 Büyük Kırılma Bölgesi (MBR) ve küçük küme bölgesinde (mcr)dna amplifikasyonu ile bcl-2 gen t(14;18)(q32;q21) taranslokasyonu belirlemek için kit. (Kod 04-28R) Direk ve nested DNA amplifikasyonu için reaktifler ve pozitif kontrol içerir. Hedef bölge: Büyük Kırılma Bölgesi (MBR) ve küçük küme bölgesi (mcr). Kod Ürün Pkg 04-28R-25 BCL-2 25 test 04-28R-50 BCL-2 50 test Pag. 28

31 Pag. 29

32 AB ANALITICA srl - Via Svizzera PADOVA, (ITALY) Tel Fax info@abanalitica.it