Genequality HEMO STRIP Kod C Kod A Kod R Kod

Transkript

1 KULLANICI KILAVUZU Genequality HEMO STRIP Kod C Kod A Kod R Kod Hemokromatoz ilişkili HFE geninde mutasyonların eş zamanlı teşhisi ve tanısı için reverse hibridizasyon testi (RHA)

2 1 ÜRÜN BİLGİSİ 1 2 KİT İÇERİĞİ 2 3 REAKTİFLERİN SAKLANMASI VE STABİLİTES 4 4 KULLANIM İÇİN ÖNLEMLER 4 5 GÜVENLİK KURALLARI Genel Güvenlik Kuralları Kit Hakkında Güvenlik Kuralları 5 6 GEREKLİ OLAN, KİT İÇERİĞİNDE BULUNMAYAN MALZEMELER Reaktifler Cihazlar Materyaller 8 7 ÖN MUAMELE VE REAKTİF HAZIRLAMA PROSEDÜRÜ Genomik DNA ekstraksiyon HFE genlerin uygun kısımlarının amplifikasyonu Reverse hibridizasyon için reaktifler 8 8 GİRİŞ 9 9 TEST PRENSİBİ ÜRÜN TANIMI ÖRNEK TOPLAMA, MANİPULASYON VE ÖN-MUAMELESİ PROTOKOL DNA Ekstaraksiyonu Dondurulmuş ya da taze tam kandan DNA ekstraksiyonu HFE genlerin uygun kısımlarının amplifikasyonu Reverse hibridizasyonu 13

3 İnkübasyon için talimatlar Yarıklar içinde sıvı değiştirmek için talimatlar Notlar ve önlemler Denatürasyon ve hidridizasyon prosedürü Sıkı yıkama prosedürü Boyanma prosedürü SONUÇLARIN YORUMLANMASI Kalite Kontrol Yorum SORUN GİDERME CİHAZ LİMİTLERİ CİHAZ PERFORMANSLARI Özgünlük BIBLIYOGRAFYA 20

4

5 1 ÜRÜN BİLGİSİ Bu kullanıcı kılavuzu aşağıdaki ürünlerin kullanımı için bilgiler içerir: HEMO STRIP KOMPLET (Kod C) Reverse hibridizasyon testi (RHA) ile hemokromatoz ilişkili HFE genlerdeki mutasyonların eş zamanlı tespiti ve tanımlanması için komplet sistem. Tanımlanan mutasyonlar: C282Y; H63D; S65C. Kit, striplerde reverse hibridizasyon (RHA) ile DNA ekstrasksiyonu, amplifikasyonu ve tespiti için tüm reaktifleri içerir. Kod Ürün Format 09-11C-20 HEMO STRIP COMPLETE 20 test HEMO STRIP (Kod A) Reverse hibridizasyon testi (RHA) ile hemokromatoz ilişkili HFE genlerdeki mutasyonların eş zamanlı tespiti ve tanımlanması için kit. Tanımlanan mutasyonlar: C282Y; H63D; S65C. Kit, striplerde reverse hibridizasyon (RHA) ile DNA ekstrasksiyonu, amplifikasyonu ve tespiti için tüm reaktifleri içerir. Kod Ürün Format 09-11A-20 HEMO STRIP 20 test HEMO STRIP (Kod R) Reverse hibridizasyon testi (RHA) ile hemokromatoz ilişkili HFE genlerdeki mutasyonların eş zamanlı tespiti ve tanımlanması için kit. Tanımlanan mutasyonlar: C282Y; H63D; S65C. Kit, striplerde reverse hibridizasyon (RHA) ile DNA ekstrasksiyonu, amplifikasyonu ve tespiti için tüm reaktifleri içerir. Kod Ürün Format 09-11R-20 HEMO STRIP 20 test Sayfa.1

6 2 KİT İÇERİĞİ NOT: Kit içeriğinde farklı kodlarda (A ya da R) farklı komponentler bulunur. (kısaltma: X= kit içeriğinde bulunan komponent; 0= kit içeriğinde bulunmayan komponent) KUTU F* 20 C DE SAKLANIR kod C kod A kod R AÇIKLAMA ETİKET TÜP (T) YADA KAPAK RENGİ 20 test X X 0 X X 0 Amplifikasyon Miks (10X Buffer,MgCl2 ve dntp içeren) Thermostabile Taq DNA polimeraz Martermiks Sarı 2 X 520,5 μl AB Taq 5 U/μL Kırmızı 1 X 20 μl X X 0 Mineral yağ Mineral yağ 1 X 1 ml X 0 0 Proteaz Proteaz R 37/38/41/42 S 23/24/26/36 37/39/46 Yeşil 5 X 100 μl KUTU A +15 / +25 C DE SAKLANIR kod C kod A kod R AÇIKLAMA ETİKET TÜP (T) YADA KAPAK RENGİ 20 test X 0 0 Hücre Lizis Solüsyonu X 0 0 Yıkama Solüsyonu SOLÜSYON 1 R 22/36/38 S 13/26/36/46 SOLÜSYON 2 R 22/36/38 S 13/26/36/46 1 X 6 ml 1 X 22 ml X 0 0 Yıkama Solüsyonu SOLÜSYON 3 1 X 21 ml X 0 0 Elüsyon Solüsyonu Elüsyon Solüsyonu 1 X 6 ml X 0 0 Filtre kolonlar 20 X ml tüpler 40 Sayfa.2

7 KUTU R +2 / +8 C DE SAKLANIR kod C kod A kod R AÇIKLAMA ETİKET TÜP (T) YADA KAPAK RENGİ 20 test X X X X X X Primer Miks PRIMER MIKS (PM) Mavi 1 X 300 μl Spesifik problara bağlı Nitroselülöz strip Hemo-Strip 20 X X X EDTA (Etilen-diamin-tetraasetik asit) alkalin solüsyonu) Denatürasyon Solüsyonu 1 X 300 μl X X X Sodyum dodesil sulfat (SDS) solüsyonu Hibridizasyon solüsyonu 1 X 75 ml X X X Sodyum dodesil sulfate (SDS) solüsyonu Sıkı Yıkama Solusyonu 2 X 100 ml X X X Koruyucu olarak 0.01% MIT *, 0.1% CAA* ve protein stabilizörleri içeren Tris-bufferda alkaline fosfataz ile streptavidin işaretli 100X konsantre solüsyon KONJUGATE 100X 1 X 750 μl X X X X X X X X X X X X X X X Dimetil sülfatta 100X konsantre 5- Brom-4-klor-3-indolil-fosfat (Xfosfat) 4-toluidin salt ve 4-Nitro mavi tetrazolyum klorür solüsyonu NaCl, Triton, protein stabilizör ve koruyucu olarak 0.01% MIT *, 0.1% CAA* içeren fosfat buffer. NaCl, MgCl2 ve koruyucu olarak 0.01% MIT *, 0.1% CAA* içeren Tris-buffer. NaCl, Triton ve koruyucu olarak 0.01% MIT *, 0.1% CAA* içeren Tris-buffer. NBT/BCIP TOXIC R /21 36 S /37 Konjugate diluent Substrate Buffer Yıkama Solüsyonu 1 X 750 μl 1 X 75 ml 2 X 75 ml 1 X 90 ml Her birinde 8 oluk içeren İnkübasyon tray 3 *kısaltmalar: MIT = Methyl-isothiazolone, CAA = Chloroacetamide. Triton is a registered trademark of Röhm e Haas Co Sayfa.3

8 3 REAKTİFLERİN SAKLANMASI VE STABİLİTESİ Kitin her bir komponenti, tekli kutuların etiketlerinde belirtilen talimatlara göre saklanmalıdır. Özellikle: F* kutusu -20 C de saklanır R kutusu +2/+8 C de saklanır A kutusu +15/+25 C de saklanır Önerilen sıcaklıkta saklandığında, tüm test reaktifleri son kullanım tarihine kadar stabil kalır. Proteaz (sadece kit kod.09-11c içerir) 4 örneğin ekstraksiyonu için yeterli miktarda hazırlanır. Proteaz -20 C'de muhafaza edilmelidir. Tekrarlanan dondurma / çözdürmeden döngüsünden kaçının çünkü aktiviteleri azaltabilir. Box R de test stripleri içeren tüpler ve bütün reaktifler kullanım öncesi oda sıcaklığında (20-25 C) olmalıdır ve kullanım sonrası hemen dondurucu içine geri konulmalıdır. Denatürasyon Solüsüyonu içeren şişe kullanımdan sonra hemen kapatılmalıdır; bu solüsyonun uzun süreli hava ile teması hızlı bozulmaya neden olur. Geliştirilmiş, kuru stripler karanlıkta ve oda sıcaklığında saklanmalıdır (20-25 C). Farklı lotlardaki reaktifleri karıştırmayın. 4 KULLANIM İÇİN ÖNLEMLER Bu kit sadece in vitro kullanım içindir. Kit; moleküler biyoloji tekniklerini diagnostikte uygulama eğitimi almış ve deneyimli araştırmacı tarafından kullanılmalıdır; Kit prosedürüne başlamadan önce kullanım kılavuzunu dikkatlice ve tamamen okuyun; Ürünleri ısı kaynağından uzakta tutun; Son kullanım tarihi geçmiş kit parçalarını kullanmayın; Saklama koşulları, kutu bütünlüğü ya da yöntem uygulaması ile ilgili her hangi bir şüpheniz olduğunda, kit kullanmadan önce AB ANALITICA teknik destek ile bağlantı kurun: laboratorio@abanalitica.it ; Nükleik asitlerin amlifikasyonunda, araştırmacı aşağıdaki özel önlemleri almalıdır: Filtreli uç kullanın; Biyolojik örnekler, saflaştırılmış DNA, kit içeriğindeki referans DNA ve tüm amplifikasyon ürünleri, amplifikasyon reaktiflerinden farklı bir yerde saklanmalıdır. PCR öncesi ve sonrası için farklı alanlar hazırlayın ve iki alan arasında materyal (pipetler, uçlar, tüpler, vs.) paylaşımı yapmayın. Sayfa.4

9 Sık sık eldiven değiştirin. Benç yüzeyini %5 sodyum hipoklorit ile temizleyin. Ekstrakte edilmiş DNA kısa bir zaman için +2 / +8 C de saklanmalı veya uzun bir zaman için -20 C de dondurulmalıdır. Kullanmadan önce PCR premiksi (Kod.09-11C ve 09-11A kitleri içerir) oda ısısında eritin; Taq DNA polimeraz ekleyin ve oda ısısında ya da buz kabında oldukça hızlı DNA purifiye edin. 5 GÜVENLİK KURALLARI 5.1 Genel Güvenlik Kuralları Reaktifler ve klinik örnekler ile çalışırken tek kullanımlık eldiven kullanın ve çalışma bitiminde ellerinizi yıkayın. Ağızla pipetleme yapmayın. Bilinen hiçbir diagnostik yöntem enfektif faktörlerin yok olduğunu garanti etmez. Tüm klinik örnekleri potansiyel enfeksiyonu ajanı olarak kabul edip o şekilde kullanmak gerekir; Klinik örnekler ile direk temasta olan cihazların kontaminasyonlu olduğu ve bu şekilde kullanılması gerektiği göz önüne alınmalıdır. Örneklerin kazara etrafa dökülmesi durumunda, %10 Sodyum Hipoklorit ile temizleyin. Temizlenmiş materyaller, kontamine ürünler için olan özel konteynerlere atılmalıdır. Klinik örnekler, materyaller ve kontamine ürünler aşağıdaki dekontaminasyondan sonra atılmalıdır: 30 dakika %5 Sodyum Hipoklorit (1 volüm %5 Sodyum Hipoklorit solüsyonu her bir 10 hacim kontaminasyonlu sıvı için) solusyonuna batırılmalı YA DA en az 2 saat 121 C de otoklavlanmalı (NOT: Sodyum Hipoklorit içeren solüsyonları otoklavlamayın!!) 5.2. Kit Hakkında Güvenlik Kuralları Bu kit kullanımı için riskler tekli komponentler ile ilişkilidir: Sayfa.5

10 Tehlikeli Komponentler: Dimetilformamit içinde BCIP/NBT (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (X phosphate) 4-toluidine salt ve 4-nitro blue tetrazolium chloride (NBT) Risk tanımı: T (Toksik) RİSK İBARESİ VE S İBARESİ R 61 R 45 R 20/21 R 36 R 53 S 45 S 36/37 Hamile kadınlarda çocuğa zarara neden olabilir Kansere neden olabilir Solunduğunda zararlıdır/deri ile teması zararlıdır Gözler için tahriş edici. Maruz kalmadan kaçının Kaza veya rahatsızlık durumlarında, doktora başvurun ve paket etiketini gösterin. Koruyucu giysi ve uygun eldivenler kullanın. Denatürasyon Solüsyonu Sodyum Hidroksit içerir. Risk tanımı: Xi Tahriş edici RİSK İBARESİ VE S İBARESİ R 36 ve R 38 S Gözler için tahriş edici. Deri için tahriş edici. Buharını solumayınız. Deri ile temasından kaçının. Gözler ile temas etmesi halinde, bol su ile yıkayın ve doktora başvurun. 100X KONJUGATE, KONJUGATE DILUENT SUBSTRAT BUFFER YIKAMA SOLÜSYONU Koruyucu olarak MIT / CAA içerir. (MIT = Methyl-isothiazolone, CAA = Chloroacetamide) Risk tanımı: Xi Tahriş edici RİSK İBARESİ VE S İBARESİ R 43 S Deri ile teması sensitizasyona neden olur. Deri ile temasından kaçının / Laboratuar giysisi giyin. Sayfa.6

11 Solüsyon 1 ve Solüsyon 2 (sadece 09-11C kodlu kit içerir) Solüsyon 1 ve 2 guanidin hidroklorür içerir. Risk tanımı: T (Toksik) ve Xi Tahriş edici RİSK İBARESİ VE S İBARESİ R 36 ve R 38 S Göz ve cilt için tahriş edicidir. Buharı solumayın. Deri ile temasından kaçının. Göz ile teması durumunda hemen bol su ile yıkayın ve doktora başvurun. Proteaz (sadece 09-11C kodlu kit içerir) Risk tanımı: Xi Tahriş edici ve sensitizasyona neden olur. RİSK İBARESİ VE S İBARESİ R 37/38 and R S S 36/37;S Solunum sistemi ve cilt için tahriş edicidir. Soluma ile sensitizasyona neden olur. Gözlere ciddi zara riski. Tozu solumayın. Deri ile temasından kaçının. Göz ile teması durumunda hemen bol su ile yıkayın ve doktora başvurun. Laboratuar giysisi ve tek kullanımlık eldiven kullanın. Göz ve yüz koruyucu giyin. Kaza veya rahatsızlık durumlarında, doktora başvurun ve paket etiketini gösterin. Kitin materyal güvenlik bilgi formu (MSDS) istendiğinde elde edilebilir. 6 KİT İÇERİĞİNDE BULUNMAYAN GEREKLİ MATERYALLER 6.1 Reaktifler DNA ekstraksiyonu için reaktifler (Kod A ve 09-11R için gerekli) Steril, DNase ve RNase-serbest su; Distile su; 96% 100% Etanol (Kit kod C için gerekli) Amplifikasyon için reaktifler (Kod R için gerekli). 6.2 Cihazlar Laminar flow kabini (kontaminasyondan korunmak için reaksiyon kurulurken kullanılması önerilir; ekstrakte DNA eklenirken başka bir laminar flow kabini kullanılması önerilebilir); Mikropipetler (aralık: 0,2-2 μl; 0,5-10 μl; 2-20 μl; μl; μl); Sayfa.7

12 Thermalcycler; Çalkalama platformu ile su banyosu (80 rpm; eğimli kapak ile; 50 C ± 0,5 C ayarlanabilir) Manyetik ısıtıcı karıştırıcı ya da mikrodalga; Mikrosantrifüj (max rpm); Hibridizasyon kuyucuklarından likit aspirasyonu için cihaz Dağıtıcı multipipet (opsiyonel). Vorteks; Orbital, resiprokal ya da salıncak platformlu shaker. 6.3 Materyaller Tek kullanımlık eldivenler; Mikropipetler için steril filtreli uçlar (aralık: 0,2-2 μl; 0,5-10 μl; 2-20 μl; μl; μl); Stripi tutmak için pens; Dereceli silindirler (10, 25, 50 ve 100 ml); 7 ÖN MUAMELE VE REAKTİF HAZIRLAMA PROSEDÜRÜ 7.1 Genomik DNA ekstraksiyon NOT: DNA ekstraksiyon reaktifleri sadece kit 09-10C da bulunur. Proteazi eritin. Reaktifin tekrar dondurulma/eritilmesinden kaçının; 56 C de su banyosunda ön-ısıtma yapın. 7.2 HFE genlerin uygun kısımlarının amplifikasyonu NOT: Maktermiks sadece kit kod.09-11c ve 09-11A de bulunur. Mastermiksi eritin. Amplifikasyon reaksiyonunun tüm kurulumu sırasında reaktifler buzda tutulmalıdır. 7.2 Reverse hibridizasyon için reaktifler Kullanmadan önce tüm test materyallerinin oda ısısında (20-25 C) erimesine izin verin. Hibridizasyon Solüsyonu ve Sıkı Yıkama Solusyonu en az 37 C ye kadar önısıtılmalıdır (tüm kristaller kullanılmadan önce çözdürülmelidir) fakat hibridizasyon ısısı 50 C nin üzerine çıkmamalıdır. Konsantre Rinse Solusyonunu 1:5 seyrelterek Rinse Solüsyonunu hazırlayın (1 hacim konsantre solüsyon + 4 volüm distile ya da deiyonize su). Her bir test oluğu için 8 ml Rinse Solüsyonu + 10 ml fazladan hazırlayın. Hazırladıktan sonra, seyreltilmiş Rinse Solüsyonu +2/+8 C de saklanırsa 2 hafta stabildir. Konsantre Konjugatı 1:100 Konjugat Diluentte seyrelterek Konjugat solüsyonu hazırlayın. Sayfa.8

13 Her bir test oluğu için 2 ml Konjugat Solüsyonu + 2ml fazladan hazırlayın (konjugat solüsyonu sıkı yıkama aşaması sırasında hazırlanabilir). Konsantre NBT/BCIP solüsyonu Substrat Bufferda 1:100 seyrelterek Substrat solüsyonunu hazırlayın. Her bir test oluğu için 2 ml Sustrat Solüsyonu + 2ml fazladan hazırlayın (substrat solusyonu sıkı yıkama aşaması sırasında hazırlanabilir). Konjugat ve substrat solüsyonu hazırlamak için kullanılan tüm şişeler iyice temizlenmelidir ve distile su ile yıkanmalıdır. Hazırlanmasından sonra, seyreltilmiş Konjugat ve Substrat solüsyonları karanlıkta oda ısısında (20 / 25 C) 8 saat stabil kalır. 8 GİRİŞ Hemokromatozis (HH) daha çok Kafkas nüfusunun yaklaşık % 0,2-0,5 etkileyen demir metabolizmasının otozomal resesif bir bozukluğunu kapsayan bir hastalıktır. Hemokromatoz birçok organda anormal demir birikimi ile vücudun tümünde demir depolanmasında progresif bir artış özelliğine sahiptir. HH hastalarında, aşırı demir çeşitli organlarda birikir ve bu organlarda karaciğer sirozu, şeker hastalığı, kardiyomiyopati, artrit ve hipogonadizm gibi ciddi hastalıklara neden olur. Organlarda demirin aşırı birikiminden kaynaklanan hasar yıllarca belirgindir, çünkü demir ihtiyacı yaş ile de azalır: hemokromatoz genellikle yaşın dördüncü-beşinci yılında teşhis edilir. Hemokromatozisin erken teşhisi çeşitli organlara geri dönülmez zarara neden olmaz (genellikle karaciğer, çünkü siroz en tehlikeli ve komplikasyonları hayatı en çok tehdit edendir) ve genetik olarak etkilenen bir birey hasta olmayabilir. Erken bir teşhis ve uygun tedavi çok önemlidir. Tedavi oldukça basittir ve fazla demiri elimine etmek için haftalık kan alınır (yaklaşık 400 ml kan bağışına eşdeğeri). Kanamalar eritropoiez uyarır ve kaybedilenlerin yerine kırmızı kan hücrelerinin üretimini sağlar bu durum demir ihtiyacı için organlarda demir depolarını harekete geçirir. Teşhise bağlı olarak tedavi yıllar boyu sürebilir. Bir hemokromatoz-ilişkili gen, 1996 yılında (Feder JN et al., 1996) tespit edildi ve yayınlandı. Bu gen HLA-A lokusunun yanında 6.kromozomun kısa kolunda bulunan HFE olarak bilinmektedir. Bu gende oluşan bir mutasyon, bağırsak mukoza arasında demir taşıyıcısı olan transferrin reseptörü ile etkileşimi mümkün olmayan mutasyona uğramış bir proteinin sentezine neden olmaktadır. Bağırsakta demir emilimini arttırmak için katkıda bulunan mutasyona uğramış HFE proteininin tam mekanizması tamamen açık değildir. HFE iki mutasyonu en çok HH ile ilişkilidir. Bunlar amino asit 282 (C282Y) de tirozin ile sistein in yer değiştirmesine neden olan G/A mutasyon ve amino asit 63 (H63D) de aspartat ile histidin in yer değiştirmesine neden olan C/G mutasyonudur. HH sahip çoğu bireyde (ABD de %, Kuzey Avrupa da 85%,Güney Avrupa'da % 65) yanlış anlamlı (missense) mutasyon C282Y için homozigot vardır. Az sayıda bileşik veya çift heterozigotlardır (C282Y/H63D). Üçüncü bir mutasyon, A / T mutasyon, amino asit 65 (S65C) de sistein ile serin yer değiştirmesi sonucu tanımlanmıştır ancak klinik olarak henüz tam olarak bilinmemektedir. Nüfusta HFE gen ve HH hastalığı sıklığı bilinir ve C282Y homozigot hali etkililiği çok değişkendir. Kafkas nüfusta C282Y için heterozigot 13% iken homozigot yaklaşık 0.5% dir. Kafkas olmayan nüfusta yayılma daha azdır. Sayfa.9

14 Kafkas nüfusunun yaklaşık 2% si 25% heterozigot iken H63D dir ve 2% si çift homozigot C282Y/H63D dir. Son yıllardaki çalışmalar gösteriyor ki hemokromatozin yaklaşık 8% i iki sık görülen mutasyonların çoğunlukla çift heterozigot C282Y olarak diğer mutasyonlar,özellikle S65C, ya da diğer az görülen mutasyonlar için negatiftir. Mutasyon tip 1 hemokromatoz veren HFE genidir. Son zamanlarda, demir birikimine sahip diğer hastalıklar (hemokromatoz tip 2, 3 ve 4), HFE gen ile ilgili olmayan, açıklanmamıştır. Bu hemokromatoz tipleri tip 1 hemokromatozdan sonra araştırıldı. Teşhis laboratuarları için, transferrin saturasyon değerlendirmesi yararlıdır, hemokromatoz vakalarının 50% den fazlası kadınlarda ve 60% si erkeklerde görülür. Bu test demir birikimine neden olan diğer hastalıklardan kaynaklanan değişmiş değerlerden dolayı spesifik değildir (hematopathies, toksik kökenli hepatopathies). Hepatopathies, neoplasies, vs yokluğunda yüksek ferritin düzeyleri hemokromatoz gösterir fakat tam teşhis vermez. Hemokromatoz un onaylı teşhisi sadece bir kan örneğinden alınan biomoleküler teşhis (DNA amplifikasyonu veya DNA sıra tekniği) ile yapılır. 9 TEST PRENSİBİ PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) literatürlerde ilk DNA amplifikasyonu metodudur. (Saiki RK ve arkadaşları, 1985). Thermostable DNA polymerase ile DNA nın spesifik bir parçasının (hedef dizi) in vitro amplifikasyon reaksiyonu olarak tanımlanabilir. Reaksiyonda nükleik asitin üç segmenti yer alır: Amplifiye olması için çift iplikli DNA kalıbı (hedef DNA) ve iki tek iplikli oligonükleotid primerler kalıp DNA ya spesifik olarak dizayn edilmiştir. DNA polymerase primerler tarafından işaretlenen bölgeden sentez işlemine başlar ve solüsyonda serbest olarak bulunan tamamlayıcı nükleotidlerin (dntpler) eklenmesi ve bağlanması ile orjinal çift iplikli hedef DNA bölgesi ile aynı olan yeni çift iplikli DNA molekülünü sentezler. Çeşitli sikluslardan sonra, hedef diziye uygun olan milyonlarca DNA molekülü oluşturabilir. Bu testin duyarlılığı, laboratuar tanısında uygulamaya olanak sağlar. Strip üzerinde immobilize spesifik prob ile işaretli amplifiye ürünlerin sonraki hibridizasyonu (alel spesifik hibridizasyon/ Reverse Dot Blot) farklı mutasyonları ayırt edebilir. 10 ÜRÜN TANIMI HEMO STRIP metodu reverse hibridizasyon prensibine dayanır. Hemokromatoz tip 1 ile ilgili mutasyonların varlığını tespit etmek için, HFE geninin uygun kısımları multipleks PCR tarafından amplifiye edilir. Denature biotinli amplikonlar, membran stripinde paralel hatlarda immobilize olan spesifik oligonukleotid problar ile hibridize olur. Hibridizasyon ve sıkı yıkamadan sonra, streptavidin konjuge alkaline fosfataz eklenir ve önceden oluşan biotinli hibide bağlanır. BCIP/NBT kromojen ile inkübasyon mor bir presipitat üretir ve görünüşte yorumlanabilen bir sonuç oluşturur. HEMO STRIP kit ile aşağıdaki mutasyonlar tespit edilebilir: C282Y, H63D ve S65C; sonuç yorumlama homo- yada hetero-zigosity değerlendirmeye izin verir. Sayfa.10

15 Şekil 1: HEMO STRIP üzerinde spesifik probların lokalizasyonu. Boyama kontrol çizgisi oryantayon için stripin en üstünde çizilmiştir. 11 ÖRNEKLERİN TOPLANMASI, MANİPULASYON VE ÖN HAZIRLIKLARI HFE genlerin mutasyonlarının araştırılması periferik tam kandan başlayarak yapılır. Örnek toplama genel sterilite önlemlerini takip etmelidir. Kan EDTAlı olarak alınmalıdır. Heparin gibi diğer koagülasyon ajanları TAQ polymerase ın güçlü inhibitörleridir ve bu yüzden amplifikasyon reaksiyonunun verimliliğini bozar. Taze kan +2/+8 C de saklanabilir (toplanmadan 4 saat içinde kullanılmalıdır); eğer uzun saklama gerekliyse örnek -20 C de dondurulmalıdır. 12 PROTOKOL 12.1 DNA ekstraksiyonu Saf ve integral DNA nın ekstraksiyonunu sağlayan başka DNA ekstraksiyon yöntemi de kullanılabilir. NOT: Aşağıdaki DNA ekstrasksiyon protokolu sadece kod.09-11c kit için tanımlanmıştır Taze veya dondurulmuş tam kandan DNA ekstraksiyonu ml bir tüpe 20 μl Proteaz ekleyin μl dondurulmuş yada taze tam kandan ekleyin (EDTA ile işlenmiş) 3. Vorteksleyin ve Solüsyon 1 karıştırın; sonra bu solüsyondan 200 μl numuneye ekleyin. 15 dakika boyunca vorteksleyerek karıştırın dakika 56 C de inkübe edin., 5. Kapağın içinden damlacıkları kaldırmak için kısa bir süre santrifüjleyin; sonra 200 μl Etanol (96%-100%) ekleyin ve 15 saniye vorteksleyerek karıştırın. 6. Kısa bir süre santrifüjleyin; sonra filter kolonunun içine karışımı aktarın; kapağı kapatın ve 1 dakika boyunca 8000 rpm de santrifüj edin. 7. Yeni bir 2 ml tüpe filter kolonunu aktarın ve filtrat içeren kolonu atın. 8. Filtre kolonunun kapağını açın ve 500 μl Solüsyon 2 ekleyin; kapağını kapatın ve 1 dakika 8000 rpm de santrifüj edin. Sayfa.11

16 9. Yeni bir 2 ml tüpe filter kolonunu aktarın ve filtrat içeren kolonu atın. 10. Filtre kolonunun kapağını açın ve 500 μl Solüsyon 3 ekleyin; kapağını kapatın ve 3 dakika rpm de santrifüj edin. 11. Filtrat ile filtrenin en alt bölümünün ıslak olmamasına dikkate ederek 1.5 ml tüp içine filtre kolonunu aktarın. Kısa bir süre için santrifüjleyin. 12. Filtre kolonunun kapağını açın ve 200 μl Elüsyon Solüsyonu veya steril distile su ekleyin. 1-5 dakika oda sıcaklığında inkübe edin ve sonra 1 dakika 8000 rpm de santrifüj edin. Filtratda bulunan ekstre edilmiş ve saflaştırılmış DNA eğer 20 C de saklanırsa, en az 1 yıl için stabilidir HFE genlerin uygun kısımlarının amplifikasyonu NOT: Amplifikasyon için mastermiks sadece kit 09-10C ve 09-11A da bulunur. Aşağıdaki reaksiyon miskini hazırlayın: N= örnek sayısı N X 34,7 μl N X 10 N X 0,3 μl Mastermiks PRIMER MIKS (PM) AB Taq Tüm reaktifler ile karıştırın, kısa bir süre santrifüjleyin ve N steril içinde 45 μl miks bölünür. Amplifikasyon için her bir tüpe ekleyin: 5 μl Ekstrakte DNA 2 damla Mineral Yağı Her bir deneyde kontaminasyonları izlemek için bir negatif kontrol içermesi önemlidir (mikse ekstrakte DNA yerine distile su ekleyin). Mikrotüpleri aşağıdaki thermalcycler programına koyun: 1 döngü 94 C 5 dak. 40 döngü 94 C 60 C 72 C 30 sn 45 sn 45 sn 1 döngü 72 C 5 dak. Saklama 4 C Amplifikasyon ürünleri fragmanları uzunluğu: Sayfa.12

17 C282Y S65C H63D 116 bp 168 bp 168bp Elde edilen amplifikasyon ürünleri hemen hibridizasyon aşamasında kullanılmalıdır ya da kullanılana kadar -20 C de saklanmalıdır Reverse hibridizasyon İnkübasyon için talimatlar - Hibridizasyon ve sıkı yıkama inkübasyonları tamamen 50 C de yapılmalıdır ve yanlış pozitif sonuçlardan (eğer sıcaklık çok düşükse) ya da yanlış negatif/düşük sinyal sonuçlardan (eğer sıcaklık çok yüksekse) kaçınmak için en kritik aşamadır. Eğimli kapağı olan çalkalamalı su banyosu sıcaklık değişimlerini kontrol etmek için iyidir. Kalibreli termometre ile sıkı sıcaklık takibi gereklidir. - Sıcak hava çalkalayıcı hibridizasyon ve sıkı yıkama için kullanılmamalıdır. - Çalkalamalı su banyosu (hibridizasyon aşaması) ve orbital, resiprokal çalkalayıcı ya da salıncak platformu (boyama aşaması) tarafından meydana getirilen hareketin büyüklüğü maksimum duyarlılık ve homojen boyama başarısı için kritiktir. Hareketin büyüklüğü, hem sıvının hem de test stripinin oluk içinde ileri geri hareketi için yüksek olmalıdır. Ayrıca, sıvının olukların kenarından sıçramasını da önlemelidir. - Hibridizasyon ve sıkı yıkama için oluklar su banyosunun sallama platformu üzerinde olmalıdır. Su seviyesi oluklarun 1/3 ve ½ yüksekliğine ayarlanmalıdır. Olukların suyun içinde yüzmediğinden emin olun. Su direk tepsisi ile temasta olmalıdır. - Daima inkübasyon sırasında su banyosunun kapağı kapalı olmalıdır. - Tepsiyi kapatmayınız Oluklardaki sıvının değiştirilmesi için talimatlar - Sıvı, tercihen aspiratöre bağlı pipet ile oluklardan aspire edilmelidir. Tepsi sıvının bir köşeye akmasını sağlayacak açı ile tutulmalıdır. - Her bir oluğa uygun solüsyondan 2 ml ekleyin ve protokole devam edin. NOT: Dağıtıcı multipipet (Eppendorf gibi) bu amaç için yararlıdır. - Bu aşamayı test protokolünde belirtildiği kadar tekrar edin. - Striplerin yıkama aşamaları arasında kurumasına izin vermeyin. - Sıvı aspirasyonu sırasında striplerin yüzeylerinin zarar görmediğinden emin olun. Tercihen, sıvıyı stripteki markır çizgisinin üzerinden aspire edin. - Tüm striplerin tamamen solüsyon altına batıp yıkandığından emin olun. - Eğer gerekli ise shaker hızını değiştirin Notlar ve önlemler - Test striplerinin kaplı yüzleri (bu kısım işaretlidir) yukarı gelecek şekilde oluklara yerleştirildiğinden emin olun. Sayfa.13

18 - Test striplerini tanımlarken kalem kullanın. Diğer işaretleyicileri kullanmayınız. Tanımlama numaralarını markır çizgisinin üzerine yazın. - Striplere elle dokunmayın, temiz pens kullanın. - Her bir örnek için yeni bir filtreli uç kullanın. - Stripler güçlü gün ışığından ve ısıdan uzakta saklanmalıdır. - Yorumlamadan önce stripleri karanlıkta tamamen kurutun Denatürasyon ve hibridizasyon prosedürü Bu test aşağıdaki prosedüre göre manuel olarak yapılabilir. NOT: Farklı inkübasyon aşamaları boyunca, test stripleri aynı oluk içinde tutulmalıdır. 1. Çalkalamalı bir su banyosunu tamamen 50 C ye ısıtın. Kalibreli termometre kullanarak sıcaklığı kontrol edin ve eğer gerekirse sıcaklığı ayarlayın. Hibridizasyon Solüsyonu ve Sıkı Yıkama Solüsyonunu en az 37 C ve 50 C yi geçmeyecek şekilde ön-ısıtın yapın. Kullanmadan önce karıştırın, tüm kristaller çözülmelidir. 2. Pens kullanarak gerekli miktarda stripi tüplerden alın (her bir örnek için bir strip) ve kalem kullanarak markır çizgisi üzerine tanımlama numaralarını yazın. 3. Gerekli miktarda test oluğu alın (her bir strip için bir oluk) ve tepsi içine yerleştirin. 4. Figür 2 de (aşama 1)gösterildiği gibi her bir oluğun üst köşesine 10 μl Denatürasyon Solusyonu (DS) ekleyin. NOT: Kullandıktan sonra hemen şişe kapaklarını kapatın. 5. Denaturasyon Solüsyonuna 10 μl biotinli amplifikasyon ürünü ekleyin ve pipet yardımı ile dikkatlice karıştırın (Figür 2, Aşama 2). Daima steril filtreli uç kullanın. Oda ısısında (20-25 C) 5 dakika inkübe edin. 6. Ön-ısıtılmış Hibridizasyon Solüsyonunu çalkalayın ve amplifikasyon ürünlerini denatüre etmek için herbir oluğa 2ml ekleyin. Dikkatlice çalkalayarak karıştırın (Figür 2, aşama 3). Pipetleme sırasında komşu oluğu kontamine etmemeye özen gösterin. 7. Stirpleri işaretli yüzleri yukarı bakacak şekilde hemen oluklara yerleştirin. Stripler tamamen solüsyon içine gömülmelidir. NOT: Tek kullanımlık eldiven ve pens kullanın. 8. Tepsi 50 C deki çalkalamalı su banyosuna koyun (yaklaşık 80 rpm, İnkübasyon için talimatlara bakın), kapağını kapatın ve 60 dakika inkübe edin. NOT: Su banyosundan suyun olukların içine sıçramasına engel olun. Su seviyesi olukların 1/3 ve ½ yüksekliğine ayarlanmalıdır. Tepsi kaymasını önlemek için iki ağırlık ile tepsiyi hareketsiz hale getirin. Sayfa.14

19 10 μl denaturasyon solüsyonu 10 μl amplifikasyon ürün ekleyin 2 ml hibridizasyon solüsyon ekleyin Olukların içine stripi koyun oluk PİPETLEYEREK KARIŞTIRIN Şekil 2: Denatürasyon ve hibridizasyon aşamaları Sıkı Yıkama Prosedürü 9. Hibridizasyondan sonra tepsiyi su banyosundan alın. 10. Tepsiyi küçük bir açı ile tutun ve tercihen bir vakum aspiratöre bağlı pipet ile sıvıyı oluklardan aspire edin. Her bir oluğa 2 ml ön-ısıtılmış Sıkı Yıkama Solüsyonu ekleyin ve oda ısısında saniye çalkalayarak yıkayın. Her bir oluktan sıvıyı aspire edin. 11. Bu yıkama aşamasını tekrar edin (oluklardaki sıvıyı değiştirme talimatlarına bakın). 12. Sonunda, solüsyonu aspier edin ve her bir stripi 2 ml ön-ısıtılmış Sıkı Yıkama Solüsyonunda 50 C çalkalamalı su banyosunda 30 dakika inkübe edin. Su banyosunun kapağını kapatın. NOT: Sıkı yıkama aşaması sırasında Durulama solüsyonu ve Konjugatı hazırlayın (reaktifleri hazırlama kısmına bakın) Boyama prosedürü Aşağıdaki tüm inkübasyonlar C de shakerda yapılmalıdır. 1. Her bir 2 ml seyreltilmiş Durulama solüsyonu ile iki kez 1 dakika yıkayın (reaktifleri hazırlama ve oluklarda sıvı değişimi talimatlarına bakın). Aspire edin. 2. Herbir oluğa 2 ml Konjugat solüsyonu ekleyin ve 30 dakika çalkalayarak inkübe edin. Aspire edin. NOT: Konjugat inkübasyonunun bitmesin 10 dakika kala Substrat solüsyonunu hazırlayın. (reaktifleri hazırlama kısmına bakın). 3. Her bir stripi 2 ml Durulama solüsyonu ile iki kez 1 dakika yıkayın ve 2 ml Subsrat Buffer ile bir kez daha yıkayın. Aspire edin. Sayfa.15

20 4. Her bir oluğa 2 ml Substrat solüsyonu ekleyin ve 30 dakika (karanlıkta) çalkalayarak inkübe edin. Aspire edin. 5. Stripleri 2 ml distile su ile çalkalayarak en az 3 dakika yıkayarak renk oluşumunu durdurun. 6. Pens kullanarak stripleri oluklardan alın ve emici kağıt üzerine koyun. Striplerin tamamen kurumasını sağlayın ve yorumlama kağıdına yapıştırın. En üst çizgi markır çizgisidir. Bu çizgi yorumlama kağıdında striplerin uygun sıra ile dizilmesini sağlar. 13 SONUÇLARIN YORUMLANMASI 13.1 Kalite Kontrol İlk pozitif çizgi Konjugat Kontrol çizgisidir (hemen markır çizgisinin altında). Bu çizgi prosedür sırasında Konjugat ve Substrat arasındaki reaksiyonu gösterir. Bu bant daima pozitif olmalıdır ve aynı test çalışmasında her bir stirpte yaklaşık aynı şiddette olmalıdır Yorumlama Temiz görünür çizgi olması pozitif reaksiyonu gösterir. Stripte pozitif olan tüm çizgi numaralarını tanımlayın ve yorumlama kağıdı ve aşağıdaki tabloyu kullanarak sonuçları belirleyin: Bant Prob reaktivitesi (1) (konjugat kontrol çizgisi; daima pozitif olmalıdır) wildtype 3 C282Y 4 63 wildtype + 65 wildtype 5 H63D and 65 wildtype 6 63 wildtype + S65C 7 H63D + S65C 14 SORUN GİDERME 1:Tüm striplerin konjugat kontrol çizgilerinde zayıf sinyal ya da sinyal olmaması Muhtemelen boyama aşamasında uygun olmayan miktarda Konjugat ya da Substrat eklenmiştir. Aynı stripler ile taze Konjugat solüsyonu ve taze Substrat solüsyonu hazırlayarak boyama aşamasını tekrar edin. Oda ısısı 20 C den düşük olmuştur. Laboratuarı doğru sıcaklığa ulaşana kadar ısıtın. Sayfa.16

21 2:Konjugat kontrol çizgisi hariç prob çizgisinde yanlış-negatif sonuç ya da oldukça zayıf sinyal. Hibridizasyon aşaması ya da sıkı yıkama sırasında sıcaklık çok yüksektir Hibridizasyon ve sıkı yıkama aşamaları sırasında su banyosunun sıcaklığını dikkatlice kontrol edin. Hibridizasyon solüsyonu ya da sıkı yıkama solüsyonu uygun şekilde ön-ısıtılmamış ya da karıştırılmamıştır. Hibridizasyon solüsyonu ve sıkı yıkama solüsyonunu uygun şekilde ön ısıtın ve karıştırın. Hibridizasyon için amplifikasyon ürünleri çok fazla seyreltildiğinden yetersiz amplifikasyon olmuştur. Amplifiye ürünlerin görünürlüğünü %3 agaroz jelde kontrol edin. 10 μl amplifiye ürün ekleyin. Jelde görünür olan PCR fragmanları stripte de temiz sonuçlar verir. Artmış DNA hedef miktarı ile amplifikasyonu tekrar edin. Ekstraksiyondan sonra elde edilen DNA solüsyonu saf değildir (O.D. 260/280 oranı çok düşüktür). Ekstraksiyon protokolünü doğru şekilde yaptığınızı kontrol edin ve yeni bir örnek ile doğru şekilde tekrar ekstraksiyon yapın. Ekstraksiyondan sonra elde edilen DNA solüsyonu kalan RNA içerir (O.D. 260/280 oranı çok yüksektir). RNase sindirim aşaması ile RNA yı uzaklaştırın. Thermalcycler doğru olarak programlanmamıştır: Termalcycler programının uygunluğunu ve kullanıcı kılavuzundaki sıcaklık profilini kontrol edin. Amplifikasyon miksine çok fazla DNA eklenmiştir: DNA örneğini seyreltin ve 10 kez az DNA ekleyerek amplifikasyonu tekrar edin. DNA ekstraksiyon aşaması sırasında problemler (kit kod.09-11a ve 09-11R için) Ekstraksiyon metodunun uygun olduğundan ve tüm bilgileri doğru şekilde takip ettiğinizden emin olun; Ekstraksiyon kitinin kullanıcı kılavuzundaki sorun giderme kısmına başvurun Yeni bir örnek ile doğru şekilde tekrar DNA ekstraksiyonu yapın. Eğer HEMO STRIP KOMPLET (kod C) kit kullanılırsa, lütfen aşağıdaki sayfadaki tabloya bakın. Olası nedenler Solüsyon 1 in yetersiz karışımından dolayı yetersiz hücresel lizis. Proteaz aktivitesinin azalmasından dolayı yetersiz hücresel lizis. Etanol (96%-100%), filtre kolonu içine transfer edilmeden önce lizate eklenmemiştir. Lökopenik hasta Filtre kolonlara transfer edilmeden Yorum ve Öneriler Yeni bir örnek ile ekstraksiyonu tekrarlayın; vorteksleyerek Solüsyon 1 ile örneği karıştırırken dikkat edin (Nokta 11, par. 11.1) Proteazdan bir miktar kullanarak yeni bir örnek ile ekstraksiyonu tekrar edin; solüsyonun tekrar dondurma/eritme işlemlerinden kaçının. Yeni bir örnek ile doğru şekilde ekstraksiyonu tekrar edin. Tam kan kullanmayın fakat örneğin lökosit fraksiyonu zengin olanı kullanın (buffy coat, Ficoll-Hypaque). Yeni bir örnek ile doğru şekilde ekstraksiyonu Sayfa.17

22 önce lizata Ethanol (%96-100) eklenmemiştir(nokta 6, par. 11.1) ya da düşük oranlı bir ethanol ile solüsyon kullanılmıştır. Filter kolonu 2 dakika boyunca oda sıcaklığında (+15 C/+25 C) inkübe edilmemiş olabilir (nokta 12, par.11.1). DNA etkili olarak elute edilememiştir. Solüsyon 1 ve 2 doğru olarak kullanılmamış olabilir. Fazla miktarda Elusyon Solusyonu ile Elusyon yapılmıştır. Elut içinde az miktarda DNA görülür. tekrar edin. Filtre kolon, Elüsyon Solüsyonu eklemeden önce oda sıcaklığında en az 1 saat inkübe edilmelidir. DNA elusyonunun etkisini artırmak için filtre kolonu oda ısısında 5 dakika inkübe edin. Her iki solusyonunda doğru sırada kullanıldığından emin olun. Yeni bir örnek ile doğru şekilde tekrar ekstraksiyon yapın. Yeni bir örnek ile doğru şekilde tekrar ekstraksiyon yapın. Amplifikasyon reaksiyonunun İyi sonuçları için gerekli DNA miktarı 180 ng. Eğer elute edilmiş DNA konsantrasyonu çok düşük ise (fotometrik ölçüm ile belirlenmiş), ekstraksiyonu 200 μl den düşük miktarda elusyon ile tekrar etmenizi öneririz. Eğer elusyon miktarı <200 μl ise, DNA konsantrasyonu elut içinde artar, fakat final ekstraktte görülen ürün azalır. 3:Yanlış-pozitif sinyaller (spesifik olmayan sinyaller). Hibridizasyon ve sıkı yıkama sırasında su banyosu sıcaklığı çok düşüktür. Spesifik sinyal elde etmek için hibridizasyon ve sıkı yıkama sırasında sıcaklığın 50 C ± 0.5 C olduğundan emin olun. Daima inkübasyon sırasında su banyosunun kapağı kapalı olmalıdır; Hibridizasyon solüsyonu ya da sıkı yıkama solüsyonu uygun şekilde ön-ısıtılmamış ya da karıştırılmamıştır. Hibridizasyon solüsyonu ve sıkı yıkama solüsyonunu uygun şekilde ön-ısıtın ve karıştırın. Renk gelişimi çok hızlıdır 15 dakika sonra renk gelişimini durdurun (önerilen 30 dakika yerine). Fazla şiddetli renk gelişimi yüksek arka plana ve/veya yanlış-pozitif sinyallere neden olabilir. Amplifikasyon miksine çok fazla DNA eklenmiştir: DNA örneğini seyreltin ve 10 kez az DNA ekleyerek amplifikasyonu tekrar edin. Eğer aynı aspesifik patern tüm striplerde görülüyorsa kontaminasyon olabilir. Tüm DNA ekstraksiyonunu ve PCR amplifikasyonunu taze hazırlanmış solüsyonlar ile tekrar edin. Sayfa.18

23 4:Stripin merkezinde renklenmeme ya da bant oluşmaması ya da homojen olmayan boyanma. Prosedür sırasında çalkalayıcı rotasyon hızı çok düşüktür. Aynı stripleri kullanarak boyama prosedürünü tekrar edin. Hızı artırın ve striplerin tamamen inkübasyon sıvısına gömülü olduğundan emin olun. 5:Güçlü arka plan Konjugat uygun olarak seyreltilmemiştir ya da konjugat fazlası uygun şekilde yıkanmamıştır. Aynı amplifiye materyalleri kullanarak dentaürasyon aşamasından başlayarak yeni stripler ile testi tekrar edin. Boyama aşamasında Durulama solüsyonu ile yıkama sırasında striplerin oluklarda ileri geri hareket ettiğinden emin olun. Yıkama zamanı en az 1 dakika olmalıdır. Oda sıcaklığı 25 C den yüksektir. Laboratuarı doğru sıcaklığa ulaşana kadar soğutun. Stripler substrat solüsyonunda çok uzun inkübe edilmişlerdir. Prosedürde belirtilen inkübasyon zamanını uygulayın. Daha fazla detaylı bilgi için AB ANALITICA teknik destek ile irtibata geçin. laboratorio@abanalitica.it, faks (+39) , ya da tel. (+39) CİHAZ LİMİTLERİ Kit performansı aşağıdaki durumlarda azalır: -Klinik örnekler kullanım için uygun değildir (doğru saklanmamış ya da heparin ile alınmış kan örnekleri) - Filtre kolonu örnekte ( 5x10 6 /200 μl den daha fazla) lökositlerin yüksek konsantrasyon nedeniyle tıkanabilir. 16 CİHAZ PERFORMANSI 16.1 Özgünlük En önemli bilgi bankasında uygulanan primer dizisi spesifik olmayan dizilerin yokluğunu değerlendirir. Eğer protokoldeki sert şartlar doğru olarak yapılırsa striplerdeki problar için de geçerlidir. Sayfa.19

24 17 BIBLIYOGRAFYA REFERANSLAR Feder JN, Gnirke A, Thomas W, Tsuchihashi Z, Ruddy DA, Basava A, Dormishian F, Domingo R Jr, Ellis MC, Fullan A, Hinton LM, Jones NL, Kimmel BE, Kronmal GS, Lauer P, Lee VK, Loeb DB, Mapa FA, McClelland E, Meyer NC, Mintier GA, Moeller N, Moore T, Morikang E, Wolff RK. Nat Genet. 13(4), , Saiki RK, S Scharf, F Faloona, KB Mullis, GT Horn, HA Erlich and N Arnheim, Science 230, , giugno Websites Sayfa.20

25 18 İLGİLİ ÜRÜNLER THROMBO STRIP KOMPLET: (Kod 09-10C) Faktör II, faktör V ve metilentetrahidrofolat redüktaz (MHTFR) kodlayan genlerdeki mutasyonların eş zamanlı belirlenmesi ve tanımlanması için reverse hibridizasyon test (RHA). Kit, striplerde reverse dot blot ile DNA ekstraksiyon, amplifikasyonu ve görüntülemei için reaktifler içerir. Kod Ürün Packg 09-10C-20 THROMBO STRIP COMPLETE 20 test THROMBO STRIP : (Kod 09-10A) Faktör II, faktör V ve metilentetrahidrofolat redüktaz (MHTFR) kodlayan genlerdeki mutasyonların eş zamanlı belirlenmesi ve tanımlanması için reverse hibridizasyon test (RHA). Kit, striplerde reverse dot blot ile DNA ekstraksiyon, amplifikasyonu ve görüntülemei için reaktifler içerir. Kod Ürün Packg 09-10A-20 THROMBO STRIP COMPLETE 20 test THROMBO STRIP : (Kod 09-10R) Faktör II, faktör V ve metilentetrahidrofolat redüktaz (MHTFR) kodlayan genlerdeki mutasyonların eş zamanlı belirlenmesi ve tanımlanması için reverse hibridizasyon test (RHA). Kit, striplerde reverse dot blot ile DNA amplifikasyonu için primerler ve görüntüleme için reaktifler içerir. Kod Ürün Packg 09-10R-20 THROMBO STRIP 20 test Sayfa.21

26

27 AB ANALITICA srl Via Svizzera PADOVA, (ITALY) Tel Fax info@abanalitica.it