KULLANICI KILAVUZU. Genequality P53 Kod 04-22A. SSCP ile p53 gen mutasyonlarını Tarama kiti A-25_ _TR.doc6

Transkript

1 KULLANICI KILAVUZU Genequality P53 Kod 04-22A SSCP ile p53 gen mutasyonlarını Tarama kiti

2

3 1. ÜRÜN BİLGİSİ 3 2. KİT İÇERİĞİ 4 3. REAKTİFLERİ SAKLAMA KOŞULLARI 6 4. KULLANIM İÇİN ÖNLEMLER 6 5. GÜVENLİK KURALLARI Genel güvenlik kuralları Kit hakkında güvenlik kuralları 8 6. KİT İÇERİĞİNDE OLMAYAN GEREKLİ MATERYALLER Reaktifler Cihazlar Materyaller REAKTİFLERİ HAZIRLAMA X TAE buffer hazırlama: X TBE buffer hazırlama: Gümüş boyama için solusyonları hazırlama ÖN-BOYAMA SOLUSYONU GELİŞME SOLUSYONU BOYAMA SOLUSYONU TESPİT ETME SOLUSYONU GİRİŞ TEST PRENSİBİ ÜRÜN TANIMI ÖRNEK TOPLAMA, MANİPULASYON VE ÖN-MUAMELESİ Kan Histolojik örnekler Histolojik örneklerin ön-muamelesi PROTOKOL 18 Page 1

4 12.1. DNA EKSTRAKSİYONU DNA AMPLİFİKASYONU Ekson A1-A2, B1-B2, C1-C2, D1-D2, E1-E2 amplifikasyonu AMPLİFİKASYON ÜRÜNLERİNİN GÖRÜNTÜLENMESİ Agaroz jel elektroforezi Jelde örnek yükleme Amplifikasyon sonuçlarının yorumlanması SSCP % poliakrilamid jel hazırlanması Gümüş boyama SSCP sonuçlarının yorumlanması SORUN GİDERME TEST LİMİTLERİ TEST PERFORMANSI Özgünlük Duyarlılık REFERANSLAR Web Siteleri 28 Page 2

5 1. ÜRÜN BİLGİSİ Var olan kılavuz aşağıdaki ürünler içindir: P53 (Kod 04-22A) SSCP ile p53 gen mutasyonlarının taranması için kit. Kit; DNA ekstraksiyonu, amplifikasyon, agaroz jel elektroforezi ile görüntüleme ve SSCP analizi için gerekli tüm reaktifleri ve pozitif kontrol içerir. Hedef bölge: p53 geni 5, 6, 7, 8 eksonları. Kod Ürün Pkg 04-22A-25 P53 25 test 04-22A-50 P53 50 test Page 3

6 2. KİT İÇERİĞİ KUTU P 20 C DE SAKLANIR AÇIKLAMA ETİKET TÜP (T) RENGİ YA DA KAPAK 25 test 50 test 8 test Tek doz premiks test-tüpü A Renksiz (T) Tek doz premiks test-tüpü B Mavi (T) Tek doz premiks test-tüpü C Sarı (T) Tek doz premiks test-tüpü D Kırmızı (T) Tek doz premiks test-tüpü E Yeşil (T) Thermostabil Taq DNA polimerase 10% Persulfat Amonyum solusyonu AB Taq 5 U/μL APS 10% Kırmızı 1 x 75 μl 1x 140 μl 1 x 33 μl Yeşil 10 x 300 μl 19 x 300 μl 3 x 300 μl KÜÇÜK ÇANTA 20 C DE SAKLANIR AÇIKLAMA ETİKET TÜP (T) RENGİ YA DA KAPAK 25 test 50 test 8 test Ekson 5 te mutasyonlu p53 genomik DNA (B amplifikasyon ürünü) p53 Mutasyonlu DNA Mavi 1 X 6 μl 1 x 10 μl 1 x 2 μl KUTU Q +2 / +8 C DE SAKLANIR AÇIKLAMA ETİKET TÜP (T) RENGİ YA DA KAPAK 25 test 50 test 8 test Akrilamid 40% Acrylamide/Bisacrylamide Solusyonu, suda toksik R / / /23/24/25 62 S / X 65 ml 1 x 120 ml 1 x 25 Ml Page 4

7 KUTU F +2 / +8 C DE SAKLANIR AÇIKLAMA ETİKET TÜP (T) RENGİ YA DA KAPAK 25 test 50 test 8 test Elektroforez buffer Örnek yükleme için Ethidium Bromide solusyonu (2,5 mg/ml) 6X Blue Mavi 1 x 400 μl 1 x 750 μl 1 x 120 μl Ethidium Bromide toksik R S 36/37 45 Kırmızı 1 x 200 μl 1 x 350 μl 1 x 100 μl DNA Moleküler Ağırlık Markır MW Markır Sarı 1 x 200 μl 1 x 400 μl 1 x 60 μl Örnek yükleme için SSCP Denatürasyon Buffer Yükleme buffer toksik R 61 S 53/45 Mor 2 x 600 μl 4 x 600 μl 1 x 600 μl KUTU A +15 / +25 C DE SAKLANIR AÇIKLAMA ETİKET TÜP (T) RENGİ YA DA KAPAK 25 test 50 test 8 test Moleküler biyoloji için agaroz AGAROZ 1 x 14 g 1 x 26 g 1 x 5 g TRIS-Acetate-EDTA, ph 8 Elektroforez buffer 50X TAE 1 x 100 ml 1 x 200 ml 1 x 40 ml TRIS-Borate-EDTA, ph 8 Elektroforez buffer N,N,N,N Tetrametiletilendiammi ne (yaklaşık %99) 5X TBE 1 x 350 ml 1 x 650 ml 1 x 100 ml TEMED 2 x 300 μl 4 x 570 μl 1 x 90 μl Gümüş Nitrat (Toz) AgNO 3 1 x 2 g 1 x 4 g 1 x 1 g 10X Fiksatif Solusyonu Ön-Boyama Solusyonu İlk Gelişme Solusyonu İkinci Gelişme Solsuyonu 10X Fiksatif Solusyonu 5X Ön- Boyama Solusyonu Gelişme Solusyonu A Gelişme Solusyonu B toksik R 23/24/ S 26 36/37/ x 100 ml 1 x 200 ml 1 x 40 ml 1 x 500 ml 1 x 1 L 1 x 200 ml 1 x 160 ml 1 x 320 ml 1 x 50 ml 1 X 5 ml 1 x 10 ml 1 x 2 ml Page 5

8 3. REAKTİFLERİ SAKLAMA KOŞULLARI Kitin herbir komponenti, tekli kutuların etiketlerinde belirtilen talimatlara gore saklanmalıdır. Özellikle: KUTU P Küçük çanta KUTU F KUTU Q KUTU A -20 C de saklanır -20 C de saklanır +2 / +8 C DE SAKLANIR +2 / +8 C DE SAKLANIR +2 / +25 C DE SAKLANIR Önerilen sıcaklıkta saklandığında, tüm test reaktifleri son kullanım tarihine kadar stabil kalır. 4. KULLANIM İÇİN ÖNLEMLER Kit; moleküler biyoloji tekniklerini diagnostikte uygulama eğitimi almış ve tecrübesi olan araştırmacı tarafından kullanılmalıdır; Kit prosedürüne başlamadan önce kullanım kılavuzunu dikkatlice ve tamamen okuyun; Ürünleri ısı kaynağından uzakta tutun; Son kullanım tarihi geçmiş kit parçalarını kullanmayın; Saklama koşulları, kutu bütünlüğü ya da metod uygulaması ile ilgili herhangi bir şüpheniz olduğunda, AB ANALITICA teknik destek ile bağlantı kurun: laboratorio@abanalitica.it; Nükleik asitlerin amlifikasyonunda, araştırmacı aşağıdaki özel önlemleri almalıdır: Filtreli uç kullanın; Biyolojik örnekler, ekstrakte edilmiş DNA, kit içeriğindeki pozitif kontrol ve tüm amplifikasyon ürünleri, amplifikasyon reaktiflerinden farklı bir yerde saklanmalıdır. Page 6

9 PCR öncesi ve sonrası için farklı alanlar hazırlayın ve iki alan arasında materyal (pipetler, uçlar, tüpler, vs.) paylaşımı yapmayın. Sık sık eldiven değiştirin. Benç yüzeyini %5 sodyum hipoklorit ile temizleyin. Kullanmadan once PCR premiksi oda ısısında eritin; Taq DNA polymerase ekleyin ve oda ısısında ya da buz kabında oldukça hızlı DNA purifiye edin. 5. GÜVENLİK KURALLARI 5.1. Genel Güvenlik Kuralları Reaktifler ve klinik örnekler ile çalışırken tek kullanımlık eldiven kullanın ve çalışma bitiminde ellerinizi yıkayın. Ağızla pipetleme yapmayın. Bilinen hiçbir diagnostik metod enfeksiyon ajanlarının yokolduğunun garantisini vermediğinden, herbir klinik örneğin potansiyel enfeksiyonlu olduğu göz önünde bulundurulup, bu şekilde çalışılması gereklidir. Klinik örnekler ile direk temasta olan cihazların kontaminasyonlu olduğu ve bu şekilde kullanılması gerektiği göz önüne alınmalıdır. Örneklerin kazara etrafa dökülmesi durumunda, %10 Sodyum Hipoklorit ile temizleyin. Temizlenmiş materyaller, kontamine ürünler için olan özel konteynerlere atılmalıdır. Klinik örnekler, materyaller ve kontamine ürünler aşağıdaki dekontaminasyondan sonra atılmalıdır: 30 dakika %5 Sodyum Hipoklorit (1 volüm %5 Sodyum Hipoklorit solusyonu herbir 10 volüm kontaminasyonlu sıvı için) solusyonuna batırılmalı YA DA en az 2 saat 121 C de otoklavlanmalı (NOT: Sodyum Hipoklorit içeren solusyonları otoklavlamayın!!) Page 7

10 5.2. Kit Hakkında Güvenlik Kuralları Bu kit kullanımı için riskler tekli komponentler ile ilişkilidir: Tehlikeli Komponentler: ETHIDIUM BROMIDE 3,8-diamino-1-ethyl-6-phenylphenantridiumbromide (Ethidium Bromide) <2% Risk tanımı: T (Toksik) RİSK İBARESİ VE S İBARESİ ETHIDIUM BROMIDE R 23 ve R 68 S 36/37 45 İnhalasyon için toksik. Geri dönülmez etkiler riski. Laboratuar giysisi ve tek kullanımlık eldiven kullanın. Kaza veya rahatsızlık durumlarında, doktora başvurun ve paket etiketini gösterin. R ve S ibareleri kit ile sağlanan konsantre ürünlere işaret etmektedir. Özellikle Ethidium Bromide için, agaroz jelde dilusyona kadar. Konsantre Ethidium Bromide uygulamasında kimyasal dağıtıcı buharlı kabin kullanın. Seyreltilmiş Ethidium solusyonu ile çalışırken daima laboratuar giysisi ve tek kullanımlık eldiven giyin. Bu ürünler genel çöplere atılamaz. Kurutucu sistem kullanılmamalıdır. Atılım için yasal kuralları takip edin. Ethidium Bromide kaza ile dökülmesi durumunda Sodyum Hipoklorit ve su ile temizleyin. İstenildiğinde Ethidium Bromide Güvenlik data sheet (MSDS) gönderilebilir. Page 8

11 YÜKLEME BUFFER Formamide 96% Risk tanımı: T (Toksik) RİSK İBARESİ VE S İBARESİ YÜKLEME BUFFER R 61 S 53 ve 45 Doğmamış çocuk için zarar riski Sadece profesyonel kullanıcılar için. Kaza veya rahatsızlık durumlarında, doktora başvurun ve paket etiketini gösterin. Ürünler ile çalışırken daima tek kullanımlık eldiven ve laboratuar giysisi kullanın. Bu ürünler genel çöplere atılamaz. Kurutucu sistem kullanılmamalıdır. Atılım için yasal kuralları takip edin. Kaza ile dökülmesi halinde kireç ya da Sodyum Hidroksit ile temizleyin. Bunların atılımına kadar konteyneri kapalı tutun. Alanı havalandırın ve dökülen ürünlerin toplanmasından sonra kontamine olmuş yüzeyi temizleyin. İstenildiğinde ürünlerin Güvenlik data sheet (MSDS) gönderilebilir. Page 9

12 ACRYLAMIDE Acrylamide/Bis-Acrylamide 29:1 Risk tanımı: T (Toksik) RİSK İBARESİ VE S İBARESİ ACRYLAMIDE R 45 R 46 R 20/21 R 25 R 36/38 R 43 R 48/23/24/25 R 62 Kansere neden olabilir. Kalıtsal genetik değişikliklere neden olabilir. İnhalasyonu ve deri ile teması toksiktir. Sindirim için toksiktir. Deri ve gözleri tahriş edicidir. Deri ile teması duyarlılığa neden olabilir. Toksik: İnhalasyon, deri ile teması ya da sindirilmesi ile uzun süre maruz kalınması çeşitli hasarlara neden olabilir. Fertiliteyi bozacak olası risk. Ürünlerin uygulamasında kimyasal dağıtıcı buharlı kabin kullanın. Laboratuar giysisi ve tek kullanımlık eldiven kullanın. Ürünleri hava geçirmez kaplayıcı ile saklayın. Bu ürünler genel çöplere atılamaz. Kurutucu sistem kullanılmamalıdır. Atılım için yasal kuralları takip edin. Kaza ile dökülmesi halinde kişisel korunma prosedürlerini izleyin. Atılım için magnezyum mıkası ve kum ile absorbe edin ve kapalı bir kutuya toplayın. Alanı havalandırın ve dökülen ürünlerin toplanmasından sonra kontamine olmuş yüzeyi temizleyin. İstenildiğinde ürünlerin Güvenlik data sheet (MSDS) gönderilebilir. Page 10

13 GELİŞME SOLUSYONU B Formaldehyde 100% Risk tanımı: T (Toksik) RİSK İBARESİ VE S İBARESİ FORMALDEHYDE R 23/24/25 R 34 R 43 İnhalasyonu, deri ile teması ve sindirimi toksiktir. Yanmaya neden olur. Deri ile teması hassasiyete neden olabilir. Ürünlerin uygulamasında kimyasal dağıtıcı buharlı kabin kullanın. Laboratuar giysisi ve tek kullanımlık eldiven kullanın. Ürünleri hava geçirmez kaplayıcı ile saklayın. Bu ürünler genel çöplere atılamaz. Kurutucu sistem kullanılmamalıdır. Atılım için yasal kuralları takip edin. Kaza ile dökülmesi halinde kişisel korunma prosedürlerini izleyin. Kireç ya da Sodyum Hidroksit ile kaplayın ve atılım için kapatılabilir konteynerlerde saklayın. Alanı havalandırın ve dökülen ürünlerin toplanmasından sonra kontamine olmuş yüzeyi temizleyin. İstenildiğinde ürünlerin Güvenlik data sheet (MSDS) gönderilebilir. Page 11

14 6. KİT İÇERİĞİNDE BULUNMAYAN GEREKLİ MATERYALLER 6.1. Reaktifler DNA ekstraksiyonu için reaktifler; Steril DNase ve RNase free su; Distile su; Buz Cihazlar Laminar flow kabini (kontaminasyondan korunmak için amplifikasyon premikse TAQ polymerase eklenirken kullanılması önerilir; ekstrakte DNA eklenirken başka bir laminar flow kabini kullanılması önerilebilir); Mikropipetler (aralık: 0,2-2 µl; 0,5-10 µl; 2-20 µl; µl); Thermalcycler; Mikrosantrifüj (max rpm); Tartı; Manyetik ısıtıcı ya da mikrodalga; Kimyasal kabin (Ethidium Bromide uygulamasında kullanılması önerilir); Agaroz minijel için dikey elektroforez tankı (yaklaşık 7-8 cm X 10 cm); Agaroz minijel için yatay elektroforez tankı (yaklaşık10-15 cm X cm), soğutucu sistem ile sağlanmalıdır; Güç kaynağı ( V); UV Transilluminator; Foto kamera ya da imaj analizör. Gümüş boyama sırasında gerekli likid aspirasyon için gereç; Yararlıdır fakat kullanmak için kesinlikle gerekli değildir Orbital çalkalayıcı, poliakrilamid jel yapımının yanında gümüş boyama sırasında çalkalama için; Beyaz ışık transilluminator ve fotografik cihaz için uygun filtre ya da poliakrilamid jel kurutmak için jel kurutucu (fotografik dökümanı ya da elektroforetik yürütmeden sonra jeli saklamak gerektiğinde). Page 12

15 6.3. Materyaller Tek kullanımlık eldivenler; Tek kullanımlık filtreli uçlar (aralık: 0,2-2 µl; 0,5-10 µl; 2-20 µl; µl); TAE dilusyonu için dereceli silindirler (1L); Agaroz jel hazırlamak için pyrex şişe ya da Becker; Parafilm. Jel gümüş boyama için uygun boyutta tank. 7. REAKTİF HAZIRLAMA X TAE buffer hazırlama: 1 litre 1X buffer hazırlamak için 20 ml 50X TAE ile 980 ml distile su karıştırın X TBE buffer hazırlama: 1 litre 0.25X buffer hazırlamak için 50 ml 5X TBE ile 950 ml distile su karıştırın Gümüş boyama için solusyonları hazırlama Ön-Boyama Solusyonu 28 ml 5X konsantre Ön-Boyama Solusyonunu 112 ml distile su ile seyreltin Gelişme Solusyonu Kullanmadan önce 11 ml Gelişme Solusyonu A yı 99 ml distile su içinde seyreltin. Sonra 297 μl Gelişme Solusyonu B ekleyin Boyama Solusyonu 0.12 g Gümüş Nitratı 70 ml distile su içinde eritin Tespit Etme Solusyonu 7 ml 10X Tespit Etme Solusyonunu 63 ml distile su içinde seyreltin. Page 13

16 8. GİRİŞ İnsan hücreleri kimyasal maddeler, virusler ve iyonizasyon radyasyonlarının farklı çeşitlerine göğüs germek zorunda kalırlar. Eğer hücreler bu faktörler ile duyarlı bir noktada hasarlanırsa etkileri korkunç olabilir. Örneğin, eğer önemli düzenleyici elementler hasarlanırsa, normal hücresel büyüme kontrolü durabilir ve hücreler hızla prolifere olup tümör formuna dönüşebilir. p53 kanser baskılayıcı bu tip hasarlara karşı bizim koruyucularımızdan biridir. Normalde, sadece düşük miktar p53 organizmada bulunur, fakat DNA hasarı belirlendiğinde p53 seviyesi artar ve önleyici miktarlar harekete geçer. p53 genomda birçok düzenleyici siteye bağlanır ve hasar tamir edilene kadar hücresel proliferasyonu durduran proteinler üretir. Diğer bir deyişle, eğer hasar çok ciddi ise p53 hücrelerin kendini öldürmesine neden olan hücresel ölüm programını (apoptosis) başlatır, böylece hasar tamamen uzaklaştırılır. p53 kanser baskılayıcı dört tanımlanabilir protein zincirinden oluşan esnek bir moleküldür. p53 merkezinde, dört zinciri birarada tutan tetramerik dominium bulunur. Her bir zincirde bir uzun ve esnek bölge ikinci stabil dominyumu tutar: DNA ile etkilşimdeki arjinin kalıntılarından (pozitif yüklü) zengin, DNA ya bağlanabilen büyük bir dominyum ( 17. kromozomun p13.1 pozisyonunda bulunan p53 geni insan malignan tümörlerinin %55 inden fazlasında silinmiştir ya da mutasyonludur. Farklı neoplazilerde keşfedilmiş mutasyonların yaklaşık %90ı genin dört iyi korunan bölgesinde eksin 5, 6, 7, 8 de lokalizedir (Hollstein ve ark., 1991). Şimdiye kadar, araştırma projelerinin çoğu p53 gen değişimlerinin prognostik uygulamalarını anlamaya yardımcı olmak ve mutasyonlu proteinlerin miktarını değerlendirmek için immunohistokimyasal teknikler kullanmaktadır. Bu teknik çok kolay ve fikse, parafine gömülü dokularda uygulanabilir olmasına rağmen tüm p53 mutasyonlu proteinleri gösteremez (Greenblatt MS ve ark., 1994). Kolorektal karsinomalı hastalarda p53 gen mutasyonlarının belirlenmesi metastaz ile yüksek korelasyon gösterirken, kolesistis karsinomada fazını ve neoplastik histotip ile korelasyonunu tanımlar. Günümüz çalışmaları, doku proliferasyonunun kontrolünde p53 geni ile beta- TGF büyüme faktörü arasında bir korelasyon göstermiştir; bu korelasyon daha etkili, hem p53 hem de beta-tgf yi uyaran kombine bir tedavi sağlar. Bu bağlamda, p53 genindeki mutasyon varlığının değerlendirilmesi zorunlu olur (Cordenonsi M. ve ark., 2003). Page 14

17 P53 gen mutasyonları SSCP (Tek İplikli Yapı Polimorfizm) ile takip eden DNA amplifikasyon teknolojisi ile çok iyi tanımlanabilir. 9. TEST PRENSİBİ PCR metodu (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) literatürde DNA amplifikasyonu için tanımlanan ilk metoddur (Saiki RK ve arkadaşları, 1985). Thermostable DNA polymerase ile DNA nın spesifik bir parçasının (hedef dizi) in vitro amplifikasyon reaksiyonu olarak tanımlanabilir. Reaksiyonda üç nükleik asit segmenti bulunur: Amplifiye olması için çift iplikli DNA kalıbı (hedef DNA) ve iki tek iplikli oligonükleotid primerler kalıp DNA ya spesifik olarak dizayn edilmiştir. DNA polymerase primerler tarafından işaretlenen bölgeden sentez işlemine başlar ve solusyonda serbest olarak bulunan tamamlayıcı nükleotidlerin (dntpler) eklenmesi ve bağlanması ile orjinal çift iplikli hedef DNA bölgesi ile aynı olan yeni çift iplikli DNA molekülünü sentezler. Çeşitli sikluslardan sonra, hedef diziye uygun olan milyonlarca DNA molekülü oluşturabilir. Bu testin duyarlılığı, laboratuar tanısında uygulamaya olanak sağlar. Amplifikasyon reaksiyonunun geniş biyolojik örneklerde uygulanabilmesinin yanında, PCRın oldukça küçük DNA segmentlerini de amplifiye edebilmesinden formalin fikse ve parafine gömülü örneklerden elde edilen başlangıç DNAsı kısmi olarak yıkılabilir. Mutasyon araştırmaları için, gen amplifikasyonu SSCP ile devam eder (Tek İplikli Yapı Polimorfizmi). Bu metod, mutasyonlu olmayanlara göre mutasyonlu polinukleotid tek-iplikli fragmanların farklı elektroforetik özelliklerine dayanır. Bu farklılıklar mutasyonlu nukleik asidin farklı üçboyutlu yapısına bağlıdır. Bu metod, insersiyon ve delesyonlara göre mutasyonların belirlenmesi için uygundur ve nukleotid değişimlerinin büyük bir parçasının yüksek duyarlılık (%90-100) ile tanımlanmasını sağlayabilir (Hayashi K, 1992). Bu metodun uygulanması kolaydır ve non radyoaktif belirleme sistemi (gümüş boyama) kullanır. Page 15

18 10. ÜRÜN TANIMI Bu metod aşağıdaki eksonları amplifiye edebilir: A1-A2, B1-B2, C1-C2, D1- D2, E1-E2, mutasyonların varlığının belirlenmesiiçin SSCP analizi ile devam eder. Ekson 5 (A1-A2): Ekson 5-6 (B1-B2): Ekson 6 (C1-C2): Ekson 7 (D1-D2): Ekson 8 (E1-E2): 152 bp 167 bp 132 bp 136 bp 149 bp Kit amplifikasyonun pozitif kontrolünü de sağlar: DNA, ekson 5 bölgesinde mutasyonludur (B amplifiye ürün). Bu kontrol insan orijinlidir, fakat kullanıcı için tehlikeli değildir. Tanı örneklerin karşılaştırılmasına dayandığından, her bir çalışmanın mutasyon için bir negatif örnek ve yukarıdakilerin tümü nedeniyle pozimorfizm durumu haricinde bir internal kontrol içermesi gerekir. Bu kit premiks formatındadır: Amplifikasyon için tüm reaktifler pre-mikstir ve Taq polymerase ve ekstrakte DNA eklenebilecek şekilde tekdoz test tüplerinde alikuatlanmıştır. Bu premiks formatı ön-amplifikasyon aşamalarının azaltılmasını, kullanıcı için zaman kazanımını garanti eder ve rekatiflerin tekrar tekrar dondurulup/çözdürülmesini (ürün performansını değiştirebilir) önler. Yukarıdakilerin tümünden dolayı premiks formatı kontaminasyon riskini ve yanlış pozitif sonuç oluşması riskini en aza indirir. Yine de, daima uygun amplifikasyon kontrollerinin kullanılmasını öneririz. Page 16

19 11. ÖRNEK TOPLAMA, MANİPULASYON VE ÖN- MUAMELESİ Kan Örnek toplama tüm genel sterilite önlemlerini takip etmelidir. Kan EDTAlı olarak alınmalıdır. Heparin gibi diğer koagülasyon ajanları TAQ polymerase ın güçlü inhibitörleridir ve bu yüzden amplifikasyon reaksiyonunun verimliliğini bozar. Taze kan kısa bir süre için +2/+8 C de saklanabilir; eğer DNA ekstraksiyonu kısa bir süre içinde yapılmayacaksa örnek dondurulmalıdır Histolojik örnekler Histolojik örnekler taze, donmuş, formalin fikse ve parafine gömülü deri biyopsileridir. Taze biyopsiler toplamadan birkaç dakika içinde çalışılmalı veya likit nitrojen ile hızlıca dondurulmalıdır ve sonra enzimatik sindirimi takiben steril kesici kullanarak mekanik kesilmeye kadar -80 C de saklanmalıdır, Proteinaz K ile sindirim ile takip etmelidir. Fikse ve parafine gömülü biyopsilerde Lilie formülü olarak %10 sodyum ve potasyum tuzları ile ph 7 de formalin buffer kullanmanızı öneririz. Buffer olmayan Bouin, Holland ve diğer asidik fiksatifler (osmik asit gibi) olan formalinde fikse edilmiş dokular sonraki nukleik asit ekstraksiyonu için uygun değildir, çünkü bu maddeler dokuda sindirilemeyen çapraz-bağlar meydana getirirler Histolojik örneklerin ön-muamelesi Taze ya da donmuş histolojik örneklerde (50 mg a kadar), örnekler steril bir bistüri ile hızla mekanik olarak parçalanır. Bu uygulamayı cam üzerinde yapın, kesilmiş dokuları bir tüpe aktarın ve örnekleri Proteinaz K ile sindirin. Fikse ve parafine gömülü örneklerde, parafin blokta yüksek oranda neoplastik element içeren bölgenin izole edilmesi ve μm de 2-4 bölüme kesilmesi önerilir. Kesmek için parça sayısı boyuta ve neoplastik alanın selülaritesine bağlıdır. Page 17

20 Kontaminasyondan korunmak için uygulamadan sonra mikrotom ve bıçağı xylene ile temizlenmelidir. Neoplastik hücreleri olmayan aynı hastadan bir örnek, bir internal kontrol olmak için hazırlanmalıdır. Parçaları 1.5 ml tüpe aktarın ve parafini uzaklaştırma ve örnek sindirimi ile devam edin. 12. PROTOKOL DNA EKSTRAKSİYONU DNa ekstraksiyonu için saf tam DNA izole eden herhangi bir metod kullanılabilir. DNA amplifikasyonu için paragraf 12.2 de belirtilen ekstraksiyon miktarı, AB ANALITICA tarafından önerilen metod kullanılarak elde edilen ekstraksiyona referans olmalıdır (DNA solusyon konsantrasyonu yaklaşık 30 ng/μl). Alternatif ekstraksiyon metodu kullanıldığında, amplifiye olması amaçlanan DNA miktarı gerçek miktarından azdır, su ile amplifikasyon miskinin uygun miktarının eklenmesi gerekir DNA AMPLİFİKASYONU Ekson A1-A2, B1-B2, C1-C2, D1-D2, E1-E2 nin amplifikasyonu Her bir premiks test tüpü A, B, C, D, E ekleyin: AB Taq Ekstrakte DNA 0,25 μl 2 μl Her bir deneyde kontaminasyonları izlemek için bir negatif kontrol içermesi önemlidir (mikse ekstrakte DNA yerine distile su ekleyin). Kitte bulunan ekson 5 te mutasyonlu pozitif kontrol premiks tüp B kullanılarak amplifiye edilmelidir. Doğru tanı analizi için, aynı hastadan mutasyonlu olmayan bir DNA amplifiye edilmesi önemlidir. Dokudan analiz yapılıyorsa bu kolaydır, çünkü aynı örnekten izole edilmiş non-neoplastik hücrelerden DNA ekstrakte edilebilir (par ebakın). Page 18

21 Eğer başlangıç öreği kan ise, mutasyon olmayan aynı hastanın DNAsı için bir kontrole sahip olması mümkün olmayacaktır. SSCP sırasında bir gen polimorfizmini belirlemenin olasılığı akılda tutularak sağlıklı bir hastadan DNA kullanmak gerekecektir (sekanslama ile doğrulamak için). Kısa bir süre santrifüj edin ve test tüplerini aşağıdaki programda thermalcyclera koyun: 1 cycle 94 C 2 min 40 cycles 94 C 55 C 72 C 35 sec 40 sec 40 sec 1 cycle 72 C 7 min Amplifikasyon fragman uzunluğu: A1-A2: 152 bp B1-B2: 167 bp C1-C2: 132 bp D1-D2: 136 bp E1-E2: 149 bp AMPLİFİKASYON ÜRÜNLERİNİN GÖRÜNTÜLENMESİ Agaroz jel elektroforezi %3 agaroz jel hazırlanması: 1,5 g Agaroz tartın ve 50 ml 1X TAE içine dökün. Solusyonu berrak oluncaya kadar manyetik ısıtıcı ya da mikrodalga içine bırakın. Birkaç dakika jelin kurumasına izin verin ve sonra 10 µl Ethidium Bromide solusyonu 2.5 mg/ml ekleyin. NOT: Ethidium Bromide güçlü bir mutajenik ajandır; daima eldiven giyin ve bu reaktifle uygulama yaparken kimyasal güvenlik kabininin içinde çalışın. Jeli tarakları ile birlikte uygun bir dökme tankına koyun ve oda ısısında soğuyana kadar bekleyin ya da jel katı hale gelene kadar buzdolabına koyun. Jel katılaştığında, dikkatlice tarakları çıkarın (jel kuyucuklarına zarar vermemeye dikkat edin), tankı elektroforez haznesine alın ve jelin üzerini Page 19

22 tamamen kaplayana kadar uygun miktarda TAE buffer ekleyin (yaklaşık jel yüzeyinin 1-2mm üzerinde) Jelde örnek yükleme Test tüpünde ya da direk parafilmde aşağıdakileri karıştırın: 2 μl 6X Mavi* 10 μl PCR ürünü ya da DNA Moleküler Ağırlık Markır (MW Markır)* Miski jel kuyucuklarına yükleyin; güç kaynağını açın ve voltajı V arasına ayarlayın dakika jeli yürütün ve sonra UV transilluminatore koyun; amplifikasyon ürünlerinin boyutunu referans Moleküler Ağırlık Markırı ile karşılaştırarak analiz edin. *DNA Moleküler Ağırlık Markır (MW): , 404, 353, 242, 190, 147, 110, 89, 67, 34, 26 bp. %3 agaroz jelde bp bantlar genellikle tam olarak çözülmez ve tek bir bant olarak görülür; 26 ve 34 bp bantları %3 agaroz jelde bazen görünmek için çok küçük olur (düşük moleküler ağırlıklarından dolayı). NOT: UV ışınları deri ve en önemlisi gözler için tehlikelidir: daima eldiven ve koruyucu gözlük kullanın ya da UV transilluminatorün koruyucu ekranını kullanın Amplifikasyon sonuçlarının yorumlanması Kontroller aşağıdaki sonuçları göstermelidir: KONTROL Mutasyonlu Pozitif Kontrol Negatif kontrol SONUÇ 167 bp band, premik B ile elde edilen Band yok Page 20

23 Sonra mutasyonlu olmayan amplifiye örnek ve araştırılan örnek aşağıdaki sonuçları göstermelidir: AMPLİFİKASYON Amplifikasyon A Amplifikasyon B Amplifikasyon C Amplifikasyon D Amplifikasyon E SONUÇ 152 bp DNA band 167 bp DNA band 132 bp DNA band 136 bp DNA band 149 bp DNA band Fig.1: Ekson 5-8 in amplifikasyon sonuçlarının agaroz jel elektroforezi Sütun 1: Sütun 2-3: Sütun 4-5: Sütun 6-7: Sütun 8-9: Sütun 10-11: Sütun 12: MW Markır Örnek A ve B nin ekson 5 (A1-A2) amplifikasyonu Örnek A ve B nin ekson 5-6 (B1-B2) amplifikasyonu Örnek A ve B nin ekson 6 (C1-C2) amplifikasyonu Örnek A ve B nin ekson 7 (D1-D2) amplifikasyonu Örnek A ve B nin ekson 8 (E1-E2) amplifikasyonu Negatif kontrol (H 2 O). Örnek A: Sağlıklı bireyden kontrol örneği; Örnek B: Analiz edilmiş örnek Page 21

24 12.4. SSCP %12 poliakrilamid jel hazırlanması: Poliakrilamid minijel hazırlamak için (1 m kalınlık, boyutlar 10 cm X 10 cm) dikkatlice 15mL test tüpünde karıştırın: Reaktif Miktar Akrilamid 4,5 ml TBE 5X 0,750 ml APS 10% 0,150 ml TEMED 15 µl H 2 O 15 ml ye kadar İki cam arasına miksi dökün, tarakları yerleştirin ve eli katılaşıncaya kadarbırakın. Bir mikrotüpte karıştırın: Yükleme buffer 6 µl Amplifiye DNA 2 µl Eğer band şiddeti çok düşük ise jelde yüklenen amplifiye DNA miktarı artırılabilir. Yükleme buffer ve purifiye DNA arasındaki oran daima 3:1 olmalıdır. Örnekleri thermalcyclerda 95 C de 5 dakika inkübe ederek dentüre edin ve örnekleri hemen buz üzerine koyun. Jele 4.5 μl her bir denatüre örnekten yükleyin. Aşağıdaki koşullarda jeli yürütün: Yürütme Buffer Voltaj Zaman Sıcaklık TBE 0.25X (dilusyon için par. 7, sayfa 13 bakın) 5 ma sabit ya da V sabit, jel boyutuna bağlı olarak Yaklaşık 3 saat ve 30 dakika (mavi boya xilene cyanol jelin sonuna erişene kadar) Bir soğutma sistemi ile 20 C de sabitlenmelidir Page 22

25 Gümüş Boyama ÖN-BOYAMA SOLUSYONU, GELİME SOLUSYONU, BOYAMA SOLUSYONU ve TESPİT ETME SOLUSYONU hazırladıktan sonra sayfa 13, par. 7 ye bakın ve boyama protokolü ile devam edin: 1. poliakrilamid jeli 5dk çalkalama altında 70 ml ÖN-MUAMELE SOLUSYONU içine koyun. Solusyonu atın ve tekrar edin. 2. Solusyonu atın ve distile su ile üçkez her biri 2 dakika olacak şekilde yıkayın; 3. Jeli 70 ml BOYAMA SOLUSYONU içine koyun ve 30 dakika karanlıkta çalkalama ile bırakın; 4. Solusyonu atın ve distile su ile iki kez her biri 1 dakika olacak şekilde yıkayın; 5. Jeli 40 ml GELİŞME SOLUSYONU içine koyun, birkaç dakika çalkalayın ve solusyonu atın; ml GELİŞME SOLUSYONU ekleyin ve bandlar tamamen görünür hale gelene kadar dakika bırakın; 7. Solusyonu atın ve jeli 70 ml TESPİT ETME SOLUSYONUna batırarak gelişmeyi durdurun. Jel birkaçdamla tespit etme solusyonu ile transparan bir plastik poşette saklanabilir. Jel sonunda bir jel kurutucu ile kurutulabilir ya da hemen fotoğraflanabilir. Page 23

26 SSCP sonuçlarının yorumlanması Bir ya da daha fazla mutasyonların varlığının belirlenmesi, her bir örnekte normal bir örnek ile DNA band paterninin karşılaştırılması ile analiz edilir. Aynı mutasyonlu örnek, eğer farklı deneylerde analiz edilirse, farklı elektroforez patternleri verebilir, çünkü SSCP çevresel koşullar için oldukça duyarlı bir tekniktir (jel polimerizasyonu, elektroforetik çalışma sırasında sıcaklık çeşitlilikleri, uygulanan voltaj, iyonik güç, vb.). Nokta mutasyonlarda, denature olmuş bandlar, normal kontrol bandının referansı ile birkaç baz ile ya da önemli bir uzaklık ile değişkenlik gösterebilir. Bu polimorfizmler ile de olabilir: Bir mutasyon ya da bir polimorfizm arasındaki ayırım sadece DNA dizileme ile doğrulanabilir. Fig.2: Ekson 5 in (B fragman) %12 poliakrilamid jelde SSCP Sütun 1/3: Wild tip patern. Sütun 2: Mutasyonlu patern. S: Tek iplikli DS: Çift iplikli Page 24

27 13. SORUN GİDERME Amplifikasyon ürünü ya da pozitif kontrol DNA bandı yoksa TAQ polymerase premikse doğru eklenememiştir -Uygun volümde pipet ve uçlar kullanın (pipet aralığı 0,2-2 μl); -Görsel olarak TAQ polymerasın premikse difüze olduğunu gözleyin: Bu basittir, çünkü enzim, yüksek bir densiteye sahip olan gliserolde çözülür; Alternatif olarak, tüp duvarına konulmuş olan TAQ polymerasın görsel olarak teyit edin, sonra kısa bir süre santrifüj edin. Thermalcycler doğru olarak programlanmamıştır: -Thermalcycler program uygunluğunu ve kullanım kılavuzundaki sıcaklık profili uygunluğunu kontrol edin ; sonra doğru program ile amplifikasyonu tekrar edin. Kit uygun şekilde çalışmaz -Premiks, TAQ polymerase ve pozitif kontrolü -20 C de saklayın; -Premiks ve reaktifleri tekrar tekrar dondurup/çözdürmekten sakının. Test edilmiş örneklerde amplifikasyon bandı yoktur, fakat pozitif kontrolde iyi bir band vardır Ekstraksiyon aşaması sırasında olası problemler: Tüm bilgileri doğru şekilde takip ettiğinizden emin olun; Ekstraksiyon kitinin sorun giderme bölümüne başvurun; Yeni bir örnek ile doğru şekilde tekrar DNA ekstraksiyonu yapın. Amplifikasyon inhibe olmuştur Başlangıç örneğini distile su ve TE ile seyreltin; Küçük miktarda klinik örnekten DNA ekstraksiyonunu tekrar edin; Uygun bir ekstraksiyon metodu kullanın Page 25

28 Amplifiye ürünlerin agaroz jelde görüntülenmesinden sonra aspesifik ürün ya da ekstra band görülmesi Thermalcycler sıcaklık değişimlerini çok yavaş yapın Thermalcycler değişikliklerini uygulayın. Amplifikasyon reaksiyonunun hazırlanması oda ısısında çok uzun zaman alır. Oda ısısında çalışma zamanınızı hızlandırın; Buz üzerinde çalışın. Ekstrakte olanlar purifiye edilmiştir Örnekleri iyi saflaştıran bir ekstraksiyon sistemi kullanın. Başlangıç örnekleri yıkılmış DNA içerir Ekstraksiyon aşamasını başka bir başlangıç klinik örneği kullanarak tekrarlayın; Örneğin uygun yolla toplanıp saklandığından emin olun. Gümüş boyamadan sonra, poliakrilamid jel çok temiz değildir (mutasyonlu pozitif kontrol için de) Elektroforetik yürütme çok kısa olmuştur Mavi boya (xylene cyanol) camın en altına ulaşana kadar jeli yürütün. Gümüş boyama çok yoğundur ve ayrıma izin vermez, örneğin tekli bandların çiftli bandlardan ayrılması. Bandlar temiz görünür olduğunda gelişimi durdurun; Jelde çok fazla DNA yüklüdür; poliakrilamid jeleörnekleri yüklemeden önce agaroz jel elektroforezi ile amplifiye ürünleri dikkatlice analiz edin. Eğer bir sorunuz ya da probleminiz olursa AB ANALITICA teknik destek ile bağlantıya geçin faks +39 (049) ya da tel. +39 (049) Page 26

29 14. TEST LİMİTLERİ Kit performansı aşağıdaki durumlarda azalır: Klinik örnekler bu analize uygun değildir (doğru saklanmamış örnekler için nötral formalin fiksatifinden farklı bir fiksatif kullanın). Amplifikasyon reaksiyonunun inhibitörlerinin görülmesi ya da uygun olmayan ekstraksiyon sistemi kullanılması nedeniyle DNA amplifiye olmaz; Kit önerilen sıcaklıkta saklanmamıştır. 15. TEST PERFORMANSI Özgünlük En önemli bilgi bankasındaki primer dizi sıralaması spesifik olmayan dizilerin yokluğunu gösterir ve farklı p53 eksonlarının amplifikasyonunu garanti eder Duyarlılık p53 gen mutasyonlarını tanımlamak için bu kitin kapasitesi tarama için seçilen metodun duyarlılığına bağlıdır: SSCP. Bu metod, uygulama koşullarına bağlı olarak %70 den %90 a kadarçeşitli duyarlılık gösterir. SSCP, iyonik güç, kullanılan matriks tipi, fragmanların boyutu, fragmanlarda mutasyonun pozisyonu ve sıcaklık gibi bazı parametreler tarafından çok fazla etkilenir. Özellikle, analiz edilmiş fragmanların boyutu arttığında SSCP duyarlılığı azalır. Duyarlılık, yaklaşık 150 bp amplifikasyon ürünleri için %90 dan fazladır (Sheffield ve ark., 1993). Normal hücrelerin miktarına karşı analiz edilen kanserli hücrelerin oranı ihmal edilemez: Bu teknik ile elde edilen değerli sonuçların yanında, kanser hücrelerinin oranı sağlıklı hücrelere karşı en az %20-30 olmalıdır, %50 den fazla ise iyidir. Paragraf de belitildiği gibi analizden önce onkogenetik alanın sınırlandırılması önerilir. Page 27

30 16. REFERANSLAR Cordenonsi M, Dupont S, Maretto S, Insinga A, Imbriano C, Piccolo S. Cell 113 (3), , Greenblatt MS, Bennett WP, Hollstein M, Harris CC. Cancer Res 54, , Hayashi K. Genet Anal Tech Appl. 9 (3),73-79, Hollstein M, Sidransky D, Vogelstein B, Harris CC. Science 5; 253 (5015), 49-53, Saiki RK, S Scharf, F Faloona, KB Mullis, GT Horn, HA Erlich and N Arnheim, Science 230, , Sheffield VC, Beck JS, Kwitek AE, Sandstrom DW, Stone EM. Genomics 16 (2), , Web Siteleri Page 28

31 Page 29

32 AB ANALITICA srl - Via Svizzera PADOVA, (ITALY) Tel Fax info@abanalitica.it