HBV Real-TM Quant Dx El Kitabı

Transkript

1 HBV Real-TM Quant Dx El Kitabı İnsan kanında Hepatit B Virus Kantitatif tespiti için Real Time PCR Kiti Kantitatif in Vitro Tanısal Kullanım için REF V5-96/3FRT 96 Rotor-Gene 6000/Q (Qiagen) ile kullanım için SaCycler-96 (Sacace) ile kullanım için Sacace Biotechnologies Srl via Scalabrini, Como Italy

2 İŞARET LİSTESİ Liste Nuarası <n> test için yeterli içerik Lot Numarası Versiyon İn Vitro Tanısal Kullanım için CONTROL INT Internal control Sıcaklık Kısıtlaması CONTROL 1 Yüksek Pozitif Kontrol Üretici CONTROL 2 Düşük Pozitif Kontrol Kullanım Talimatı CONTROL - Negatif Kontrol SonKullanma Talimatı CAL 1 Standart 1 Dikkat! CAL 2 Standart 2 Sacace HBV Real-TM Quant Dx VER

3 İÇİNDEKİLER İSİM...4 GİRİŞ....4 KULLANIM AMACI...4 TESTİN PRENSİBİ...5 SAĞLANAN MATERYALLER...6 GEREKLİ FAKAT DAĞLANMAYAN MATERYALLER...6 UYARI VE ÖNLEMLER...7 SAKLAMA VE TAŞIMA TALİMATLARI...8 KARARLILIK...8 KALİT KONTROL...8 ÖRNEK TOPLANMASI, SAKLANMASI VE TAŞINMASI...8 ETKİLEŞEN MADDELER REAKTİF HAZIRLIĞI...9 DNA İZOLASYONU...9 INTERNAL KONTROL...10 TEST KALİBRASYONU...10 TEST PROTOKOLÜ...11 KALİTE KONTROL PROSEDÜRÜ...12 SONUÇLARIN YORUMLANMASI...12 PERFORMANS ÖZELLİKLERİ...13 ANALİTİK ÖZELLİKLER LİNEER ARALIK...13 ÖZGÜNLÜK...14 GENOTİP TESPİTİ...14 ÇAPRAZ REAKTİVİTE...14 DAYANIKLILIK...14 HASSASİYET...15 ÇAPRAZ KONTAMİNASYON...15 ROTORGENE 6000/Q İÇİN PROTOKOL...16 SaCycler-96 Real Time PCR system İÇİN PROTOKOL...21 PROBLEM GİDERİLMESİ...23 Sacace HBV Real-TM Quant Dx VER

4 İSİM HBV Real-TM Quant Dx GİRİŞ Hepatit B virüsü (HBV) Hepadnavirus ailesine mensuptur. Virüs partikülü (virion) bir dış lipit zarf ve proteinden oluşan ikosahedral nükleokapsit çekirdekten ibarettir. Bu virionların çapı 42 nm ve bazen "dane partikülleri" olarak adlandırılırlar. Nükleokapsid viral DNA ve ters transkriptaz aktivitesine sahip bir DNA polimeraz içerir. Virüs bir çekirdek eksik ipliksi ve küresel organları da dahil olmak üzere pleomorfik biçimlerinin bulunabileceği en küçük zarflı hayvan virüslerindendir. Bu partiküller bulaşıcı değildir ve lipit ve viron yüzeyinin bir kısmını kaplayan ve yüzey antijeni (HbsAg) proteinlerden oluşur ve virüsün yaşam döngüsü sırasında aşırı üretilmektedir. Akut viral hepatit ile ilişkili Hepatit B virüsü ile akut enfeksiyon - genel hastalık belirtileri, iştah kaybı, bulantı, kusma, sonra vücut ağrıları, hafif ateş ve koyu idrar ile başlar ve sarılık gelişmesi ile ilerler. Kaşıntılı deri her hepatit virüsü türlerü için olası bir belirti olarak bir görülür. Hastalık birkaç hafta sürer ve sonra yavaş yavaş en çok etkilenen kişilerde geliştirir. Birkaç kişide daha şiddetli karaciğer hastalığı (fulminan karaciğer yetmezliği) gelişebilir, ve bunun sonucu olarak ölebilir. Enfeksiyon tamamen asemptomatik olabilir ve tanınmayan gidebilir.[16] Hepatit B virüsü ile kronik enfeksiyon asemptomatik olabilir veya karaciğerde (kronik hepatit), kronik inflamasyon ile ilişkili olup birkaç yıllık bir süre içinde siroza yol açabilir. Bu tip enfeksiyonlar hepatoselüler karsinoma insidansını( karaciger kanseri) dramatik olarak arttırır. Kronik taşıyıcılarda siroz ve karaciğer kanseri riskinin artmasını önlemek için alkol alınmaması teşvik edilir. Dünya üzeride yaklaşık 300 milyon kişi Hepatit B virüsü ile enfekte olmuştur. ELİSA, HBV enfeksiyonları için halen ana tespit yöntemidir fakat ELISA sonucu ne verimli serum viral yük veya hepatit etkinliğini yansıtır ne de antiviral tedavilerin etkinliğini izlenebilir. Şimdilerde PCR testleri HBV yükünün görüntülenmesi için kullanılmaktadır. HBV DNA izleme, yüksek viral replikasyonlu bireylerin tanımlanmasında, tedavi alan hastaların izlenmesinde, ve antiviral tedavinin başarılı olup olmadığını tahmin etmek için önemli bir araç haline gelmiştir. Örneğin, lamivudin gibi yeni antiviral ajanlar tanıtımıyla, hastaların yakından izlenmesi antiviral ilaca dirençli virüs suşları oluşumunu veya antiviral tedavinin kesilmesinden sonra flareslerin varlığı nedeniyle giderek daha önemli hale gelmiştir. KULLANIM AMACI HBV Real-TM Quant Dx Kit, insan kanında çift renkli algılama ile eş zamanlı olarak Hepatit B virüsünün kantitatif tespiti ile HBV-spesifik İç Kontrol (IC) tespitinin yapıldığı Real-Time Amplifikasyon testidir. HBV Real-TM Quant Dx Real Time HBV testi HBV taşıyıcı kan, plazma, serum veya dokuda tarama veya HBV enfeksiyonunun varlığını onaylamak için kullanılan tanısal bir test değildir. Sacace HBV Real-TM Quant Dx VER

5 TEST PRENSİBİ HBV Real-TM Quant Dx Kiti insan plazmasında Hepatit B virüsünün kantitatif tespiti için kullanılan bir Real-Time testtir. HBV DNA sı plazmadan ekstrakte edilir, real time Amplifikasyon kullanılarak amplifiye edilir ve HBV veya HBV IC için spesifik floresan boya probları kullanılarak tespit edilir. Termal döngünün her bir turunda amplifiye ürünler yüksek sıcaklık ile tek zincirli hale geçerek primer bağlanmasına izin verir ve sıcaklığın düşürülmesi ile uzama gerçekleşir. Ürünlerin üstel amplifikasyonu yüksek ve düşük sıcaklıklar arasındaki döngülerde hedef dizinin milyon kat veya daha fazla amplifikasyonu ile sağlanır. İki hedefin de (HBV ve IC) amplifikasyonu aynı reaksiyonda eş zamanlı olarak gerçekleşir. Real Time boyunca floresan yoğunluğunun ölçülmesi amplifikasyonun ardından reaksiyon tüplerinin yeniden açılmasına gerek kalmadan biriken ürünlerin tespit ve kantitasyonunun yapılmasını sağlar. IC tek tek işlenmiş her bir örnek için bir ekstraksiyon ve amplifikasyon kontrolü olarak hizmet eder ve olası inhibasyonları tespit eder. IC, HBV DNA dan başka bir kanalda tespit edilir. HBV- IC-L rekombinant DNA içeren bir yapıda liyofilize İç Kontroldür ve nükleik asit ekstraksiyonundan PCR amplifikasyonu-tespitine kadar analizin bütün basamaklarına dahil edilir. HBV Rec IC sadece ekstraksiyon prosedürünü izlemeye ve olası PCR inhibasyonlarını kontrol etmeye değil aynı zamanda ekstraksiyon prosedürü sırasında yaşanabilecek olası DNA kayıplarını doğrulamaya yarar ki bu da HBV viral yükün kesin olarak hesaplanmasını sağlar. Test; 4th WHO International Standard for Hepatitis B virus for Nucleic Acid Amplifikasyon Techniques (NIBSC code: 10/264) e göre standardize edilmiştir ve sonuçlar International Units/mL (IU/mL) olarak verilir. HBV Real-TM Quant Dx testi için hedef dizi HbsAg kodlayan 5 genidir. Bu bölge HBV için spesifiktir ve hayli korunmuştur. Sacace HBV Real-TM Quant Dx VER

6 SAĞLANAN MATERYALLER Sacace HBV Real-TM Quant Dx Amplification Reaktif Kit RT-PCR REAKTİF PAKEDİ 96 vial (0,2 ml) liyofilize Amplifikasyon Reaktifi Sacace HBV Real-TM Quant Dx Control Kit 1, 2 CONTROL INT 4 vial liyofilize Reaktif HBV-IC-L CONTROL 1 4 vial liyofilize Reaktif HBV-Pos1-L C+ - Sacace HBV Real-TM Quant Dx Yüksek Pozitif Kontrol* CONTROL 2 4 vial liyofilize Reaktif HBV-Pos2-L C+ - Sacace HBV Real-TM Quant Dx Düşük Pozitif Kontrol* CONTROL 4,0 vial, her vial için 4,0 ml Negatif Kontrol Sacace HBV Real-TM Quant Dx Calibrator Kit 1,2 CAL 1 4 vial Liyofilize Reaktif HBV Quantitative Standard 1 CAL 2 4 vial Liyofilize Reaktif HBV Quantitative Standard 2 1 Standart ve Kontrol konsantrasyonları lota spesifiktir. 2 Örnek hazırlığı prosedürü sırasında kullanılmalıdır (RNA izolasyonuna bakın). GEREKLİ FAKAT SAĞLANMAYAN MATERYALLER RNA izolasyon kiti (RNA izolasyonuna bakın) eppendorf tip tüpler için masa santrifüjü Vortex mikser Tek kullanımlık, tozsuz eldiven Biyolojik tehlikeli atık konteyneri Budolabı, dondurucu Real Time Thermal cycler Bulaşıcı malzemeler ile çalışmak için onaylanmış biyolojik güvenlik kabini Pipetler (ayarlanabilir) Filtreli steril pipet uçları Tüp rakları Sacace HBV Real-TM Quant Dx VER

7 UYARI VE ÖNLEMLER In Vitro Tanısal Tıbbi Cihaz Sadece In Vitro Tanısal Kullanım için 1. Örneklerle çalışmaya başlamadan önce bu prospektüsdeki talimatları dikkatle okuyun. Optimal PCR sonuçları için kullanıcı manueline uyulması önemlidir. 2. Numune ve reaktiflerle çalışırken tek kullanımlık eldiven, lab önlüğü giyin ve göz koruması kullanın. 3. Rutin laboratuvar önlemleri alın. Yemeyin, içmeyin, sigara içmeyin, makyaj yapmayın veya kontak lenslerinizi çıkarıp takmayın. Ağız ile pipetleme yapmayın. 4. Kitleri son kullanma tarihlerinden sonra kullanmayın. 5. Farklı kitler arasında reaktifleri karıştırmayın. 6. Nükleik asit kontaminasyonunu engellemek için aerosol bariyerli pipet ucu kullanılmalıdır. Bütün sıvı transferleri arasında pipet ucunu değiştirin. 7. Örneklerin hazırlanması sırasında çapraz kontaminasyonu önlemek ve örneklere nükleaz bulaşmasını önlemek için iyi laboratuvar uygulamalarına uymak önem taşır. RNA veya DNA ile çalışılırken uygun aseptik teknikler kullanılmalıdır. 8. Sadece tozsuz tek kullanımlık eldiven kullanın. 9. Kullanılmayan reaktifleri ve numuneleri yerel düzenlemelere uygun olarak yok edin. 10. Heparinin reaksiyonu inhibe ettiği gözlenmiştir. Heparinize edilmiş numunelerin kullanılmaması önerilir. 11. Numuneler bulaşıcı olabilir. Testi gerçekleştirirken evrensel önlemleri alın. 12. Örnekler ve Kontroller bir laminer akış alanında hazırlanmalıdır. 13. Numune veya kontroller ile çalışırken çapraz kontaminasyonu engellemek için iyi laboratuvar uygulamalarına uygun davranın. 14. Etrafa saçılan bütün numune veya reaktifleri %0,5 lik sodyum hipoklorit veya başka uygun dezenfektanlar kullanarak temizleyin. Ardından yüzeyi %70 lik etanol ile silin. 15. Numune ve reaktiflerin cilt ve göz ile temasından kaçının. Eğer temas eder ise derhal su ile yıkayın ve medikal yardım alın. 16. Bu ürün potensiyel tehlikeli madde içermez. Material Safety Data Sheets (MSDS) istek üzerine sağlanır. 17. Bu ürünün kullanımı amplifikasyon teknikleri üzerine uzman kullanıcı ile sınırlı olmalıdır. 18. Labarotuvardaki çalışma akışı tek yönlü işlemelidir. Ekstraksiyon alanında başlamalı PCR ve ardından tespit alanına doğru devam etmelidir. Önceki basamakların gerçekleştirildiği alanlara örnek, ekipman ve reaktif taşımayın. Sacace HCV Real-TM Quant Dx VER

8 Sacace HBV Real-TM Quant Dx VER

9 DEPOLAMA VE TAŞIMA TALİMATLARI HBV Real-TM Quant Dx PCR kitin bütün bileşenleri kullanılmadığında +2-8ºC de saklanmalıdır. HBV Real- TM Quant Dx PCR kitin bütün bileşenleri paketin üzerindeki son kullanma tarihine kadar kararlılığını korur. Aksi belirtilmediği sürece, reaktiflerin ilk kullanımdan önce ve sonraki raf ömrü aynıdır. HBV Real-TM Quant Dx PCR kitini +2-8ºC de transfer edin. KARARLILIK HBV Real-TM Quant Dx kit etiketinde belirtilen son kullanma tarihine kadar kararlıdır. Ürün, etiketin üzerinde belirtilen kontrol tarihine kadar işlemeye devam edecektir. Işık, ısı ve neme maruz kalmak bazı kit bileşenlerini etkileyebilir. Bu durumdan kaçınılmalıdır. Etiketinin üzerinde bulunan talimatlara uygun saklanmayan reaktiflerin performansı etkilenebilir ve bu test sonuçlarını ileri derecede etkileyebilir. Pozitif veya Negatif Kontrol değeri beklenen aralığın dışında ise bu reaktiflerin bozulduğunu gösteriyor olabilir. Bu durumda ilgili test sonuçları geçersizdir ve örnekler yeniden çalışılmalıdır. Testin yeniden kalibre edilmesi gerekiyor olabilir. KALİTE KONTROL Sacace s ISO Certified Kalite Yönetim Sistemi uyarınca, her lot tutarlı ürün kalitesini sağlamak için önceden belirlenmiş özellikleri karşı test edilir. ÖRNEKLERİN TOPLANMASI, SAKLANMASI VE TAŞINMASI Not: Bütün numuneleri potansiyel bulaşıcı olarak ele alın. Son çalışmalar göstermiştir ki; EDTA veyya sitratlı plazma HBV tespiti için çalışmaya en uygun örneklerdir. Bu sebeple biz de HBV Real-TM Quant Dx ile çalışmak üzere bu materyalleri öneriyoruz. HBV Real-TM Quant Dx testinin IC validasyonu EDTA lı kan örnekleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Diğer örnek materyalleri valide değildir. HBV Real-TM Quant Dx testi sadece insan plazması ile kullanılır* 1. HBV Real-TM Quant Dx ile EDTA tüpleri kullanılabilir. Örnek tüpü üreticisinin talimatlarını izleyin. 2. EDTA lı tüpe toplanmış tam kan altı saat içinde x g de 20 dk santrifüj edilerek plazma ve hücresel elemanlar olarak ikiye ayrılmalıdır. Izole edilmiş plazma steril polipropilen bir tüpe aktarılmalıdır. 2-8 C de fazladan 3 gün daha saklanabilir. Alternatif olarak plazma -18 C de bir aya - 70 C de bir yıla kadar saklanabilir. 3. Tam kanı dondurmayın. 4. Heparin ile antikoagüle edilmiş numuneler test ile çalışmaya uygun değildir. 5. Donmuş numuneleri kullanmadan önce oda sıcaklığına getirin. 6. Tam kan 2-25 C de transfer edilmeli ve toplandıktan sonra 6 saat içinde işlenmelidir. Plazma 2-8 C de veya dondurulmuş olarak transfer edilebilir. 7. Klinik örneklerin ve etyolojik ajanların taşınması için ülke, federal, eyalet ve yerel yönetmeliklere uyulmalıdır. * Serum bazı durumlarda başlangıç materyali olarak kullanılabilir. Bu durumda HBV Real TM Quant Dx kitin analitik hassasiyeti aynıdır, ancak önemli ölçüde serum hazırlama sırasında pıhtı oluşumu aşamasında viral parçacıkların çökelmesi sebebi ile klinik duyarlılığında azalma olabilir. Sacace HBV Real-TM Quant Dx VER

10 İNTERFERAN MADDELER Artmış bilirubin ( 15 mg/dl) veya lipit ( 800 mg/dl) sistem ile etkileşime girmez. Heparin ( 10 IU/ml) PCR I etkiler. Antikoagülan olarak heparinin kullanıldığı tüplerde toplanan numuneler kullanılmamalıdır. Ayrıca heparin kullanan hastaların serumları da kullanılmamalıdır. REAKTİFLERİN HAZIRLANMASI Herhangi bir HBV Real-TM Quant Dx protokolüne başlamadan önce aşağıdaki reaktifleri hazırlayın: 1. Gerekli miktarda Liyofilize Kontrol ve Kalibratörü alın ve kısa süre santrifüj edin. 2. Aşağıdaki tabloya göre Negatif Kontrol ( KONTROL -) ekleyin: Liyofilize reaktif CONTROL -, µl CAL CAL CONTROL CONTROL CONTROL INT T üpleri kapatın ve oda sıcaklığında 2 dk inkübe edin. Periyodik olarak vorteksleyin. 4. Tüpleri 5 sn santrifüj edin. 5. Çözülmüş reaktifler 2-8 C de ve ışıktan korunarak 30 gün saklanabilir (dondurmayın!). DNA İZOLASYONU Aşağıdaki izolasyon kitleri önerilir: Magno-Virus (Sacace, REF K-2-16): örnek hacmi 1000 µl; SaMag-24 (Sacace, REF SM102): otomatik nükleik asit saflaştırma sistemi: SaMag Viral Nucleic Acid Extraction Kit örnek hacmi 400 µl DNA ekstraksiyonunu üreticinin talimatlarına uygun olarak yapın. DNA izolasyon prosedürü sırasında bütün örneklere/liziz karışımlarına, kontrollere, kalibratörlere10 µl IC ekleyin. Yüksek ve Düşük Pozitif Kontroller (KONTROL 1 ve KONTROL 2) ile beraber Neg. Kontrol (KONTROL -) izolasyon prosedüründe hasta numuneleri ile beraber kullanılmalıdır. Bu kontroller için, DNA saflaştırma kiti protokolünde numune için uyulan talimatlara uyulmalıdır. Sacace HBV Real-TM Quant Dx VER

11 İÇ KONTROL HBV-IC-L nükleik asit ekstraksiyonundan PCR amplifikasyon-tespitine kadar analizin bütün basamaklarında taşınan rekombinant DNA içeren bir yapı sunar. HBV-IC-L nin varlığı sadece ekstraksiyon prosedürünü izlemeye ve olası PCR inhibitörlerini kontrol etmeye değil aynı zamanda ekstraksiyon prosedürü sırasında oluşabilecek RNA kayıplarını denetlemeye de yarayarak HBV viral yükün tam olarak hesaplanmasını da sağlar. Bir IC eşik döngüsü [Ct] test geçerlilik parametresi bir kalibrasyon çalışması sırasında kurulur. Tanımlı, tutarlı bir IC miktarı (10 ul) örnek hazırlığının başında her numuneye, kalibratör ve kontrole eklenir ve real time pcr cihazında uygun numune işlenmesi ve test geçerliliğini göstermek için ölçülür. Kalibrasyon prosedürü boyunca IC hedef dizi floresan sinyalin tespit edildiği median amplifikasyon döngüsü sonraki tüm işlenmiş örnekler tarafından yerine getirilmesi gereken bir IC Ct geçerlilik aralığı kurar. The established range of samples IC Ct = Medium IC Ct of 6 calibrators ± 2 cycles Kurulan IC Ct değerini aşan örneklerin örnek hazırlığından başlanarak yeniden çalışılması gerekir. TEST KALİBRASYONU Numune ve kontrollerin HBV DNA konsantrasyonunu kantite etmek için bir kalibrasyon eğrisi gerekir. Kalibrasyon eğrisi oluşturmak için iki test kalibratörü üçer defa çalışılır ( HCV konsantrasyonuna karşı tespit edilmiş floresan sinyali reaktif seviyesinde eşik döngüsü (Ct) ) Kalibrasyon eğrisi eğimi ve kesişim cihaz üzerinde hesaplanır ve saklanır. Bir numune içindeki mevcut HBV DNA konsantrasyonu, önceden oluşturulmuş kalibrasyon eğrisi üzerinden hesaplanır. Kantitatif Standartlar CAL1 ve CAL2 hasta numunelerinin çalışıldığı şekilde çalışılmalıdır. HBV Real- TM Quant Dx kitin yeni lotunun ilk kullanımından önce, bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak için 6 Kalibratör RNA ekstraksiyon prosedüründen başlayarak çalışılmalıdır ( iki kontrol 3 er defa çalışılır): Her kalibrasyon çalışması için CAL1 için 3 örnek hazırlığı tüpü, CAL2 için 3 örnek hazırlığı tüpü ayırın. Her tüpe10 µl KONTROL INT ekleyin; Uygun tüplere DNA saflaştırma kitinde belirtilen miktarda CAL1 ve CAL2 ekleyin. (örneğin, Magno-Virus kit (Sacace, REF K-2-16) kullanırken 1000 µl) RNA saflaştırma kitinde tarif edilen örnek hazırlığı prosedürüne uyun. Sacace HBV Real-TM Quant Dx VER

12 TEST PROTOKOLÜ Not: Reaksiyon Mix hacmi = 50 µl Sulandırılmadan önce, dondurularak kurutulmuş içeriğin herhangi bir bölümünü tartmak adına hiçbir girişimde bulunulmamalıdır. REAL TIME PCR KALİBRASYON PROSEDÜRÜ: 1. Ekstrakte edilmiş Kalibratörlerin PCR ı için liyofilize Reaktifleri içeren 6 reaksiyon tüpü hazırlayın Kalibratörün RNA saflaştırmasından elde edilen ayrıştırılmış örneklerden 50 µl ekleyin. Amplifikasyon ve tespit için bu manuelde tarif edilen prosedürü izleyin. HBV Real-TM Quant Dx kalibrasyonu kabul edilip kaydedildikten sonra lotun son kullanma tarihine kadar kullanılabilir. Bu süre boyunca, bütün örnekler aynı lot numaralı HBV Real-TM Quant Dx kullanarak oluşturulan kalibrasyon eğrisinden alınarak daha ileri bir kalibrasyon gerekmeden test edilebilir. REAL TIME PCR ÖRNEK PROSEDÜRÜ: 1. Ekstrakte örnekler ve kontrollerden PCR gerçekleştirmek için gerekli miktarda liyofilize reaktif içeren reaksiyon tüpü hazırlayın. 2. DNA saflaştırma basamağında elde edilken elue örneklerden 50 µl ekleyin. Tüpleri kapatın ve Real Time PCR cihazına yerleştirin. Real-time cihazınızda aşağıdaki gibi bir sıcaklık profili oluşturun: Stage Тemp, С Time Fluorescence detection Cycle repeats Hold min s Cycling Cycling s s 95 5 s s* FAM/Green, JOE/Green/HEX s 5 40 * Rotor-Gene 6000/Q cihazı kullanılıyorsa 20 s Sacace HBV Real-TM Quant Dx VER

13 Sacace HBV Real-TM Quant Dx VER

14 KALİTE KONTROL PROSEDÜRÜ Olası reaksiyon inhibasyonlarını tanımlamak ve her bir örneğin ekstraksiyon aşamasını kontrol etmek için örnek hazırlığının başında belirlenmiş bir iç kontrol (IC) her örneğe eklenir. Negatif Kontrol (KONTROL - ), HBV Yüksek (+) Kontrol (KONTROL 1) ve HBV düşük (+) Kontrol (KONTROL 2) her teste ikişerli olarak dahil edilmelidir. Eğer kontroller beklenen aralığının dışında ise (Data Sheet bkz), o çalışmadaki bütün örnekler ve kontroller örnek hazırlama basamağından başlanarak yinelenmelidir. SONUÇLARIN YORUMLANMASI İç Kontrol (IC), FAM/Green kanalında ve HBV DNA Joe/Yellow/HEX kanalında tespit edilir. Her bir DNA amplifikasyonu FAM/Green channel (IC için) veya Joe/Yellow/HEX kanalında (HBV DNA için) ölçülebilen ve bir sigmoid büyüme eğrisi (log ölçekli) ile sonuçlanan floresan sinyal üretimi ile ilişkilidir. Veri analizi üreticinin talimatlarına uygun olmak üzere İlgili yazılım ve el kitabı temel alınarak yapılır (Rotor- Gene 6000/Q, Qiagen ve SaCycler-96, Sacace kullanma talimatları). Sonuçları yorumlamadan önce çalışmanın geçerliliğinden emin olmak için elde edilen sonuçları kontrol edin. HBV DNA kantitasyon standartlarının analizi sonucu oluşturulan standart eğrisi ve CT değerleri temel alınarak belirlenir. HBV DNA konsantrasyonu IU/ml olarak ifade edilir. Eğer sonuç 100,000,000 IU/ml den fazla ise, sonuç 100,000,000 IU HBV/ml den fazla olarak görüntülenecektir. Eğer sonuç lineer ölçüm aralığının üstünde ise, örnek 10 kat dilüe edildikten sonra çalışılabilir. Ardından sonuç 10 ile çarpılmalıdır. 1 ml den ekstraksiyon halinde sonuç 7 IU/ml den düşük ise ekranda sonuç 7 IU HBV/ml den düşük olarak görüntülenecektir. Sacace HBV Real-TM Quant Dx VER

15 PERFORMANS ÖZELLİKLERİ HBV Real-TM Quant Dx Kit common technical specifications (CTS) for in vitro diagnostic medical devices (2009/108/EC) and European Pharmacopoeia 7.0, p Nucleic acid Amplifikasyon techniques (07/2010:20621) e göre değerlendirilmiştir. ANALİTİK DUYARLILIK Analitik duyarlılık veya Tespit Limiti (LOD) % 95 veya daha büyük bir olasılık ile tespit edilebilir HBV DNA en küçük miktarı olarak tanımlanır. LOD örnek DNA saflaştırma dikkate, belirli bir ekstraksiyon yöntemi ile birlikte HBV Pozitif klinik numuneler kullanarak belirlenir. HBV DNA, üretici talimatlarına göre Magno Virüs saflaştırma kiti (Sacace, REF K-2-16) ile ekstre edilmiştir. HBV Real-TM Quant Dx testinin LOD u 1.0 ml örnek hazırlık prosedürü ile 7 IU/mL dir. LOD, HCV negatif insan plazmasında hazırlanan 4th WHO International Standard for Hepatitis C virus for Nucleic Acid Amplifikasyon Techniques (NIBSC code: 06/102 15) dilüsyonları ile belirlenmiştir. Sonuçlar Probit analizi ile belirlenmiştir. LİNEER ARALIK Doğrusal aralık veya Lineerlik bir testin nükleik asit konsantrasyonu ile doğrudan orantılı olan test sonuçları elde etme yeteneğidir. Diğer bir değişle, test sonuçları üst ve alt konsantrasyonu aralığında konsantrasyonları ile doğru orantılıdır. HBV Real-TM Quant Dx testinin kantitasyon için üst limiti 100 milyon IU/mL ve kantitasyon için alt limit Tespit limitine eşittir (1.0 ml örnek hazırlık prosedürü ile7 IU/mL) HBV Real-TM Quant Dx kitinin lineer aralığı 3 th WHO International HBV DNA Standard ına karşı kalibre edilmiş HBV sentetik kantitatif standat bir dilüsyon serisinin analiz edilmesi (8,00 log IU/ml - 1,00 log IU/ml) ile değerlendirilmiştir. Sonuçlar, HCV Real-TM Quant Dx test lineerliğinin temsilcisi, Şekil 1 de gösterilmiştir. 8,00 HBV Real-TM Quant Dx Conc., log IU/ml 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 y = 0,92x + 0,1859 R² = 0,9864 0,00 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 Target Conc., log IU/ml Sacace HBV Real-TM Quant Dx VER

16 ÖZGÜNLÜK Primer ve probların analitik özgünlüğü European Directorate for the Quality of Medicine & HealthCare (EDQM) dan elde edilen 100 negatif plazma örneği ile değerlendirilmiştir. HBV primer ve probları ile spesifik bir sinyal vermemişlerdir. HBV Real-TM Quant Dx kitinin özgünlüğü %100 dür. GENOTİP TESPİTİ HBV virüsünün farklı genotiplerinin tespit edilebilmesi primer ve probların özgünlüğüne bağlıdır. Ilgili tüm alt ve genotip görülebilirliği böylece sağlanmıştır. Test edilen genotipler: A, B, C, D, H. Test edilen bütün HBV genotipleri HBV Real-TM Quant Dx kit ile pozitif sonuç vermişlerdir. ÇAPRAZ REAKTİVİTE HBV Real-TM Quant Dx kitinin potansiyel çapraz reaktiviteleri aşağıda listelenen kontrollere karşı yapılmıştır. Bu, bu patojenler ile herhangi bir çapraz reaksiyon gözlenmedi. Tablo 1: Diğer patojenlere karşı testin özgünlüğü: Kontrol grubu HBV Sonuçlar(Joe/Yellow channel) Results IC(Fam/Green channel) Cytomegalovirus (CMV) - + Epstein Barr virus (EBV) - + Hepatitis C virus (HCV) - + Hepatitis D virus (HDV) - + Hepatitis A virus (HAV) - + Parvovirus B Herpes Zoster Virus (VZV) - + Human immunodeficiency virus Herpes simplex virus Herpes simplex virus Human herpes virus Human herpes virus West Nile Virus (WNV) - + Tick-borne encephalitis virus (TBEV) - + Adenovirus type Adenovirus type Adenovirus type Escherichia coli (E.coli) - + Staphylococcus aureus - + Streptococcus pyogenes - + Streptococcus agalactiae - + DAYANIKLILIK Tahlilin sağlamlığı yöntem parametrelerinin küçük ve kazara çeşitlilikler tarafından etkilenmez kapasitesinin bir ölçüsüdür ve normal kullanım sırasında güvenilirliliğin bir göstergesidir. HBV Real-TM Quant Dx kit 96 şişe kullanıma hazır liyofilize reaktif RT-PCR REAKTİF PAKEDİ içerdiğinden, kitin normal kullanımı sırasında olası tek çeşitlilik DNA saflaştırma basamağı sırasında elde edilen elue örneklerin eklenen miktarıdır. HBV Real-TM Quant Dx kitin sağlamlığı, farklı hacimlerde elüe örnek (46-52 µl) ile değerlendirilmiştir. Liyofilize reaktif içeren şişelere küçük çeşitlilikte (46-52) HBV RNA ile zenginleştirilmiş%95 cut-off değerinde final konsantrasyonda 20 HBV RNA plazma havuzu eklenmiştir. Test edilen bütün örnekler HBV RNA için pozitif bulunmuştur. KESİNLİK HBV Real-TM Quant Dx kitin kesinliği manuel örnek hazırlama için SaCycler-96 cihazı kullanılarak değerlendirilmiştir. HBV Real-TM Quant Dx kitinin kesinlik verileri testin toplam varyansının tespitine izin vermektedir. Total varyans; testler arası değişkenlik (çalışmalar arasında aynı konsantrasyondaki çoklu örnek sonuçlarının değişkenliği), the test içi değişkenlik (farklı günlerde farklı cihazlar kullanılarak Sacace HBV Real-TM Quant Dx VER

17 yapılan çalışmalardan elde edilen sonuçlar arasındaki değişkenlik) lotlar arası değişkenlik (farklı lotlar kullanılarak yapılan çalışmalarda elde edilen sonuçlar arasındaki değişkenlik). Elde edilen veriler, belirli bir patojen ve IC Kontrol için, standart sapma ve varyasyon katsayısı belirlemek için kullanılmıştır. Bütün kombinasyonlar halinde testler incelendiğinde (testler arası, testler içi, lotlar arası), aşağıdaki tabloda belirtildiği şekilde, kabul edilen aralıkta log hallinde Standart Sapma ve % CV (+/- 0.5 log of set point) göstermiştir. Hesaplanan toplam değişkenlik: Mean SD Ct HBV log Mean SD Ct IC log 0,006 0,004 Mean CV % Ct HBV Mean CV % Ct IC 1,31 1,05 Test içi çeşitlilik SD Ct HBV log SD Ct IC log 0,006 0,004 CV % Ct HBV CV % Ct IC 1,31 1,05 Testler arası çeşitlilik SD Ct HBV log SD Ct IC log 0,006 0,004 CV % Ct HBV CV % Ct IC 1,32 1,05 ÇAPRAZ KONTAMİNASYON HBV Real-TM Quant Dx kitin çapraz kontaminasyonu RotorGene Q cihazı kullanılarak yapılan manuel örnek hazırlığı için değerlendirilmiştir. Çapraz kontaminasyonun olmadığını göstermek için yüksek konsantrasyon HBV li negatif plazma ve Negatif plazma örneklerinden oluşan 20 örneklik panel kullanılmıştır. Bütün pozitif örnekler doğru şekilde tespit edilmiş, iyi ve temiz sigmoid-şekilli loresans eğri ile floresan Pozitif Reaksiyon ve hem HBV kanalında hem de IC kanalında 35 in altında Cycle treshold (Ct) değeri vermiştir. Hiç bir Negatif örnek HBV kanalında floresan sinyal vermemiş ve IC kanalı hiç bir çapraz kontaminasyo göstermemiştir. Sacace HBV Real-TM Quant Dx VER

18 ROTORGENE 6000/Q için PROTOKOL 1. Ana elektrik düğmesine basarak cihazı açın, Rotor-Gene yazılımını başlatın. 2. Yeni bir çalışma başlatın. Şekil 1. New Run Başlatma 3. Uygun rotor u seçin, Locking Ring Attached kutusuna tik atın ve Next e basın. Şekil 2. Rotor ve Kilitleme Halkası 4. Kullanıcı adı, notlar ve reaksiyon hacmini ( 50 ) girin. Daha sonra Next e basın. Şekil 3. Reaksiyon Hacmi Sacace HBV Real-TM Quant Dx VER

19 5. Edit Profile e tıklayın ve sıcaklık profilini programlayın. Şekil 4. Profil Düzenleme Şekil 5. Hold: Enzim aktivasyon basamağı Şekil 6. Cycling: Birinci amplifikasyon basamağı Sacace HBV Real-TM Quant Dx VER

20 Şekil 7. Cycling: İkinci amplifikasyon ve tespit basamağı 6. New Run Wizard menüsünde Gain Optimisation a tıklayın ve aşağıdaki parametreleri ayarlayın: Şekil 8. Gain Optimisation 7. PCR tüplerini dikkatle RotorGene 6000/Q rotor a yerleştirin, kapağı kapatın, çalışmayı başlatın. Şekil 9. Çalışmanın başlatılması. Sacace HBV Real-TM Quant Dx VER

21 8. Ö rneklerin pozisyon ve isimlerini girin (örnekler için unknown, kontroller için Negatif Kontrol ve Pozitif Kontrol ). Eğer kit kalinbrasyon çalışması gerçekleştiriliyor ise CAL1 ve CAL2 için standard ismini kullanın ve HBV Real-TM Quant Dx Data Card ında belirtilen kantitatif standart konsantrasyonlarını girin. 9. Kullanıcı sonraki klinik örneklerin kantitatif sonuçlarını almak için Standart Eğrisi ile kalibrasyon deneyini almalıdır. Bunu yapmak için Import Curve e tıklayın, From Other Run seçeneğini seçin, aktarılacak kalibrasyon dosyasını seçin ve Joe/Yellow Kanalına aktarın. Sacace HBV Real-TM Quant Dx VER

22 Veri Analizi IC Amplifikasyon analizi (Cycling A.Green (Fam) 1. Analysis e basın, Quantitation a basın ve Cycling A.Green (Cycling A.Fam) seçin ve Show a basın. 2. automatic option Threshold u. 3. Main menu penceresinde Dynamic tube ve Slope Correct düğmelerini aktive edin (Quantitation analysis). 4. Sonuç tablosunda (Quantitation Analysis), More settings I seçin ve NTC Threshold u 10% a ayarlayın. 5. Seçin: Threshold: 0,03 6. Sonuç tablosunda (Quantitation Results), IC (Fam/Green channel) nin Ct değeri(threshold cycle) 30 ( IC bkz) olmalıdır. HBV Amplifikasyon analizi (Cycling A.Yellow (Joe) 1. Analysis e basın, Quantitation da Cycling A.Yellow (Cycling A.Joe) I seçin Show a basın. 2. Threshold un otomatik seçeneğini kapatın. 3. Dynamic Tube ve Slope Correct düğmelerine basın 4. Sonuç tablosunda (Quantitation Analysis) More settings I seçin ve NTC Threshold u 10% a ayarlayın. 5. Seçin: Threshold: 0,03 6. Sonuçlar tablosunda (Quantitation Analysis) Ct değeri(threshold cycle) görünür. 7. Yeni ekranda - Quantitation Results- HBV DNA IU/ml değeri görünür.

23 Sacace HBV Real-TM Quant Dx VER

24 SaCycler-96 Real Time PCR sistemi için protokol Önerilen ayarlar: 1. RealTime_PCR software iconuna çift tıklayın 2. Device handling I seçin. 3. Takılı cihazı seçin ve Connect e tıklayın. 4. Menüden Test -> Create/Edit test seçin. Create new test düğmesine tıklayın HBV Real-TM Quant DX adını girin, OK tıklayın. 5. Seçin: Analysis Type Multiplex detection ve Method Threshold, Standard Quantity 2 ve copy 3 (toplam 6 standart), 2 Pozitif Kontrol, 1 Negatif Kontrol, FAM (IC) ve R6G (s), 50 µl Mixture volume: 6. Amplifikasyon Program ın altında, yeni program yaratmak için ikonuna tıklayın. 7. Preliminary heating seçin ve aşağıdaki şablonu seçin. Apply e tıklayın, ve cihazı aşağıdaki gibi programlayın: 8. düğmesine tıklayın Amplifikasyon programını uygun dosyaya kaydedin. Sonra önceki ekranda OK düğmesine tıklayın. 9. Test düğmesine tıklayın, sonra Test menüsünden HBV Real-TM Quant DX seçin, örnek sayısını belirtin, önce Add e sonra OK e tıklayın. Sacace HBV Real-TM Quant Dx VER

25 10. PCR tüplerinin plate yerleştirilmesi için varsayılan Autofill pozisyonlamayı veya tüplerin pozisyonunu manuel olarak belirlemek için Free Filling I kullanın. Concentration kolonunda, yeşil daireye tıklayın ve DataCard da belirtilen HCV standardı değerlerini girin. (aşağıdaki örneğe bkz). 11. Apply e tıkladığınızda Start Program penceresi açılacaktır. 12. Thermalcycling program aşağıdaki gibi olacaktır: 13. Open block a tılayın, PCR tüplerini cihaza yerleştirin, Close a tıklayın ve PCR Amplifikasyon programını başlatmak için düğmesine tıklayın. 14. Çalışma tamamlandıktan sonra sonuçların yorumu için O e tıklayın. 15. Results table dan seçin: analysis type Multiplex detection, Threshold (Ct) method ve Quantitative. 16. Parameter of data analysis ikonuna tıklayın, Normalization data opsiyonunu seçin ve Apply düğmesine tıklayın. 17. Fare ile sürükle ve bırak yaparak eşik çizgisini (threshold line). Eşik çizgisi için önerilen değerler; HEX kanalı için 40, FAM kanalı için 25 ( eşik seviyesini sonuç eğrinize göre hafifçe adapte edin). 18. HEX kanalı için viral yük sonuçları Results kolonunda belirecek. Final sonuçlar IU/ml olarak belirtilir. 19. Standart eğrisini diğer çalışmaya aktarmak için, Additional standards tabına tıklayın ve standartları içeren dosya dönün. ikonunu seçin. Ardından viral yük sonuçlarını görmek için Results tabına geri NOT: SaCycler ın IVD li versiyonu için, HCV Real-TM DX protokolü cihaz ile verilen bilgisayara halihazırda yüklü olduğundan 4-8 arasını atlayın ve talimatları 9. noktadan itibaren takip edin. Sacace HBV Real-TM Quant Dx VER

26 PROBLEM GİDERİLMESİ 1. Zayıf (Ct > 30) veya IC (Fam/Green channel) ın yayınlanmış sinyal aralığının (İç Kontrole bkz) aşılması durumunda: bütün örneklerin yeniden test edilmesi gerekmektedir. PCR inhibe oldu ise. Önerilen bir DNA ekstraksiyon metodu kullandığınızdan emin olun ve üreticinin talimatlarını izleyin. Reaktiflerin saklanma koşulları talimatlar ile uyumlu değil ise. Saklama koşullarını kontrol edin. The PCR koşulları talimatlar ile uyumlu değil ise. PCR koşullarını kontrol et ve protokolde IC tespiti için belirtilen floresan kanalı seçin. Reaktiflerin pipetlenmesi sırasında örneklere IC eklenmedi ise. DNA ekstraksiyon prosedürü boyunca dikkatli olun. 2. Korelasyon katsayısı R dan küçük ise: bütün örneklerin yeniden test edilmesi gerekmektedir. 3. KONTROL 1 in hesaplanan konsantrasyonu ve/veya KONTROL 1 veri kağıdında belirtilen konsantrasyondan farklı ise bütün örneklerin yeniden test edilmesi gerekmektedir. 4. Joe/HEX/Yellow kanalında ekstraksiyonun Negatif Kontrolü ile sinyal alınması durumunda: DNA ekstraksiyonu sırasında kontaminasyon. Bütün örnek sonuçları geçersizdir. Bütün yüzey ve cihazları çamaşır suyu ve etanol ile dekontamine edin. Ekstraksiyon boyunca sadece filtreli pipet ucu kullanın. Tüpler arasında pipet uçlarını değiştirin. DNA ekstraksiyonunu yeni set reaktifler ile tekrarlayın. 5. Negatif PCR Kontrolünün sinyal vermesi durumunda: PCR hazırlık prosedüründe kontaminasyon. Bütün örnek sonuçları geçersizdir. Bütün yüzeyleri çamaşır suyu ve alkol veya özel DNA dekontaminasyon reaktifleri ile dekontamine edin. Pozitif Kontrolleri en son ekleyin. PCR hazırlığını yeni bir set reaktif ile tekrarlayın. Sacace HBV Real-TM Quant Dx VER

27 REFERANSLAR 1. Zuckerman AJ (1996). "Hepatitis Viruses". In Baron S, et al.. Baron's Medical Microbiology (4th ed.). University of Texas Medical Branch. ISBN Locarnini S (2004). "Molecular virology of hepatitis B virus". Semin. Liver Dis. 24 Suppl 1: doi: /s PMID Terrault N, Roche B, Samuel D (July 2005). "Management of the Hepatit B virüsüin the liver transplantation setting: a European and an American perspective". Liver Transpl. 11 (7): doi: /lt PMID Harrison T (2009). Desk Encyclopedia of General Virology. Boston: Academic Press. p ISBN Howard, C. R. (1986). "The Biology of Hepadnaviruses". Journal of General Virology 67 (7): doi: / PMID Beck J, Nassal M (January 2007). "Hepatit B virüsüreplication". World J. Gastroenterol. 13 (1): PMID Shibayama T, Masuda G, Ajisawa A, Hiruma K, Tsuda F, Nishizawa T, Takahashi M, Okamoto H (May 2005). "Characterization of seven genotypes (A to E, G and H) of Hepatit B virüsürecovered from Japanese patients infected with human immunodeficiency virus type 1". Journal of Medical Virology 76 (1): doi: /jmv PMID Bonino F, Chiaberge E, Maran E, Piantino P (1987). "Serological markers of HBV infectivity". Ann. Ist. Super. Sanita 24 (2): PMID Zoulim F (November 2006). "New nucleic acid diagnostic tests in viral hepatitis". Semin. Liver Dis. 26 (4): doi: /s PMID * Rotor-Gene Technology, Qiagen in ticari markasıdır. * SaCycler, Sacace Biotechnologies in ticari markasıdır. Sacace Biotechnologies Srl via Scalabrini, Como Italy Tel Fax mail: info@sacace.com web: Sacace HBV Real-TM Quant Dx VER