HCV Real-TM Quant Dx El Kitabı

Transkript

1 HCV Real-TM Quant Dx El Kitabı İnsan Plazmasında Hepatit C virüsünün Kantitatif tespiti için Real Time PCR Kiti Kantitatif In Vitro Tanısal Kullanım için REF V1-96/3FRT 96 Rotor-Gene 6000/Q (Qiagen) ile kullanım için SaCycler-96 (Sacace) ile kullanım için Sacace Biotechnologies Srl via Scalabrini, Como Italy

2 İŞARET LİSTESİ Liste Numarası <n> Test için yeterli içerik Lot Numarası Versiyon In Vitro Tanısal Kullanım için KONTROL INT İÇ Kontrol Sıcaklık Kısıtlamaları KONTROL 1 Yüksek Pozitif Kontrol Üretici KONTROL 2 Düşük Pozitif Kontrol Kullanım Talimatı KONTROL - Negatif Kontrol Son Kullanma Tarihi CAL 1 Standart 1 Dikkat! CAL 2 Standart 2 Sacace HCV Real-TM Quant Dx VER

3 İÇİNDEKİLER İSİM...4 GİRİŞ KULLANIM AMACI...5 TEST PRENSİBİ...5 SAĞLANAN ÜRÜNLER...6 GEREKLİ AMA SAĞLANMAYAN MATERYALLER...6 UYARI VE ÖNLEMLER...7 DEPOLAMA VE TAŞIMA TALİMATLARI...8 STABİLİTE...8 KALİTE KONTROL...8 ÖRNEK TOPLANMASI, SAKLANMASI VE TAŞINMASI...8 ENTERFERANS MADDELERİ...9 REAKTİFLERİN HAZIRLANMASI...9 RNA IZOLASYONU...9 İÇ KONTROL...10 TEST KALİBRASYONU...10 TEST PROTOKOLÜ...11 KALİTE KONTROL PROSEDÜRÜ...12 SONUÇ YORUMLANMASI...12 PERFORMANS ÖZELLİKLERİ...13 ANALİTİK HASSASİYET LİNEER ARALIK...13 ÖZGÜLLÜK...14 GENOTİP TESPİTİ ÇAPRAK REAKTİVİTE...14 DAYANIKLILIK...14 KESİNLİK...15 ÇAPRAZ KONTAMİNASYON...15 ROTORGENE 6000/Q İÇİN PROTOKOL...16 SaCycler-96 Real Time PCR SİSTEMİ İÇİN PROTOKOL...21 PROBLEM GİDERİLMESİ...23 Sacace HCV Real-TM Quant Dx VER

4 İSİM HCV Real-TM Quant Dx GİRİŞ Hepatit C virüsü (HCV), Flaviviridae ailesine mensup tek zincirli RNA virüsüdür. HCV 1974 yılından, etyolojik ajanların klonlandığı 1989 yılına kadar A-olmayan ve B-olmayan hepatit virüsü (NANBH) olarak kabul edilmiştir. Dünya Sağlık Organizasyonu tarafından dünya üzerinde 170 milyon HCV enfekte hasta olduğu tahmin edilmektedir. HCV nin bulaşma yolları arasında, intravenöz yol ile enfekte insan kanına maruz kalmak, uyuşturucu kullanımı veya kontrolsüz kan transfüzyonu baş roldedirler. Diyaliz, kolonoskopi ve ameliyat sırasında hastane kaynaklı HCV ye maruziyet de bildirilmiştir. Virüsün perinatal veya cinsel yolla bulaşan türleri etkisizdir ama HCV enfekte anne veya cinsel partner aynı zamanda HIV Tip1 ile enfekte ise daha sık görülür. Akut HCV enfekte çoğu insan semptom göstermez veya çok hafif semptomlara sahip olur (yorgunluk, bulantı, sarılık) ama virüsün temizlenmesi sağlanamaz ve vakaların yaklaşık %80 i kronik enfeksiyona dönüşür. Kronik HCV hastalarında, hepatit %15 20 oranında, yılda %1-4 oranında hepatosellüler karsinoma geliştirme riski ile, değişken hızlarda siroza ilerler yılında HCV genomunun Choo ve arkadaşları tarafından keşfedilmesi, viral hepatit C için serolojik ve moleküler testlerin geliştirilmesine yol açmıştır. İlk jenerasyon enzim-bağlı immunosorbent testlerinde (ELISA) mikrotitreplakların kuyuları HCV genomunun yapısal olmayan 4 (NS4) bölgesinden elde edilmiş saflaştırılmış rekombinant antijen c100-3 ile kaplıdır. Ne var ki, ELISA-1 yüksek-risk kan donörleri arasında ve hiperglobulinemi varlığında yüksek oranda Yalancı pozitif (%50-70) sonuç verme eğilimindeydi. Bu yüzden, ikinci jenerasyon HCV ELISA lar geliştirildi. Ortho Diagnostics tarafından geliştirilen ELISA-2 rekombinant çekirdek antijenlerin (C22-3), NS3 bölgesi (c33c) ve NS4 bölgesi (C100-3) yanı sıra, adlandırılan C100-3, bir parçasını içerir. Üçüncü nesil anti-hcv ELISA 1996 yılında ABD'de ve 1993 yılında Avrupa'da tanıtıldı. ELISA-2 nin antijenlerine ek olarak, üçüncü jenerasyon anti-hcv ELISA viral genomun NS5 bölge antijenini kullanır. Bununla birlikte, sentetik peptit antijenleri (c22 and c-100) ELISA-2 nin rekombinant antijenlerinin yerini almıştır. Diğer üreticiler, örneğin Abbott Diagnostics, HCV genomunun aynı bölgesinden elde edilen rekombinant antijenler kullanır. ELISA her nesil ile artan duyarlılık ve özgüllüğe rağmen, yanlış-pozitif antikor sonuçları özellikle düşük riskli kan bağışında dikkat edilmesi gereken bir durumdur. Bu nedenle, ek veya doğrulayıcı testler ELISA paralel olarak geliştirilmiştir. Rekombinant immüno testi (RIBA'nın) HCV epitopu için antikor varlığı veya yokluğunun doğrulanması için yaygın olarak kullanılır. RIBA da rekombinant veya peptid HCV antijenleri bir nitroselüloz şerit üzerine ayrı bantlar olarak, zayıf bir- Pozitif (Seviye I) ve bir orta Pozitif (Seviye II) Kontrol şerit ile çevrili olarak yerleştirilir. ELISA ve RIBA antikor testleri olduğu için, bir ya da ikisinin pozitifliği mutlaka mevcut bir HCV enfeksiyonunu göstermez, HCV geçirmiş ve iyileşmekte olan hastalarda anti-hcv uzun yıllardır Pozitif kalabilir. Tersine, serokonversiyon sırasında, antikor testleri Negatif olabilir. Ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ile HCV RNA doğrudan moleküler biyoloji algılama HCV enfeksiyonu tanısı için altın standart olarak kabul edilir. Sacace HCV Real-TM Quant Dx VER

5 KULLANIM AMACI HCV Real-TM Quant Dx Kit, insan kanında çift renkli algılama ile eş zamanlı olarak Hepatit C virüsünün kantitatif tespiti ile HCV-spesifik İç Kontrol (IC) tespitinin yapıldığı Real-Time Amplifikasyon testidir. Kantitatif HCV RNA testi interferon monoterapi, interferon plus ribavirin kombinasyon terapi ve peginterferon plus ribavirin kombinasyon tedavilerisine yanıtta prognostik bilgi sağlar. Kalıcı viral yanıt tedavi kesildikten 6 ay sonra, HCV RNA testi için negatif alınarak tanımlanır. Son çalışmalar göstermiştir ki tedaviye yanıt oranı da önemlidir. Örneğin 4 haftalık tedavi sonrasında HCV RNA negatif test sonucuna dönüşme hızlı bir virolojik yanıt teşkil eder ve bu tedavinin başarısı için güçlü bir göstergedir. 12 haftalık tedavinin ardından erken virolojik yanıt göstermeyen hastaların, HCV RNA da en az 2-log düşme ile tanımlanır. 36 haftalık tedavi sonrasında da yanıt vermesi olası değildir ve tedavi sonlandırılmalıdır. HCV Real-TM Quant Dx Real Time HCV testi, HCV taşıyıcı kan, plazma, serum veya dokuda tarama veya HBV enfeksiyonunun varlığını onaylamak için kullanılan tanısal bir test değildir TEST PRENSİBİ HCV Real-TM Quant Dx Kiti insan plazmasında Hepatit C virüsünün kantitatif tespiti için kullanılan bir Real- Time testtir. HCV RNA sı plazmadan ekstrakte edilir, real time Amplifikasyon kullanılarak amplifiye edilir ve HCV veya HCV IC için spesifik floresan boya probları kullanılarak tespit edilir. Termal döngünün her bir turunda amplifiye ürünler yüksek sıcaklık ile tek zincirli hale geçerek primer bağlanmasına izin verir ve sıcaklığın düşürülmesi ile uzama gerçekleşir. Ürünlerin üstel amplifikasyonu yüksek ve düşük sıcaklıklar arasındaki döngülerde hedef dizinin milyon kat veya daha fazla amplifikasyonu ile sağlanır. İki hedefin de (HCV ve IC) amplifikasyonu aynı reaksiyonda eş zamanlı olarak gerçekleşir. Real Time boyunca floresan yoğunluğunun ölçülmesi amplifikasyonun ardından reaksiyon tüplerinin yeniden açılmasına gerek kalmadan biriken ürünlerin tespit ve kantitasyonunun yapılmasını sağlar. IC tek tek işlenmiş her bir örnek için bir ekstraksiyon ve amplifikasyon kontrolü olarak hizmet eder ve olası inhibasyonları tespit eder. IC, HCV RNA dan başka bir kanalda tespit edilir. HCV- IC-L rekombinant RNA içeren bir yapıda liyofilize İç Kontroldür ve nükleik asit ekstraksiyonundan PCR amplifikasyonu-tespitine kadar analizin bütün basamaklarına dahil edilir. HCV Rec IC sadece ekstraksiyon prosedürünü izlemeye ve olası PCR inhibasyonlarını kontrol etmeye değil aynı zamanda ekstraksiyon prosedürü sırasında yaşanabilecek olası RNA kayıplarını doğrulamaya yarar ki bu da HCV viral yükün kesin olarak hesaplanmasını sağlar. Test; 4th WHO International Standard for Hepatitis C virus for Nucleic Acid Amplifikasyon Techniques (NIBSC code: 06/102 15) e göre standardize edilmiştir ve sonuçlar International Units/mL (IU/mL) olarak verilir. HCV Real-TM Quant Dx testi için hedef dizi HCV genomunun 5 utr bölgesidir. Bu bölge HCV için spesifiktir ve hayli korunmuştur. Sacace HCV Real-TM Quant Dx VER

6 SAĞLANAN MATERYALLER Sacace HCV Real-TM Quant Dx Amplifikasyon Reaktif Kiti RT-PCR REAKTİF PAKEDİ 96 şişe (0,2 ml) liyofilize Amplifikasyon Reaktifi Sacace HCV Real-TM Quant Dx Kontrol Kiti 1, 2 KONTROL INT 4 şişe liyofilize Reaktif HCV-IC-L KONTROL 1 4 şişe liyofilize Reaktif HCV-Pos1-L C+ - Sacace HCV Real-TM Quant Dx Yüksek Pozitif Kontrol* KONTROL 2 4 şişe with liyofilize Reaktif HCV-Pos2-L C+ - Sacace HCV Real-TM Quant Dx Düşük Pozitif Kontrol* KONTROL 4 şişe, her şişe 4,0 ml Negatif Kontrol Sacace HCV Real-TM Quant Dx Kalibratör Kit 1,2 CAL 1 4 şişe liyofilize Reaktif HCV Kantitatif Standart 1 CAL 2 4 şişe liyofilize Reaktif HCV Kantitatif Standart 2 1 Standart ve Kontrol konsantrasyonları lota spesifiktir. 2 Örnek hazırlığı prosedürü sırasında kullanılmalıdır (RNA izolasyonuna bakın). GEREKLİ FAKAT SAĞLANMAYAN MATERYALLER RNA izolasyon kiti (RNA izolasyonuna bakın) eppendorf tip tüpler için masa santrifüjü Vortex mikser Tek kullanımlık, tozsuz eldiven Biyolojik tehlikeli atık konteyneri Budolabı, dondurucu Real Time Thermal cycler Bulaşıcı malzemeler ile çalışmak için onaylanmış biyolojik güvenlik kabini Pipetler (ayarlanabilir) Filtreli steril pipet uçları Tüp rakları Sacace HCV Real-TM Quant Dx VER

7 UYARI VE ÖNLEMLER In Vitro Tanısal Tıbbi Cihaz Sadece In Vitro Tanısal Kullanım için 1. Örneklerle çalışmaya başlamadan önce bu prospektüsdeki talimatları dikkatle okuyun. Optimal PCR sonuçları için kullanıcı manueline uyulması önemlidir. 2. Numune ve reaktiflerle çalışırken tek kullanımlık eldiven, lab önlüğü giyin ve göz koruması kullanın. 3. Rutin laboratuvar önlemleri alın. Yemeyin, içmeyin, sigara içmeyin, makyaj yapmayın veya kontak lenslerinizi çıkarıp takmayın. Ağız ile pipetleme yapmayın. 4. Kitleri son kullanma tarihlerinden sonra kullanmayın. 5. Farklı kitler arasında reaktifleri karıştırmayın. 6. Nükleik asit kontaminasyonunu engellemek için aerosol bariyerli pipet ucu kullanılmalıdır. Bütün sıvı transferleri arasında pipet ucunu değiştirin. 7. Örneklerin hazırlanması sırasında çapraz kontaminasyonu önlemek ve örneklere nükleaz bulaşmasını önlemek için iyi laboratuvar uygulamalarına uymak önem taşır. RNA veya DNA ile çalışılırken uygun aseptik teknikler kullanılmalıdır. 8. Sadece tozsuz tek kullanımlık eldiven kullanın. 9. Kullanılmayan reaktifleri ve numuneleri yerel düzenlemelere uygun olarak yok edin. 10. Heparinin reaksiyonu inhibe ettiği gözlenmiştir. Heparinize edilmiş numunelerin kullanılmaması önerilir. 11. Numuneler bulaşıcı olabilir. Testi gerçekleştirirken evrensel önlemleri alın. 12. Örnekler ve Kontroller bir laminer akış alanında hazırlanmalıdır. 13. Numune veya kontroller ile çalışırken çapraz kontaminasyonu engellemek için iyi laboratuvar uygulamalarına uygun davranın. 14. Etrafa saçılan bütün numune veya reaktifleri %0,5 lik sodyum hipoklorit veya başka uygun dezenfektanlar kullanarak temizleyin. Ardından yüzeyi %70 lik etanol ile silin. 15. Numune ve reaktiflerin cilt ve göz ile temasından kaçının. Eğer temas eder ise derhal su ile yıkayın ve medikal yardım alın. 16. Bu ürün potensiyel tehlikeli madde içermez. Material Safety Data Sheets (MSDS) istek üzerine sağlanır. 17. Bu ürünün kullanımı amplifikasyon teknikleri üzerine uzman kullanıcı ile sınırlı olmalıdır. 18. Labarotuvardaki çalışma akışı tek yönlü işlemelidir. Ekstraksiyon alanında başlamalı PCR ve ardından tespit alanına doğru devam etmelidir. Önceki basamakların gerçekleştirildiği alanlara örnek, ekipman ve reaktif taşımayın. Sacace HCV Real-TM Quant Dx VER

8 DEPOLAMA VE TAŞIMA TALİMATLARI HCV Real-TM Quant Dx PCR kitin bütün bileşenleri kullanılmadığında +2-8ºC de saklanmalıdır. HCV Real- TM Quant Dx PCR kitin bütün bileşenleri paketin üzerindeki son kullanma tarihine kadar kararlılığını korur. Aksi belirtilmediği sürece, reaktiflerin ilk kullanımdan önce ve sonraki raf ömrü aynıdır. HCV Real-TM Quant Dx PCR kitini +2-8ºC de transfer edin. KARARLILIK HCV Real-TM Quant Dx kit etiketinde belirtilen son kullanma tarihine kadar kararlıdır. Ürün, etiketin üzerinde belirtilen kontrol tarihine kadar işlemeye devam edecektir. Işık, ısı ve neme maruz kalmak bazı kit bileşenlerini etkileyebilir. Bu durumdan kaçınılmalıdır. Etiketinin üzerinde bulunan talimatlara uygun saklanmayan reaktiflerin performansı etkilenebilir ve bu test sonuçlarını ileri derecede etkileyebilir. Pozitif veya Negatif Kontrol değeri beklenen aralığın dışında ise bu reaktiflerin bozulduğunu gösteriyor olabilir. Bu durumda ilgili test sonuçları geçersizdir ve örnekler yeniden çalışılmalıdır. Testin yeniden kalibre edilmesi gerekiyor olabilir. KALİTE KONTROL Sacace s ISO Certified Kalite Yönetim Sistemi uyarınca, her lot tutarlı ürün kalitesini sağlamak için önceden belirlenmiş özellikleri karşı test edilir. ÖRNEKLERİN TOPLANMASI, SAKLANMASI VE TAŞINMASI Not: Bütün numuneleri potansiyel bulaşıcı olarak ele alın. Son çalışmalar göstermiştir ki; EDTA veyya sitratlı plazma HCV tespiti için çalışmaya en uygun örneklerdir. Bu sebeple biz de HCV Real-TM Quant Dx ile çalışmak üzere bu materyalleri öneriyoruz. HCV Real-TM Quant Dx testinin IC validasyonu EDTA lı kan örnekleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Diğer örnek materyalleri valide değildir. HCV Real-TM Quant Dx testi sadece insan plazması ile kullanılır* 1. HCV Real-TM Quant Dx ile EDTA tüpleri kullanılabilir. Örnek tüpü üreticisinin talimatlarını izleyin. 2. EDTA lı tüpe toplanmış tam kan altı saat içinde x g de 20 dk santrifüj edilerek plazma ve hücresel elemanlar olarak ikiye ayrılmalıdır. Izole edilmiş plazma steril polipropilen bir tüpe aktarılmalıdır. 2-8 C de fazladan 3 gün daha saklanabilir. Alternatif olarak plazma -18 C de bir aya - 70 C de bir yıla kadar saklanabilir. 3. Tam kanı dondurmayın. 4. Heparin ile antikoagüle edilmiş numuneler test ile çalışmaya uygun değildir. 5. Donmuş numuneleri kullanmadan önce oda sıcaklığına getirin. 6. Tam kan 2-25 C de transfer edilmeli ve toplandıktan sonra 6 saat içinde işlenmelidir. Plazma 2-8 C de veya dondurulmuş olarak transfer edilebilir. 7. Klinik örneklerin ve etyolojik ajanların taşınması için ülke, federal, eyalet ve yerel yönetmeliklere uyulmalıdır. * Serum bazı durumlarda başlangıç materyali olarak kullanılabilir. Bu durumda HBV Real TM Quant Dx kitin analitik hassasiyeti aynıdır, ancak önemli ölçüde serum hazırlama sırasında pıhtı oluşumu aşamasında viral parçacıkların çökelmesi sebebi ile klinik duyarlılığında azalma olabilir. Sacace HCV Real-TM Quant Dx VER

9 İNTERFERAN MADDELER Artmış bilirubin ( 15 mg/dl) veya lipit ( 800 mg/dl) sistem ile etkileşime girmez. Heparin ( 10 IU/ml) PCR I etkiler. Antikoagülan olarak heparinin kullanıldığı tüplerde toplanan numuneler kullanılmamalıdır. Ayrıca heparin kullanan hastaların serumları da kullanılmamalıdır. REAKTİFLERİN HAZIRLANMASI Herhangi bir HCV Real-TM Quant Dx protokolüne başlamadan önce aşağıdaki reaktifleri hazırlayın: 1. Gerekli miktarda liyofilize Kontrol ve Kalibratörü alın ve kısa süre santrifüj edin. 2. Aşağıdaki tabloya göre Negatif Kontrol ( KONTROL -) ekleyin: Liyofilize Reaktif KONTROL -, µl CAL CAL KONTROL KONTROL KONTROL INT Tüpleri kapatın ve oda sıcaklığında 2 dk inkübe edin. Periyodik olarak vorteksleyin. 4. Tüpleri 5 sn santrifüj edin. 5. Çözülmüş reaktifler 2-8 C de ve ışıktan korunarak 30 gün saklanabilir (dondurmayın!). RNA İZOLASYONU Aşağıdaki izolasyon kitleri önerilir: Magno-Virus (Sacace, REF K-2-16): örnek hacmi 1000 µl SaMag-24 (Sacace, REF SM102): otomatik nükleik asit saflaştırma sistemi: SaMag Viral Nucleic Acid Extraction Kit örnek hacmi 400 µl RNA ekstraksiyonunu üreticinin talimatlarına uygun olarak yapın. RNA izolasyon prosedürü sırasında bütün örneklere/liziz karışımlarına, kontrollere, kalibratörlere10 µl IC ekleyin. Yüksek ve Düşük Pozitif Kontroller (KONTROL 1 ve KONTROL 2) ile beraber Neg. Kontrol (KONTROL -) izolasyon prosedüründe hasta numuneleri ile beraber kullanılmalıdır. Bu kontroller için, DNA saflaştırma kiti protokolünde numune için uyulan talimatlara uyulmalıdır. Sacace HCV Real-TM Quant Dx VER

10 İÇ KONTROL HCV-IC-L nükleik asit ekstraksiyonundan PCR amplifikasyon-tespitine kadar analizin bütün basamaklarında taşınan rekombinant RNA içeren bir yapı sunar. HCV-IC-L nin varlığı sadece ekstraksiyon prosedürünü izlemeye ve olası PCR inhibitörlerini kontrol etmeye değil aynı zamanda ekstraksiyon prosedürü sırasında oluşabilecek RNA kayıplarını denetlemeye de yarayarak HCV viral yükün tam olarak hesaplanmasını da sağlar. Bir IC eşik döngüsü [Ct] test geçerlilik parametresi bir kalibrasyon çalışması sırasında kurulur. Tanımlı, tutarlı bir IC miktarı (10 ul) örnek hazırlığının başında her numuneye, kalibratör ve kontrole eklenir ve real time pcr cihazında uygun numune işlenmesi ve test geçerliliğini göstermek için ölçülür. Kalibrasyon prosedürü boyunca IC hedef dizi floresan sinyalin tespit edildiği median amplifikasyon döngüsü sonraki tüm işlenmiş örnekler tarafından yerine getirilmesi gereken bir IC Ct geçerlilik aralığı kurar. The established range of samples IC Ct = Medium IC Ct of 6 Kalibratörs ± 2 cycles Kurulan IC Ct değerini aşan örneklerin örnek hazırlığından başlanarak yeniden çalışılması gerekir. TEST KALİBRASYONU Numune ve kontrollerin HCV RNA konsantrasyonunu kantite etmek için bir kalibrasyon eğrisi gerekir. Kalibrasyon eğrisi oluşturmak için iki test kalibratörü üçer defa çalışılır ( HCV konsantrasyonuna karşı tespit edilmiş floresan sinyali reaktif seviyesinde eşik döngüsü (Ct) ) Kalibrasyon eğrisi eğimi ve kesişim cihaz üzerinde hesaplanır ve saklanır. Bir numune içindeki mevcut HCV RNA konsantrasyonu, önceden oluşturulmuş kalibrasyon eğrisi üzerinden hesaplanır. Kantitatif Standartlar CAL1 ve CAL2 hasta numunelerinin çalışıldığı şekilde çalışılmalıdır. HCV Real-TM Quant Dx kitin yeni lotunun ilk kullanımından önce, bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak için 6 Kalibratör RNA ekstraksiyon prosedüründen başlayarak çalışılmalıdır ( iki kontrol 3 er defa çalışılır): Her kalibrasyon çalışması için CAL1 için 3 örnek hazırlığı tüpü, CAL2 için 3 örnek hazırlığı tüpü ayırın. Her tüpe10 µl KONTROL INT ekleyin; Uygun tüplere RNA saflaştırma kitinde belirtilen miktarda CAL1 ve CAL2 ekleyin. (örneğin, Magno-Virus kit (Sacace, REF K-2-16) kullanırken 1000 µl) RNA saflaştırma kitinde tarif edilen örnek hazırlığı prosedürüne uyun. Sacace HCV Real-TM Quant Dx VER

11 TEST PROTOKOLÜ Not: Reaksiyon Mix hacmi = 50 µl Sulandırılmadan önce, dondurularak kurutulmuş içeriğin herhangi bir bölümünü tartmak adına hiçbir girişimde bulunulmamalıdır. REAL TIME PCR KALİBRASYON PROSEDÜRÜ: 1. Ekstrakte edilmiş Kalibratörlerin PCR ı için liyofilize Reaktifleri içeren 6 reaksiyon tüpü hazırlayın Kalibratörün RNA saflaştırmasından elde edilen ayrıştırılmış örneklerden 50 µl ekleyin. Amplifikasyon ve tespit için bu manuelde tarif edilen prosedürü izleyin. HCV Real-TM Quant Dx kalibrasyonu kabul edilip kaydedildikten sonra lotun son kullanma tarihine kadar kullanılabilir. Bu süre boyunca, bütün örnekler aynı lot numaralı HCV Real-TM Quant Dx kullanarak oluşturulan kalibrasyon eğrisinden alınarak daha ileri bir kalibrasyon gerekmeden test edilebilir. REAL TIME PCR ÖRNEK PROSEDÜRÜ: 1. Ekstrakte örnekler ve kontrollerden PCR gerçekleştirmek için gerekli miktarda liyofilize reaktif içeren reaksiyon tüpü hazırlayın. 2. RNA saflaştırma basamağında elde edilken elue örneklerden 50 µl ekleyin. Tüpleri kapatın ve Real Time PCR cihazına yerleştirin. Real-time cihazınızda aşağıdaki gibi bir sıcaklık profili oluşturun: Aşama Sıc, С Süre Floresan tespiti Döngü tekrarı Hold min 1 Hold min s Cycling s s 95 5 s Cycling s* FAM, JOE/HEX/Cy s * Rotor-Gene 6000/Q cihazı kullanılıyorsa 20 s Sacace HCV Real-TM Quant Dx VER

12 KALİTE KONTROL PROSEDÜRÜ Olası reaksiyon inhibasyonlarını tanımlamak ve her bir örneğin ekstraksiyon aşamasını kontrol etmek için örnek hazırlığının başında belirlenmiş bir iç kontrol (IC) her örneğe eklenir. Negatif Kontrol (KONTROL - ), HCV Yüksek (+) Kontrol (KONTROL 1) ve HCV düşük (+) Kontrol (KONTROL 2) her teste ikişerli olarak dahil edilmelidir. Eğer kontroller beklenen aralığının dışında ise (Data Sheet bkz), o çalışmadaki bütün örnekler ve kontroller örnek hazırlama basamağından başlanarak yinelenmelidir. SONUÇLARIN YORUMLANMASI İç Kontrol (IC), FAM/Green kanalında ve HCV RNA Joe/Yellow/HEX kanalında tespit edilir. Her bir DNA amplifikasyonu FAM/Green channel (IC için) veya Joe/Yellow/HEX kanalında (HCV RNA için) ölçülebilen ve bir sigmoid büyüme eğrisi (log ölçekli) ile sonuçlanan floresan sinyal üretimi ile ilişkilidir. Veri analizi üreticinin talimatlarına uygun olmak üzere İlgili yazılım ve el kitabı temel alınarak yapılır (Rotor- Gene 6000/Q, Qiagen ve SaCycler-96, Sacace kullanma talimatları). Sonuçları yorumlamadan önce çalışmanın geçerliliğinden emin olmak için elde edilen sonuçları kontrol edin. HCV RNA kantitasyon standartlarının analizi sonucu oluşturulan standart eğrisi ve CT değerleri temel alınarak belirlenir. HCV RNA konsantrasyonu IU/ml olarak ifade edilir. Eğer sonuç 100,000,000 IU/ml den fazla ise, sonuç 100,000,000 IU HCV/ml den fazla olarak görüntülenecektir. Eğer sonuç lineer ölçüm aralığının üstünde ise, örnek 10 kat dilüe edildikten sonra çalışılabilir. Ardından sonuç 10 ile çarpılmalıdır. 1 ml den ekstraksiyon halinde sonuç 13 IU/ml den düşük ise ekranda sonuç 13 IU HCV/ml den düşük olarak görüntülenecektir. Sacace HCV Real-TM Quant Dx VER

13 PERFORMANS ÖZELLİKLERİ HCV Real-TM Quant Dx Kit common technical specifications (CTS) for in vitro diagnostic medical devices (2009/108/EC) and European Pharmacopoeia 7.0, p Nucleic acid Amplifikasyon techniques (07/2010:20621) e göre değerlendirilmiştir. ANALİTİK DUYARLILIK Analitik duyarlılık veya Tespit Limiti (LOD) % 95 veya daha büyük bir olasılık ile tespit edilebilir HCV RNA en küçük miktarı olarak tanımlanır. LOD örnek RNA saflaştırma dikkate, belirli bir ekstraksiyon yöntemi ile birlikte HCV Pozitif klinik numuneler kullanarak belirlenir. LOD örnek RNA saflaştırma dikkate, belirli bir ekstraksiyon yöntemi ile birlikte HCV Pozitif klinik numuneler kullanarak belirlenir. HCV RNA, üretici talimatlarına göre Magno Virüs saflaştırma kiti (Sacace, REF K-2-16) ile ekstre edilmiştir. HCV Real-TM Quant Dx testinin LOD u 13 IU/mL örnek hazırlığı prosedürü ile 1.0 ml dir. LOD, HCV negatif insan plazmasında hazırlanan 4th WHO International Standard for Hepatitis C virus for Nucleic Acid Amplifikasyon Techniques (NIBSC code: 06/102 15) dilüsyonları ile belirlenmiştir. Sonuçlar Probit analizi ile belirlenmiştir. LİNEER ARALIK Doğrusal aralık veya Lineerlik bir testin nükleik asit konsantrasyonu ile doğrudan orantılı olan test sonuçları elde etme yeteneğidir. Diğer bir değişle, test sonuçları üst ve alt konsantrasyonu aralığında konsantrasyonları ile doğru orantılıdır. HCV Real-TM Quant Dx testinin kantitasyon için üst limiti 100 milyon IU/mL ve kantitasyon için alt limit t espit limitine eşittir (1.0 ml örnek hazırlık prosedürü ile 13 IU/mL) HCV Real-TM Quant Dx kitinin lineer aralığı 4 th WHO International HCV RNA Standard ına karşı kalibre edilmiş HCV sentetik kantitatif standat bir dilüsyon serisinin analiz edilmesi (8,00 log IU/ml - 1,00 log IU/ml) ile değerlendirilmiştir. Sonuçlar, HCV Real-TM Quant Dx test lineerliğinin temsilcisi, Şekil 1 de gösterilmiştir. 9 HCV Real-TM Quant Dx Conc., log IU/ml 8 y = 0,9653x + 0, R² = 0, Target Concentration, log IU/ml Sacace HCV Real-TM Quant Dx VER

14 ÖZGÜNLÜK Primer ve probların analitik özgünlüğü European Directorate for the Quality of Medicine & HealthCare (EDQM) dan elde edilen 100 negatif plazma örneği ile değerlendirilmiştir. HBV primer ve probları ile spesifik bir sinyal vermemişlerdir. HCV Real-TM Quant Dx kitinin özgünlüğü %100 dür. GENOTİP TESPİTİ HBV virüsünün farklı genotiplerinin tespit edilebilmesi primer ve probların özgünlüğüne bağlıdır. Test edilen bütün HCV genotipleri HCV Real-TM Quant Dx kit ile pozitif sonuç vermişlerdir. ÇAPRAZ REAKTİVİTE HCV Real-TM Quant Dx kitinin potansiyel çapraz reaktiviteleri aşağıda listelenen kontrollere karşı yapılmıştır. Bu, bu patojenler ile herhangi bir çapraz reaksiyon gözlenmedi. Tablo 1: Diğer patojenlere karşı testin özgünlüğü: Kontrol grubu Results HCV (Joe/Yellow channel) Results IC (Fam/Green channel) Cytomegalovirus (CMV) - + Epstein Barr virus (EBV) - + Hepatitis B virus (HBV) - + Hepatitis D virus (HDV) - + Hepatitis A virus (HAV) - + Parvovirus B Herpes Zoster Virus (VZV) - + Human immunodeficiency virus Herpes simplex virus Herpes simplex virus Human herpes virus Human herpes virus West Nile Virus (WNV) - + Tick-borne encephalitis virus (TBEV) - + Adenovirus type Adenovirus type Adenovirus type Rotavirus A - + Escherichia coli (E.coli) - + Staphylococcus aureus - + Streptococcus pyogenes - + Streptococcus agalactiae - + DAYANIKLILIK Tahlilin sağlamlığı yöntem parametrelerinin küçük ve kazara çeşitlilikler tarafından etkilenmez kapasitesinin bir ölçüsüdür ve normal kullanım sırasında güvenilirliliğin bir göstergesidir. HCV Real-TM Quant Dx kit 96 şişe kullanıma hazır liyofilize reaktif RT-PCR REAKTİF PAKEDİ içerdiğinden, kitin normal kullanımı sırasında olası tek çeşitlilik RNA saflaştırma basamağı sırasında elde edilen elue örneklerin eklenen miktarıdır. HCV Real-TM Quant Dx kitin sağlamlığı, farklı hacimlerde elüe örnek (46-52 µl) ile değerlendirilmiştir. Liyofilize reaktif içeren şişelere küçük çeşitlilikte (46-52) HCV RNA ile zenginleştirilmiş %95 cut-off değerinde final konsantrasyonda 20 HCV RNA plazma havuzu eklenmiştir. Test edilen bütün örnekler HCV RNA için pozitif bulunmuştur. Sacace HCV Real-TM Quant Dx VER

15 KESİNLİK HCV Real-TM Quant Dx kitin kesinliği manuel örnek hazırlama için SaCycler-96 cihazı kullanılarak değerlendirilmiştir. HCV Real-TM Quant Dx kitinin kesinlik verileri testin toplam varyansının tespitine izin vermektedir. Total varyans; testler arası değişkenlik (çalışmalar arasında aynı konsantrasyondaki çoklu örnek sonuçlarının değişkenliği), the test içi değişkenlik (farklı günlerde farklı cihazlar kullanılarak yapılan çalışmalardan elde edilen sonuçlar arasındaki değişkenlik) lotlar arası değişkenlik (farklı lotlar kullanılarak yapılan çalışmalarda elde edilen sonuçlar arasındaki değişkenlik). Elde edilen veriler, belirli bir patojen ve IC Kontrol için, standart sapma ve varyasyon katsayısı belirlemek için kullanılmıştır. Hesaplanan toplam değişkenlik: mean SD Log Ct HCV mean SD Log Calc Conc (log IU/ml) mean SD Log Ct IC 0,0045 0,0608 0,0046 mean CV % Ct HCV mean CV % Calc Conc (IU/ml) mean CV % Ct IC 1,05 14,68 1,07 Testler arası değişkenlik SD log Ct HCV SD log Calc Conc (log IU/ml) SD log Ct IC 0,004 0,064 0,004 CV % Ct HCV CV % calc conc (IU/ml) CV % Ct IC 0,86 15,70 0,81 Test içi değişkenlik SD log Ct HCV SD log Calc Conc (log IU/ml) SD log Ct IC 0,006 0,050 0,005 CV % Ct HCV CV % Calc Conc CV % Ct IC 1,371 11,607 1,086 Inter-lot değişkenlik SD log Ct HCV SD log Calc Conc (log IU/ml) SD log Ct IC 0,004 0,069 0,006 CV % Ct HCV CV % calc conc CV % Ct IC 0,925 16,738 1,319 ÇAPRAZ KONTAMİNASYON HCV Real-TM Quant Dx kitin çapraz kontaminasyonu RotorGene Q cihazı kullanılarak yapılan manuel örnek hazırlığı için değerlendirilmiştir. Çapraz kontaminasyonun olmadığını göstermek için yüksek konsantrasyon HCV li negatif plazma ve Negatif plazma örneklerinden oluşan 20 örneklik panel kullanılmıştır. Bütün pozitif örnekler doğru şekilde tespit edilmiş, iyi ve temiz sigmoid-şekilli loresans eğri ile floresan Pozitif Reaksiyon ve hem HCV kanalında hem de IC kanalında 35 in altında Cycle treshold (Ct) değeri vermiştir. Hiç bir Negatif örnek HCV kanalında floresan sinyal vermemiş ve IC kanalı hiç bir çapraz kontaminasyo göstermemiştir. Sacace HCV Real-TM Quant Dx VER

16 ROTORGENE 6000/Q için PROTOKOL 1. Ana elektrik düğmesine basarak cihazı açın, Rotor-Gene yazılımını başlatın. 2. Yeni bir çalışma başlatın. Şekil 1. New Run Başlatma 3. Uygun rotor u seçin, Locking Ring Attached kutusuna tik atın ve Next e basın. Şekil 2. Rotor ve Kilitleme Halkası 4. Kullanıcı adı, notlar ve reaksiyon hacmini ( 50 ) girin. Daha sonra Next e basın. Şekil 3. Reaksiyon Hacmi Sacace HCV Real-TM Quant Dx VER

17 5. Edit Profile e tıklayın ve sıcaklık profilini programlayın. Şekil 4. Profil Düzenleme Şekil 5. Hold: Ters transkripsiyon basamağı Şekil 6. Hold 2: Enzim aktivasyon basamağı Sacace HCV Real-TM Quant Dx VER

18 Şekil 7. Cycling: 1 st Amplifikasyon Basamağı Şekil 8. Cycling: 2 nd Amplifikasyon ve Tespit Basamağı 6. New Run Wizard menüsünde Gain Optimisation a tıklayın ve aşağıdaki parametreleri ayarlayın: Şekil 9. Gain Optimisation Sacace HCV Real-TM Quant Dx VER

19 7. PCR tüplerini dikkatle RotorGene 6000/Q rotor a yerleştirin, kapağı kapatın, çalışmayı başlatın. Şekil 10. Çalışmanın başlatılması. 8. Örneklerin pozisyon ve isimlerini girin (örnekler için unknown, kontroller için Negatif Kontrol ve Pozitif Kontrol ). Eğer kit kalinbrasyon çalışması gerçekleştiriliyor ise CAL1 ve CAL2 için standard ismini kullanın ve HCV Real-TM Quant Dx Data Card ında belirtilen kantitatif standart konsantrasyonlarını girin. 9. Kullanıcı sonraki klinik örneklerin kantitatif sonuçlarını almak için Standart Eğrisi ile kalibrasyon deneyini almalıdır. Bunu yapmak için Import Curve e tıklayın, From Other Run seçeneğini seçin, aktarılacak kalibrasyon dosyasını seçin ve Joe/Yellow Kanalına aktarın. Sacace HCV Real-TM Quant Dx VER

20 Veri Analizi IC Amplifikasyon analizi (Cycling A.Green (Fam) 1. Analysis e basın, Quantitation a basın ve Cycling A.Green (Cycling A.Fam) seçin ve Show a basın. 2. A utomatic option Threshold u kapatın. 3. Main menu penceresinde Dynamic tube ve Slope Correct düğmelerini aktive edin (Quantitation analysis). 4. Sonuç tablosunda (Quantitation Analysis), More settings I seçin ve NTC Threshold u 10% a ayarlayın. 5. Seçin: Threshold: 0,03 6. Sonuç tablosunda (Quantitation Results), IC (Fam/Green channel) nin Ct değeri(threshold cycle) 30 ( IC bkz) olmalıdır. HCV Amplifikasyon analizi (Cycling A.Yellow (Joe) 1. Analysis e basın, Quantitation da Cycling A.Yellow (Cycling A.Joe) I seçin Show a basın. 2. Threshold un otomatik seçeneğini kapatın. 3. Dynamic Tube ve Slope Correct düğmelerine basın. 4. Sonuç tablosunda (Quantitation Analysis) More settings I seçin ve NTC Threshold u 10% a ayarlayın. 5. Seçin Threshold: 0,03 6. Sonuçlar tablosunda (Quantitation Analysis) Ct değeri(threshold cycle) görünür. 7. Yeni ekranda - Quantitation Results- HCV RNA IU/ml değeri görünür. Sacace HCV Real-TM Quant Dx VER

21 SaCycler-96 Real Time PCR sistemi için protokol Önerilen ayarlar: 1. RealTime_PCR software iconuna çift tıklayın. 2. Device handling i seçin. 3. Takılı cihazı seçin ve Connect e tıklayın. 4. Menüden Test -> Create/Edit test seçin. Create new test düğmesine tıklayın ve HCV Real-TM Quant DX, adını girin, OK e tıklayın. 5. Seçin: Analysis Type Multiplex detection ve Method Threshold, Standard Quantity 2 ve copy 3 (toplam 6 standart), 2 Pozitif Kontrol, 1 Negatif Kontrol, FAM (IC) ve R6G (s), 50 µl Mixture volume: 6. Amplifikasyon Program ın altında, yeni program yaratmak için ikonuna tıklayın. 7. Preliminary heating seçin ve aşağıdaki şablonu seçin. Apply e tıklayın, ve cihazı aşağıdaki gibi programlayın: 8. düğmesine tıklayın Amplifikasyon programını uygun dosyaya kaydedin. Sonra önceki ekranda OK düğmesine tıklayın. 9. Test düğmesine tıklayın, Sonra Test menüsünden HCV Real-TM Quant DX seçin, örnek sayısını belirtin, önce Add e sonra OK e tıklayın. Sacace HCV Real-TM Quant Dx VER

22 10. PCR tüplerinin plate yerleştirilmesi için varsayılan Autofill pozisyonlamayı veya tüplerin pozisyonunu manuel olarak belirlemek için Free Filling I kullanın. Concentration kolonunda, yeşil daireye tıklayın ve DataCard da belirtilen HCV standardı değerlerini girin. (aşağıdaki örneğe bkz). 11. Apply e tıkladığınızda Start Program penceresi açılacaktır. 12. Thermalcycling program aşağıdaki gibi olacaktır: 13. Open block a tılayın, PCR tüplerini cihaza yerleştirin, Close a tıklayın ve PCR Amplifikasyon programını başlatmak için düğmesine tıklayın. 14. Çalışma tamamlandıktan sonra sonuçların yorumu için O e tıklayın. 15. Results table dan seçin: analysis type Multiplex detection, Threshold (Ct) method ve Quantitative. 16. Parameter of data analysis ikonuna tıklayın, Normalization data opsiyonunu seçin ve Apply düğmesine tıklayın. 17. Fare ile sürükle ve bırak yaparak eşik çizgisini (threshold line). Eşik çizgisi için önerilen değerler; HEX kanalı için 40, FAM kanalı için 25 ( eşik seviyesini sonuç eğrinize göre hafifçe adapte edin). 18. HEX kanalı için viral yük sonuçları Results kolonunda belirecek. Final sonuçlar IU/ml olarak belirtilir. 19. Standart eğrisini diğer çalışmaya aktarmak için, Additional standards tabına tıklayın ve standartları içeren dosya dönün. ikonunu seçin. Ardından viral yük sonuçlarını görmek için Results tabına geri NOT: SaCycler ın IVD li versiyonu için, HCV Real-TM DX protokolü cihaz ile verilen bilgisayara halihazırda yüklü olduğundan 4-8 arasını atlayın ve talimatları 9. noktadan itibaren takip edin. Sacace HCV Real-TM Quant Dx VER

23 PROBLEM GİDERİLMESİ 1. Zayıf (Ct > 30) veya IC (Fam/Green channel) ın yayınlanmış sinyal aralığının (İç Kontrole bkz) aşılması durumunda: bütün örneklerin yeniden test edilmesi gerekmektedir. PCR inhibe oldu ise. Önerilen bir RNA ekstraksiyon metodu kullandığınızdan emin olun ve üreticinin talimatlarını izleyin. Reaktiflerin saklanma koşulları talimatlar ile uyumlu değil ise. Saklama koşullarını kontrol edin. The PCR koşulları talimatlar ile uyumlu değil ise. PCR koşullarını kontrol et ve protokolde IC tespiti için belirtilen floresan kanalı seçin. Reaktiflerin pipetlenmesi sırasında örneklere IC eklenmedi ise. RNA ekstraksiyon prosedürü boyunca dikkatli olun. 2. Korelasyon katsayısı R dan küçük ise: bütün örneklerin yeniden test edilmesi gerekmektedir. 3. KONTROL 1 in hesaplanan konsantrasyonu ve/veya KONTROL 1 veri kağıdında belirtilen konsantrasyondan farklı ise bütün örneklerin yeniden test edilmesi gerekmektedir. 4. Joe/HEX/Yellow kanalında ekstraksiyonun Negatif Kontrolü ile sinyal alınması durumunda: RNA ekstraksiyonu sırasında kontaminasyon. Bütün örnek sonuçları geçersizdir. Bütün yüzey ve cihazları çamaşır suyu ve etanol ile dekontamine edin. Ekstraksiyon boyunca sadece filtreli pipet ucu kullanın. Tüpler arasında pipet uçlarını değiştirin. RNA ekstraksiyonunu yeni set reaktifler ile tekrarlayın. 5. Negatif PCR Kontrolünün sinyal vermesi durumunda: PCR hazırlık prosedüründe kontaminasyon. Bütün örnek sonuçları geçersizdir. Bütün yüzeyleri çamaşır suyu ve alkol veya özel DNA dekontaminasyon reaktifleri ile dekontamine edin. Pozitif Kontrolleri en son ekleyin. PCR hazırlığını yeni bir set reaktif ile tekrarlayın. Sacace HCV Real-TM Quant Dx VER

24 REFERANSLAR 1. World Health Organization. Hepatitis C Global prevalence (update). Wkly Epidemiol Rec, 1999, 74, Alter, H Discovery of non-a, non-b hepatitis and identification of its etiology. Am. J. Med.107 (Suppl.6B):16S 20S. 3. Bendinelli, M., M. Pistello, F. Maggi, and M. Vatteroni Blood-borne hepatitis viruses: hepatitis B, C, D, and G viruses and TT virus, p In S.Specter, R.L. Hodinka, and S.A. Young (ed.), Clinical virology manual, 3 rd ed. ASM Press, Washington, D.C. 4. Choo, Q.-L., G. Kuo, A.J. Weiner, L.R. Overby, D.W. Bradley, and M. Houghton Isolation of a cdna clone derived from a blood-borne non-a, non-b viral hepatitis genome. Science 244: Lauer, G.M., and B.D. Walker Hepatit C virüsü infection.n. Engl. J. Med. 345: De Medina M, Schiff ER. Hepatitis C: diagnostic assays. Sem Liver Dis, 1995, 1, Kao, J.-H., M.-Y. Lai, Y.-T. Hwang, P.-M. Yang, P.-J. Chen, J.-C. Sheu, T.-H. Wang, H.-C. Hsu, and D.-S. Chen Chronic hepatitisc without anti-hepatitis C antibodies by second generation assay: a clinicopathologic study and demonstration of the usefulness of a third generation assay. Dig. Dis. Sci. 41: Schiff ER, de Medina M, Kahn RS. New perspectives in the diagnosis of hepatitis C. Sem Liver Dis, 1999, 19, Lok ASF, Gunaratnam NT. Diagnosis of hepatitis C. Hepatology, 1997, 26(Suppl 1), 48 56S. 10. Pawlotsky J M, Bouvier-Alias M, Hezode C, Darthuy F, Remire J, Dhumeaux D. Standardization of Hepatit C virüsü RNA quantification. Hepatology. 2000; 32: Manns MP, McHutchison JG, Gordon SC, et al. Peginterferon alfa-2b plus ribavirin compared with interferon alfa-2b plus ribavirin for initial treatment of chronic hepatitis C: a randomized trial. Lancet. 2001; 358: Weiland O, Braconier JH, Fryden A, Norkrans G, Reichard O, Uhnoo I. Influence of pretreatment factors on outcome of interferon-alpha treatment of patients with chronic hepatitis C. Scand J Infect Dis. 1999; 31: Fried MW, Shiffman ML, Reddy KR,et al. Peginterferon alfa-2a plus ribavirin for chronic Hepatit C virüsü infection.n Engl J Med. 2002; 347: Jensen DM, Morgan TR, Marcellin P, et al. Early identification of HCV genotype 1 patients responding to 24weeks peginterferon alpha-2a (40kd)/ribavirin therapy. Hepatology. 2006; 43: Davis GL, Wong JB, McHutchison JG, Manns MP, Harvey J, Albrecht J. Early virologic response to treatment with peginterferonalfa-2b plus ribavirin in patients with chronic hepatitis C. Hepatology. 2003; 38: Terrault NA, Pawlotsky JM, McHutchison J,et al. Clinical utility of viral load measurements in individuals with chronic hepatitis C infection on antiviral therapy. J Viral Hepat. 2005; 12: * Rotor-Gene Technology, Qiagen in ticari markasıdır. * SaCycler, Sacace Biotechnologies in ticari markasıdır. Sacace Biotechnologies Srl via Scalabrini, Como Italy Tel Fax mail: info@sacace.com web: Sacace HCV Real-TM Quant Dx VER