HPV 6/11 Real-TM. in Vitro Diagnostik Kullanım için IVD. Kullanılan Semboller. in Vitro Diagnostik Kullanım için. Dikkat! Lot Numarası.

Transkript

1 IVD in Vitro Diagnostik Kullanım için REF TV11-100FRT VER RotorGene 3000/6000 (Corbett Research), SmartCycler (Cepheid), iq icycler ve iq5 (Biorad), Applied Biosystems 7300/7500 Real Time PCR Systems (Applera) ile kullanılan HPV 6/11 Real-TM Kullanılan Semboller Katolog Numarası in Vitro Diagnostik Kullanım için Sıcaklık koşulları Dikkat! Lot Numarası Son Kullanma Tarihi VER Versiyon Kullanım Bilgileri Reaktif İçerir Üretici

2 İSİM HPV 6/11 Real-TM GİRİŞ HPV genital enfeksiyonu dünyada viral etyolojinin en sık cinsel yolla bulaşan hastalıklarından (STDs) biridir (farklı ülkelerde cinsel açıdan aktif genç kadınlarda 20% - % 46 oranında görülür). Servikal kanseri dünyada kadınlarda en sık görülen ikinci kanserdir ve klinik, moleküler, epidemiyolojik ve deneysel kanıt ile dünyada cinsel yolla iletilen bazı HPV genotip ve servikal neoplazi arasında etyolojik ilişki kuruldu. Servikal Intraepithelial Neoplasia (CIN Sınıf I III) in farklı sınıflarından HPV genotipin tespit frekansına dayalı olarak HPV genotip, High-risk HPV tip (16, 18, 31 ve 45), Intermediate-risk tip (33, 35, 39, 51, 52, 56, 58, 59, ve 68), ve Low-risk tip (6, 11, 42-44) olarak ayrılmıştır. Genital siğiller (teknik olarak kondilomata acuminata olarak da bilinir) en sık iki HPV tipleri, HPV 6 ve HPV 11 ile ilişkilidir. Birkaç yöntem Pap yayılması, elektron mikroskobu, immunositokimya ile sitolojik tarama, klinik gözleme sahip HPV klinik veya subklinik enfeksiyon teşhisi için kullanılmıştır, fakat bu yöntemler standartdizasyon olmaması, subjektiflik, yetersiz duyarlılık ve tahmin edilebilir düşük değer gibi dezavantajlara sahiptir. HPV teşhisinin en perspektif yolu polimeraz zincir reaksiyonu tarafından yüksek kanserojen riskli Human Papilloma virüsünün DNA dan doğrudan tespitidir. PCR a dayalı yöntemler, servikal swablar veya skrapes, servikovajinal lavaj, dondurulmuş biyopsiler ve formaline sabitlenmiş parafin-gömülü doku gibi klinik örneklerden alınan genital HPV genotiplerinin tiplenmesi ve tespiti için başarılı şekilde kullanıldı. KULLANIM AMACI Kit HPV 6/11 Real-TM ürogenital swablarda İnsan Papillomavirus genotip 6/11 in kalitatif tespiti için bir in vitro Real Time amplifikasyon testidir. TEST PRENSİBİ HPV 6/11 Real-TM test iki temel aşamaya dayanır: örneklerden DNA izolasyonu ve Real Time amplifikasyonu. PCR-mix-1 tüp, internal Kontrol olarak kullanılan β-globine gen, HPV 6 ve 11 in alanına direk olarak karşı primerler içerir. Eğer swab tam olarak hazırlanmazsa (yüksek miktarda mukoz ya da yetersiz miktarda epitel hücre), İnternal kontrol tespit edilemez. HPV 6 FAM (Green) kanalında tespit edilir, HPV 11 JOE (Yellow)/Cy3/HEX kanalında ve Human β-globine gene ROX (Orange)/Texas Red kanalında tespit edilir. KİT İÇERİĞİ Part N 1 DNA-Sorb-A : örnek hazırlama; Part N 2 HPV 6/11 TM : Real Time amplifikasyon. Part N 1 DNA-sorb-A : Lysis Solution, 30 ml; Sorbent, 2 x 1,0 ml; Washing Solution, 100 ml; DNA-eluent, 2 x 5 ml; Transport medium, 30 ml. 100 test için gerekli reaktifler içerir. Part N 2 HPV 6/11 TM : PCR-mix-1-FRT, 2 x 0,6 ml; PCR-Buffer-FRT, 2 x 0,3 ml; TaqF Polymerase, 0,03 ml; Pos Control Complex C+ (HPV 6, 11, human DNA), 0,2 ml; Negative Control C-, 1,2 ml;* DNA-buffer, 0,5 ml; 120 test için reaktifler içerir. *Ekstraksiyon Negatif Kontrol olarak izolasyon prosedüründe kullanılmalı GEREKLİ FAKAT SAĞLANMAYAN MATERYALLER Zone 1: Örnek hazırlama: Biyolojik kabin eppendorf tipi tüpler için masa mikrosantrifüj (RCF max. 16,000 x g); Eppendorf 5415D ya da benzeri 60 C ± 2 C kuru ısı bloğu Vorteks mikser Aerosol bariyerli pipetörler (5-40 μl; μl; μl)

3 1,5 ml polipropilen steril tüpler (Sarstedt, QSP, Eppendorf) Tek kullanımlık eldivenler, pudrasız Bio güvenlikli atık kapları Buzdolabı Tüpe racks Zone 2: Real Time amplifikasyonu: Real Time Thermalcycler Workstation Aerosol bariyerli pipetörler ( 0,5-10 µl; 5-40 µl kapsiteli) Tüp rackları UYARILAR VE ÖNLEMLER 1. Lizis Solusyonu, guanidine thiocyanate içerir. Guanidine thiocyanate, solunursa, deri ile temas ederse ya da yutulursa zararlıdır. Asitler ile teması toksik gaz oluşumuna neden olur. (Xn; R: 20/21/22-36/37/38; S: 36/37/39). 2. Örnekler ve reaktifler ile çalışırken tek kullanımlık eldivenler, laboratuar giysileri ve göz koruyucuları kullanın. 3. Ağızla pipetleme yapmayın. 4. Laboratuar çalışma alanında yemek yemeyin, bir şey içmeyin, kozmetik uygulamayın ya da kontak lenslerini ellemeyin. 5. Son kullanma tarihi geçmiş kitleri kullanmayın. 6. Tüm örnekleri ve kullanılmayan reaktifleri yasal düzenlemelere göre yok edin. 7. Örnekler potansiyel enfeksiyon ajanı olarak kabul edilmeli ve biyolojik kabinlerde Biyogüvenlik Seviye 2 ya da diğer uygun biyogüvenlik pratiklerine göre çalışılmalıdır. 8. Dökülen tüm örnekler ya da reaktifleri 0,5% sodyum hipoklorit ya da uygun diğer dezenfektanlar ile temizleyin. 9. Örnekler ve reaktiflerin deri, gözler ve mukoz membranlar ile temasından kaçının. Eğer bu solüsyonlar ile temas ederse bol su ile yıkayın ve doktorunuza başvurun. 10. Material Safety Data Sheets (MSDS) istenildiğinde verilebilir. 11. Bu kit DNA-Sorb ekstraksiyon kit ile kullanılmak için tasarlanmıştır. Eğer DNA-Sorb dan başka bir kit ile DNA ekstraksiyonu yapılıyorsa, bu kullanıcı sorumludur. 12. Bu kiti ancak PCR tekniği bilgisi olan kişiler kullanmalıdır. 13. Laboratuardaki iş akışı Ekstraksiyon alandan başlayıp Amplifikasyon ve Tespit alanlarına doğru tek bir kişinin yönetiminde olmalıdır. Örnekleri, ekipmanları ve reaktifleri bir önceki çalışma alanına geri götürmeyin. SAKLAMA KOŞULLARI DNA-sorb-A +2-8 C de saklanabilir. HPV 6/11 Real-TM -20 C de saklanabilir. Kit 2-8 C de taşınabilir fakat 2-8 C de ve -20 C de saklanmalıdır. KARARLILIK HPV 6/11 Real-TM Test kit etiketi üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabil kalır. Ürünün performansı etiket üzerinde yazılı kontrol tarihi ile sağlanacaktır. Işık, ısı ya da neme maruz kalmak bazı kit bileşenlerin raf ömrünü etkileyebilir. Tekrarlanan çözdürme ve bu reaktiflerin dondurulması duyarlılığı azaltabildiği için bu durumdan kaçınılmalıdır. KALİTE KONTROL Komplet kit RotorGene 6000 (Corbett Research) de test edilmiştir. Analiz sertifikası için info@sacace.com dan bilgi alabilirsiniz. ÖRNEK SAKLAMA, TOPLAMA VE TRANSPORT Aşağıdaki numunelerden HPV 6/11 Real-TM DNA-Sorb-A (REF K-1-1/A) ile ekstre edilmiş DNA analiz edebilir: Servikal swablar: Bir pamuk veya polyester swab kullanarak servikal ağzından ve ektoserviksin çevresinden fazla mukusu alın. Bu swabı atın. En büyük kıl ektoservikse dokunana kadar servikal ağız içine cm Örnekleme Servikal Fırça yerleştirin. Servikal kanal içine tamamen fırça takmayın. Kanaldan uzaklaştırarak saat yönünün tersi yönünde, 3 kere tam çevirerek fırçayı döndürün. 0,5 ml Transport ortamı (Sacace) ile nükleaz-free 2,0 ml tüp içine fırçayı yerleştirin saniye boyunca ortamda fırçayı şiddetlice sallayın. Tüp içinde fırçayı sonda bırakarak skorlanmış çizgide sapını koparın.

4 doku mekanik homojenizör ile homojenize edilmiş ve PBS sterilde çözülmüş (önerilen DNA-Sorb-C REF K- 1-6/50 bu kitte dahil değildir, ama ayrı ayrı sipariş edilebilir) Sıvı-bazlı sitoloji numuneler (Cytoscreen, PreservCyt) (bu kitte önerilen DNA-Sorb-D REF K-1-8/100 dahil değildir ama ayrı ayrı sipariş edilebilir) Toplamadan hemen sonra örneklerin çalışılması önerilir. 24 saatten daha uzun olmamak kaydıyla örnekleri 2 8 C de ya da daha uzun saklamak için 20/80 C de saklayın. Klinik örneklerin transportu, etiyolojik faktörlerin transportu için ülkesel, federal, lokal ve yasal düzenlemelere göre yapılmalıdır. ÖRNEK VE REAKTİF HAZIRLAMA 1. Lizis Solusyonu ve Yıkama Solusyonu (diğerleri +2-8 C de saklanmasına rağmen) buz kristalleri çözülene kadar C ye kadar ısıtılır. Bir tüpte Ekstraksiyonun Negatif Kontrolü olacak şekilde gerekli miktarda 1,5 ml polipropilen tüpler hazırlayın. 2. Herbir tüpe 300 μl Lizis Solusyonu ekleyin. 3. Uygun tüplere 100 μl Örneklerden ekleyin. 4. Aşağıdaki gibi Kontrolleri ekleyin: Cneg işaretli tüpe 100 μl C (Negatif Kontrol amplifikasyon kiti ile sağlanır) ekleyin. 5. Tüpleri vorteksleyin ve 65 C de 5 dakika inkübe edin. 5-7 saniye santrifüj edin. Eğer numune tamamen çözülmemişse, maksimum hızda ( ) 5 dakika yenicen santrifüj etmenizi ve supernatantı DNA ekstraksiyonu için yeni bir tüpe aktarmanızı öneririz. 6. Sorbenti şiddetlice vorteksleyin ve her bir tüpe 20 μl ekleyin saniye vorteksleyin ve tüm tüpleri oda ısısında 3 dakika inkübe edin. Bu adımı tekrar edin. 8. Tüm tüpleri 5000g de 30 saniye santrifüj edin ve aerosol bariyerli mikropipet kullanarak pellete zarar vermeden her bir tüpten dikkatlice supernatantı atın. Yeni bir tüpe geçerken pipet ucunu değiştirin. 9. Her bir tüpe 500 μl Yıkama Solusyonu ekleyin. Şiddetlice vorteksleyin ve 10000g de 30 saniye vorteksleyin. Her bir tüpten supernatantı atın. 10. Aşama 9 u tekrar edin ve tüm tüpleri kapakları açık şekilde 65 C de 5-10 dakika inkübe edin. 11. Pelleti 100 μl DNA-eluent içinde yeniden süspense edin. 65 C de 5 dakika inkübe edin ve periyodik olarak vorteksleyin. 12. Tüpleri 12000g de 1 dakika santrifüj edin. 13. Supernatant amplifikasyon için hazır DNA içerir. Eğer amplifikasyon, ekstraksiyon ile aynı günde yapılmayacaksa hazırlanan örnekler maksimum 5 gün için 2-8 C de saklanabilir ya da 20 /-80 C de dondurulabilir. PROTOKOL: 1.Örnek (N) ve kontroller (N+2) için yeterli miktarda reaksiyon tüpü hazırlayın örnek için Miks hazırlayın: PCR- buffer-frt içeren tüpe 30 μl TaqF DNA Polymerase ekleyin. Dikkatlice tüpü vorteksleyin. Bu miks +4 C de 3 ay saklanabilir. 3. Her bir örnek için yeni bir steril tüpe 10 µl PCR-mix-1-FRT ve 5 µl PCR- buffer-frt/ TaqF DNA Polymerase (Tablo 2 bakın) ekleyerek Reaksiyon Miks hazırlayın. 4. Her bir reaksiyon tüpüne 15 μl Reaksiyon Miks ekleyin ve 10 μl ekstrakte DNA örneği ekleyin. 5. Her bir panel için 2 kontrol hazırlayın: Amplifikasyon Negatif Kontrol işaretli tüpe 10 µl DNA-buffer ekleyin; Amplifikasyon Pozitif Kontrol işaretli tüpe 10 µl Positive Control C+ ekleyin; 6. Termocyler içine tüpleri koyun. Sonuçlar, eşik çizgisi ile floresan eğrisinin kesiştiği nokta yorumlanabilir. Tablo 2. N numune sayısı kadar reaktif miktarları için pipetleme şeması Örnek: PCR-mix-1-FRT PCR- buffer-frt/ TaqF DNA Polymerase Örnek: PCR-mix-1-FRT PCR- buffer-frt/ TaqF DNA Polymerase Örnek: PCR-mix-1-FRT PCR- buffer-frt/ TaqF DNA Polymerase

5 Not: Karışımların miktarlarının hesaplanması reaktifler dikkate alınarak 2 kontrol ve 1 ekstra örnek için yapıldı. Rotor-Gene 3000/6000 ile Real Time Amplifikasyonu 1. Advanced sistemini programlayıp New Run penceresinde etkinleştirerek HPV Assays için bir şablon oluşturun. Dual Labeled Probe/Hydrolysis probes seçin ve New düğmesini tıklayın. 2. Yeni bir pencerede karusel tipini 36-Well Rotor ya da 72-Well Rotor ve Reaction Volume (μl) 25 olarak seçin. 3. Edit Profile penceresinde HPV Screen programını ayarlayın (bu program bütün Sacace HPV High Risk Screen Real TM kiti için aynı kullanılır): t, C Zaman Fluorescence tespit Döngü Bekleme dk 1 Bekleme dk sn Döngü 64 Touchdown: 25 sn 5 1 deg. per cycle sn Döngü sn sn 40 2ci geçişte (60 C) 4x Rotor-Gene için Fam (Green), Joe (Yellow) ve Rox (Orange) kanalında flüoresans tespit 4. Floresan kanal duyarlılık düzenlemesi yapın: Channel Setup (Kanal Kurulum) Calibrate (Kalibrasyon) (RG6000 için optimizasyon sağlayın) Auto Gain Calibration (Otomatik Kalibrasyon Ayarı) (Optimizasyon) Set up (Kurulum) Calibrate Acquiring (Kalibrasyon Elde edilmesi) (Optimizasyon Elde edilmesi) ve Perform Calibration (Perform Kalibrasyon) (Optimizasyon) 1. devralmadan önce seçin. Min Okuma 4FI, Max Okuma 8FI tüm kanallar için görünür. Tüp pozisyon kolonunda Rotor-Gene 2000/3000/6000 karuselinde tüp pozisyonunu programlayın (1ci pozisyon reaktifli reaksiyon tüpü içerir). Start run tıklayın. ANALİZ SONUÇLARI: 1. Sonuçlar, threshold line (eşik çizgisi) ile flüoresan eğrisinin kesiştiği noktada Rotor-Gene 3000/6000 software ile yorumlanır. HPV 6, FAM (Yeşil) kanalında, HPV 11 JOE (Sarı) kanalında ve IC DNA ROX (Orange) kanalında tespit edilir. 2. Analysis bastıktan sonra Quantitation (Kantitasyon) düğmesini seçin. Fam(yeşil) kanalı Dynamic Tube, More Setting (Outlier Removal ) seçin ve NTC 10%, Threshold: 0,03 ayarlayın. 3. Eliminate cycles before: 5 ayarlayın. 4. Fam (Yeşil) kanalında (Quant. Resultes Cycling A. FAM/Green) Ct 32 değerli örnekler HPV 6 için pozitif olarak yorumlanır. 5. JOE (Sarı) kanalında (Quant. Resultes Cycling A.JOE/Yellow) Ct 32 değerli örnekler HPV 11 için pozitif olarak yorumlanır. 6. Eğer Ct değeri FAM (Yeşil) ve JOE (Sarı) kanallarında belirlenmemişse ve sonuç tablosunda Rox kanalında Ct değeri 30 dan daha düşükse, örnekler negatif olarak yorumlanır. Tablo 2. Kontroller için sonuçlar Kontrol Kontrol adımı Ct kanal Fam Ct kanal Joe Ct kanal Rox (Green) (Yellow) (Orange) Yorumlama NCS DNA isolation Neg Neg Neg Geçerli sonuç DNA-buffer Amplification Neg Neg Neg Geçerli sonuç Pos Complex C+ Amplification Pos (<30) Pos (<30) Neg Geçerli sonuç

6 Örnek Fam kanal HPV 6 tespit Joe kanal HPV 11 tespit Rox kanal Human DNA tespit iq icycler ve iq5 (Bio-Rad) ile Real Time Amplifikasyonu 1. Tüpleri kapatın (strips) ve cihaz içine aktarın. Not: Cihaz deneye başlamadan en az 15 dakika önce açılmalıdır. 2. Workshop ekelyin ve aşağıdaki amplifikasyon protokolünü kaydedin: Döngü Sıcaklık, C Zaman Fluoresc.tespit Tekrar Döngü dk s Döngü 3 65 Touchdown: 55 s 6 1 deg. per cycle s s Döngü s Real-time s 3. Örnek ve controller için plate oluşturmak için Edit Plate Setup seçin. FAM, HEX ve ROX kanallarında flüoresans tespiti seçin. 4. Run düğmesine basın. ANALİZ VERİLERİ Sonuçlar, eşik çizgisi ile flüoresan eğrisinin kesiştiği noktada iq icycler ya da iq5 software ile yorumlanır. HPV 6, FAM kanalında, HPV 11 HEX kanalında ve IC DNA, ROX kanalında tespit edilir. Flüoresans eğrisinin doğrusal olduğu düzeylerde eşik çizgisini (farenin sol tuşu ile) yerleştirin. Fam (Select a Reporter penceresinde FAM-490 ) kanalında Ct değeri (Ct < 32) sıfırdan farklı ise, örnekler HPV 6 için pozitif olarak yorumlanır. HEX (Select a Reporter penceresinde HEX-530 ) kanalında Ct değeri (Ct < 32) sıfırdan farklı ise, örnekler HPV 11 için pozitif olarak yorumlanır. ROX (Select a Reporter penceresinde ROX-575 ) kanalında örneklerin Ct değeri 30 ise ve FAM ve HEX kanalında flüoresans sinyali yoksa örnekler negatif olarak yorumlanır. Fam kanal HPV 6 tespit Hex kanal- HPV 11 tespit

7 Rox kanal Human DNA (β-globine gene) tespit MX3000P (Stratagene) programı aşağıdaki gibidir: 1. Termocylere tüpleri koyun ve cihazı kapatın. 2. Quantitative PCR (Multiple Standarts) seçin ve OK tıklayın. Not:Cihaz deneye başlamadan en az 15 dakika önce açılmalıdır. 3. Options menüsünde Optics Configuration seçin ve HEX/JOE filter sete Joe ve FAM filter set de Fam ekleyin. 4. Well type penceresinde örnekler için Unknown ayarlayın ve Collect fluorescence data alanında Fam, Hex, Rox tüm örnekler için seçin. 5. Bütün hücreleri iki kez tıklayın ve - negatif ve + pozitif olarak örnek bilgileri (field Well Information ) ekleyin. 6. Pencerenin sağ üst kısmındaki Thermal Profile Setup düğmesini seçin. t, C Zaman Fluorescence tespit Döngü Segment dk 1 Segment dk sn Segment 3 (Cycling) Segment 4 (Cycling) 64 Touchdown: 1 deg. per cycle 25 sn sn sn sn sn Fam, Joe, Rox 5 40 ANALİZ SONUÇLARI 1. Ampifikasyon bittikten sonra, pencerenin sol üst kısmındaki Analysis düğmesini seçin tane flüresans kanalının aktif olduğundan emin olun (Dyes Shown alaında Rox, Joe, Fam düğmelerini seçin). 3. Threshold fluorescence otomatik olarak ayarlayın. o ROX kanalı için 150 o HEX kanalı için 150 o FAM kanalı için Area to analyze analında Text Report seçin. 5. Deney geçersiz olabilir; Eğer Negatif PCR Kontrol herhangi bir pozitif flüoresans sinyal vermezse;

8 Eğer Pozitif PCR Kontrol tüm kanallarda pozitif sinyal verirse (Fam, Joe, Rox). 6. Örnek sonuçları: Herhangi bir pozitif flüoresans sinyalin yokluğu durumunda Geçersiz kabul edilir (pozitif yada internal) Eğer Internal kontrol sinyali Rox kanalında bulunursa (Ct 30) Negatif kabul edilir. Pozitif: o HPV 6 için eğer Fam kanalında (Ct 32) pozitif sinyal içerirse; o HPV 11 için eğer Joe kanalında (Ct 32) pozitif sinyal içerirse; Örnek Rox kanal Human DNA tespit Fam kanal HPV 6 tespit Joe/Hex kanal HPV 11 tespit SmartCycler (Cepheid) ile Real Time Amplifikasyonu 1. Minisantrifüjün rotoruna SmartCycler PCR tüpleri aktarın ve kısa süre santrüfüj edin(5-10 sec). 2. Ana menüde Define Protocols (Protokoller tanımla) seçin ve sol alt köşedeki New Protocol (Yeni protokol) seçeneğini seçin. Protokol için bir isim belirleyin ve aşağıdaki parametreleri ayarlayın: 3. Save Protocol (Protokol kaydet) seçin. 4. Ana menüden Create Run (Çalışma Oluştur) seçeneğini seçin ve Run Name (Çalışma ismi) penceresinde deney için bir isim girin. 5. Dye Set (Boya Ayarı) düğmesini tıklayın ve FCTC25 seçin. 6. Add/Remove Sites (Ekle/Çıkar Site) seçin ve analiz için yeni bir pencerede Protokol ve Sites seçin. OK tıklayın. 7. SmartCycler içine reaksiyon tüplerini koyun ve Start Run (Çalışmayı başlat) düğmesine basarak deneyi başlatın. 8. View Results (Sonuçları gör) menüsünde Results Table (Sonuç tablosu) basın ve Sample ID (örnek ID) kolonuna örnek isimlerini ekleyin. 9. Flüoresans, HPV 6 için Fam kanalında, HPV 11 için Cy3 kanalında ve Internal Kontrol için Cy3 kanalında Real Time da görülmektedir.

9 SONUÇ ANALİZİ 1. Analysis settings (Analiz ayarları) basın ve Manual Thresh Fluor Units kolonunda Fam ve Cy3 kanaları için 30 a threshold (eşik) çizgisinin değerini ayarlayın. Update Analysis ( Analiz güncelleme) tıklayın. 2. Results Table (Sonuç Tablosu) menüsünde Save Run (Çalışmayı Kaydet) tıklayın. 3. Deney geçersiz olabilir; Eğer Negatif PCR Kontrol herhangi bir pozitif flüoresans sinyal vermezse; Eğer Pozitif PCR Kontrol tüm kanallarda pozitif sinyal verirse (Fam, Cy3, TxR). 7. Örnek sonuçları: Herhangi bir pozitif flüoresans sinyalin yokluğu durumunda Geçersiz kabul edilir (pozitif yada internal) Eğer Internal kontrol sinyali (Texas Red (TxR) kanalında bulunursa (Ct 30) Negatif kabul edilir. Pozitif: o HPV 6 için eğer Fam kanalında (Ct 32) pozitif sinyal içerirse; o HPV 11 için eğer Cy3 kanalında (Ct 32) pozitif sinyal içerirse; Örnek Fam kanal HPV 6 tespit Cy3 kanal HPV 6 tespit TxR kanal Human DNA tespit PERFORMANS ÖZELLİKLERİ Analitik özgüllük Primerler ve probların analitik özgüllüğünü negatif örnek ile doğrulanmıştır. Bu örnekler spesifik HPV 6,11 primerler ve problar ile sinyal vermezler. Kit HPV 6/11 Real-TM in özgüllüğünü 100% dür. Kit HPV 6/11 Real- TM ın potansiyel çapraz-reaktivitesi kontrol grubuna karşı aşağıdaki tabloda test edilmiştir. Diğer patojenler ile herhangi bir çapraz-reaktivite gözlenmedi. Tablo 1: Başka patojenler ile kitin özgüllük testi: Kontrol Grubu Sonuçlar Adenovirus type 2 - Adenovirus type 3 - Adenovirus type 7 - Cytomegalovirus - Epstein Barr virus - Human immunodeficiency virus 1 -

10 Hepatitis B virus - Hepatitis C virus - Herpes simplex virus 1 - Herpes simplex virus 2 - Human herpes virus 6 - Human herpes virus 8 - HPV groups β, γ, μ (1,3,4,5,8,37,38,65,20,24,49,50,15) - HPV group α (7, 10, 16, 18, 26, 27, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 53, 58, 59) - Analitik duyarlılığı Kit HPV 6/11 Real-TM, 500 kopya/ ml den az olmayan % 100 duyarlılıkla testlerin HPV 6 & 11 DNA tespitini sağlar. Tespit, negatif numuneler tarafından kontrol standardını ve dilüsyonlarını gerçekleştirir. Hedef bölge: L1 gene SORUN GİDERME 1. Klinik örnekler için IC (Rox/Texas Red channel) sinyal vermez ya da zayıf verir. Yanlış swab hazırlama: epitel hücrelerinin yetersiz miktarı veya mukoza yüksek miktarı Örnek toplama prosedürünü tekrar edin. PCR inhibe olur. Size önerilen DNA ekstraksiyon yöntemini kullandığınızdan ve üreticinin talimatlarını izlediğinizden emin olun. Ekstre edilmiş DNA pipetlenmeden önce maksimum hızda ( g) 2 dakika boyunca bütün tüpleri tekrar santrifüj edin ve dikkatlice süpernatantı alın. Reaksiyonda inhibe olan sorbent pellete dokunmayın. Reaktif saklama koşulları talimatlara uygun değildir. Saklama koşullarını kontrol edin. PCR koşulları talimatlara uygun değildir. PCR şartlarını ve protokolde rapor edilmiş flüoresans kanalını IC tespit için seçin. 2. Pozitif kontrol sinyal vermez ya da zayıf sinyal verir. PCR koşulları talimatlara uygun değildi. Amplifikasyon protokolunu kontrol edin ve manuel de rapor edilmiş fluoresans kanalını seçin. 3. Ekstraksiyonun Negatif Kontrol ile sinyal herhangi bir sinyal verir. DNA ekstraksiyon prosedürü sırasında kontaminasyon olabilir. Tüm örneklerin sonuçları geçersizdir. Sodyum hipoklorit ve etanol ile cihazın tüm yüzeyleri dekontamine edin. Ekstraksiyon prosedürü sırasında sadece filtre uçları kullanın. Tüpler arası geçişte uçları değiştirin. Reaktiflerin yeni bir seti ile DNA ekstraksiyonunu tekrar edin. 4. PCR Negatif Kontrolu (DNA-buffer) ile herhangi bir sinyal verir. PCR hazırlık işlemi sırasında kontaminasyon olabilir. Tüm örneklerin sonuçları geçersizdir. Sodyum hipoklorit ve etanol veya özel DNA dekontaminasyon reaktifleri ile cihazın tüm yüzeyleri dekontamine edin. Sonunda Pozitif kontrolü pipetleyin. Reaktiflerin yeni bir seti ile PCR hazırlanmasını tekrar edin. Sacace Biotechnologies Srl 44 Scalabrini str., Como, Italy *PCR: The Polymerase Chain Reaction (PCR) process is covered by patents owned by Hoffmann-La Roche and applicable in certain countries. Sacace does not encourage or support the unauthorized or unlicensed use of the PCR process. Use of this kit is recommended for persons that either have a license to perform PCR or are not required to obtain a license