HIV Real-TM Quant Dx El Kitabı

Transkript

1 HIV Real-TM Quant Dx El Kitabı İnsan plazmasında Kantitatif Human Immunodeficiency Virus tespiti için Real Time PCR Kiti Sadece Kantitatif invitro Diagnostic Kullanım REF V0-96/3FRT 96 Rotor-Gene 6000/Q (Qiagen) ile kullanım için SaCycler-96 (Sacace) ile kullanım için Sacace Biotechnologies Srl via Scalabrini, Como Italy

2 KULLANILAN SEMBOLLERİN AMLAMLARI Liste Numarası <n> testi için yeterli içerik Lot Numarası Versiyon invitro Diagnostic kullanım CONTROL INT Internal kontrol Sıcaklık limitleri CONTROL 1 Yüksek Pozitif Kontrol Üretici CONTROL 2 Düşük Pozitif Kontrol Kullanım talimatlarına bakınız CONTROL - Negatif Kontrol Son Kullanım tarihi CAL 1 Standard 1 Dikkat! CAL 2 Standard 2 Sacace HIV Real-TM Quant Dx VER

3 İÇİNDEKİLER İSİM...4 GİRİŞ...4 KULLANIM AMACI...5 TAHLİL PRENSİBİ...5 SAĞLANAN MALZEMELER...6 SAĞLANMAYAN GEREKLİ MALZEMELER...6 UYARILAR EV ÖNLEMLER...7 MUHAFAZA VE NAKLİYE TALİMATLARI...8 STABİLİTE...8 KALİTE KONTROL...8 NUMUNE TOPLAMA, MUHAFAZA VE TAŞIMA....8 ETKİLEŞİM MADDELERİ...9 REAKTİFLERİN HAZIRLANMASI...9 RNA İZOLASYONU...9 INTERNAL KONTROL...10 TAHLİH KALİBRASYONU...10 TAHLİL PROTOKOLÜ...11 KALİTE KONTROL PROSEDÜRÜ...12 SONUÇLARIN YORUMLANMASI...12 PERFORMANS KARAKTERİSTİKLERİ...13 ANALİTİK HASSASİYET...13 DOĞRUSAL ARALIK...13 ÖZGÜNLÜK...14 GENOTİP TESPİTİ...14 ÇAPRAZ REAKTİVİTE...14 DAYANIKLILIK...15 KESİNLİK...15 ÇAPRAZ KONTAMİNASYON...15 ROTORGENE 6000/Q İÇİN PROTOKOL...17 SaCycler-96 Real Time PCR system İÇİN PROTOKOL...22 SORUN GİDERME...24 Sacace HIV Real-TM Quant Dx VER

4 İSİM HIV Real-TM Quant Dx GİRİŞ HIV, HIV-1 ve HIV-2 olarak yapısal ve antijenik özellikler bakımından farklılaşmış bir lentivürüstür (retrovirüs ailesi üyesi). HIV-2, HIV-1 den epeyce az bir sıklıkta ortaya çıkar terminolojisine göre, üç bağımsız HIV-1 grubu vardır: <<M>> (main/asıl), <<O>> (outlier/aykırı), <<N>> (non-v/non-o). Grup O ile N daha az yaygındır ve Afrika ülkelerinin popülasyonunda görülür. Grup M, 11 alttip içerir, bunlar: A1, A2, B, C, D, F1, F2, G,H, J, K dır. Virüsün bulaşma şekli, virüsün yayılması için çok önemlidir.hiv üç şekilde bulaşır: heteroseksuel ve homoseksüel ilişki, parenteral kan ve kan ürünleri ve vertical, enfekte anneden intrauterine yoluya, doğum esnasında veya doğum sonrası emzirmeyle çocuğa bulaşması. HIV tek sarmallı, pozitive-sense, örtülü RNA virüsleri olarak bulaşır. RNA genomun hedef hücreye girmesiyle, viral olarak kodlanmış ters transkriptaz ile çift-sarmallı DNA'ya dönüştürülür (ters transkriptaz), bu,virüs partikülüne viral genom ile birlikte taşınır. Ortaya çıkan viral DNA daha sonra hücre çekirdeğinin aktarılır ve konak kofaktör ve viral kodlamayla hücresel DNA'ya entegre edilir. Entegrasyondan sonra virüs,virüs ve konak hücrenin immun sistemi tarafından algılanmasını önlemek için, latent hale dönüşebilir. Alternatif olarak,virüs, yeni virüs partikülleri gibi hücreden salınan viral protein ve yeni RNA genomları üretimini transkribe edebilir,yeniden çoğalma döngüsü başlar. Direkt HIV tespitinde günümüzdeki en etkili yöntemlerden biri, polimeraz zincir raksiyonu (PCR) ile in vitro sükleik asitlerin spesifik amplifikasyonudur. Bu yöntemin bir çok avantajı vardır: DNA/RNA virüs tespiti seroloji açısından sürenin azaltılmasına olanak sağlar; PCR, HIV enfekte anneli çocuklarda HIV tanısı için gerekli metoddur; kan plazmasındaki (viral yük) HIV RNA tespiti tedavi etkinkiğinin izlenmesinde zorunlu bir prosedürdür. Sacace HIV Real-TM Quant Dx VER

5 KULLANIM AMACI HIV Real-TM Quant Dx Kit, insan plazmasında, İnsan İmmün Yetmezlik Virüsü 1 (HIV-1) RNA'nın kantitatif tespiti ve çift renkli tespit yoluyla HIV-1spesifik Internal Kontrol (IC) 'ün eşzamanlı tespiti için Real-Time Amplification testidir. Kantitatif HIV RNA testi, antiretroviral tedavi için tedaviye yanıt olasılığına ilişkin prognostik bilgi sağlar. Periferik kandaki HIV seviyelerinin kantitatif ölçümünün, HIV bulaşmış kişilerin yönetiminde ve prognozunda önemli bir parametre olduğu gösterilmiştir. Antiretroviral tedavi başlatılması ya da değiştirilmesi ile ilgili kararlar, plazma HIV RNA seviyelerinin (viral yük) izlenmesi, CD4+ T hücre sayımına ve hastanın klinik koşullarına bağladır. Antiretroviral tedavinin amacı, plazmada mevcut viral yük tahlilleri ile tespit edilemeyen seviyelerinin, HIV RNA konsantrasyonu azaltmaktır. HIV Real-TM Quant Dx Real Time tahlili, HIV için donörlerin kan, plazma, serum veya dokularının taranması amaçlı ya da HIV enfeksiyon varlığını doğrulamak için kullanılan bir tanı testi değildir. TAHLİL PRENSİBİ HIV Real-TM Quant Dx Kiti insan plazmasında İnsan İmmün Yetmezlik Virüsü 1 (HIV-1) RNA nin kantitatif tespiti için bir Real-Time testtir. HIV RNA, plazmadan ekstrakte edilir, real time amplifikasyon kullanılarak amplifiye edilir ve HIV veya HIV IC için spesifik floresan reporter boya probları kullanılarak tespit edilir. Thermal cyclingin her turunda, sıcaklık düşülürken amplifikasyon ürünleri yüksek sıcaklıkta primer temperleme ve genişlemeyle tek sarmala ayrılmalarına olabak sağlanır. Ürünün üstel aplifikasyonu, yüksek ve düşük sıcaklıklar arasında tekrarlanan cyclingte elde edilir, bir milyar yad daha yüksek katlarda oluşan hedef sekansların amplifikasyonu ile sonuçlanır. Hedeflerin (HIV ve IC) amplifikasyonu, aynı reaksiyonda eş zamanlı olarak meydana gelir. Real Time esnasında floresan yoğunlukların izlenmesi, real time ampldikasyondan sonra reaksiyon tüpünü yeniden açmasına gerek bırakmadan biriken ürünün miktarının belirlenmesine ve tepitine olanak sağlar. Internal kontrol (IC) olası inhibasyonu tanımlamak için ve her biri ayrı ayrı işlenmiş anplifikasyon ve ekstraksiyon kontrolü olarak hizmet verir. IC, HIV RNA kanaldan farklı bir kanal tespit edilir. HIV -IC liyofilize bir Internal kontroldür ve PCR amlifikasyon-tespit nükleik asit ekstraksiyon anzalizinin tüm adımlarında taşınan rekombine RNAiçeren yapıyı temsil eder. HIV Rec IC varlığı sadece ekstraksiyon prosedürünün izlenmesine ve olası PCR inhihasyonunun kontrolüne olanak sağlamaz, ama ekstraksiyon prosedürü esnasında RNA'nın olası kayıplarını doğrulamak böylece HIV viral yükü tam olarak tanımlamaya imkan verir. Bu tahlil,nükleik Asit Amplifikasyon Teknikleri (NIBSC code: 10/152)İnsan İmmün Yetmezlik Virüsü için, 3. HIV-1 WHO Uluslararası standartlarına karşı standartize edilmiştir ve sonuçlar, Uluslararası Birim / ml (lu / ml) cinsinden rapor edilmiştir. HIV Real-TM Quant Dx tahlili hedef sekansı, HIV genomunun havuz genidir. Bu bölge, HIV için spesifik ve son derece konservatiftir. Sacace HIV Real-TM Quant Dx VER

6 SAĞLANAN MALZEMELER Sacace HIV Real-TM Quant Dx Amplification Reagent Kit RT-PCR REAGENT PACK 96 vials (0,2 ml) liyofilize amplification reaktifleri ile, 0,1g Sacace HIV Real-TM Quant Dx Control Kit 1, 2 CONTROL INT 4 şişe liyofilize reaktif HIV-IC-L ile, 0,2g CONTROL 1 4 şişe, liyofilize reaktif HIV-Pos1-L C+ - Sacace HIV Real-TM Quant Dx High Positive Control ile, 0,2g CONTROL 2 4 şişe, liyofilize reaktif HIV-Pos2-L C+ - Sacace HIV Real-TM Quant Dx Low Positive Control ile, 0,2g CONTROL 4,0 şişe, her şişede Negative Control 4,0 ml Sacace HIV Real-TM Quant Dx Calibrator Kit 1,2 CAL 1 4 şişe, liyfilize reaktif HIV Quantitative Standard 1ile, 0,2g CAL 2 4 şişe liyofilize reaktif HIV Quantitative Standard 2i le, 0,2g 1Standard ve kontrollerin konsantrasyonları her lot için spesifiktir. 2numune hazırlama prosedürü esnasında (bakınız RNA isolation) GEREKLİ AMA SAĞLANMAYAN MALZEMELER RNA izolasyon kiti (bakınız RNA izolasyon) eppendorf tip tüpler için masaüstü mikrosantrfüj Vorteks mikser Atılabilir eldiven, pudrasız. Biyolojik tehlikeli atıklar için kap Buzdolabı, Dondurucu Real Time Thermal cycler Enfeksiyöz malzemeler ile çalışmak için uygun Biyolojik güvenlik kabini Pipetler (ayarlanabilir) Filtreli steril pipet uçları Tüp rakları Sacace HIV Real-TM Quant Dx VER

7 UYARILAR VE ÖNLEMLER In Vitro Diagnostic Medikal Cihaz Sadece In Vitro Diagnostic Kullanım için 1. Numuneleri işlemeden önce, pakette bulunan prospektüsteki talimatları dikkatlice okuyun. Kullanım kılavuzu ile sıkı uyum optimum PCR sonuçları için gereklidir. 2. Reaktif ve örnekler ile çalışırken, atılabilir eldiven, laboratuar önlüğü ve göz koruyucu kullanın.işlem sonrası ellerinizi iyice yıkayın. 3. Rutin laboratuar önlemleri kullanın. Laboratuar çalışma alanlarında, sigara içmeyin, herhangi birşey yemeyin - içmeyin, kozmetik uygulamayın veya kontakt lenslere ellemeyin. Ağzinizla pipetleme yapmayın. 4. Son kullanı tarihlerinden sonra kitleri kullanmayın. 5. Farklı kitlerin reaktiflerini karıştırmayın 6. Pipetleme esnasında oluşan aerosoller nedeniyle nükleik asit kontaminasyon riskini azalmak için, aerosol bariyerli pipet uçları kullanılmalıdır.. Tüm likit transferleri arasında aerosol bariyerli pipet uçlarını değiştirin. 7. Numune hazırlığı esnasında, iyi bir laboratuar uygulaması olması için, ekstraksiyon prosedürü esnasında ve sonrasında numunelere kazara nükleazların girişi gibi numuneler arası çapraz kontaminasyon riskinin minimize edilmesi gereklidir. RNA veya DNA ile çalışırken daima uygun aseptik teknikler kullanılmalıdır. 8. Yalnızca pudrasız eldivenler kullanın. 9. Tüm numuneleri ve kullanılmayan reaktifleri,yerel yönetim kurallara uygun olarak imha edin. 10. Heparinin, reaksiyonu inhibe ettiği gösterilmiştir. Heparinize örneklerin kullanılması tavsiye edilmez. 11. Örnekler bulaşıcı olabilir. Tahlili yaparken genel önlemleri alın. 12. Numuneler ve kontroller bir laminer akış başlığı içinde hazırlanmalıdır. 13. Örnek ve kontrol içeren tüm malzemeleri, örnek ve kontrollerin çapraz kontaninasyonunu engellemek amacıyla iyi laboratuar uygulamalarına göre çalışın. 14. Dökülen/ saçılan tüm numune veya reaktifleri temizleyin ve %0.5 lik sodyum hipoklorit veya diğer uygun dezenfektanlarla dezenfekte edin. % 70 etanol ile yüzeyi silin. 15. Örnek veya reaktifin deri, göz ve mukoza zarları ile temasından kaçının, temas olması halinde su ile yıkayınız ve hemen tıbbi yardım alın. 16. Bu ürün potansiyel olarak bulaşıcı bileşenler içermez. Malzeme Güvenlik Bilgi Formları (MSDS) istek üzerine verilebilir. 17. Bu ürünün kullanımı, amplifikasyon teknikleri konusunda eğitimli personel ile sınırlı olmalıdır. 18. Personnel should be using proper anti-contamination safeguards when moving between areas. Laboratuvar süreci tek yönlü olmalı Ekstraksiyon alanında başlamalı ve sonra Amplifikasyon alanlarına gidilmeli/ yönlenmelidir. Örnekleri, ekipmanları ve reaktifleri önceki adımın yapıldığı bölgeye/alana geri döndürmeyin. Personel, alanlar arasında hareket ederken uygun anti-kontaminasyon önlemleri almış olmalıdır. Sacace HIV Real-TM Quant Dx VER

8 MUHAFAZA VE NAKLYE TALİMATLARI HIV Real-TM Quant Dx PCR kitinin tüm bileşenleri kullanılmadıklarında +2-8ºC de muhafaza edilmelidir. HIV Real-TM Quant Dx PCR kitinin tüm bileşenleri etiketlerinde belirtilen son kullanım tarihlerine kadar stabildirler. Reaktiflerin raf ömrü, aksi belirtlmedikçe ilk kullanım öncesi ve sonrasında aynııdır. HIV Real-TM Quant Dx PCR kiti +2-8ºCde nakliye edilir. STABİLİTE HIV Real-TM Quant Dx Test etiketinde belirtilen son kullanım tarihine kadar stabildir. Ürün etiketinde basılı kontrol tarihine kadar performansını koruyacaktır. Işık, ısı veya neme maruz kalma, kitin bazı bileşenlerini etkileyebilir, bunlardan kaçınılmalıdır. Bileşenler, etiketlerde belirtilenler dışındaki koşullarda muhafaza edildiğinde düzgün çalışmayabilir ve tahlil sonuçlarını olumsuz etkileyebilir.pozitif veya negatif kontrol değerleri, beklenilen aralığın dışında çıkmarsa, bu reaktiflerin bozulduğunun bir göstergesi olabilir. Ilgili test sonuçları geçersizdir ve numuneler tekrar test edilmelidir.. Tahlilin yeniden kalibrasyonu gerekebilir. KALİTE KONTROL Her lot, tutarlı ürün kalitesini sağlamak için; SACACE, ISO Sertifikalı Kalite Yönetim Sistemine uygun olarak, önceden belirlenmiş özelliklere karşı test edilmektedir. ÖRNEK TOPLAMA, MUHAFAZA VE TAŞIMA Not: Tüm örnekler, potansiyel bulaşıcı ajanlar olarak ele alınmalıdır. Güncel çalışmalar, HIV tespiti için en uygun örnek malzemesi olarak EDTA veya sitratlı plazmayı referans göstermektedir. Bu nedenle, HIV Real-TM Quant Dx ile bu malzemelerin kullanılmasını öneririz. HIV Real- TM Quant Dx tahlilinde iç doğrulama, insan EDTAlı plazma numuneleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Diğer örnek materyaller valide edilmemiştir. HIV Real-TM Quant Dx tahlili, sadece insan plazma örnekleri ile kullanım içindir. * 1. EDTA tüpler HIV Real-TM Quant Dx ile kıllanılabilir. Numune tüpü üreticisinin talimatlarına uyun. 2. EDTA içinde toplanan tam kan, altı saat içinde 20 dakika boyunca x g'de santrifüj ile plazma ve hücre bileşenlerinin ayrılmalıdır. Izole edilmiş plazmanın, steril bir polipropilen tüpü içine transfer edilmesi gerekir. Plazma, ilave 3 gün 2-8 C'de muhafaza edilebilir. Ya da alternatif olarak, -18 C de 1 aya,-70 C'de 1 yıla kadar muhafaza edilebilir. 3. Tam kanı dondurmayın. 4. Heparin ile antikoagule edilmiş örnekler bu test için uygun değildir. 5. Dondurulmuş örnekleri kullanmadan once oda sıcaklığına getirin. 6. Tam kan 2-25 C de taşınmalı ve toplandıktan sonra 6 saat içerisinde işlenmelidir. Plazma 2-8 C de veya dondurulmuş olarak taşınabilir.. 7. Klinik örneklerin taşınması, etiyolojik ajanların taşınmasına yönelik ülke, federal, eyalet ya da yerel yönetmeliklere, uymak zorundadır. * Serum bazı durumlarda başlangıç malzemesi olarak da kullanılabilir. Bu durumda kit HIV Real-TM Quant Dx analitik hassasiyeti aynıdır, ancak serum hazırlamanın pıhtı geri çekilme fazı esnasında viral partüküllerin çökelmesiyle klinik hassasiyet önemli ölçüde azalabilir.. Sacace HIV Real-TM Quant Dx VER

9 ETKİLEŞİM MADDELERİ Artmış bilirubin ve lipid ( 800 mg / dl) düzeyleri ( 15 mg / dl) sistemini etkilemez. Heparin ( 10 IU/ml) PCR I etkiler. Antikoagülan olarak heparin içeren tüpler de toplanan numuneler kullanılmamalıdır. Ayrıca, heparinize hasta numuneleri de kullanılmamalıdır. REAKTİF HAZIRLAMA HIV Real-TM Quant Dx protokolüne başlamadan once reaktifleri aşağıdaki gibi hazırlayın: 1. İstenen liyofilize kontrol ve kalibratör miktarlarını seçin ve kısaca santrifüjleyin. 2. Aşağıdaki tabloya göre Negative Control( CONTROL -) ekleyin: Liyofilize reaktif CONTROL -, µl CAL CAL CONTROL CONTROL CONTROL INT Tüpleri kapatın ve tüm tüpleri oda sıcaklığında 2 dak. Inkübe edin.periyodik olarak vorteksleyin. and 4. Tüpleri 5 sn. Santrifüjleyin. 5. Çözünmüş reaktifler ( CAL1, CAL2, CONTROL 1, CONTROL2 ve CONTROL INT) 2-8 C de muhafaza edilmeli ve daima 30 güne kadar ışıktan korunmalııdır. (dondurmayın!) RNA ISOLATION TOPLAMA, MUHAFAZA VE TAŞIMA paragrafında belirtilen numune türleri için IVD-CE valide edilmişse, herhangi bir ticari RNA/DNA isolasyon kiti kullanılabilir. Sacace Biotechnologies aşağıdaki kitlerin kullanılmasını tavsiye eder: Magno-Virus (Sacace, REF K-2-16): numune hacmi 1000 µl SaMag Viral Nucleic Acids Extraction kit (Sacace, REF SM003): otomatik nucleic acid purifikasyon sistemi : Kit numune hacmi 400 µl RNA ekstraksiyonunu, üreticinin talimatlarına uygun olarak gerçekleştirin. RNA izolasyon prosedürü esnasında, tüm numune, kontrol ve kalibratörlerdeki (bakınız Internal kontrol) numune/lysis karışımına doğrudan 10 µl COTROL INT ekleyin. RNA izolasyon prosedürü sırasında, yüksek ve düşük negative kontroller (CONTROL 1 ve CONTROL 2) hem de Neg. Control (CONTROL -)daima hasta numuneleri ile birlikte kullanılmalıdır. Bu kontroller RNA purifikasyon kit kullanımı el kitabında belirtilen hasta numuneleriyle aynı şekilde işleme tabii tutulmalıdırlar. Sacace HIV Real-TM Quant Dx VER

10 INTERNAL KONTROL HIV-IC-L, PCR amplifikasyon-tespiti için nükleik asit ekstrasyonunun tüm analiz adımları boyunca taşınan, rekombinant RNA içeren yapısını gösterir. HIV-IC-L varlığı, olası PCR sadece inhibasyonunun kontrolü ve ekstraksiyon prosedürünün izlenmesine değil, aynı zamanda ekstraksiyon prosedürü esnasında olası RNA kaybının doğrulanmasına imkan verir, böylece tam olarak HIV viral yük hesaplanabilir. Bir IC threshold cycle [Ct] tahlil geçerlilik parametresi kalibrasyon çalışması sırasında oluşturulur. Belirtilen tutarlı IC miktarı (10 µl) Real time PCR cihazında ölçülen uygun örnek prosesini ve tahlilin geçerliliği göstermek amacıyla,hazırlık başlangıcında her bir numuneye, kalibtaör ve kontrole eklenir. Kalibrasyon prosedürü sırasında tespit edilen (iki kalibratör üç tekrarda çalışılır) IC hedef sekans floresan sinyalli median amplifikasyon, tüm müteakip numunelerin işlenmesiyle IC Ct geçerlilik değerlerinin yerine getirilmesi için yapılır.. IC Ct örnekleri için oluşturulan değer aralığı= 6 kalibratörün Medium IC Ct ± 2 cycles Oluşturulan değer aralığını aşan örnekler, numune hazırlamadan başlanılarak yeniden test edilmelidir. TAHLİL KALİBRASYONU Numunelerin ve kontrollerin HIV RNA konsantrasyonunu ölçmek için bir kalibrasyon eğrisi gerekir.t Kalibrasyon eğrisini oluşturmak için, iki tahlil kalibratörü üç tekrarda çalışılır.( HIV konsantrasyonu, floresan sinyal seviyesinin reaktive olduğu threshold cycle (Ct) ye karşılık gelen yerde tespit edilir). Hesaplanan kalibrasyon eğrisi eğimi ve kesişim cihazda saklanır. Örnekteki HIV RNA konsantrasyonu, saklanan kalibrasyon eğrisinden hesaplanır. Kalitaif standart CAL1 ve CAL2 hasta numunesi gibi aynı işleme tabii tutulmalıdır. Yeni lotlu HIV Real-TM Quant Dx'in ilk kullanımından önce, kalibrasyon eğrisi oluşturmak için RNA eksrraksiyon prosedüründen itibaren, 6 kalibratör çalışılmalıdır(iki kalibratör üç tekrarda çalışılır) CAL 1 için 2 numune hazırlama tüpü, her kalibrasyon çalışmasında CAL 2 için 3 tüp hazırlayın. Herbir tüpe 10 µl o CONTROL INT ekleyin. Uygun tüplere RNA prufikasyon kit manuelinde belirtilen miktarda CAL1 ve CAL2 ekleyin. (Örneğin, Magno-Virus kit için 1000 µl kullanılır (Sacace, REF K-2-16) Kullanılan RNA purifikasyon kitinin el kitabında belirtilen numune hazırlama prosedürünü takip edin. Sacace HIV Real-TM Quant Dx VER

11 TAHLİL PROSEDÜRÜ Not: Reaction Mix hacmi = 50 µl Rekonstitüsyondan önce dondurularak kurutulmuş malzemenin herhangi kısmı dışında tatırmamalıdır. REAL TIME PCR KALİBRASYON PROSEDÜRÜ: 1. Ekstrakte kalibratör PCR performansı için liyofilize reaktifli 6 reaksiyon tüpü hazırlayın kalibratörün RNAprufikasyon prosedürüden elde edilen 50 µl elute örneği ekleyin. Amplifikasyon ve tespit prosedürü için bu manuelde belirtilenleri takip edin. HIV Real-TM.Quant Dx kalibrasyonu çalışması kabul edilip, saklandıktan sonra bu lot bitene kadar kullanılabilir. Bu süre zarfında, sonraki tüm örnekler aynı lot numaralı HIV Real- TM Quant Dx kullanılan klinik numunelerin tahlilindeki Kalibrasyon eğrisiyle, tekrar kalibrasyona gerek kalmadan test edilebilir. REAL TIME PCR NUMUNE PROSEDÜRÜ: 1. Ekstrakte numune ve kontrollerin PCR'ını gerçekleştirmek için, liyofilize reaktifli reaksiyon tüplerini gereken miktarda hazırlayın. 2. RNA prufikasyon adımından elde edlilen 50 µl elute numuneyi ekleyin. Tüpleri kapatın ve Real TimePCR cihazına yerleştirin. Enstrümanınızda aşağıdaki gibi bir sıcaklık profili oluşturun: Adım Sıcaklık Cycle Süre Floresan tespiti С tekrarla Hold dk 1 Hold dk sn Cycling sn sn sn Cycling sn* FAM/Green, JOE/Yellow 42** sn * Rotor-Gene 6000/Q instrument kullanılımında 30 sn ** Rotor-Gene 6000/Q instrument kullanımında 40 cycles Sacace HIV Real-TM Quant Dx VER

12 KALİTE KONTROL PROSEDÜRÜ Internal Kontrol (IC) tanımlanmış miktarı,her bir numunenin ekstraksiyon prosesini kontrol etmek ve olası inhibasyon reaksiyonunu tanımlamak için, her numune ve kontrolün numune hazırlama prosedürünün başlangıcından itibaren işleme konulur. Negative Control (CONTROL -), HIV High (+) Control (CONTROL 1) ve HIV Low (+) Control (CONTROL 2) ün tekrarı her çalışmasına dahil edilmelidir. Eğer kontroller beklenilen aralıklarının dışındaysa (veri sayfasına bakınız), tüm numuneler ve kontroller için numune hazırlama adımından itibaren bu çalışma tekrar yapılmalıdır. SONUÇLARIN YORUMLANMASI Internal Control (IC) FAM/Green kanalda, tespit edilir. HIV RNA ise Joe/Yellow/HEX kanalda Her DNA amplifikasyonu,sigmoid büyüme eğrisi (log ölçeği) olarak elde edilen, FAM/Green kanal (ICiçin) de veya Joe/Yellow/HEX kanalda (HIV RNA için) ölçülebilir floresan sinyalinin üretimi ile ilişkilidir. Veri analizleri, İlgili yazılım kullanarak ve el kitabının önerileri dikkate alınarak., üreticinin talimatlarına (Operation manual Rotor-Gene, 6000/Q, Qiagen ve Instrument Manual SaCycler-96, Sacace) göre yapılmalıdır. Sonuçların yorumlanması ve çalışma geçerli olduğundan emin olmak için elde edilen sonuçları kontrol edin. HIV RNA, CT değerleri ve kantitatif standartlarının analizinden sonuçlanan, standart eğriye göre tespit edilir. HIV RNA konsantrasyonu IU/ml olarak ifade edilir. Sonuçlar 10,000,000 IU/ml den fazla ise, 10,000,000 IU HIV/ml den fazla olarak gösterilecektir.sonuçlar lineer ölçüm aralığından fazla ise, numune 10x dilüsyonda sonra analiz edilebilir, elde edilen sonuçlar 10 ile çarpılmalıdır. 1 ml ekstarksiyon sonuçlarının 48 IU/ml den düşük olduğu durumlarda, sonuç 48 IU HIV/ml de n düşük olarak gösterilecektir. Sacace HIV Real-TM Quant Dx VER

13 PERFORMANS KARAKTERİSTİKLERİ HIV Real-TM Quant Dx Kit in vitro teşhis tıbbi cihazlar için ortak teknik şartnamelere (CTS) (2009/108/EC) ve European Pharmacopoeia 7.0, p Nucleic acid aplifikasyon tekniklerine (07/2010:20621) göre değerlendirilmiştir. ANALİTİK HASSASİYET Analitik hassasiyet ya da tespit limitleri (LOD) tam olarak% 95 ya da daha büyük bir olasılık ile tespit edilebilir HIV RNA'nın miktarı olarak tanımlanır. Numune RNA prufikasyonu dikkate alındığında LOD özel bir ekstraksiyon metodu ile kombinasyonda HIVpozitif klinik örnekler kullanılarak tespit edilir. HIV RNA, üreticinin talimatlarına göre Magno-Virus saflaştırma kiti ile ekstrakte edilmiştir. (Sacace, REF K-2-16) HIV Real-TM Quant Dx tahlilinin LOD değerleri, numune hazırlama prosedürü ile 48 IU/mL dir. LOD, HIV negatif insan plazmasında Human Immunodeficiency Virus for Nucleic Acid Amplification Techniques (NIBSC code: 10/152)için 3rd HIV-1 WHO International Standard dilüsyonlarının test edilmesiyle saptanmıştır. Sonuçlar Probit analizi ile tespit edilmiştir. LINEAR ARALIK Linear aralık ya da tahlilin linearitesi,nükleik asit konsantrasyonu ile doğru orantılı sonuçları elde etme gücüdür. Diğer bir deyişle, konsantrasyonlar ile doğru orantılı olan test sonuçlarının alt ve üst konsantrasyonları arasıdır. HIV Real-TM Quant Dx tahlili için hesaplama üst sınırı 10 million IU/mL, alt sınır hesaplama sınırı ise the lower limit of LOD a (1 ml numune hazırlama prosedüürü ile 48 IU/mL) eşittir. HIV Real-TM Quant Dx kitinin linear aralığı Human Immunodeficiency Virus için 3rd HIV-1 WHO International Standard for karşı kalibre edilen HIV sentetik kantitatif standartın dilüsyon serisi (8,00 log IU/ml tan 1,00 log IU/ml) analiz edilerek tespit edilmiştir. HIV Real-TM Quant Dx tahlil linearitesini gösteren sonuçlar, Şekil 1 de gösterilmiştir.. Sacace HIV Real-TM Quant Dx VER

14 ÖZGÜNLÜK Primerler ve probların analitik özgünlüğü, the Quality of Medicine & HealthCare (EDQM).için European Directorate ten elde edilen 100 negatif plazma örneği ile valide edilmiştir. HIV spesifik primerler ve problar ile herhangi bir sinyal oluşturmamışlardır. HIV Real-TM Quant Dx kitinin özgünlüğü %100dü. GENOTİP TESPİTİ HIV virusunun farklı genotipleri tespit kabiliyeti primer ve probların özgünlüğüne bağlıdır. HIV Real-TM Quant Dx, NAT (Main), NIBSC code: 12/224 HIV-1 alttipi için NIBSC WHO Reference Reagent 2nd WHO International Reference Panel Preparation den elde edilen farklı HIV genotipleri için pozittif numuneler kullanılmıştır. Bu Panel farklı HIV alt tipleri A, B, C, D, AE, F, G, AA-GH, grup N ve grup O gösteren 10 numuneyi içerir. Test edilen tüm M-grup (A, B, C, D, AE, F, G, AA-GH) alt tipleri HIV Real-TM Quant Dx kiti ile pozitif sonuçlar vermiştir. ÇAPRAZ-REAKTİVİTE HIV Real-TM Quant Dx kitinin potansiyel çapraz reaktivitesi aşağıdaki tabloda listelenen grup kontrollerine karşı test edilmiştir. Bu patojenler ile herhangi bir çapraz reaktivite gözlemlenmemiştir. Table 1: Kit özgünlüğünün diğer patojenler ile testi : Kontrol Grup HIV Sonuçları (Joe/Yellow kanal) IC Sonuçları (Fam/Green kanal) Cytomegalovirus (CMV) - + Epstein Barr virus (EBV) - + Hepatitis B virus (HBV) - + Hepatitis D virus (HDV) - + Hepatitis A virus (HAV) - + Parvovirus B Herpes Zoster Virus (VZV) - + Herpes simplex virus Herpes simplex virus Human herpes virus Human herpes virus West Nile Virus (WNV) - + Tick-borne encephalitis virus (TBEV) - + Adenovirus type Adenovirus type Adenovirus type Rotavirus A - + Escherichia coli (E.coli) - + Staphylococcus aureus - + Streptococcus pyogenes - + Streptococcus agalactiae - + Sacace HIV Real-TM Quant Dx VER

15 DAYANIKLILIK Normal kullanım sırasında güvenilirlik göstergesi sağlar ve metod parametrelerin küçük veya kazara oluşan varyasyonlarıyla tahilin dayanıklılık kapasite ölçümü aynı kalır. HIV Real-TM Quant Dx kiti, 96 şişe kullanıma hazır liyofilize reaktiflerle RT-PCR REAGENTS PACK içerir,sadece olası varyasyonlarda kitin normal kullanımı esnasında RNA purifikasyon adımından elde edilen ek elüte numunelerln farklı hacimleri olabilir. HIV Real-TM Quant Dx kitinin dayanıklılığı, elüte numunenin farklı hacimleri (46 ila 52 µl) eklenerek değerlendirilmiştir. 3 kez %95 cut-off değeri son konsantrasyonu için HIV RNA ile 20 negatif plazma havuzları küçük varyasyonları ile (46 ul 52 ila) Liyofilize reaktifler içeren şişelere eklenmiştir. Tüm test edilen numuneler HIV RNA açısından pozitif bulunmuştur. KESİNLİK HIV Real-TM Quant Dx kitinin kesinliği SaCycler-96 cihazları kullanılarak manuel numune hazırlama için değerlendirilmiştir. HIV Real-TM Quant Dx kiti kesinlik verileri, tahlilin toplam varyasyonlarının tespitine olanak sağlar. Intraassay değişkenliklerinin toplam varyans oluşumları ( çalışma içindeki aynı konsantrasyonlu numunelerin çoklu sonuçlarının değişkenliği), inter-assay değişkenliği ( farklı günlerde ve farklı enstrümanlarda oluşan tahlil sonuçlarının çoklu sonuçlarının değişkenliği) ve inter-lot değişkenliği (değişik lotlar kullanılan tahlil çoklu sonuçlarının değişkenliği). Elde edilen veriler standart sapma ve spesifik patojen ve iç kontrol varyasyon katsayısını belirlemek için kullanılmıştır. Hesaplanan toplam değişkenlik: Ortalama SD Log Ct HIV Ortalama SD Log Calc Conc (log Ortalama SD Log Ct IC IU/ml) 0, , , Ortalama CV % Ct HIV Ortalama CV % Calc Conc (IU/ml) Ortalama CV % Ct IC Intra-assay değişkenliği 0,81 14,13 0,74 SD log Ct HIV SD log Calc Conc (log IU/ml) SD log Ct IC 0,003 0,055 0,003 CV % Ct HIV CV % Calc Conc (IU/ml) CV % Ct IC Inter-assay değişkenliği 0,71 13,58 0,76 SD log Ct HIV SD log Calc Conc (log IU/ml) SD log Ct IC 0,004 0,059 0,003 CV % Ct HIV CV % Calc Conc CV % Ct IC Inter-lot değişkenliği 0,816 13,370 0,774 SD log Ct HIV SD log Calc Conc (log IU/ml) SD log Ct IC 0,004 0,064 0,003 CV % Ct HIV CV % Calc Conc CV % Ct IC 0,894 15,450 0,694 Sacace HIV Real-TM Quant Dx VER

16 ÇAPRAZ KONTAMİNASYON HIV Real-TM Quant Dx kitinin çapraz kontaminasyonu, RotorGene Q cihazı kullanılarak manuel numune hazırlama için değerlendirildi. Negatif plazma numuneleri ve yüksek HIV konsantrasyonlu spiked negatif plazmanın alternatif 20 numuneden oluşan paneli çapraz kontaminasyon olmadığını göstermek üzere test edilmiştir. Tüm pozitif numuneler, doğru olarak tespit edilmiştir, iyi ve net sigmoid şekilli floresan eğriler ile floresan pozitif reaksiyon ve Internal Kontrol kanalda ve HIN kanalda Cycle threshold (Ct) 35 'ten düşük vermişlerdir. Hiçbir negative numune HIV kanalda floresan sinyal vermez ve Internal Control kanal hiçbirinde çapraz kontaminasyon göstermez. Sacace HIV Real-TM Quant Dx VER

17 ROTORGENE 6000/Q İÇİN PROTOKOL 1. Ana düğmeye basarak cihazı açın, Rotor-Gene software başlar 2. New Run (yeni çalışma) başlatın Şekil 1. New Run başlatın 3. Uygun rotor seçin, Locking Ring Attached box kontrol edin ve Next te tıklayın Şekil 2. Rotor ve Locking Ring 4. Kullanıcı adını, notları ve hacimi (50) girin. Sonra Next te basın. Şekil 3. Reaksiyon Hacmi Sacace HIV Real-TM Quant Dx VER

18 5. Edit Profile e tıklayın ve sıcaklık profilini programlayın. 1 2 Şekil 4. Profil Düzenleme Şekil 5. Hold: Reverse transcription adımı Şekil 6. Hold 2: Anzim aktivasyon adımı Sacace HIV Real-TM Quant Dx VER

19 Şekil7. Cycling: 1st Aplifikasyon adımı Şekil 8. Cycling: 2nd Amplifikasyon ve tespit adımı New Run Wizard menudeki Gain Optimisation a tıklayın ve aşağıdaki parametreleri ayarlayın: Şekil 9. Gain Optimisation Sacace HIV Real-TM Quant Dx VER

20 6. PCR tüplerini dikkatlice RotorGene 6000/Q rotora yerleştirin, kapağı kapatın ve çalışmayı başlatın. Şekil 10. Çalışmayı başlatmak 7. Numune pozisyonlarını ve isimlerini girin (numuneler için unknown, kontroller için Negative Control ve Positive Control. Eğer kit kalibrasyon çalışması yapılıyorsa, CAL1 ve CAL2 için standard adını kullanın v HIV Real-TM Quant Dx Data Card te belirtilen Kantitatif Standart konsantrasyonunu yazın. 8. Kullanıcı, kantitatif sonuçları olan klinik örneklerlerin tahlili için Standat eğrili kalibrasyon çalışmasını almalıdır. Bu tıklama Import Curve yapar, From Other Run opsiyonunu seçin, çıktı alınacak Kalibrasyon dosyasını ve Import Joe/Yellow Channel seçin. Sacace HIV Real-TM Quant Dx VER

21 Veri Analizi IC amplifikasyon analizi (Cycling A.Green (Fam) 1. Analysis basın ve Quantitation Cycling A.Green (Cycling A.Fam) Show seçin. 2. Threshold otomatik seçeneğini kapatın. 3. Dynamic tube ve ana menu penceresindeki Slope Correct düğmesini active edin (kantitatif analiz). 4. Sonuçlar tablosunda (kantitatif analiz) More settings seçin ve NTC Threshold u %10 a ayarlayın 5. Threshold: 0,03 seçin 6. Sonuçlar tablosunda (Kantitatif sonuçlar), IC (Fam/Green channel) 30 olması gereken Ct (Threshold cycle) değeri görünür. HIV amplifikazyon analizi Cycling A.Yellow(Joe) 1. Analysis basın ve Quantitation Cycling A.Yellow (Cycling A.Joe) Show seçin. 2. Threshold otomatik seçeneğini kapatın. 3. Dynamic Tube, Slope Correct butonlarına basın. 4. Sonuçlar tablosunda (kantitatif analiz) More settings seçin ve NTC Threshold u %10 a ayarlayın 5. Threshold: 0,03 seçin 6. Sonuçlar tablosunda (kantitatif analiz), Ct (Threshold cycle) görünür. 7. Yeni Quantitation Results penceresinde HIV RNA IU/ml değerleri görünür. Sacace HIV Real-TM Quant Dx VER

22 SaCycler-96 Real Time PCR system İÇİN PROTOKOL Önerilen Ayarlar: 1. RealTime_PCR software de ikonuna çift tıklayın. 2. Cihaz seçin 3. Takılı cihazı seçin ve Connect e tıklayın. 4. Menüden Test -> Create/Edit test i seçin. Create new test butonuna tıklayın ve HIV Real-TM Quant DX ismini girin, OK. e tıklayın. 5. Analiz tipini Multiplex detection seçin ve Method Threshold, Standard Quantity 2 ve copy 3 (total 6 standards), 2 positive controls, 1 negative control, FAM (IC)ve R6G (s), 50 µl Mixture hacmi: 6. Amplification Program altındaki, butonuna yeni program oluşturmak için tıklayın. 7. Preliminary heating seçin veaşağıdaki şablonu seçin. Apply a tıklayın, enstrümanı aşağıdaki gibi programlayın. 8. tıklayın ve uygun bir klasöre büyütme programı dosyasını kaydedin. Önceki penceredeki OK e basın. 9. Test ekle butonuna tıklayın, açılan Test menusunden HIV Real-TM Quant DX I seçin, örneklerin sayısını gösterir ve ilk Ekle 'yi tıklatın, sonra OK e basın. Sacace HIV Real-TM Quant Dx VER

23 10. Plate içindeki PCR tüp konumlandırmada varsayılan Autofill'i kullanın ya da manuel konumlandırma için Free Filling'i seçin. Concentration kolonunda, yeşil daireye tıklayın ve Data Card ta (aşağıdaki örneğe bakın) belirtilen HIV standart değerlerini girin. 11. Apply tıklama, Start Program penceresini getirecektir. 12. Thermalcycling program aşağıdaki gibi olacaktır: 13. Open bloğuna basın, PCR tüplerini enstrümana yerleştirin, Close bloka basın ve sonra PCR amplifikasyon programını başlatmak için a basın. 14. Çalışma tamamlandıktan sonra, sonuçları yorumlamak için OK a tıklayın. 15. Sonuçlar tablosundan, analiz tipi Multiplex detection, Threshold (Ct) method ve Quantitative seçin. 16. Veri analizi parametresini değiştirmek için ikonuna tıklayın, yeni bir pencere görünecektir. Ayarları aşağıdaki resimdeki gibi tam olmalı, sonra Apply a tıklayın: 60% Criterion of the positive PCR result olarak ayarlayın; Normalization data checkbox Kaldırılmalıdır. 17. Mouse kullanarak sürükle eşik çizgisini ayarlayın ve bırakın. Threshold hattı için önerilen değerler: HEX kanal için 40, FAM kanal için 25 (hafifçe threshold seviyesini sonuç eğrinize göre adapte edin). 18. Viral yük sonuçları HEX kanalı için "Sonuçlar" sütununda görünecektir. Nihai sonuçlar IU / ml olarak ifade edilmiştir. 19. Diğer çalışmada standart eğri almak için, Additional standards sekmesine tıklayın ve standartları içeren çalışma dosyası nı seçin. Viral yük sonuçlarını görmek için "Results" sekmesine geri dönün. NOT: SaCycler ve IVD versiyonu için, HIV RealTM DX protokolü cihazla verilen PC takılı olduğundan, 4-8 noktalarını görmezden gelin ve sadece nokta dokuzdaki talimatları izleyin. Sacace HIV Real-TM Quant Dx VER

24 SORUN GİDERME 1. Zayıf (Ct > 30) veya belirlenmiş aralığı aşan (Fam/Green kanal) sinyali (Internal Kontrole bakınız) numunenin yeniden test edilmesi gereklidir. PCR inhibe edilmiştir. Önerilen RNA ekstraksiyon metodunu kullandığınızdan ve üreticinin talimatlarını izlediğinizden emin olun Reaktif muhafaza koşulları talimatlara uygun değil. Muhafaza koşullarını kontrol edin. PCR koşulları talimatlara uygun değil. Protokolde belirtilen IC tespit floresan kanalını seçin ve PCR koşullarını kontrol edin IC, reaktif pipetleme esnasında numuneye eklenmemiş. RNA ekstraksiyon prosedürü esnasında dikkatli olun. 2. R2 korelasyon katsayısı 0.9 den küçük: Tüm numunelerin yeniden test edilmesi gereklidir. 3. Hesaplanan CONTROL 1 ve/veya CONTROL 1konsantrasyonları Data Sheet te belirtilen kontrol konsantrasyolarından farklı: Tüm numunelerin yeniden test edilmesi gereklidir. 4. Ekstraksiyon Negatif Kontrol için, olmayan (Joe/Hex/Yellow kanal) sinyali. RNA prosedürü esnasında kontaminasyon. Tüm numune sonuçları geçersizdir. Bütün yüzeyleri ve enstrümanları sodyum hipoklorid ve etanol ile dekontamine edin. Ekstraksiyon prosedürü esnasında sadece filtre pipet uçlarını kullanın. Tüpler arasında pipet uçlarını değiştirin. Yeni reaktif setleriyle RNA ekstraksiyonunu tekrarlayın. 5. Sinyalsiz Negative PCR Control. PCR hazırlama prosedürü esnasında kontaminasyon. Tüm sonuçlar geçersizdir. dekontaminasyon reaktifleriyle dekontamine edin. etanol veya özel DNA Sacace HIV Real-TM Quant Dx VER

25 REFERANSLAR 1. Sherman GG, Lilian RR, Bhardwaj S, Candy S, Barron P. - Laboratory information system data demonstrate successful implementation of the prevention of mother-to-child transmission programme in South Africa. - S Afr Med J Mar;104(3 Suppl 1): Swaminathan S, Hu Z, Rupert AW, Higgins JM, Dewar RL, Stevens R, Chen Q, Rehm CA, Metcalf JA, Baseler MW, Lane HC,Imamichi T. - Plasma Interleukin-27 (IL-27) Levels Are Not Modulated in Patients with Chronic HIV-1 Infection. - PLoS One Jun 4;9(6):e doi: /journal.pone ecollection Shtarkshall RA. - An Interactive-Integrative Approach to Educational Interventions Aimed at Reducing HIV Infection. - Int J Adolesc Med Health May 18;4(3-4): doi: /IJAMH Pantano S, Tyagi M, Giacca M, Carloni P. - Molecular dynamics simulations on HIV-1 Tat. - Eur Biophys J Jul;33(4): Epub 2003 Nov Bahbouhi B, Landay A, Al-Harthi L - Dynamics of cytokine expression in HIV productively infected primary CD4+ T cells. - Blood Jun 15;103(12): Epub 2004 Feb Ferreira V, Moura P, Crovella S, Sobhie Diaz R, Castelo Filho A, Ximenes R, Arraes LC. - The Influence of HIV-1 Subtype in the Response to Therapeutic Dendritic Cell Vaccine. - Open AIDS J. 2012;6: doi: / Epub 2012 Dec Cardona-Arias JA, Higuita-Gutiérrez LF - Impact of HIV/AIDS on quality of life: meta-analysis Rev Esp Salud Publica Jan-Feb;88(1): doi: /S Kann RK, Seddon JM, Kyaw-Tanner MT, Henning J, Meers J. - Association between feline immunodeficiency virus (FIV) plasma viral RNA load, concentration of acute phase proteins and disease severity. - Vet J Feb 6. pii: S (14) doi: /j.tvjl Chandrashekar S. - Half a decade of mini-pool nucleic acid testing: Cost-effective way for improving blood safety in India. - Asian J Transfus Sci Jan;8(1):35-8. doi: / Kaur P, Khong WX, Wee SY, Tan EL, Pipper J, Koay E, Ng KY, Yap JK, Chew KK, Tan MT, Leo YS, Inoue M, Ng OT - Clinical evaluation of a low cost, in-house developed real-time RT-PCR human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) quantitation assay for HIV-1 infected patients. - PLoS One Mar 6;9(3):e doi: /journal.pone ecollection * Rotor-Gene Technology, Qiagen tescilli markasıdır. * SaCycler I, Sacace Biotechnologies tescilli markasıdır. SacaceBiotechnologiesSrl via Scalabrini, Como Italy Tel Fax mail: info@sacace.com web: Sacace HIV Real-TM Quant Dx VER