yandan üzüm, kuru üzüm ve şaraplarda OTA varlığı ülkemizin de içinde bulunduğu üzüm yetiştiriciliğinin yaygın olduğu ülkelerde önemli bir sorun

Transkript

1 1. GİRİŞ Tarımsal ürünler hasattan başlayarak işleme ve depolama aşamalarında ortam koşullarına, tarım ürününün bileşimine ve su içeriğine bağlı olarak değişik küflerle kontamine olurlar. Küflerle kontaminasyon iki açıdan önemlidir. Yakın zamana kadar tarımsal ürünlerdeki küflerin varlığı yalnızca bozulmalar, ürünün besin değerinde kayıplar, danelerin çimlenme kabiliyetindeki düşüşler ve özet olarak ekonomik açıdan önemli görülmüştür. Üzerinde küflerin geliştiği tahılların ve yağlı tohum küspelerinin hayvan yemi olarak değerlendirilmesi sakıncalı bulunmamıştır. Küflerin verdiği ekonomik zararlar, tarım ürünlerindeki kayıpları içerisinde önemli bir düzeydedir. Ancak gıda ve yemlerde gelişen küflerin gelişme sürecini tamamladıktan sonra miselleri içerisinde oluşturdukları ve birçok durumda üzerinde bulundukları ürüne (substrata) salgıladıkları toksik metabolitler, insan ve hayvan sağlığını tehdit ettiğinden, küflenme ekonomik boyutun ötesinde önem taşımaktadır. Küflerin ürettikleri bu sekonder metabolitlere mikotoksin denir. Gıda ve yemler çok çeşitli küflerin saldırısına hedef olmakla beraber, mikotoksin üreten küf sayısının bugün yaklaşık 350 civarında olduğu bilinmektedir (Tunail, 2000). Mikotoksinler, 1960 lı yıllarda aflatoksinlerin bulunmasına kadar çok fazla dikkat çekmemiştir. Önemli mikotoksinlerin çoğunu Aspergillus, Penicillium ve Fusarium cinsleri oluşturmaktadır. Fungusların sekonder metabolizmaları sonucu sentezlenen mikotoksinlerle kontamine olmuş gıda ve yemlerin tüketilmesiyle ortaya çıkan intoksikasyona mikotoksikozis denmektedir (Ünlütürk ve Turantaş, 1999). Gıda ve yemlerde en önemli kontaminantlardan biri olarak kabul edilen mikotoksinler, bugün dünyada gıda üreticisi olan bölgelerin büyük bölümünde, gıda güvenliği için önemli bir tehlike oluşturmaktadır (Akpınar, 2006). Aspergillus ve Penicillium cinsi küfler tarafından üretilen mikotoksinler içerisinde okratoksin A (OTA), nefrotoksik ve kanserojenik aktivitiye sahip olması nedeniyle büyük önem taşımaktadır. OTA nın Bulgaristan, Yunanistan ve Romanya gibi bazı Balkan ülkelerinde Balkan Endemik Nefropatisi olarak adlandırılan öldürücü böbrek hastalıklarına ve üriner bölgede çeşitli tümörlere neden olduğu bildirilmiştir. OTA özellikle tahıl ürünlerinde önemli sorun oluşturmaktadır. Diğer 1

2 yandan üzüm, kuru üzüm ve şaraplarda OTA varlığı ülkemizin de içinde bulunduğu üzüm yetiştiriciliğinin yaygın olduğu ülkelerde önemli bir sorun haline gelmiştir (Kabak ve Var, 2006b). OTA ilk kez 1965 yılında Güney Afrika lı kimyacılar tarafından tanımlanmış ve Scott tarafından sorgum tanelerinden izole edilen Aspergillus ochraceus K-804 suşundan izole edilmiştir. Günümüzde OTA, 10 dan fazla ülkede doğal bir kontaminant olarak kabul edilmektedir. OTA nın dünyanın çeşitli ülkelerinde baklagillerde, hububatlarda ve diğer bitkisel ürünlerde, hayvan yemlerinde, hayvan etlerinde ve insan dokularındaki varlığı saptanmıştır. OTA bitkisel ürünler içerisinde özellikle mısır, buğday, arpa, sorgum, yulaf, baklagiller, yer fıstığı ve karışık yemlerde bulunan en önemli mikotoksinlerden biri olarak kabul edilmektedir. Ayrıca domuz dokularında da yaygın olduğu ve OTA düzeyinin hayvansal ürünlerde hububatlardakilerden daha fazla olduğu bildirilmiştir (Karagözlü ve Karapınar, 1998). Şarapta OTA tespiti 1995 yılında yapılan bir çalışmada tespit edilmiştir (Zimmerli ve Dick, 1995). Aspergillus carbonarius un OTA ürettiği ise 1999 yılında keşfedilmiştir (Battilani ve ark., 2006). Üzümde ve şarapta OTA konsantrasyonu ülkeden ülkeye ve bölgeden bölgeye değişiklik göstermektedir. Örneğin Macaristan da yapılan araştırmalarda şarap örneklerinde OTA ya rastlanmazken (Berente ve ark., 2005; Brera ve ark., 2005), İtalya, İspanya ve Portekiz de yapılan araştırmalarda tespit edilmiştir (Serra ve ark., 2003; Brera ve ark., 2005; Ratola ve ark., 2006; Gomez ve ark., 2006). Yunanistan da yapılan çalışmada ise şarapta çok düşük miktarlarda OTA tespit edilmiştir. Kırmızı şarap örneklerinde ortalama olarak 0,09 µg/l, roze şarap örneklerinde 0,08 µg/l ve beyaz şarap örneklerinde ise 0,06 µg/l miktarında tespit edilmiştir (Stefaniki ve ark., 2003). TSE tanımına göre şarap, yalnız taze üzüm veya şırasının fermentasyonu ile elde edilen alkollü bir içkidir (Anonim, 1976). Canbaş ın (1992) tanımına göre şarap, bir kısmı veya tamamı ezilmiş taze üzümlerin veya üzüm şırasının etil alkol fermentasyonuna terk edilmesi sonucu elde edilen alkollü bir içkidir. Bağcılığın ve şarapçılığın tarihi neredeyse insanlık tarihi kadar eskidir. Bulunan tarihi kalıntılarda üzüm figürlerine ve şarap testilerine sıkça rastlanmaktadır. Günümüzde ise bağcılık ve şarapçılık gıda ürünleri ekonomisi açısından önemli bir yere gelmiştir. Dünya üzüm ekiliş alanları incelendiğinde 7,5 milyon hektarlık bir alanda 2

3 üzüm üretimi yapıldığı tespit edilmiştir. Buna karşılık elde edilen üzüm miktarı ise 65,5 milyon tondur (FAO, 2006). Üzüm ekiliş alanları ve üzüm üretim miktarı açısından Türkiye; İspanya, Fransa ve İtalya gibi şarapçılığın en önemli üreticileri konumunda olan ülkelerle birlikte ilk sıralarda yer almaktadır. Şarap üretimi incelendiğinde ise Türkiye çok altlarda yer almaktadır. Örneğin Portekiz in üzüm ekiliş alanı Türkiye den az olmasına karşılık şarap üretimi 12 katıdır. Türkiye de üretilen üzümlerin büyük kısmı sofralık kuru ve yaş üzüm olarak tüketilmektedir. Ayrıca pekmez, şıra, sucuk da önemli miktarlarda tüketilmektedir. Dünyanın bağcılık için en verimli iklim kuşağında bulunan Türkiye, çok eski ve köklü bir bağcılık kültürüne sahiptir. Vitis vinifera şaraplık üzüm çeşitlerin tümünü kapsamaktadır. Türkiye de çeşit üzüm yetiştirilmekte olduğu tahmin edilmektedir. Ancak bunların 34 çeşidi şaraplık üzümdür. Bu 34 çeşit şaraplık üzümün ise 12 si yabancı, 22 si de yerli üzümlerdir. Şarap üretiminde üzümler ya monocepage (tek üzüm çeşidinden üretilen şarap) ya da kupaj (harman) olarak kullanılmaktadır (Özay ve ark., 2005). Türkiye de şarapçılık diğer ülkelerdeki şarapçılığa benzememektedir. Diğer ülkelerde bağcılar üzüm yetiştirmenin yanı sıra şarap üretimini de gerçekleştirmektedir. Dünya şarapçılığına baktığımızda genellikle şarap üreticileri birleşerek kendi şaraphanelerini kurarak büyük kapasiteli şaraphaneler oluşturmaktadırlar. Türkiye de ise bağcı sadece üzüm üreticisidir, ürettiği üzümü kendisi işlemeyip şarap fabrikalarına satmaktadır yılı itibariyle şarap üretimi için izin almış firma sayısı 76 dır (Anonim, 2006). Ülkemiz bağcılık yapmak için son derece uygun koşullara sahiptir. Özellikle İç Anadolu yöresinde şarapta üstün nitelikler oluşturan bileşiklerin üzümde meydana gelmesi için en uygun iklim koşullarına sahiptir. Gece ve gündüz arasındaki büyük sıcaklık farklılıkları, diğer bazı iklim ve toprak özellikleri bu bölgede yetişen Kalecik Karası şaraplarına ayrı bir özellik vermiştir. Son yıllarda şarap fabrikaları tarafından alımına öncelik verilen bu çeşidin şarapları yurtiçinde ve yurt dışında şarap tadım programlarında en yüksek sıralarda yer almaktadır (Ergenekon, 2002). Bağcılık sektörü bölge düzeyinde incelendiğinde; Ege bölgesinde çekirdeksiz kuru üzüm, Marmara Bölgesinde sofralık ve şaraplık üzüm, Akdeniz Bölgesinde ilk 3

4 turfanda üzüm, Orta Anadolu ve Güneydoğu Anadolu da şaraplık, şıralık, sofralık ve çekirdekli kuru üzüm yetiştirmek için çok uygun koşullara sahip olduğu görülmektedir. İhracatta başarılı olmak için öncelikle standartlara uygun üzüm ve şarap üretmek gerekmektedir. Bugün üzüm ve şaraplardaki en önemli ihracat engeli, ürünün içerisindeki mikotoksin miktarıdır. Bu mikotoksinlerin başında aflatoksin ve okratoksin A gelmektedir. İlk olarak 1996 yılında İngiltere ye ihraç ettiğimiz kuru üzümlerde yüksek oranda OTA tespit edilmiş ve ürünler geri gönderilmiştir (Kabak ve Var, 2006b). Bağcılık ve şarapçılık Türkiye için de önemli bir tarım ve gıda sektörü dalıdır. Bu üretim dallarının uluslararası rekabet edebilir seviyeye getirilmesi için kaliteli ve AB standartlarına uygun üretim yapabilmesi gerekmektedir. Son yıllarda ortaya çıkan en önemli konu şarapta OTA varlığıdır. Bu araştırmanın amacı Trakya Bölgesinde üretilen sofralık şaraplarda okratoksin A varlığının tespiti ve bazı kalite özelliklerinin belirlenmesidir. Bu amaç doğrultusunda çalışmada, bölgede üretim yapan firmalardan toplanmış 45 şarap örneği üzerinde analizler yapılmıştır. 4

5 2. LİTERATÜR 2.1. Okratoksin A nın Yapısı ve Özellikleri Gıdalar içerdikleri proteinler, karbonhidratlar, yağlar, mineral maddeler, vitaminler ve su nedeniyle mikroorganizmalar için mükemmel bir gelişme ortamı oluştururlar. Hammaddelerin temini ve taşınması, ürünün hasadı aşamasından itibaren son ürünün üretimine kadar değişik işlem basamaklarında gıdaya değişik kaynaklardan, çeşitli mikroorganizmalar bulaşabilmekte ve bu mikroorganizmalar uygun koşullarda hızla gelişerek yüksek sayılara ulaşabilmektedir. Okratoksinler, özellikle Aspergillus ochraceus suşları başta olmak üzere Aspergillus cinsine ait küflerin değişik tür ve suşları tarafından üretilen toksik metabolitlerdir ve bunlar içinde en toksik olan okratoksin A (OTA) dır. Okratoksin üreten türlere; A.ochraceus, A.alliaceus, A.melleus ve A.ostianus örnek olarak verilebilir. Okratoksinler genel olarak Aspergillus türleri tarafından üretilmekle birlikte P.cyclopium, P.crysogenum, P.viridicatum ve diğer bazı Penicillium türlerinin de bu toksini ürettiği bildirilmiştir (Ünlütürk ve Turantaş, 1999). Okratoksinlerin 10 u aşkın türevi vardır. Teknolojik olarak en önemlileri okratoksin A (OTA), okratoksin B (OTB) ve okratoksin C (OTC) dir. Bunlardan en toksik olanı ise OTA dır. Okratoksin A; nefrotoksik, immunosupresif, teratojenik, genotoksik ve karsinojenik özelliktedir (Cabanes ve ark., 2002; Serra ve ark., 2003; Battilani ve ark., 2006). Okratoksinlerin hedef organı böbreklerdir ve daha sonra karaciğerde kansere sebep olmaktadır. Organizmanın protein sentezini, mitokondriyal transport sistemini ve glukoneojenezi inhibe ederek kanın pıhtılaşma mekanizmasını bozmaktadır. Teratojenik etkinlikte olan OTA, bağışıklık sistemini de baskılayarak sekonder enfeksiyon (E.coli) olasılığının artışına neden olmaktadır. Ayrıca vücutta yağ peroksidasyonunu artırmaktadır. OTA nın Bulgaristan, Romanya, Yugoslavya ve Tuna nehri kıyısı kırsal kesimlerinde görülen nefropati (kronik böbrek hastalığı) ile ilişkisi konusunda kuvvetli bulgular bulunmaktadır (Betina, 1989; Bach, 1991; Krogh ve ark., 1977). 5

6 Okratoksin A; suda çözünen, renksiz bir bileşiktir. UV ışınları altında mavi renkte floresan verir. Kimyasal yapısında fenilalanin, Cl ve OH içeren dihidroizokumarin bulunur. Okratoksin A nın Cl içermeyen derivatı okratoksin B, etilester derivatı ise okratoksin C dir. Bu iki derivat gıdalarda görülseler de düşük konsantrasyonda bulunduklarından fazla önem taşımazlar. Şekil 2.1 de OTA nın yapısı görülmektedir (Tunail, 2000). Şekil 2.1. Okratoksin A nın Yapısı A.oachraceus un optimum gelişme sıcaklığı 28 o C dir. OTA oluşturabilmek için de o C sıcaklığa gereksinim gösterir. Maksimum düzeyde toksini 30 o C de %95 bağıl nemde üretir. Sıcaklık derecesi azalırsa daha yüksek bağıl nem ihtiyacı doğar. Penicillium türleri ise düşük sıcaklıklarda toksin oluşturabilirler. P.verrucosum 5-10 o C sıcaklıkta okratoksin üretebilmektedir (Tunail, 2000). Okratoksin A nefrotoksik ve kanserojenik aktiviteye sahip olması nedeniyle büyük önem taşımaktadır. Üzümler hasat öncesi, hasat sırasında veya üzümlerin işlenmesi aşamasında çeşitli küf türleri tarafından kontamine olabilmektedir. Türkiye nin dünyanın önde gelen bağcı ülkeler arasında yer alması, yaş üzüm üretiminde dünya beşincisi ve kuru üzüm üretiminde ise dünya birincisi olması nedeniyle bu konu ülkemiz açısından büyük önem taşımaktadır (Kabak ve Var, 2006a). 6

7 Ülkemizde üzüm ve üzüm ürünlerinde OTA varlığı ile ilgili olarak sorunlar ilk olarak yılları arasında İngiltere ye ihraç edilen kuru üzümlerde yüksek düzeyde OTA tespit edilmesiyle yaşanmıştır. Kuru üzümlerde OTA nın hangi aşamada meydana geldiğini tespit etmek amacıyla yapılan çalışmada Ege bölgesinden toplanan 52 yaş üzüm örneğinin 37 sinde OTA ya rastlanmazken, 15 örnekte 0,24-1,5 µg/kg arasında değişen miktarlarda OTA bulunduğu bildirilmiştir (Kabak ve Var, 2006b). Şarap üretiminde küflenmiş üzümlerin kullanılması, küf ile kontamine olmuş ekipmanların şarapla temas etmesi veya iyi üretim tekniklerine uyulmaması şaraplarda OTA kontaminasyonu riskini arttırmaktadır. OTA nın üzüm veya şaraplarda bulunması ile ilgili olarak elde edilen verilerin genelde Almanya, Fransa, İskandinav ve Balkan Ülkeleri kaynaklı olmasıyla birlikte, Kodeks Alimentarius Komisyonu şarabın tahıllardan sonra OTA açısından en riskli gıda kaynağı olduğunu ve gıda yoluyla alınan OTA nın %15 inin şarap tüketiminden kaynaklandığını bildirmiştir. Üzümlerde ve dolayısıyla şaraplarda OTA varlığı ve miktarı sıcaklık, yağmur ve nispi nem gibi iklim faktörlerine, üzümün olgunluğuna ve kalitesine, üzüm tırtıllarının varlığına, şarabın üretildiği bölgeye, şarabın rengine, şarap yapım tekniği ve depolama koşullarına göre değişiklik gösterebilmektedir (Kabak ve Var, 2006a). Okratoksin A nın rastlandığı ürünler başta arpa olmak üzere, tahıllar, yer fıstığı, baklagiller, kahve, baharat gibi gıda maddelerinin (Petzinger ve Weidenbach, 2002; Cabanes ve ark., 2002; Serra ve ark., 2003) yanı sıra ülkemizin en önemli ihraç ürünlerinden biri olan kuru üzüm de riskli ürünler arasında sayılmaktadır. Türkiye de yapılan çalışmalarda, kuru incir ve baharat olarak kullanılan kırmızı biberlerde de okratoksin A ya sıklıkla rastlanmıştır (Akpınar, 2006). Okratoksin A'nın toksik etkileri üzerinde çalışmalar yaygın olarak çeşitli deney hayvanları üzerinde gerçekleştirilmektedir. Üzerinde çalışılan bütün hayvanlar ağızdan okratoksin A alınmasına farklı derecede duyarlılık göstermiştir. Yüksek seviyede okratoksin A alınmasıyla böbreklerde, diğer organlarda ve dokularda değişiklikler gözlenmiştir, fakat bu toksine çevrede bulunduğu derecede maruz kalınması sadece böbrek dokularında bozukluklara neden olmuştur (Anonim, 1979). Bir kilogram yemde 200 µg kadar seviyede bulunması sıçanlarda ve domuzlarda böbrek sisteminde değişikliklere neden olabilmektedir. Bilimsel açıdan okratoksin A nın nefropatiye neden olduğu ve genellikle bu duruma kümes hayvanlarında ve 7

8 domuzlarda rastlandığı tespit edilmiştir. Okratoksin A farelerde, sıçanlarda ve hamsterlarda teratojeniktirler (Anonim, 1979). Okratoksin B nadir olarak doğal kontaminant olarak bulunur ve daha az toksiktir. Diğer okratoksinler hiçbir zaman doğal ürünlerde bulunmaz (Anonim, 1979). Okratoksin A'nın bir kilogram yemde 200 µg alınmasının domuzlarda ve sıçanlarda nefropatiye neden olmasıyla okratoksin A'nın potansiyel bir nefrotoksik olduğu bütün deneysel çalışmalar ile kanıtlanmıştır. Daha düşük seviyedeki alımlar için test yapılmamıştır. Bilimsel açıdan okratoksin A'nın çiftlik hayvanlarında nefropatiye neden olduğu uzun süredir bilinmektedir. Bu toksin birçok gıda maddesinde bulunmaktadır, yem olarak kullanılan ham maddelerde 27 mg/kg seviyesine kadar, insanlar tarafından tüketilecek gıdalarda ise 100 µg/kg seviyesine kadar bulunabilir. Ev yapımı gıdalarda okratoksin A kontaminasyonu kontrollü bir yerde üretilen gıdalardan daha fazladır (Anonim, 1979) Okratoksin A İle İlgili Gıda Mevzuatındaki Düzenlemeler Türkiye de 1997 yılında yürürlüğe giren Türk Gıda Kodeksinde gıdalarda bulunabilecek maksimum mikotoksin seviyeleri belirtilmiştir yılında yayınlanan Gıda Maddelerinde Belirli Bulaşanların Maksimum Seviyelerinin Belirlenmesi Hakkında Tebliğ (Anonim, 2002) ile gıda maddelerinde bulunabilecek maksimum okratoksin A miktarları da belirlenmiştir (Çizelge 2.1). 8

9 Çizelge 2.1. Gıda Maddelerindeki Maksimum Mikotoksin Seviyeleri (Anonim, 2002) Maksimum Seviye (ppb) Gıda Maddesi Aflatoksin Okratoksin A Patulin B 1 B 1 +B 2 +G 1 +G 2 M 1 Fındık, yer fıstığı ve diğer yağlı kuru meyveler,yağlı tohumlar, incir üzüm ve kurutulmuş meyveler ve bunlardan üretilen 5 10 işlenmiş gıdalar Tahıllar (karabuğday-fagopyrum sp.dahil) ve tahıl ürünleri 2 4 Süt 0.05 Süt tozu 0.5 Peynir 0.25 Bebek mamaları ve devam formülleri (süt bazlı) 0.05 Bebek mamaları ve bebek gıdaları 1 2 Baharat 5 10 Diğer gıda maddeleri * 5 10 İşlenmemiş tahıl taneleri (çeltik ve karabuğday dahil) 5 Tahıllardan elde edilen bütün ürünler (tahıl bazlı işlenmiş ürünler ve doğrudan insan 3 tüketimine sunulan tahıl taneleri) Kuru üzüm 10 Elma suyu ve elma suyu içeren içecekler ve sirkeler ** 50 * Bulunması muhtemel riskli gıdalar ** Konsantre ürünlerde tarifine uygun hazırlama soncundaki üründe bakılır. Okratoksin A ile ilgili yasal düzenlemelerde de, aflatoksinlerde olduğu gibi, AB mevzuatında bir çok gıda grubu ile ilgili hükümler yer almaktadır. Türkiye gıda mevzuatında sadece tahıl ve tahıl ürünleri ile kuru üzümde bulunabilecek en yüksek OTA miktarları bulunmaktadır. Mevcut olan düzenlemede AB mevzuatı ile tam bir uyum söz konusudur. AB ve Türkiye gıda mevzuatlarında; işlenmemiş tahıllar, tahıl ürünleri ve kuru üzümde bulunabilecek en yüksek OTA miktarları sırasıyla, 5, 3 ve 10 μg/kg olarak kabul edilmiştir. Çizelge 2.2 de görüldüğü üzere çözünebilir (instant) kahve, kavrulmuş kahve, üzüm ve incir haricinde kurutulmuş meyveler, kuru incir, bebek ve küçük çocukların beslenmesinde kullanılacak tahıl esaslı ek gıda, bebekler ve özel tıbbi maksatlar için dietetik gıdalarda bulunabilecek en yüksek OTA miktarları AB 9

10 mevzuatında sırasıyla 6, 3, 2, 8 ve 0,5 μg/kg olarak belirlenmişken, ülkemiz gıda mevzuatında bu hususta bir düzenleme bulunmamaktadır (Arıcı, 2005). Çizelge 2.2. AB ve ülkemizde yürürlükte olan okratoksin A ile ilgili yasal düzenlemelerde gıdalarda izin verilen en yüksek okratoksin A miktarları (Arıcı, 2005). Ürün İşlenmemiş tahıl daneleri (işlenmemiş pirinç ve işlenmemiş kara buğday dahil) Bütün tahıl ürünleri (işlenmiş tahıl ürünleri ve direkt tüketime sunulan tahıl daneleri dahil) Okratoksin A için en yüksek değer (µg/kg) AB TR Kuru üzüm Çözünebilir (instant) kahve 6 -* Kavrulmuş kahve 3 - Üzüm ve incir haricinde kurutulmuş meyveler 2 - Kuru incir 8 - Bebek ve küçük çocukların beslenmesinde kullanılacak tahıl esaslı ek gıda (En yüksek değer kuru maddeye göre hesaplanır) Bebekler ve özel tıbbi maksatlar için dietetik gıdalar (Süt ve ürünlerinde en yüksek değer olarak tüketilen ürün, diğer gıdalar için kuru madde dikkate alınır) * Düzenleme yok. 0,5-0, Okratoksin A İle İlgili Yapılan Araştırmalar Gümüş ve ark. (2003) tarafından yapılan araştırmada; bira fermentasyonu süresince farklı konsantrasyonlardaki OTA miktarında meydana gelen değişiklikler Elisa metodu kullanılarak tespit edilmiştir. Buna göre yaklaşık 10 ppb OTA ilave edilen örnekte (A) fermentasyon sonunda (10. gün) OTA seviyesinde %24,97 oranında azalma tespit edilirken, yaklaşık 20 ppb OTA ilave edilen örneğin (B) OTA seviyesinde %18,74 oranında bir azalma olduğu belirlenmiştir. Yaklaşık 30 ppb OTA ilave edilen örnekte (C) ise daha düşük düzeyde bir azalma (%8,9) olduğu tespit edilmiştir. Fermentasyon boyunca OTA konsantrasyonu arttıkça, OTA'daki azalma oranı düşmüştür. Fermentasyon boyunca OTA konsantrasyonu maya gelişimini etkilemiş, 10

11 OTA ihtiva eden örneklerde maya gelişimi daha yavaş olmuştur. Yüksek konsantrasyonlarda OTA ihtiva eden mayşede tespit edilen maya sayısı, kontrol ve düşük OTA konsantrasyonlu mayşedeki maya sayısına göre daha düşük bulunmuştur. Fermentasyon boyunca ph değerinde OTA yüksek olan örneklerde, düşük olanlara göre daha yavaş düşüş gözlenmiştir. Örneklerde OTA konsantrasyonu arttıkça oluşan alkol oranı düşmüştür. Fermentasyon başlangıcında tüm örneklerde toplam şeker oranı %6,62 iken OTA konsantrasyonu arttıkça % şeker miktarı daha yüksek tespit edilmiştir. Karagözlü ve Karapınar (2000) tarafından yapılan araştırmada; aşurelik buğday, mısır, mısır unu, yulaf gevreği, yulaf ezmesi, yulaf unu ve müsliden oluşan toplam 100 adet gıda örneğinde okratoksin A taraması yapılmış ve örneklerin fungal yükleri saptanmıştır. Analiz edilen 100 örnekten 1 adet aşurelik buğday, 2 adet mısır ve 1 adet yulaf ezmesi olmak üzere toplam 4 örnekte 0,27-9,84 ppb düzeyleri arasında değişen okratoksin A varlığı saptanmıştır. OTA varlığı saptanan örneklerdeki küf sayıları ise <10-2,6x10 4 /g arasında değişmektedir. Lo Curto ve ark. (2004) farklı pestisit uygulanmış üzümlerden elde edilmiş 23 kırmızı ve beyaz şarap örnekleri üzerinde okratoksin A taraması çalışması yapmışlardır. Araştırmadaki şaraplar İtalya nın üç farklı bölgesinden temin edilmiştir. Tarama sonucunda şarap örneklerinde okratoksin A tespit edilmiş olup özellikle kırmızı şaraplarda beyaz şaraplardakine göre daha yüksek oranda rastlandığı kaydedilmiştir. Sentetik pestisitlerle muamele edilmiş üzümlerde OTA konsantrasyonunun düştüğü tespit edilmiştir. Azoxystrobin ile muamele edilmiş örneklerde OTA konsantrasyonunun %96,5 oranında düştüğü, dinocap ve penconazole ile muamele edilmiş örneklerde OTA konsantrasyonunun %88 oranında düştüğü tespit edilmiştir. Serra ve ark. (2003) tarafından yapılan araştırmada Portekiz şaraplık üzümlerinde okratoksin A taraması yapılmıştır. Ülkenin farklı iklim şartlarındaki 4 bölgesinde 11 bağ üzerinde araştırma yapılmıştır. Hasat döneminde bağlardan 1650 üzüm örneği alınmıştır. Bunlardan 370 tanesinin Aspergillus türleri ile 301 tanesinin Penicillium türleri ile enfekte olduğu tespit edilmiştir. Aspergillus türleri izole edilen örneklerin %14 ü okratoksin A üretmiştir. Penicillium izole edilen örneklerde OTA ya rastlanmamıştır. Araştırma sonucunda A. carbonarius ve A. niger küflerinin şaraplık üzümlerde OTA oluşumuna neden olan en önemli etken olduğu tespit edilmiştir. Cabanes ve ark. (2002) tarafından yapılan çalışmada da şaraptaki okratoksin A kaynağı 11

12 araştırılmış ve A.carbonarius un şarapta OTA kontaminasyonuna neden olduğu saptanmıştır. Petzinger ve Weidenbach (2002) gıda zinciri içerisinde yer alan mikotoksinlerden okratoksin A nın rolünü incelemişlerdir. Son yıllarda Avrupa ülkelerinde en sık rastlanan mikotoksinin kansorejen yapıdaki OTA olduğu bildirilmiştir. Birçok gıda maddesinde bulunan OTA nın insanlarda ve hayvanlarda bağışıklık sistemine etki ettiği tespit edilmiştir. Avrupadan toplanan 6476 gıda maddesinin %57 sinde OTA kontaminasyonu olduğu tespit edilmiştir. Özellikle tahıl ürünlerinde 3 ppm seviyesini geçen ürünlerin oranı %1,4 olarak tespit edilmiştir. Aynı şekilde et ürünlerinde, kahvede, birada da yüksek oranlarda OTA ya rastlandığı tespit edilmiştir. Siyah çayda OTA ya rastlanmamasına karşılık bitkisel çayların %42 sinde 10 µg/kg ye varan oranlarda tespit edilmiştir. Esteban ve ark. (2006) su aktivitesi ve sıcaklığın okratoksin A üreten Aspergillus carbonarius üzerine etkilerini araştırmışlardır. İki farklı kültür ortamında (Czapek Yeast Autolysate (CYA) agar ve Yeast Extract Sucrose (YES agar) 6 farklı Aspergillus carbonarius türü tarafından farklı sıcaklıklarda (15 o C-30 o C) ve su aktivitesinde (0,78-0,99) 30 günlük periyotta OTA üretilmiştir. CYA nın YES e göre daha iyi bir kültür ortamı olduğu izolasyon testinde tespit edilmiştir. OTA konsantrasyonunun 15 o C de 30 o C ye göre daha yüksek olduğu tespit edilmiştir. OTA türlere bağlı olarak 0,86, 0,90 ve 0,94 su aktivitesi seviyelerinde oluşmuştur. 15 o C de sadece 0,94-0,99 aralığında OTA üremesi meydana gelmiştir. Gomez ve ark. (2006) İspanya da likör şarap üretiminde kullanılan üzümlerde okratoksin A üreten küfler üzerine araştırma yapmışlardır. Örnekler her bir bağdan üç farklı gelişme döneminde toplanmıştır. Bunlar ben düşme dönemi, hasat zamanı ve olgunlaşma sonrası dönemidir. İspanya nın farklı üretim bölgelerinden toplam 4 bağdan örnekler alınmıştır. Her bir bağda 10 ayrı bitkiden toplam 10 salkım alınmıştır. Üzümlerin olgunluk döneminde Aspergillus spp. sayısının arttığı kaydedilmiştir. Farklı Aspergillus spp. arasında en baskını siyah Aspergillus türleri (özellikle A. niger ve A. carbonarius) olduğu belirlenmiştir. Ratola ve ark. (2006) dünya boyutunda farklı şarap örneklerinde laboratuarlar arası OTA taraması yapmışlardır. Araştırmaya beş kıta üzerinde 17 ülkeden toplam 24 laboratuar katılmıştır. Araştırmada Portekiz de farklı koşullarda üretilmiş iki adet beyaz 12

13 (beyaz şarap ve beyaz likör şarabı) ve bir adet kırmızı şarap örneğinin OTA taraması sonuçları karşılaştırılmıştır. Kırmızı şarapta ortalama olarak 2,73±0,96 µg/l, beyaz şarapta ortalama olarak 1,96±0,53 µg/l, likör şarapta ise ortalama olarak 1,59±0,59 µg/l OTA tespit edilmiştir. Chulze ve ark. (2006) Güney Amerika da Arjantin ve Brezilya da şaraplık üzüm, üzüm suyu ve kurutulmuş üzüm üzerinde okratoksin A varlığı konusunda çalışma yapmışlardır. Arjantin de Aspergillus carbonarius dominant OTA üreten küf olarak tespit edilmiştir. Brezilya da ise A. niger, Aspergillus ochraceus ve Aspergillus carbonarius olarak tespit edilmiştir. Üzüm suyu ve şaraplarda yapılan OTA analizlerinde çok düşük değerler saptanmıştır. Genel olarak sofralık kırmızı şarap örneklerinde OTA değerleri beyaz ve roze şarap örneklerine göre daha yüksek oranda tespit edilmiştir. Battilani ve ark. (2006) üzüm ve şaraplarda okratoksin A üzerine Avrupa düzeyinde araştırma yapmışlardır. Avrupa da ilk OTA kontaminasyonu 1996 yılında tespit edilmiştir. Aspergillus carbonarius un OTA ürettiği ise 1999 yılında keşfedilmiştir. Daha sonra Avrupa boyutunda üzüm ve şaraplarda yapılan araştırmalarda Aspergillus carbonarius un OTA üretiminde hakim olan küf olduğu tespit edilmiştir. Şarap örneklerinde yapılan analizlerde OTA konsantrasyonunun kırmızı şaraplarda en yüksek, roze şaraplarda daha az ve beyaz şaraplarda ise en az seviyede tespit edildiği belirtilmiştir. Varga ve Kozakiewicz (2006) üzüm ve üzümden elde edilen ürünler üzerinde okratoksin A ile ilgili bilgilerin verildiği çalışmada, ilk olarak OTA nın nasıl tespit edildiği, moleküler yapısı, Avrupa da analiz edilen üzüm ve üzüm ürünleri örneklerindeki OTA konsantrasyonları rakamı ve bununla ilgili AB düzenlemeleri ve son olarak da OTA tarama yöntemleri açıklanmıştır. Berente ve ark. (2005) Macar şarapları üzerinde okratoksin A üzerine araştırma yapmışlardır. Çalışmada Macaristan ın 12 farklı bölgesinden toplam 87 şıra ve şarap örneği analize dahil edilmiştir. Araştırma sonuçlarına göre Macaristan daki şıra ve şarap örneklerinde OTA tespit edilememiştir. Brera ve ark. (2005) tarafından yapılan çalışmada da Macar şaraplarında OTA tespit edilememiştir. Brera ve ark. (2005) İtalya ve Macaristan şarapları üzerinde okratoksin A taraması yapmışlardır. Toplam 267 örnek üzerinde çalıştıkları araştırmada şarapların 19 13

14 adedi tatlı, 186 adedi kırmızı, 11 adedi roze ve 51 adedi beyaz şaraplardan seçilmiştir. OTA taraması IAC temizleme prosedürü ve HPLC-FL yöntemiyle gerçekleştirilmiştir. Macar şaraplarında mikotoksin kontaminasyonuna rastlanmamıştır. İtalyan kırmızı şaraplarının %84 ünde, tatlı şarapların %63 ünde, roze şarapların %56 sında ve beyaz şarapların %19 unda OTA kontaminasyonu tespit edilmiştir. Kırmızı şaraplarda OTA konsantrasyonu 4 g/l ye kadar tespit edilmiştir. Stefaniki ve ark. (2003) Yunanistan da benzer bir çalışma yaparak 286 adet şarap ve 81 adet kuru üzümde okratoksin A taraması yapmışlardır. Diğer araştırmaların aksine Yunanistan da yürütülen bu araştırmada kırmızı, beyaz ve roze şaraplar arasında OTA konsantrasyonu açısından anlamlı bir fark tespit edilememiştir. OTA konsantrasyonu; 104 kırmızı şarap örneği ortalaması 0,09 g/l, 118 beyaz şarap örneği ortalaması 0,06 g/l ve 20 roze şarap örneği ortalaması 0,08 g/l olarak saptanmıştır. Kurutulmuş kuru üzümde ise 1,3 g/kg olarak saptanmıştır. 14

15 3. MATERYAL ve METOD 3.1. Materyal Araştırma materyalini çeşitli firmalara ait 45 adet farklı şarap çeşidi oluşturmuştur. Bu şaraplar 13 farklı firmadan temin edilmiştir. Çizelge 3.1 de üzüm çeşitlerine göre şarapların çeşitleri ve üretim tarihleri verilmiştir. Kırmızı şaraplardan 17 adedi monosepaj, kalan 17 adedi de kupajdır. Kupaj kırmızı şarapların bazılarında çeşit sayısı dörde kadar yükselmektedir. Beyaz şarapların ise 6 adedi monosepaj, 5 adedi kupajdır. Şaraplık üzümler Trakya Bölgesinde üretilmiştir. Çizelge 3.1. Örnek Kapsamına Alınan Şaraplar, Üretildikleri Üzüm Çeşitleri ve Üretim Tarihleri No Üzüm Çeşidi Şarap Çeşidi Yıl 1 Cabernet Sauvignon Kırmızı Merlot Kırmızı Kalecik karası/shiraz Kırmızı Papaz karası/cinsault/karasakız Kırmızı Cinsault Kırmızı Papaz karası/cinsault Kırmızı Papaz karası Kırmızı Gamay Kırmızı Papaz karası/gamay Kırmızı Cinsault/Çalkarası/Karasakız Kırmızı Kalecik karası/merlot/shiraz/kuntra Kırmızı Kalecik karası Kırmızı Cabernet Sauvignon Kırmızı Merlot Kırmızı Shiraz Kırmızı Shiraz Kırmızı

16 No Üzüm Çeşidi Şarap Çeşidi Yıl 17 Cinsault/Cabernet Sauvignon/Gamay Kırmızı Kırmızı şaraplık üzüm (Karışım) Kırmızı Gamay/Karasakız Kırmızı Gamay/Cinsault/Karasakız Kırmızı Gamay/Cinsault Kırmızı Gamay/Cinsault Kırmızı Cabernet Sauvignon/Cinsault Kırmızı Carignan/Karasakız Kırmızı Kalecik karası Kırmızı Gamay Kırmızı Merlot/Gamay/Cinsault Kırmızı Öküzgözü/Gamay/Cinsault Kırmızı Adakarası Kırmızı Merlot Kırmızı Cinsault Kırmızı Cabernet Sauvignon (Organik) Kırmızı Çalkarası Kırmızı Cabernet Sauvignon/Bogazkere/Syrah Kırmızı Semillon/Sauvignon Blanc Beyaz Sauvignon Blanc Beyaz Semillon Blanc Beyaz Emir/Semillon Beyaz Emir/Semillon Beyaz Sauvignon blanc/semillon Beyaz Semillon/Narince Beyaz Reisling Beyaz Sauvignon Blanc Beyaz Semillion Beyaz Narince Beyaz

17 3.2. Metot Fiziksel ve Kimyasal Analizler ph Değerinin Ölçümü Örnekler 20 o C de WTW marka 330 model ph metre ile ölçülmüştür. Elektrod deney numunesinin içine batırılıp, ph metrenin sıcaklık ayarlama sistemi ölçme sıcaklığına göre ayarlanmıştır Kullanılan ph metreye uygun olarak tayin işlemi yapılmıştır. Değişmez bir değere ulaşınca ph değeri 0,05 yaklaşımla alet üzerindeki kadrandan doğrudan doğruya okunmuştur (Anonim, 1988) Asit Tayini 25 ml şarap bir beherde kaynamaya başlayıncaya kadar ısıtılıp içindeki CO 2 uçurulduktan sonra, turnusol kağıdı veya bromtimol mavisi belirteç çözeltisi kullanılarak N/10 luk NaOH ile titre edilmiştir (Anonim, 1988). Harcanan alkali miktarına göre asit miktarı, tartarik asit olarak litrede g ve aynı zamanda miliekivalent olarak verilmiştir (Miliekivalent 1 litre şarabı nötr hale getirecek N/1 alkali miktarıdır) Alkol Miktarının Belirlenmesi Alkol miktarının tespiti Ebülyometre metoduyla Tekirdağ Bağcılık Araştırma Enstitüsü nde yapılmıştır. Önce aletin kazan kısmına 15 ml su konulmuştur. Termometresi takılarak ocağı yakılmıştır. Su kaynayınca termometre okunmuştur. Sonra aletteki su boşaltılmış, kazan birkaç defa alkol tayini yapılacak şarapla çalkalandıktan sonra içine 50 ml şarap pipetlenmiştir. Daha sonra aletin soğutucusuna su doldurulmuştur. Şarap kaynadığında sıcaklık derecesi sıfıra ayarlandıktan sonra şarabın kaynama derecesinin karşılığı olan % hacim alkol miktarı bulunmuştur (Anonim, 1988). 17

18 Kükürtdioksit SO 2 Tayini Kükürtdioksit tayinininde aşağıdaki çözeltiler kullanılmıştır; - İyot (I), N/64 - Sodyum hidroksit çözeltisi (NaOH), %4 - Sülfürik asit çözeltisi (H 2 SO 4 ), %25 (180 ml derişik H 2 SO ml damıtık su) - Nişasta çözeltisi, %1 Genel Kükürtdioksit (SO 2 ) Tayini: Bir erlene 25 ml %4 lük NaOH konulmuş üzerine pipetin ucu alkaliye değecek şekilde tutularak 50 ml deney numunesi eklenmiş ve 15 dakika bekletilmiştir. 10 ml %25 lik sülfürik asit ve 2-3 ml nişasta eriyiği eklenerek meydana gelen mavi renk ancak 3-4 kez çalkalandıktan sonra kaybolmayıncaya kadar iyotla titre edilmiştir. Harcanan iyot miktarı (A) kaydedilerek aşağıdaki hesaplamaya göre genel SO 2 miktarı bulunmuştur (Anonim, 1988). Genel Kükürtdioksit (SO 2 ) Miktarı mg/l = A x 10 A = Titrasyonda harcanan iyot (I) çözeltisi miktarı, ml Serbest Kükürtdioksit (SO 2 ) Tayini: 200 ml lik bir erlene 50 ml deney numunesi pipetin ucu erlenmayerin dibine değdirilerek aktarılmıştır. Üzerine 2-3 ml %1 lik nişasta çözeltisi ve 5 ml %25 lik sülfürik asit çözeltisi konularak N/64 lük iyot çözeltisi ile titre edilmiştir. Harcanan iyot miktarı (B) kaydedilmiş ve aşağıdaki hesaplama yöntemiyle serbest SO 2 miktarı bulunmuştur. 18

19 Serbest Kükürtdioksit (SO 2 ) Miktarı mg/l = B x 10 B = Titrasyonda harcanan iyot (I) çözeltisi miktarı, ml Bağlı Kükürtdioksit (SO 2 ) Miktarı Tayini: Genel kükürtdioksit miktarından serbest kükürtdioksit miktarının çıkarılmasıyla bulunmuştur Şarapta Okratoksin A (OTA) Analizi (Elisa Metodu) Şarap içindeki CO 2 'i uzaklaştırmak için filtre kağıdından 5 ml örnek bir erlen içine alınarak, 12,5 ml %70'lik methanol (methanol:su) ile 3 dakika çalkalandıktan sonra Whatman No:1 filtre kağıdından süzülmüştür. Filtrasyondan 1 ml alınıp 1 ml distile su ile sulandırılmış ve 50 µl alınarak test işlemlerine geçilmiştir. Standartlar önce 0 µg/kg (ppb), 5 µg/kg, 10 µg/kg, 20 µg/kg, 40 µg/kg olarak içerisine OTA antibody bulunan mikrotiter platedeki çukurcuklara aktarılmış ve daha sonra ekstraktlardan 50 µl sonraki çukurcuklara konulmuştur. Üzerine 50 µl enzim konjuge ve 50 µl okratoksin A antibody konularak 10 dakika oda sıcaklığında bekletilmiş daha sonra 3 defa saf su ile yıkanmıştır. Üzerine 100 µl substrat/kromogen ilave edilmiş, 5 dakika oda sıcaklığında bekletildikten sonra 100 µl durdurma solusyonu ilave edilmiş ve 10 dakika içinde "ELx800 Serisi Microplate Reader" da 450 nm'de absorbans değerleri okunmuştur. Sonuçlar bilgisayar ortamında özel programla (Ridawin) hesaplanmıştır (Anonim,1999) Mikrobiyolojik Analizler Laktik Asit Bakterileri Şarap örneklerinden uygun dilisyonlar hazırlanarak MRS Agar üzerine yüzeye sürme ekim yapılmıştır. Ekim sonunda 32 o C de 48 saat inkübasyona bırakılmış ve inkübasyon sonucunda gelişen koloniler sayılmıştır (Baumgart, 1993). 19

20 Maya ve Küf Sayısının Belirlenmesi Maya ve küf sayımı için ph sı %10 luk tartarik asit ile 3,5 a ayarlanmış Potato Dextrose Agar (PDA) üzerine yüzeye sürme ekim yapılmıştır. Ekim sonunda 25 o C de 5 gün inkübasyona bırakılmış ve inkübasyon sonucunda gelişen koloniler sayılmıştır (Baumgart, 1993) İstatistiki Analizler Kırmızı ve beyaz şarap örneklerinin tespit edilen OTA miktarları, ph değerleri, asitlik değerleri, genel, serbest, bağlı kükürt dioksit değerleri arasında fark olup olmadığı bağımsız örnekler için iki populasyonun aritmetik ortalamaları arasındaki farkın tahmini yöntemiyle analiz edilmiştir (Newbold, 2000); 2 σ σ y ( x y) ± z (1) n 2 x α / 2 + nx y Formülde (1) x ve y farklı populasyonların aritmetik ortalamalarını, zα / 2 güven aralığını σ 2 varyansı, n ise örnek hacmini belirtmektedir. Tüm şarap örneklerinin etiketinde belirtilen alkol dereceleriyle analiz edilen alkol dereceleri arasında fark olup olmadığı karşılıklı çiftler t testiyle belirlenmiştir. Sd ± tα / (2) n d 2 Formülde (2) d çiftler arasındaki farkların aritmetik ortalamasını, tα / 2 güven aralığını (n-1 serbestlik derecesinde), Sd çiftler arasındaki farkların standart sapmasını ve n çift sayısını belirtmektedir. 20

21 4. ARAŞTIRMA SONUÇLARI ve TARTIŞMA 4.1. Şarap Örneklerinde Okratoksin A Kırmızı şarap örneklerinin %21,9 unda OTA miktarı tespit edilebilirlik seviyesinin altında bulunmuştur. Kırmızı şarapta tespit edilen en düşük OTA miktarı 0,12 ppb, en yüksek değer ise 1,2 pbb olup ortalama 0,67 pbb olarak bulunmuştur. Çizelge 4.1 ve 4.2 de görüldüğü üzere OTA tespit edilen örnekler Türk Gıda Kodeksinde işlenmiş ürünler için belirtilen 3 ppb maksimum değerin altında tespit edilmiştir. Beyaz şarap örneklerinin %36,4 ünde OTA miktarı tespit edilebilirlik seviyesinin altında bulunmuştur. Beyaz şarapta tespit edilen en düşük OTA miktarı 0,20 ppb, en yüksek değer ise 1,02 pbb olup ortalama 0,56 pbb olarak hesaplanmıştır. Kırmızı ve beyaz şaraplar arasında tespit edilen OTA miktarları açısından fark olup olmadığı iki populasyonun aritmetik ortalamaları arasındaki farkın tahmini yöntemiyle analiz edilmiş ve aralarında anlamlı bir fark bulunamamıştır. Avrupa da yapılan araştırmalarda elde edilen sonuçlarda olduğu gibi (Stefaniki ve ark., 2003; Brera ve ark., 2005; Battilani ve ark. 2006; Varga ve Kozakiewicz, 2006) kırmızı şarap örneklerinde beyaz şarap örneklerine göre daha yüksek OTA konsantrasyonu bulunmuştur. Yunanistan da yapılan çalışmada Stefaniki ve ark. (2003) tarafından elde edilen sonuçlarda kırmızı şaraplarda ortalama 0,09 ppb, beyaz şaraplarda ise 0,06 ppb OTA tespit edilmiş olup, yapılan araştırma sonuçlarından düşüktür. Brera ve ark., 2005 tarafından İtalyan şaraplarından elde edilen sonuçlarda ise kırmızı şarapta 0,01 ile 4,01 ppb OTA tespit edilmiş olup, yapılan araştırmada 0,12-1,20 ppb olarak elde edilen sonuçlardan oldukça yüksek olduğu görülmektedir. Aynı çalışmada beyaz şarapta OTA miktarı 0,01 ile 0,21 ppb olarak tespit edilmiştir. Kuzey Avrupa ülkelerinde yapılan çalışmalarda kırmızı şarapta15,6 ppb, beyaz şarapta 8,6 ppb seviyelerinde OTA konsantrasyonu tespit edilmiştir (Miraglia ve Brera, 2002). Avustralya da yapılan araştırmalarda ise 0,05 ile 0,62 ppb konsantrasyonlarında OTA tespit edilmiştir (Varga ve Kozakiewicz, 2006). 21

22 Çizelge 4.1. Kırmızı Şarap Örneklerinde Tespit Edilen Okratoksin A Miktarları (µg/l, ppb) No Üzüm Çeşidi Yıl Şarap OTA Çeşidi Miktarı(ppb) 1 Cabernet Sauvignon 2003 Kırmızı 0,50 2 Merlot 2004 Kırmızı 0,63 3 Kalecik karası/shiraz 2004 Kırmızı 0,78 4 Papaz karası/cinsault/karasakız 2004 Kırmızı 0,49 5 Cinsault 2004 Kırmızı 0,12 6 Papaz karası/cinsault 2004 Kırmızı 1,20 7 Papaz karası 2004 Kırmızı 1,10 8 Gamay 2004 Kırmızı 0,86 9 Papaz karası/gamay 2004 Kırmızı 0,41 10 Cinsault/Çalkarası/Karasakız 2004 Kırmızı 0,46 11 Kalecik karası/merlot/shiraz/kuntra 2005 Kırmızı 0,44 12 Kalecik karası 2004 Kırmızı 0,20 13 Cabernet Sauvignon 2004 Kırmızı -* 14 Merlot 2004 Kırmızı -* 15 Shiraz 2004 Kırmızı 0,60 16 Shiraz 2004 Kırmızı 1,00 17 Cinsault/Cabernet Sauvignon/Gamay 2005 Kırmızı 0,68 18 Kırmızı şaraplık üzüm (Karışım) 2004 Kırmızı 1,02 19 Gamay/Karasakız 2000 Kırmızı 0,75 20 Gamay/Cinsault/Karasakız 2000 Kırmızı 0,50 21 Gamay/Cinsault 2002 Kırmızı 0,25 22 Gamay/Cinsault 2002 Kırmızı -* 23 Cabernet Sauvignon/Cinsault 2004 Kırmızı 0,90 24 Carignan/Karasakız 2004 Kırmızı 0,35 25 Kalecik karası 2004 Kırmızı 1,17 26 Gamay 2003 Kırmızı 1,06 27 Merlot/Gamay/Cinsault 2004 Kırmızı 1,12 28 Öküzgözü/Gamay/Cinsault 2003 Kırmızı -* 29 Adakarası 2005 Kırmızı 0,20 30 Merlot 2005 Kırmızı -* 31 Cinsault 2005 Kırmızı -* 32 Cabernet Sauvignon (Organik) 2005 Kırmızı -* 33 Çalkarası 2005 Kırmızı a 34 Cabernet Sauvignon/Bogazkere/Syrah 2004 Kırmızı a Ortalama değer 0,67 Minimum 0,12 Maksimum 1,20 a: analiz edilmemiştir *tespit edilebilirlik sınırı altında 22

23 Çizelge 4.2. Beyaz Şarap Örneklerinde Tespit Edilen Okratoksin A Miktarları (µg/l, ppb) No Üzüm Çeşidi Yıl Şarap OTA Çeşidi Miktarı(ppb) 35 Semillon/Sauvignon Blanc 2004 Beyaz 1,02 36 Sauvignon Blanc 2004 Beyaz 0,54 37 Semillon Blanc 2004 Beyaz 0,32 38 Emir/Semillon 2000 Beyaz 0,98 39 Emir/Semillon 2000 Beyaz 0,67 40 Sauvignon blanc/semillon 2005 Beyaz 0,23 41 Semillon/Narince 2003 Beyaz 0,20 42 Reisling 2002 Beyaz -* 43 Sauvignon Blanc 2005 Beyaz -* 44 Semillion 2005 Beyaz -* 45 Narince 2000 Beyaz -* Ortalama değer 0,56 Minimum 0,20 Maksimum 1,02 a: analiz edilmemiştir *tespit edilebilirlik sınırı altında Şarap örneklerinin OTA miktarları genel dağılımı incelendiğinde tespit edilebilirlik sınırı altında çıkan OTA miktarının oranı %25,6 olarak hesaplanmıştır. Şarapların %25 inde OTA ya rastlanmadığı ifade edilebilir (Çizelge 4.3). Dördü kırmızı şarap örneği olmak üzere toplam 6 örnekte 0,25 ppb nin altında OTA tespit edilmiştir. 1 ppb nin üzerinde OTA bulunan 7 şarap örneği tespit edilmiş olup bunun altısı kırmızı şarap örnekleridir. 1 ppb yi aşan şarap oranı toplam şaraplar içerisinde %16,3 lük bir orana sahiptir. Çizelge 4.3. Şarap Örneklerinde Tespit Edilen OTA Miktarının Dağılımı Kırmızı Beyaz Toplam OTA Miktarı Sayı Oran(%) Sayı Oran(%) Oran (%) 0 ppb 7 21,9 4 36,4 25,6 <0,25 ppb 4 12,5 2 18,1 13,9 0,26-0,50 ppb 7 21,9 1 9,1 18,7 0,51-0,75 ppb 4 12,5 2 18,1 13,9 0,76-1,00 ppb 4 12,5 1 9,1 11,6 1,00-1,25 ppb 6 18,7 1 9,1 16,3 Toplam , ,0 100,0 23

24 4.2. Şarap Örneklerinin ph Değerleri Şarap örneklerinin tespit edilen ph değerleri Çizelge 4.4 ve 4.5 de verilmiştir. ph değerleri 3,27 ile 4 arasında değişmiştir. En düşük ph değeri 3,27 ile Emir/Semillon kupajı olan beyaz şarapta ortaya çıkmıştır. En yüksek ph değeri olan 4 ise 2005 hasad yılına ait Cinsault üzüm çeşidinden üretilen kırmızı şarapta tespit edilmiştir. Çizelge 4.4. Kırmızı Şarap Örneklerinin Tespit Edilen ph Değerleri No Üzüm Çeşidi Yıl Şarap Çeşidi ph 1 Cabernet Sauvignon 2003 Kırmızı 3,80 2 Merlot 2004 Kırmızı 3,90 3 Kalecik karası/shiraz 2004 Kırmızı 3,80 4 Papaz karası/cinsault/karasakız 2004 Kırmızı 3,80 5 Cinsault 2004 Kırmızı 3,80 6 Papaz karası/cinsault 2004 Kırmızı 3,90 7 Papaz karası 2004 Kırmızı 3,75 8 Gamay 2004 Kırmızı 3,80 9 Papaz karası/gamay 2004 Kırmızı 3,90 10 Cinsault/Çalkarası/Karasakız 2004 Kırmızı 3,85 11 Kalecik karası/merlot/shiraz/kuntra 2005 Kırmızı 3,30 12 Kalecik karası 2004 Kırmızı 3,75 13 Cabernet Sauvignon 2004 Kırmızı 3,50 14 Merlot 2004 Kırmızı 3,70 15 Shiraz 2004 Kırmızı 3,40 16 Shiraz 2004 Kırmızı 3,90 17 Cinsault/Cabernet Sauvignon/Gamay 2005 Kırmızı 3,60 18 Kırmızı şaraplık üzüm (Karışım) 2004 Kırmızı 3,85 19 Gamay/Karasakız 2000 Kırmızı 3,60 20 Gamay/Cinsault/Karasakız 2000 Kırmızı 3,64 21 Gamay/Cinsault 2002 Kırmızı 3,90 22 Gamay/Cinsault 2002 Kırmızı 3,85 23 Cabernet Sauvignon/Cinsault 2004 Kırmızı 3,78 24 Carignan/Karasakız 2004 Kırmızı 3,90 25 Kalecik karası 2004 Kırmızı 3,90 26 Gamay 2003 Kırmızı 3,95 27 Merlot/Gamay/Cinsault 2004 Kırmızı 3,75 28 Öküzgözü/Gamay/Cinsault 2003 Kırmızı 3,95 29 Adakarası 2005 Kırmızı 3,83 30 Merlot 2005 Kırmızı 3,60 31 Cinsault 2005 Kırmızı 4,00 32 Cabernet Sauvignon (Organik) 2005 Kırmızı 3,45 33 Çalkarası 2005 Kırmızı 3,90 34 Cabernet Sauvignon/Bogazkere/Syrah 2004 Kırmızı 3,63 24

25 Çizelge 4.5. Beyaz Şarap Örneklerinin Tespit Edilen ph Değerleri No Üzüm Çeşidi Yıl Şarap Çeşidi ph 35 Semillon/Sauvignon Blanc 2004 Beyaz 3,90 36 Sauvignon Blanc 2004 Beyaz 3,90 37 Semillon Blanc 2004 Beyaz 3,80 38 Emir/Semillon 2000 Beyaz 3,27 39 Emir/Semillon 2000 Beyaz 3,60 40 Sauvignon blanc/semillon 2005 Beyaz 3,80 41 Semillon/Narince 2003 Beyaz 3,58 42 Reisling 2002 Beyaz 3,45 43 Sauvignon Blanc 2005 Beyaz 3,40 44 Semillion 2005 Beyaz 3,50 45 Narince 2000 Beyaz 3,75 Kırmızı şarapların minimum ph değeri 3,30 olup üst değer de 4 olarak ölçülmüştür. Beyaz şaraplarda ise minimum ph değeri 3,27 olup üst değer de 3,90 olarak belirlenmiştir. Kırmızı şarapların ph değeri ortalaması 3,76 olup, beyaz şarapların ph ortalama değeri olan 3,63 den p<0,05 düzeyinde önemli bir farka sahip olduğu bulunmuştur (Çizelge 4.6). Kırmızı şarapların ph sının beyaz şaraplara göre daha yüksek olduğu sonucuna varılabilir. Çizelge 4.6. Şarap Örneklerinin Tespit Edilen ph Değerlerinin Ortalamaları Arasındaki Farkın Tahmini Aritmetik Ortalaması Standart Sapması t değeri Kırmızı 3,7626 0,1689 Beyaz 3,6318 0,2129 2,095* Genel 3,7307 0,1860 *p<0,05 düzeyinde önemli 4.3. Şarap Örneklerinin Asitlik Değerleri (% Tartarik Asit Cinsinden) Analiz sonucunda elde edilen verilere göre örnek şaraplardaki asitlik oranı 3,36 g/l ile 7,35 g/l arasında değişmektedir (Çizelge 4.7). Genel olarak kırmızı şarap örneklerinin asitlik değeri beyaz şaraplara göre düşük tespit edilmiştir. En düşük asitlik oranı 3,36 g/l olarak tespit edilmiş olup 2005 hasad dönemine ait Cinsault üzümünden yapılmış olan kırmızı şaraptır. Bu şarap örnekler içerisinde en yüksek ph değerine 25

26 sahiptir. 29 ve 33 nolu şarap örnekleri diğer düşük asitliğe sahip kırmızı şaraplar olup yine ph değerleri 3,83 ve 3,90 gibi yüksek ölçülmüştür. Asitlik değeri en yüksek analiz edilen 2005 Sauvignon Blanc beyaz şarap çeşidi olup 7,35 g/l olarak belirlenmiştir. Çizelge 4.7. Kırmızı Şarap Örneklerinde Tespit Edilen Asitlik Değerleri No Üzüm Çeşidi Yıl Şarap Çeşidi Asitlik (g/l) 1 Cabernet Sauvignon 2003 Kırmızı 4,86 2 Merlot 2004 Kırmızı 4,11 3 Kalecik karası/shiraz 2004 Kırmızı 4,44 4 Papaz karası/cinsault/karasakız 2004 Kırmızı 5,01 5 Cinsault 2004 Kırmızı 5,70 6 Papaz karası/cinsault 2004 Kırmızı 5,19 7 Papaz karası 2004 Kırmızı 4,68 8 Gamay 2004 Kırmızı 5,31 9 Papaz karası/gamay 2004 Kırmızı 4,80 10 Cinsault/Çalkarası/Karasakız 2004 Kırmızı 4,92 11 Kalecik karası/merlot/shiraz/kuntra 2005 Kırmızı 4,83 12 Kalecik karası 2004 Kırmızı 5,10 13 Cabernet Sauvignon 2004 Kırmızı 4,59 14 Merlot 2004 Kırmızı 5,10 15 Shiraz 2004 Kırmızı 4,53 16 Shiraz 2004 Kırmızı 4,59 17 Cinsault/Cabernet Sauvignon/Gamay 2005 Kırmızı 4,23 18 Kırmızı şaraplık üzüm (Karışım) 2004 Kırmızı 4,59 19 Gamay/Karasakız 2000 Kırmızı 4,32 20 Gamay/Cinsault/Karasakız 2000 Kırmızı 4,56 21 Gamay/Cinsault 2002 Kırmızı 4,47 22 Gamay/Cinsault 2002 Kırmızı 5,31 23 Cabernet Sauvignon/Cinsault 2004 Kırmızı 4,20 24 Carignan/Karasakız 2004 Kırmızı 4,56 25 Kalecik karası 2004 Kırmızı 4,47 26 Gamay 2003 Kırmızı 5,31 27 Merlot/Gamay/Cinsault 2004 Kırmızı 4,53 28 Öküzgözü/Gamay/Cinsault 2003 Kırmızı 5,01 29 Adakarası 2005 Kırmızı 3,75 30 Merlot 2005 Kırmızı 5,79 31 Cinsault 2005 Kırmızı 3,36 32 Cabernet Sauvignon (Organik) 2005 Kırmızı 6,06 33 Çalkarası 2005 Kırmızı 3,54 34 Cabernet Sauvignon/Bogazkere/Syrah 2004 Kırmızı 5,73 Ortalama değer 4,75 Minimum 3,36 Maksimum 6,06 26

27 TS 521 e göre beyaz ve kırmızı şaraplarda genel asit değeri tartarik asit cinsinden en az 3 g/l olması gerektiği belirtilmiştir. Analiz edilen şarapların asitlik değeri ortalaması kırmızı şaraplarda 4,75 g/l, beyaz şaraplarda ise 5,22 g/l olarak belirlenmiştir. Bu sonuca göre örneklerin standartlara uygun olduğu ortaya konulmuştur. Çizelge 4.8. Beyaz Şarap Örneklerinde Tespit Edilen Asitlik Değerleri No Üzüm Çeşidi Yıl Şarap Çeşidi Asitlik (g/l) 35 Semillon/Sauvignon Blanc 2004 Beyaz 4,47 36 Sauvignon Blanc 2004 Beyaz 4,77 37 Semillon Blanc 2004 Beyaz 5,70 38 Emir/Semillon 2000 Beyaz 4,83 39 Emir/Semillon 2000 Beyaz 5,46 40 Sauvignon blanc/semillon 2005 Beyaz 5,61 41 Semillon/Narince 2003 Beyaz 4,35 42 Reisling 2002 Beyaz 5,70 43 Sauvignon Blanc 2005 Beyaz 7,35 44 Semillion 2005 Beyaz 5,07 45 Narince 2000 Beyaz 4,20 Ortalama değer 5,22 Minimum 4,20 Maksimum 7,35 Örnek şarapların kırmızı ve beyaz şarap olarak asit değerleri açısından aralarında bir fark olup olmadığı test edilmiştir. Yapılan analiz sonucunda p<0,05 düzeyinde beyaz şarap örneklerinin asit değerinin kırmızı şarap örneklerinin değerine göre daha yüksek olduğu ve aralarında önemli bir fark olduğu tespit edilmiştir (Çizelge 4.9). Asitlik değeri ortalamalarına bakıldığında da beyaz şarapların 5,22 g/l gibi yüksek bir ortalamaya sahip olduğu belirlenmiştir. Çizelge 4.9. Şarap Örneklerinde Tespit Edilen Ortalama Asitlik Değerleri Arasındaki Farkın Tahmini Aritmetik Ortalaması Standart Sapması t değeri Kırmızı 4,7515 0,6103 Beyaz 5,2282 0,891-2,003* Genel 4,8680 0,709 *p<0,05 düzeyinde önemli 27

28 4.4. Şarap Örneklerinde Alkol Miktarı Kırmızı şarap örneklerinde en düşük alkol oranı %10,4 ile 2004 Papaz karası/cinsault, en yüksek alkol oranı %13,2 ile 2004 Merlot çeşidi olarak tespit edilmiştir (Çizelge 4.10). Beyaz şarap örneklerinde en düşük alkol oranı %9,85 ile 2000 Emir/Semillon kupajı olarak tespit edilmiştir. En yüksek alkol oranı %13,55 ile 2005 Sauvignon Blanc olarak tespit edilmiştir (Çizelge 4.11). Tüm analiz edilen şaraplardaki alkol miktarları %9,85 ile %13,55 arasında değişmektedir. Genel ortalama olarak alkol miktarı %11,69 olarak hesaplanmıştır. TS 521 e göre kırmızı şaraplardaki alkol oranının en düşük %11, en yüksek %13,5, beyaz şaraplardaki alkol oranının ise en düşük %11, en yüksek %12,5 düzeyinde olması gerekmektedir. Bunun yanı sıra % olarak etikette bildirilen alkol miktarında ±1 derece tolerans kabul edilmektedir. Buna bağlı olarak 38 nolu şarap örneği dışındaki analiz edilen şarap örneklerinin alkol miktarlarının standartlara uygun olduğu belirlenmiştir. 28

29 Çizelge Kırmızı Şarap Örneklerinin Etikette Belirtilen ve Analiz Edilen Alkol Değerleri No Üzüm Çeşidi Yıl Şarap Çeşidi Bildirilen Alkol Derecesi (%) Analiz Edilen Alkol (%) 1 Cabernet Sauvignon 2003 Kırmızı 13,4 12,8 2 Merlot 2004 Kırmızı 13,91 13,2 3 Kalecik karası/shiraz 2004 Kırmızı 12,5 12,75 4 Papaz karası/cinsault/karasakız 2004 Kırmızı 12 11,8 5 Cinsault 2004 Kırmızı 11 11,4 6 Papaz karası/cinsault 2004 Kırmızı 11 10,4 7 Papaz karası 2004 Kırmızı 11 10,95 8 Gamay 2004 Kırmızı 11 10,9 9 Papaz karası/gamay 2004 Kırmızı Cinsault/Çalkarası/Karasakız 2004 Kırmızı 13 12,3 11 Kalecik karası/merlot/shiraz/kuntra 2005 Kırmızı Kalecik karası 2004 Kırmızı 12 11,87 13 Cabernet Sauvignon 2004 Kırmızı 12 11,6 14 Merlot 2004 Kırmızı 12 12,45 15 Shiraz 2004 Kırmızı 12 11,25 16 Shiraz 2004 Kırmızı 11,5 12,1 17 Cinsault/Cabernet Sauvignon/Gamay 2005 Kırmızı 12,5 12,05 18 Kırmızı şaraplık üzüm (Karışım) 2004 Kırmızı 12,5 12,05 19 Gamay/Karasakız 2000 Kırmızı 11 11,4 20 Gamay/Cinsault/Karasakız 2000 Kırmızı 11 11,45 21 Gamay/Cinsault 2002 Kırmızı 11 11,45 22 Gamay/Cinsault 2002 Kırmızı 11 11,65 23 Cabernet Sauvignon/Cinsault 2004 Kırmızı 12,5 11,7 24 Carignan/Karasakız 2004 Kırmızı ,25 25 Kalecik karası 2004 Kırmızı 13 12,2 26 Gamay 2003 Kırmızı 13,5 12,6 27 Merlot/Gamay/Cinsault 2004 Kırmızı 12,5 11,6 28 Öküzgözü/Gamay/Cinsault 2003 Kırmızı 11 10,45 29 Adakarası 2005 Kırmızı - 11,3 30 Merlot 2005 Kırmızı - 12,6 31 Cinsault 2005 Kırmızı - 11,7 32 Cabernet Sauvignon (Organik) 2005 Kırmızı - 12,9 33 Çalkarası 2005 Kırmızı - 12,55 34 Cabernet Sauvignon/Bogazkere/Syrah 2004 Kırmızı ,87 Ortalama değer 11,77 Minimum 10,40 Maksimum 13,20 29

30 Çizelge Beyaz Şarap Örneklerinin Etikette Belirtilen ve Analiz Edilen Alkol Değerleri No Üzüm Çeşidi Yıl Şarap Çeşidi Bildirilen Alkol Derecesi (%) Analiz Edilen Alkol (%) 35 Semillon/Sauvignon Blanc 2004 Beyaz 12,87 11,9 36 Sauvignon Blanc 2004 Beyaz 13,76 13,55 37 Semillon Blanc 2004 Beyaz ,35 38 Emir/Semillon 2000 Beyaz 11 9,85 39 Emir/Semillon 2000 Beyaz Sauvignon blanc/semillon 2005 Beyaz 11, Semillon/Narince 2003 Beyaz 12,5 12,85 42 Reisling 2002 Beyaz - 12,4 43 Sauvignon Blanc 2005 Beyaz - 12,5 44 Semillion 2005 Beyaz - 12,4 45 Narince 2000 Beyaz - 11,05 Ortalama değer 11,89 Minimum 9,85 Maksimum 13,55 Çizelge Şarap Örneklerinin Etikette Belirtilen ve Analiz Edilen Alkol Değerleri Arasında Farkın Karşılıklı Çiftler Yöntemiyle Tahmini Aritmetik Ortalaması Standart Sapması t değeri Belirtilen Alkol Oranı 11,9289 0,9029 Analiz Edilen Alkol Oranı 11,6942 0,8628 2,346* *p<0,05 düzeyinde önemli Şarap örneklerinin üzerinde belirtilen alkol dereceleri ile analiz edilen alkol dereceleri arasında fark olup olmadığı kesin sonuçlara ulaşmak için karşılıklı çiftler yöntemiyle test edilmiştir. Bu yöntemde her bir örnek arasında tespit edilen farklar arasında anlamlı bir fark olup olmadığı test edilmiştir. Yapılan test sonucuna göre belirtilen alkol oranlarının analiz edilen alkol oranlarından p<0,05 düzeyinde anlamlı olarak daha yüksek olduğu tespit edilmiştir. Bu farkın %95 güven derecesinde miktarı 0,031 ile 0,437 değiştiği belirlenmiştir. Firmaların belirttikleri orandan daha düşük oranda alkol seviyesinde üretim yaptıkları belirlenmiştir. 30