Mikrodalganın Bazı Bacillus Türlerinin Sporlarına Etkisi

KSÜ. Fen ve Mühendislik Dergisi, 9(1), 2006 27 KSU. Journal of Science and Engineering 9(1), 2006 Mikrodalganın Bazı Bacillus Türlerinin Sporlarına Etkisi Özlem ERDOĞRUL 1, Feryal ERBİLİR 2 1 Kahramanmaraş Sütçü İmam Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Gıda Mühendisliği Bölümü, Kahramanmaraş 2 Kahramanmaraş Sütçü İmam Üniversitesi, Fen Edebiyat Fakültesi, Biyoloji Bölümü, Kahramanmaraş ÖZET: Çalışmada Bacillus subtilis IMG22, B. subtilis ATCC 6633, B. subtilis var. niger, B. brevis FMC 3, B. cereus E.Ü. kullanılmıştır. Hazırlanan % 0,2; 0,5; 0,8; 1,0; 1,5 oranında nişasta konsantrasyonlarındaki solüsyonlara Bacillus sporları (10 6 spor/ml) inoküle edilmiştir. Daha sonra 25 o C de 0, 4, 8, 12 saat inkübe edilen solüsyonlara, düşük ( Watt) ve en yüksek ( Watt) mikrodalga uygulanmış ve B. subtilis IMG 22 en duyarlı, B. brevis FMC3 ise en dirençli suş olarak belirlenmiştir. B. brevis FMC3 ü dirençlilikte B. subtilis var. niger, B. cereus EU, B. subtilis ATCC 6633 takip etmiştir. Dört yüz Watt (en düşük)gücündeki mikrodalga uygulamasının Bacillus sporları üzerine inhibitör etkisi göstermezken, Watt lık (en yüksek) uygulanmanın tüm Bacillus sporları üzerine inhibitör etkisi olduğu belirlenmiştir. Ayrıca >%0,8 oranında nişasta konsantrasyonun Bacillus sporlarını koruyucu özellikte olduğu tespit edilmiştir. Bacillus suşlarını inoküle ettiğimiz ve 12 saat inkübe ederek en yüksek mikrodalgaya arz ettiğimiz doymuş tuz solüsyonlarından KCl/K 2 CO 3 (a w = 0,93) de spor dirençlerinin azaldığı tespit edilmiştir. Bu durum yüksek su aktivitesinin mikrodalga muamelesi ile sinerjik bir etki gösterdiğini ve sporları inaktive ettiğini göstermektedir. Anahtar Kelimeler: Bacillus türleri, Mikrodalga, Sinerjik etki, tuz ve nişasta solüsyonları Effect of Microwaves on Survival of Some Bacillus Spores ABSTRACT: B. subtilis IMG22, B. subtilis ATCC 6633, B. subtilis var. niger, B. brevis FMC 3, B. cereus E.Ü. were used in this study. Bacillus spores (10 6 spore/ml) were added in different starch solutions (0.2, 0.5, 0.8, 1.0, and 1.5%) and then incubated 25 o C for 0, 4, 8, 12 hours. The solutions were heated with microwave at lower ( Watts) and the highest ( Watts) power levels. The results of this part of the study showed that B. subtilis IMG 22 had the lowest microwave resistance and B. brevis FMC3 had the highest microwave tolerance. In lower power levels of microwave Bacillus spp. spores were survived but in the highest power levels they were not survived. Starch concentrations of >0.8% increased microwave resistance. Bacillus spp. spores were incubated (12 hours) in different salt solutions and were treated with the highest power level of microwave. Spores tested in saturated solutions of KCl/K 2 CO 3 (a w = 0.93) exhibited lower microwave tolerance levels. This findings indicated that the elevation of a w had a synergistic effect with microwave treatment on the inactivation of spore contamination. Key Words: Bacillus species, Microwave, Synergistic effect, Salt and Starch solutions. GİRİŞ Gıda maddeleri pek çok yöntemle korunmaktadır. Bunlar arasında kurutma, dondurma, salamura etme, konserve etme, tuzlama, katkı maddeleri bulunmaktadır. Her geçen gün gıda endüstrisi ürün kalitesini arttırmak ve gıdalarla insanlara bulaşabilecek mikroorganizmaları engellemek amacıyla daha az enerji ve gıda katkıları kullanarak gıdaları korumak için araştırmalara devam edilmektedir. Günümüzde gıda patojenlerini etkisiz hale getirmek amacı ile pek çok yöntem kullanılmaktadır. Mikrodalga fırın da bu yöntemlerden bir tanesidir. Elektromagnetik spektrumun 300 MHz300 GHz arasındaki frekansına sahip bölümü mikrodalga diye adlandırılır. Mikrodalgalar elektromagnetik spektrum üzerindeki radyo ve kızıl ötesi dalgaların arasında bulunan, dalga boylu, enerji yayan elektromagnetik dalgalardır (Giese, 1992). Gıdalar mikrodalga enerjisi gibi enerjileri absorbe edebilmektedirler. Mikrodalga yöntemleri geleneksel pişirme yöntemleriyle karşılaştırıldığında, farklı avantajlar sunmaktadır. Bu avantajlar arasında çalışma sisteminin hızlı oluşu, enerji tasarrufu ve zaman kontrolü sayılabilir (Decareau, 1986). Mikrodalga; gıdaları kurutmada, et yumuşatmasında, pirinç kepeğinin kekreliğini önlemede ve kahve tanelerinin çok fazla koyulaşmasını engellemek amacı ile kullanılmaktadır (Decareau, 1986; Mermelstein, 1989). Geleneksel ve mikrodalga ısıtma tekniklerinin mikroorganizmaları öldürücü etkileri üzerine tespit edilmiş farklı görüşler bulunmaktadır. Goldblith ve Wang (1967), Escherichia coli ve Bacillus subtilis spor süspansiyonlarını geleneksel ve mikrodalga ısısına maruz bıraktığında iki ısıtma tekniğinin letal etkisinin pek farklı olmadığını gözlemişlerdir. Buna karşın Culkin ve Fung (1975), E. coli ve Salmonella typhimurium üzerinde mikrodalganın tek başına kullanımının öldürücü etkisi olmadığını tespit etmişlerdir. Bacillus cinsine ait bakteriler çeşitli hidrolitik enzimler üretirler ve bunun sonucu olarak ta gıdalarda bulunan çeşitli protein, karbonhidrat, yağ, glikozid, alkol ve organik asitleri kullanabilirler. B. cereus un bazı suşları insanda gıda zehirlenmesine neden olur. B. subtilis ve diğer Bacillus türleri özellikle konserve teknolojisinde sorunlara, ürün bozulmalarına neden olur

KSÜ. Fen ve Mühendislik Dergisi, 9(1), 2006 28 KSU. Journal of Science and Engineering 9(1), 2006 (Ünlütürk ve Turantaş, 1999). Bu nedenle Bacillus türlerinin mikrodalga ile muamelesinde yetersiz ısıtma problem yaratmaktadır (Chipley ve ark., 1980). Bu çalışmada sporlu bakterilerden Bacillus subtilis IMG22, B. subtilis ATCC 6633, B. subtilis var. niger, B. brevis FMC 3, B. cereus E.Ü. kullanılmıştır. Bakteri sporları değişik tuz ve nişasta çözeltileri içeren ortamlarda farklı inkübasyon koşullarında ve farklı güç seviyelerinde mikrodalgaya maruz bırakılmıştır. Çalışma, çeşitli ortamlarda hazırlanmış sporlu bakterilere karşı mikrodalga etkisini araştırmak amacı ile yapılmıştır. MATERYAL ve METOT Test Organizmaları: B. subtilis IMG22, B. subtilis ATCC 6633, B. subtilis var. niger, B. brevis FMC 3, B. cereus E.Ü, kullanılmıştır. Mikrodalga Fırın: Çalışmada 2450 MHz de 18 litrelik döner tablası bulunan (Arçelik), ev tipi mikrodalga fırın kullanılmıştır. Spor Süspansiyonunun Hazırlanması: Bakterilerin kültivasyonu için Nutrient Agar (Difco, Detroit, Mich.) kullanılmıştır. Nutrient Agar a ekilen bakteriler 24 saat etüvde inkübe edilmiş ve inkübasyon süresi sonunda etüvden çıkarılan petrilerde üreyen bakterilerden alınan bir öze dolusu bakteri hücrelerinin zarar görmemesi ve canlılık özelliklerini kaybetmemeleri için izotonik ortam olan Tamponlanmış Fosfat (TF) (ph 7.0) içerisine alınmıştır. Vortex (tüp karıştırıcı) ile karıştırılarak homojen hale getirilen bakterilerden bir damla litrede 30 mg MnCl 2 içeren Nutrient Agar a ekilmiş ve 37 o C de 4 gün inkübe edilmiştir. İnkübasyon süresinin sonunda üreyen bakteri kolonileri santrifüj tüplerine alınarak steril distile su ile iki kez yıkanmış ve TF çözeltisi içerisine alınmıştır. Santrifüj tüplerine eşit olarak dağıtılan süspansiyon 6000 rpm de 30 dakika santifüj edildikten (Micro 22 R Hettich Zentrifugen) sonra santrifüj tüpünün üst kısmında kalan sıvı kısım tüpten atılarak geri kalan kısım 80 o C de 20 dakika bekletilmiştir. Bu şekilde Bacillus ssp sporları elde edilerek mililitrede 10 6 spor olacak şekilde dilue edilmiştir. Spor boyama yapılarak hazırlanan dilüsyonlarda vejetatif hücre olmadığı mikroskop ile tespit edilmiştir (Wang ve ark., 2003). Değişik Tuz Solüsyonlarında Bacillus sporlarının Mikrodalga Toleranslarının Belirlenmesi: BaCl 2, KCl, KCl/K 2 CO 3 (Merck)(1:1 wt/wt) nin doymuş çözeltileri hazırlanarak 19 ml alınmış ve içerlerine 1 ml spor süspansiyonları ilave edilmiştir. Sporlu tuz çözeltileri 25 o C de 12 saat inkübe edikten sonra her biri en yüksek mikrodalga gücüne ( Watt) maruz bırakılmıştır. Daha sonra 45 o C de su banyosunda soğutulup Nutrient Agar a ekimleri yapılmış ve varlıkları tespit edilmiştir (Wang ve ark., 2003). Değişik Nişasta Solüsyonlarında Bacillus sporlarının Mikrodalga Toleranslarının Belirlenmesi: Bir ml spor süspansiyonu 19 ml değişik oranlarda nişasta içeren (Çözünebilir nişasta, Merck) (%0.2, 0.5, 0.8, 1.0, 1.5) solüsyonlara ilave edilerek 25 o C de 0, 4, 8, 12 saat inkübe edilmiştir. Daha sonra örneklerin her biri düşük ( Watt) ve en yüksek ( Watt) mikrodalgaya maruz bırakılarak yukarıdaki işlemler tekrarlanmıştır (Wang ve ark., 2003). Çalışmada hazırlanan solüsyonların su aktiviteleri higrometre ile belirlenmiştir (Wang ve ark., 2003). BULGULAR Çalışmada elde edilen bulgular Tablo 1 ve 2 de gösterilmiştir. Çalışmada değişik oranlarda nişasta içeren ortamlara ilave edilen spor süspansiyonları 25 o C de 0, 4, 8, 12 saat inkübe edildikten sonra düşük ve en yüksek mikrodalga güçlerine maruz bırakılmıştır. Düşük mikrodalga gücüne maruz bırakılan sporlu örneklere karşı mikrodalganın öldürücü gücünün çok fazla olmadığı tespit edilmiştir. En yüksek güç değerinde mikrodalga uygulanan örnekler ise nişasta oranı yüksek olan solüsyonlarda ısıya daha dirençli oldukları tespit edilmiştir. BaCl 2, KCl, KCl/K 2 CO 3 (Merck) (1:1 wt/wt) nin doymuş çözeltileri hazırlanarak spor süspansiyonlarının mikrodalganın en yüksek gücü ile maruz bırakılması sonucunda KCl/K 2 CO 3 teki spor süspansiyonları düşük mikrodalga toleransı göstermişlerdir. TARTIŞMA ve SONUÇ Mikrodalganın canlılar üzerine olan etkileri bir çok araştırmanın konusu olmuştur. Mikrodalga uygulamasının bazı mikroorganizmalar üzerinde termal etkilerinin olduğu saptandığı gibi (Coote ve ark., 1991; DiazCinco ve Martinelli, 1991; Fujikawa ve ark., 1991; Welt ve ark., 1994), termal etkilerinin olmadığı da bazı araştırmacılar tarafından belirlenmiştir (Frölich, 1975; Cope, 1976). Mikroorganizmaların ısıya karşı dirençleri onların kalıcı bir niteliği olmayıp, içinde bulundukları ortamın fiziksel ve kimyasal yapısına bağımlı olarak değişebilmektedir (Cemeroğlu ve Acar, 1986). Gıdaların viskozite ve homojenite gibi fiziksel özellikleri içerdikleri bakterilerin mikrodalga toleransını etkilemektedir. Kindle ve arkadaşları (1996) Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus ve Mycobacterium terrae türlerini beş değişik formülde hazırlanmış bebek sütüne inoküle ederek mikrodalga uygulamışlardır. Yaptıkları çalışmanın sonucunda aynı güç değerinde ısı dağılımının farklı bebek sütünde değişik olduğunu bu nedenle yaşayan bakteri sayısında değişiklikler kaydedildiği belirtmişlerdir. Coote ve ark., (1991) Listeria monocytogenes üzerinde ısının letal etkisini incelemişler ve homojen ortamlarda çok geniş bir etki bulunduğunu tespit etmişlerdir. Yapılan başka bir çalışmada değişik gıdalar mikrodalga ile steril edilmeye çalışılmış ve sterilizasyonun ancak mikrodalga ile kaynatma sonucunda elde edildiği tespit edilmiştir.

KSÜ. Fen ve Mühendislik Dergisi, 9(1), 2006 29 KSU. Journal of Science and Engineering 9(1), 2006 Mikrodalganın düşük güç seviyesi sporların varlığını engelleyemezken, yüksek seviyesinin etkin bir biçimde sporlu bakterilerin belirlenememesini sağlamıştır (Kozempel ve ark., 1998). Erdoğrul ve Çakıroğlu (2004), yaptıkları bir çalışmada Yersinia enterocolitica inoküle ettikleri kıymada düşük güç seviyelerinde bu bakterinin varlığını sürdürdüğünü, ancak yüksek güç seviyesinde söz konusu bakterinin 1. günde inhibe olduğunu tespit etmişlerdir. Değişik konsantrasyonlarda hazırlanmış nişasta solüsyonlarının viskoziteleri farklıdır. Çalışmada farklı doymuş tuz solüsyonlarına inoküle edilerek mikrodalga uygulanmış sporlu bakterilerin varlığına da bakılmıştır. Doymuş tuz solüsyonları kullanmamızın ana amacı ozmotik basıncın etkisine bakmaktır. Çalışmamızda hazırladığımız BaCl 2, KCl, KCl/K 2 CO 3 tuz solüsyonlarının su aktivitesi (a w) sırasıyla 0,65; 0,71; 0,93 olarak tespit edilmiştir. Tablo1: Farklı nişasta konsantrasyonlarındaki Bacillus spp. sporlarının ve Watt lık mikrodalga gücüne karşı direnci Bacillus spp. Mikrodalga gücü (W)/5 dakika Nişasta konsantrasyonu* İnkübasyon süresi (%) (saat) 0,2 0,5 0,8 1 1,5 0 4 B. brevis FMC3 8 12 0 4 B.subtilis var.niger 8 12 0 4 B. cereus E.Ü. 8 12 0 4 B.subtilis ATCC 6633 8 B.subtilis IMG 22 * : Üreme gözlenen, : üreme gözlenemeyen 12 0 4 8 12

KSÜ. Fen ve Mühendislik Dergisi, 9(1), 2006 30 KSU. Journal of Science and Engineering 9(1), 2006 Hayashi ve ark. (1991), NaCl ün düşük konsantrasyonlarının, mikrodalga uygulamalarında yüksek öldürücü etkisinin olduğunu saptamışlardır. Çalışmalarında Vibrio parahaemolyticus, S. aureus, Salmonella enterica serovar Enteritidis, E. coli ve B. cereus kullanmışlardır. Wang ve ark. (2003) yaptıkları bir çalışmada B. cereus, B. coagulans, B. licheniformis ve B. subtilis ile benzer bir çalışma yapmışlar ve KCl/K 2 CO 3 ile ilgili bulguları bizim bulgularımızla benzer nitelik taşımaktadır. Wang ve ark. (2003), mikrodalga toleransına maruz bıraktıkları spor süspansiyonlarının, en düşük ısı toleransını NaNO 3 ve KCl/K 2 CO 3 ün doymuş çözeltilerinde tespit etmişlerdir. Endosporlar, aynı türün vejetatif hücrelerine nazaran yaşamlarını sürdürdükleri yerlerde uygun olmayan ısıya, soğuğa, ozmoza, kurumaya, zehirli kimyasal maddelere karşı daha dayanıklıdırlar (Khalil ve Villota, 1985). Tablo 2. Kullanılan test organizmalarının farklı tuz çözeltilerinde % 100 mikrodalga toleransındaki sonuçları Kullanılan Çözeltiler* Kullanılan Test Mikrodalga Organizmaları KCl/ İnkübasyon süresi KCl BaCl seviyesi 2 K 2 CO 3 Mikrodalga süresi B.subtilis 6633 12 Saat w 5 dakika B.subtilis IMG 22 12 Saat w 5 dakika B.subtilis var. niger 12 Saat w 5 dakika B.brevis FMC 3 12 Saat w 5 dakika B.cereus E.Ü. 12 Saat w 5 dakika * : Üreme gözlene, : Üreme gözlenemeyen Çalışmamızda farklı Bacillus türleri, değişik nişasta konsantrasyonlarında, farklı sürelerde inkübe edilmiş ve düşük ve en yüksek mikrodalga seviyesi uygulanmıştır. Burada elde edilen sonuç B. subtilis IMG 22 nin uyguladığımız yönteme en az dirençli suş olduğunu söyleyebiliriz. En çok dirençli suş ise B. brevis FMC3 olarak tespit edilmiştir. B. brevis FMC3 ü B. subtilis var. niger, B. cereus EU, B. subtilis ATCC 6633 takip etmiştir. Mikrodalganın düşük güç seviyesi sporların varlığını engelleyemezken, yüksek seviyesinin etkin bir biçimde sporlu bakterilerin belirlenememesini sağlamıştır. Ayrıca %0,8 oranında nişasta konsantrasyonun koruyucu özellikte olduğu tespit edilmiştir. Bacillus suşlarını inoküle ettiğimiz ve 12 saat inkübe ederek en yüksek mikrodalgaya arz ettiğimiz doymuş tuz solüsyonlarından KCl/K 2 CO 3 de spor dirençlerinin azaldığı tespit edilmiştir. KCl/K 2 CO 3 çözeltisi hazırlanan tuz çözeltilerinin en yüksek su aktivitesine sahip olanıdır. Bu durum yüksek su aktivitesinin mikrodalga muamelesi ile sinerjik bir etki gösterdiğini ortaya koymaktadır. TEŞEKKÜR Bu çalışmada laboratuar çalışmalarındaki katkılarından dolayı Hulusi Özçelik, Harun Polat ve Hakan Sarı ya teşekkür ederiz. KAYNAKLAR Cemeroğlu, B., Acar, J. 1986. Meyve ve sebze işleme teknolojisi. Gıda Teknolojisi Derneği, Yayın No:6, 512 s. Chipley, J.R., Rohifs, L.A., Ford, C.L. 1980. Heat activation of Bacillus spores by the use of microwave irradiation. Microbios, 29:105108. Coote, P.J., Holyoak, C.D., Cole, M.B. 1991. Thermal inactivation of Listeria monocytogenes during a process simulating temperatures achieved during microwave heating. Journal of Applied Bacteriology, 70: 489494. Cope, F.W. 1976. Superconductivitya possible mechanism for nonthermal biological effects of microwaves. Journal of Microwave Power, 11: 267 270. Culkin, K.A., Fung, D.Y.C. 1975 Destruction of Escherichia coli and Salmonella typhimurium in microwave cooked soups. Journal of Milk Food Technology, 38, 815. Decareau, R.V. 1986. Microwave food processing equipment throughout the world. Food Technology, 40 (6): 99105. DiazCinco, M., Martinelli, S. 1991. The use of microwaves in sterilization. Dairy Food and Environmental Sanitation, 11:722724. Erdoğrul, Ö., Çakıroğlu, E. 2004. Presence of Yersinia enterocolitica in minced meat exposed to heat treatment in microwave oven. Annals of Microbiology, 54:3, 283288. Frölich, H. 1975. The extraordinary dielectric properties of biological materials and the action of enzymes. Proceedings of the National Academy of Sciences,USA, 72: 42114215. Fujikawa, F., Ushioda, H., Kudo, Y. 1991. Kinetics of Escherichia coli destruction by microwave irradiation. Applied and Environmental Microbiology, 58:920924.

KSÜ. Fen ve Mühendislik Dergisi, 9(1), 2006 31 KSU. Journal of Science and Engineering 9(1), 2006 Giese, J. 1992. Advances in microwave food Processing, Food Technology, September, 118123. Golblith, S.A., Wang, D.I.C. 1967. Effect of microwaves on Escherichia coli and Bacillus subtilis. Applied Microbiology, 15: 13711375. Hayashi, M., Shimazaki, Y., Katama, S., Kakiichi, N. 1991. Effect of sodium chloride on destruction of microorganisms by microwave heating in potatoes. Japonese Journal of Public Health, 38: 413417. Khalil, H., R. Villota. 1985. A comparative study on the thermal inactivation of Bacillus stearothermophilus spores in microwave and conventional heating. In Proceedings of the Fourth International Congress on Engineered Food. Applied Science Publishers, Essex, England. Kindle, G., Busse, A., Kampa, D., MeyerKonig, U., Daschner, F.D. 1996. Killing activity of microwaves in milk. Journal of Hospital Infection, 33(4):273 278. Kozempel, M.F., Annous, B.A., Cook, R.D., Scullen, O.J., Whiting, R.C. 1998. Inactivation of Microorganisms with microwaves at reduced Temperatures. Journal of Food Protection, 61 (5):582585. Mermelstein, N.H. 1989. Microwave food processing. Food Technology, 43:117. Ünlütürk, A., Turantaş, F. 1999. Gıda Mikrobiyolojisi. 2. Baskı, Mengi Tan Basımevi, Çınarlı, İzmir, 598s. Wang, J.C., Hu, S.H., Lin, CY. 2003. Lethal effect of microwaves on spores of Bacillus spp. Journal of Food Protection, 66:4, 604609. Welt, B.A., Tong, C.H., Rossen, J.L., Lund, D.B. 1994. Effect of microwave radiation on inactivation of Clostridium sporogenes (PA 3679) spores. Applied and Environmental Microbiology, 60:482 488.