NKR TIP MECMUSI (THE JOURNL OF THE FCULTY OF MEDICINE) Voİ. 48 : 191-198, 1995 KOBYLRD GENTMİSİN'İN KRCİĞER TOKSİTESİNİN RŞTIRILMSI : E VİTMİNİ'NİN ETKİSİ Orhn Cnbolt* Mustf Kvutcu* Serdr Öztürk* Ekmel Olcy"* İsmil Hkkı Gökhun* Cemil Ekinci 4 *" İlker Durk" Serbest rdikller, üzerlerinde ortklnmmış elektron tşıyn, hücresel ypılrdki lipit, protein, krbonhidrt gruplrı ile rhtlıkl etkileşmeye girerek onlrın ypı ve fonksiyonlrını bozn ve yrıc DN ypısındki hsss ypılr üzerine etki ederek hsr oluşturn ktif kimysl mddelerdir. Serbest rdikller, günümüzde bir çok hstlığın ptolojisinden sorumlu tutulmktdırlr (3). Orgnizmd rdiklik hsrdn korunmd, Gluttyon peroksidz (GSH-Px E.C. 1.6.4.2), Ktlz (CT E.C.1.11.1.6.) ve Süperoksit Dismutz (SOD E.C. 1.15.1.1.) enzimtik olrk, vitmin E ise non-enzimtik olrk görev yprlr. Çeşitli hücre içi ve hücre dışı kynklrdn oluşn hidroksil (OH-) ve peroksit (02-) rdiklleri enzimtik olrk, diğer rdiklik mddeler ise non-enzimtik meknizmlrl etkisizleştirilirler. Gentmisin'in (Gent) proksiml renl tübülüslerde birikerek lizozom, mitokondri vey membrn hsrı ile böbrek toksitesine yolçtığı bilinmektedir (3,5,8,10,14,17,18). Bu toksitenin meknizmsı tm çıklnmmkl berber bzı nti oksidnlnn bu toksiteden koruyucu etki ypmsı bu hsrlrın rdikl metbolizmsıyl ilişkili olbileceği düşüncesini kl getirmektedir (6,4,7,12,13,16). Gent'nm böbrek toksitesiyle oln ilişkisi üzerine bir çok çlışm olmsın rğmen krciğer üzerindeki serbest rdikl hsn ile ilgili olrk ypıln bir çlışmy rstlnmmıştır. Bu çıdn çlışmmızd gentmisinin krciğerdeki serbest rdikl metbolizmsı üzerine oln muhtemel etkisi rştırılmış ve bu metbolizmdki değişimler enzimtik çıdn incelenmiştir. yrıc, orgnizmd hidrojen *.Ü. Tıp Fkültesi Biyokimy nbilim Dlı. ** S.S.Y.B. Hıfzıssıhh Enstitüsü ***.Ü. Tıp Fkültesi Ptoloji nbilim Dlı Geliş Trihi : Ock 1, 1995 Kbul Trihi : Mrt 30, 1995
192 O. Cnbolt - M. Kvutcu - S. Öztürk - E. Olcy - İ.H. Gökhun - C. Ekinci - D. İlker peroksit oluşumunu Fenton ve Hber-Weiss reksiyonlrı ile ktlizleyen demir (Fe) ve bkır (Cu) elementlerinin krciğerdeki konsntrsyonlrı d tyin edilmiştir. Bu çlışmd yrıc Vitmin E'nin krciğer dokusundki ntioksidn etkisi değerlendirilmiştir. MTERYL ve METOD İLÇLR : Gentmisin Dev, Vitmin E Roche firmlrındn sğlndı. Gentmisin dozu 200 mg/kg/gün, Vitmin E dozu 400 mg/kg/ gün olrk intr musküler olrk uygulndı. HYVNLR : Yklşık 2 ylık ve ortlm 450 grm ğırlığınd 30 erkek koby çlışmmızd deney hyvnı olrk kullnılmıştır. 1. gruptki 10 hyvn kontrol grubu olrk seçildi ve bu grub sdece serum fizyolojik uygulndı. 2. gruptki 10 hyvn gentmisin ve 3. gruptki 10 hyvn ise gentmisin + E vitmini yine 10 gün süreyle yukrıdki dozlrd uygulndı. Çlışmd gruplr ilç uygulmsı eş zmnlı olrk ypıldı. Hyvnlr deney şrtlrın hzırlık ve deney süresince norml lbortuvr diyetiyle beslendi. Hyvnlr servikl disloksyonl öldürüldükten sonr krciğer dokulrı yni gün ypıln homojenizsyon işlemine kdr buz tnkınd sklndı. DOKULRIN NLİZE HZIRLNIŞI VE KTİVİTE - MİKTR TYİNLERİ : Krciğer dokulrı deiyonize su ile yıkndıktn sonr Brun - Melsungen mrk homojeniztör ile 3 dkik 1000 devirde homojenize edildi. Homojent 20.000 g de 60 dk. sntrifüj edildikten sonr süperntnt lındı. Bu süperntd GSH-Px ktivitesi tyin edildi (10). Geriye kln süperntnt 5/3 (v/v) ornınd hzırlnn Etnol/kloroform çözeltisiyle 1/1 ornınd hzırlnıp 10.000 g de 60 dk. sntrifüj edildi. Sntrifüj sonrsı elde edilen süperntntd SOD (15,12) ve CT (1) ktiviteleri tyin edildi. Sntrifüj işlemlerinin hepsi + 4 C de ypıldı. Fe ve Cu miktrlrı Vrin Techtron tomik bsorbsiyon spektrofotometresiyle tyin edildi. Dokulrın protein miktrlrı Lowry metodu ile tyin edildi (9). GSH-Px ve CT ktiviteleri spesifik ktivite cinsinden verildi (İÜ/ mg protein). SOD ktivitesi ise NBTH redüksiyon hızını % 50 inhibe eden protein miktrı cinsinden ifde edildi. Fe ve Cu değerleri ise ppm olrk verildi. Dokulrdki histoptolojik değerlendirilme ptoloji nbilim Dlı trfındn ışık mikroskobu (Nixon ve bot mrk) ile ypıldı. İsttistik çlışmlr Student's t testi kullnıldı.
Kobylrd Gentmisirı'in Krciğer Toksitesirıirı rştırılmsı: E Vitmininin 193 SONUÇLR : Çlışm sonuçlrı Tblo I de verilmiştir. Bu tblodn d nlşılcğı gibi SOD değerleri gent ve gent + E vitmini grubund kontrol grubun göre yüksek olrk bulundu. Gent ve Gent + E vitmini grubundki SOD ktiviteleri kendi rlrınd krşılştırıldığınd ise bir frklılık gözlenmedi. GSH-Px ktiviteleri her iki grupt kontrol grubun göre düşük olrk bulunmuştur. Bun krşılık CT ktivitesi kontrol grubun göre gent grubund düşük bulunmsın rğmen isttistiksel olrk bir nlmlılık rzetmemiştir. Gent + E vitmini grubund ise CT ktivitesi kontrole göre düşük bulunmuştur. GSH-Px ve CT ktiviteleri çısmdn gent ve gent+e vitmini verilen iki grup krşılştırıldığınd GSHpx ktivitesinin değişmediği, bun krşılık CT ktivitesinin gent-i-e vitmini grubund düşük olduğu bulunmuştur. Fe ve Cu miktrlrı çısınd sonuçlr değerlendirildiğinde, gent ve gent + E vitmini gruplrınd kontrol gruplrın göre bir frklılık gözlenmemiştir. Gent ve gent + E vitmini gruplrı Fe ve Cu miktrlrı çısındn yorumlndığınd Fe miktrlrının değişmediği bun krşılık Cu değerlerinin gent + E grubund düşük olduğu bulundu. Ptoloji nbilim Dlınd ışık mikroskobu ile ypıln histoptolojik değerlendirme sonucund gent ve gent + E grubund ptolojik bir değişime rstlnmmıştır. TRTIŞM Gentmisinin serbest rdikl metbolizmsıyl oln ilişkisini böbrekler çısmdn çıklyn birçok çlışm olmsın rğmen ilcın bu metbolizmyl ilgili olrk krciğer toksitesini rştırn bir çlışmy litertür trmsınd rstlymdık. Bu çıdn biz sdece çlışmmızdn elde ettiğimiz bulgulrı kendi içersinde değerlendirmeye krr verdik. SOD enzim ktivitesinin kontrol grubun göre diğer iki grupt yüksek bulunmsı bu enzimin ortmd bulunbilecek peroksit rdikllerini ortdn kldırmsının bir çbsı olbilir. yrıc gent ve gent + E vitmini grubund ktiviteler rsı bir frklılık olmmsı ise E vitminin peroksit rdikllerini söndürmede bu dokud bir etkisinin olmdığının göstergesi olrk çıklnbilir. GSH-Px ktivitesinin her iki grupt kontrol grubun göre düşük bulunmsı bun krşılık CT çısındn nlmlı bir frklılık bulunmmsı hidrojen peroksiti substrt olrk kullnn ve oluşmsı muhtemel
48 O. Cnbolt - M. Kvutcu - S. Öztürk - E. Olcy - İ.H. Gökhun - C. Ekinci - D. İlker hidroksit rdikllerinden dokuyu koruyn bu iki enzimin ktivitelerindeki bskılnmyı göstermektedir. Gentnm SOD üzerine böyle bir etkisi görünmemekle berber, bu iki enzimden GSH-Px'in dh fzl etkilendiği ve ktivitesinin düştüğü yorumu getirebilir. Gent ve gent + E vitmini gruplrı çısındn krşılştırıldığınd E vitmininin GSH-Px üzerine bir etki göstermediği, bun krşılık ktlz ktivitesini dh d bskılndığı gözlenmiştir. Bu oly E vitminin bu dokud nti oksidn bir özellik tşımdığı vey henüz çıklnmyn bir meknizm ve enzim ktivitelerini etkilediği şeklinde çıklnbilir. Bu konun dh iyi ydınltılmsının ise nck kinetik çlışmlrl mümkün olbilecektir. Fe ve Cu konsntrsyonlrının kontrol grubun göre her iki grupt bir frklılık göstermemesi krciğer dokusu için Fenton ve Hber - Weiss reksiyonlrının önemli bir hidrojen peroksit kynğı olmdığı düşüncesini kl getirmektedir. Gent ve gent + E vitmini grubu her iki element çısındn değerlendirildiğinde, Fe çısmdn bir frklılık gözlenmezken Cu'nun gent+e vitmini grubund gent grubun göre dh düşük bulunmuştur. Bu durum, E vitmininin Cu metbolizmsını olumsuz yönde etkilediğini göstermektedir. Histoptolojik incelemede dokud bir ptolojiye rstlnmmsı gentnm krciğer üzerinde önemli bir toksitesinin olmdığı tesbitini desteklemektedir. Tblo I : Gent ve Gent + E vitmini uygulnn kobylrın krciğer dokulrındki enzim ktivite sonuçlrı ve element konsntrsyonlrı. Gruplr SOD GSH-Px CT CU Fe 1 10.92 + 2.66 0.71 +0.61 102.7 + 15.8 11.67 + 4.53 44.5 + 17.5 2 13.67 + 2.95 0.526 + 0.080 95.7 + 13.6 13.66 + 5.56 44.7+16.7 3 13.13 + 2.51 0.530 + 0.105 69.8 + 10.4 8.92 + 3.06 46.8 + 18.0 1. Grup : Kontrol 2. Grup : Gent 3. Grup : Gent + E vitmini 1-2 1-3 2-3 Student's t-testi sonuçln : P< 0.05 İsttistik olrk nlmlı : P> 0.05 İsttistik olrk nlmsız
Kobylrd Gentmisirı'in Krciğer Toksitesirıirı rştırılmsı: E Vitmininin 195 ÖZET Bu çlışm kobylrd gentnm krciğer toksitesini rştırmk ve E vitmininin ntioksidn etkisini incelemek mcıyl ypılmıştır. Krciğer dokusund Gluttyon Peroksidz (GSH-Px), Süperoksit Dismutz (SOD), Ktlz (CT) ktiviteleri ve Demir (Fe), Bkır (Cu) miktrlrı tyin edilmiştir. Çlışmd kullnıln kobylr 3 grub yrılmış 1. grup kontrol, 2. grup gent uygulnn, 3. grup ise gent + E vitmini uygulnn grup olrk seçilmiştir. SOD ktivitesi her iki grupt kontrol grubun göre rtış göstermiştir. GSH-Px değerleri gent ve gent + E vitmini uygulnn grupt kontrol grubun göre düşük bulunmuştur. Kontrol grubunun CT ktivitesi ile Gent grubunun CT ktivitesi rsınd isttistiksel olrk nlmlı bir frklılık bulunmmku.iır. Bun krşılık CT ktivitesi, gent + E vitmini verilen grupt düşük olrk bulunmuştur. Fe ve Cu çısındn her iki grupt kontrol grubun göre bir frklılık gözlenmemiştir. Gent tedvisinin krciğer dokusund SOD ktivitesini indüklediği, bun krşılık GSH-Px ve CT ktivitesini bskıldığı nlşılmıştır. Krciğer dokusund Hber-Weiss ve Fenton tipi reksiyonlr çısındn Fe ve Cu nun önemli bir ktkısının bulunmdığı tesbit edilmiştir. yrıc E vitmininin bu dokudki enzim ktiviteleri üzerinde herhngi bir etkisinin olmdığı görülmüştür. Histoptolojik inceleme sonuçlrı d gentnm krciğer üzerinde önemli bir toksite göstermediği görüşünü desteklemektedir. nhtr Kelimeler : Geııtmisin, Serbest Rdikller, Elementler SUMMRY Estblishment of Gentmicin Heptoloxicity in Guine Pigs : The effects of Vitmin E In our study, ctivities of mjör enzymes prticipting in free rdicl metbolism Iglutthione peroxidse (GSH-Px), Superoxide dismutse (SOD), Ctlse (CT) nd levels of Ferrun (Fe), Copper (Cu)l were mesured in liver tissues from guine pigs treted with gentmicin lone nd gentmicin + Vitmin E. In the gentmicin nd gentmicin + Vitmini E groups, SOD ctivities were found higher compred with control groups. GSH-Px ctivities were found to be decresed in gentmicin nd gentmicin +
196 O. Cnbolt - M. Kvutcu - S. Öztürk - E. Olcy - İ.H. Gökhun - C. Ekinci - D. İlker vitmin E groups. However, there were ııo meningful differences between CT ctivities of control nd gentmicin groups. In the vitmin E group, ctivity ws found lowered. Fe nd Cu levels of the the liver tissues of gentmicin nd gentmicin + vitmin E groups were not different from control group. We think tht Fe nd Cu re not importnt fctors s ctlyst of Hber- Weiss nd Fenton rections in the liver tissues treted by gentmicin. Result suggest tht gent cuses increses in SOD ctivities but decreses in GSH-Px nd CT ctivites. We found tht vitmin E did not mke ny effect on the ctivities of the free rdicl metbolising enzymes in the liver tissue. ccordingly, no importnt chnges were observed in the histopthologicl exmintions of the liver tissues due to gentmicin tretment. To sum up, enzymtic ntioxidnt defense system ws not significntly ffected with gentmicin tretment. Key words : Gentmicin, Free rdicls, Elements KYNKLR t. ebi H In : Metbods of Enzymtic nlysis (Ed. H.U. Bergmeyer), p. 673 cdemic Press Inc. New York nd London (19"4). 2. Durk I Yurtlni Z Cnbolt O kyol O : methodologicl pproch to superoxide dismutse (SOD) ctivity ssy bsed on msed on inhibition of nitroblue tetrzolium (NBT) reduction. Clin. Chim. çt. 1993; 214 : 103-104. 3. Freemn B Crpo JD : Biology of Disese Free rdicls nd Tissue injury, Lb Inv. 1982, 47,5,412. 4. Hoe SD Rowley nd B H'ilivvell : Rections of ferrioxmine nd desferrioxmine with the hydroxy! rdicl. Chem. Biol. Interctions. 1982; 41 : 75-81. 5. Humes HD nd M Weinberg : Toxic Nephropthies in the Kidney (Eds. B.M. Brenner nd F.C. Rector) p. 1491, W.B. Sunders Co. Phildelphi 1986. f<. Kvutçu M Cnbolt O Öztürk S : Reduced enzymtic ntioxidnt defense mechnism in kidney tissues from gentmicin treted guine pigs : The effect of vitmines E nd C. Nephron, 1995 (Bskıy Kbul Edildi). 7. Ngh EO Ogunleve IO nd Mdusolumuo M : Protection of selenium ginst gentmicininduced renl dmge in the rt. Biochem. 1984; 95. 831-837. 8. Lurenit G Criler MB Rolmn F Vn Hoof nd P Tulken,s Mechnism of minoglycosideinduced lysosoml phospholipids : in vitro nd in vivo studies with gentmicin nd mikcin. Biochem. Phmmcol, 1982; 31 : 3861-3870.
Kobylrd Gentmisirı'in Krciğer Toksitesirıirı rştırılmsı: E Vitmininin 51 9. Lowy O Rosenbrugn N Frr L Rondll R : Protein mesurement with theofilin pnenol regeııt J. Biol. Chem. 1951; 183 : 265-275. io. Pgli DE V.lentine WN : Studies on the quntittive nd qulittive chrcteristion of erythrocyte glutthione peroxdse. J. Lb. Clin. Med. 1967; 70 : 158-169..11. Powell JH nd MM Reidenber : Further studies of the response of kidney hysosomes to minoglycosides nd other ctions. Biochem. Phrmcol. 1983; 32 : 3213-3220. 12. Rmsmmy LS.Josepovitz KY Ling PB L ne nd Kloynides GJ Filure of inhibition of lipid peroxidtion by vitmin eto protect ginst gentmicin nephrotoxi-city in the rt. Biochem. Phrmcol. 1987; 36 : 2125-2132. 13 Rmsmmy LS Josepovitz KY Ling BP Lne nd Kloynides GJ : Effects of diphenlenedimine on gentmicin-induced lipid peroxidtion rıd toxidtion nd toxicity in rt ren! cortex. J Phrmcol. Exp. Ther. 1986; 238 : 83-88. 14. Simmons CF Bogusky RT nd Humes HD : Inhibitory effects of gentmicin on renl mitiochondril oxidtive phosphoryltion. J Phrmcol. Exp. Ther. 1980; 214 : 709-715. 15. Sun Y Oberley LW Li Y : simple method for clinicl ssy of superoxide dismutse. Clin. Chem. 1988; 34 : 479-500. 16. VVlker PD nd Shh SV : Evidence suggesting role of hydroxil rdicl in gentmicin-inducedcute renl filure in rts. Clin. Invest. 1988; 81 : 334-341. 17. Willims PD Holohn PD nd Ross CD : Gentmicin nephrotoxicity I. cute biochemicl correltes in rts Toxicol. ppl. Phrmcol. 1981; 61 : 234-242. 1.3. Willims PD Holohn PD nd Ross CR : Gentmicin nephrotoxicity II. Plsm membrne chnges. Toxicol. ppl. Phrmcol. 1981; 61 : 243-251. rdicls in cute nephrotoxic nephritis. Lb Invest. 1984; 51 : 396-403.