ARAÞTIRMALAR (Research Reports) Ýdiyopatik hipogonadotropik hipogonadizmli hastalarda konvansiyonel gonadotropin tedavisinin lenfosit alt guruplarý üzerine etkileri ve IL-2 reseptör (IL-2R) ekspresyonu ile iliþkisi The effects of conventional gonadotrophin therapy on lymphocyte subgroups and its association with IL-2R expression in patients with idiopathic hypogonadotrophic hypogonadism Fatih Tanrýverdi, Dr., MD. fatihtan@erciyes.edu.tr Ümit Demirkoparan, Dr., MD. Department of Internal Medicine, umit@yahoo.com Fahri Bayram, fbayram@erciyes.edu.tr Yusuf Özkul, Department of Genetics, ozkul@erciyes.edu.tr Munis Dündar, Department of Genetics, dundar@erciyes.edu.tr Hilal Akalýn, Dr., PhD., Department of Genetics, akalin@erciyes.edu.tr Türkan Patýroðlu, Department of Pediatrics, turkanp@erciyes.edu.tr Fahrettin Keleþtimur, fktimur@erciyes.edu.tr This study was honoured with the Gevher Nesibe Research Encouragement Awards Championship, 2005. This manuscript can be downloaded from the webpage: http://tipdergisi.erciyes.edu.tr/download/2007;29(1):001-006.pdf Submitted : January 21, 2006 Revized : September 26, 2006 Accepted : January 17, 2007 Özet Amaç: Seks steroidleri ve immün sistem iliþkisinin varlýðý insanda bilinmekle birlikte, otoimmün hastalýklarýn patogenezini anlamak için gerekli olan bu iliþkinin mekanizmasý halen açýk deðildir. Erkeklerdeki major seks steroidlerinden olan testosteron ile IL-2R ekspresyonunun lenfosit düzeyindeki fonksiyonel iliþkisi insanda in-vivo ortamda henüz incelenmemiþtir. Bu nedenlerden dolay idyopatik hipopogonadotropik hipogonadizmli (ÝHH) hastalarda planladýðýmýz, konvansiyonel gonadotropin tedavisinin lenfosit alt guruplarý ve periferal mononükleer hücrelerdeki (PMBC) IL-2R ekspresyonu üzerine etkileriyle ilgili araþtýrmanýn ön çalýþma sonuçlarýný sunacaðýz. Gereç ve Yöntem: ÝHH tanýsý alan 10 erkek hasta (ortalama yaþ 25,6 ± 7,1) ve yaþ/cinsiyet eþleþtirilmiþ 10 saðlýklý kontrol (ortalama yaþ 27,1 ± 3,9) çalýþmaya alýnmýþtýr. Hastalar 12 ay boyunca haftada 3 gün; hcg ve human postmenopozal gonadotropin (hmg) ile tedavi edilmiþtir. Lenfosit alt guruplarýndan CD3, CD4, CD8, CD16 ve CD19 yüzdeleri flow sitometri ile ölçülmüþtür. Quantitative real-time PCR ile kontrollerin PMBC lerinden elde edilen cdna larda IL-2R (hedef gen) ve beta-aktin (referans gen) ekspresyonu analiz edilmiþtir. Bulgular: Hasta gurubunda tedavi öncesi total lenfosit sayýsý kontrollere göre anlamlý olarak yüksek ve ortalama CD4 yüzdesi ise anlamlý olarak düþüktü (P<0,05). Tedavi sonrasýnda hastalarda lenfosit sayýlarý azaldý ve CD4 düzeyleri ise normalize oldu (P<0,05). Hastalarýn ortalama bazal IL-2R mrna düzeyi % 273.3 ± 50 olarak bulundu ve kontrole göre anlamlý olarak yüksekti. Tedavi sonrasýnda ise IL-2R mrna düzeyinde istatistiksel olarak anlamlý azalma saptandý (%93 ± 13) (P<0,05). Sonuç: Çalýþmamýzda literatürde ilk defa ÝHH tanýsý alan hastalarda in-vivo olarak seks hormonu ile sitokin reseptörünün iliþkisi lenfosit düzeyinde gösterilmiþ oldu. ÝHH li hastalardaki gerek lenfosit alt tiplerinde gerekse de daha belirgin olarak IL-2R ekspresyonunda normale göre farklýlýklar bulunmakta ve testosteron düzeyinin artmasýyla bu deðiþiklikler düzelmektedir. Anahtar Kelimeler: Hipogonadotropik hipogonadizm; Ýnterlökin reseptörleri; Lenfosit alt tipleri; Testosteron. Abstract Purpose: Although the presence of the interaction between sex steroids and the immune system is known, the mechanism of this interaction, which is very important in understanding the pathogenesis of the autoimmune disorders, is still unclear. In-vivo interaction of testosterone and IL-2R expression at lymphocyte level has not yet been investigated. Therefore, in the present study, we report the preliminary results of our ongoing study regarding the effects of conventional gonadotrophin therapy on lymphocyte subgroups and its relation with IL-2R expression in patients with idiopathic hypogonadotrophic hypogonadism (IHH). Materials and Method: Peripheral venous blood samples were obtained from 10 patients with IHH (Mean age 25.6 ± 7.1 years) and 10 age- and sex-matched healthy volunteers (Mean age 27.1 ± 3.9 years). Patients were treated for 12 months (3 days a week) with hcg and hmg. Lymphocyte subtype levels including CD3, CD4, CD8, CD16 and CD19 were analyzed by flow cytometry. Quantitative Real- Time RT-PCR was used to examine the express ion of IL-2R (target gene) and beta-aktin (reference gene) in peripheral mononuclear blood cells (PMBCs) derived from patients and controls. Results: In the patient group, before treatment total lymphocyte count was significantly high and the mean CD4 percentage was significantly low when compared to the results of healthy controls (P<0.05). Following gonadotrophin treatment, lymphocyte count and CD4 levels were significantly normalized (P<0.05). Baseline IL-2R mrna level was 273 ± 50 % in the patient group and a significant decrease in IL-2R mrna level was found after treatment (93 ± 13 %) (P<0.05). Conclusion: In-vivo interaction between sex hormone and cytokine receptor in patients with IHH was shown for the first time in the literature. Both lymphocyte subtypes and IL-2R expression are affected in IHH patients and the increase in serum testosterone levels normalizes these changes. Key Words: Hypogonadism, hypogonadotropic; Lymphocyte Subsets ;Testosterone; Receptors, Interleukin Corresponding Author: Fatih Tanrýverdi 38039, Kayseri/Turkey Telephone : +90 352 4374937-20957 E-mail : fatihtan@erciyes.edu.tr 1
Ýdiyopatik hipogonadotropik hipogonadizmli hastalarda konvansiyonel gonadotropin tedavisinin lenfosit alt guruplarý üzerine etkileri ve IL-2 reseptör (IL-2R) ekspresyonu ile iliþkisi Giriþ. Gonadotropin-releasing hormon tip-1 (GnRH-I) hipofizer gonadotroplardan GnRH reseptörü (GnRHR) aracýlýðýyla FSH/LH salýnýmýný saðlayan ve klasik olarak reprodüktif sistem fonksiyonlarý bilinen dekapeptit yapýda bir nörohormondur (1). Hayvan çalýþmalarýnda GnRH ve GnRHR ekspresyonunun santral sinir sistemi ile sýnýrlý olmadýðý ve meme, over ve prostat dokularýnda eksprese edildiði gösterilmiþtir (2). Ýnsan periferal T hücrelerinde de (CD4+, CD8+) immünreaktif ve bioaktif GnRH gösterilmiþtir (3,4). Bütün bu bulgular insanda klasik hipotalamo-pitüiter-gonadal aksýn (HPG aks) yanýsýra immün system düzeyinde bir lokal HPG aksýn varlýðýnýn göstergesidir (5). Son yýllara kadar organizmada tek GnRH izoformunun olduðu düþünülüyordu ancak White ve ark. tarafýndan tüm vertebralýlarda korunan ve GnRH-I ile %70 homoloji gösteren GnRH-II yi insanda klonlandý (6). GnRH-II nin özellikle ekstrahipotalamik bölgede eksprese edilmesi ve yaygýn doku daðýlýmý olmasý önemli fizyolojik fonksiyonlarýnýn olduðunu düþündürmektedir. Ýnsanda immün sistemde ve özellikle periferik T ve B lenfositlerde GnRH-I ve GnRH-II nin ekspresyonu ve peptidlerin varlýðý gösterilmiþtir (7,8). Deneysel çalýþmalardan elde edilen veriler her iki nöropeptidin potansiyel immün etkilerinin olduðunu ve otoimmün hastalýklarýn patogenezinde klinik öneminin olabileceðini göstermektedir. Ýnterlökin-2 (IL-2), IL-2 reseptör (IL-2R) kompleksi yoluyla lenfosit aktivasyon ve proliferasyonunda anahtar rol oynar, ve lenfosit altgrup deðiþiminde de etkili faktörlerden birisidir. Ýnsan ve ratlarda yapýlan in-vitro çalýþmalarda fonksiyonel önemi bilinmemekle birlikte, GnRH nýn periferal lenfositlerde IL-2R ekspresyonunu artýrdýðý gösterilmiþtir (9,10). Ancak insanda henüz lokal HPG aks ve IL-2/IL-2R iliþkisi halen tam aydýnlatýlamamýþtýr. Erkek ve kadýndaki major seks steroidlerinden olan testosteron ve östrojen in IL-2 veya IL-2R üzerine regüle edici etkileri çeþitli deneysel çalýþmalarda gösterilmekle birlikte; immün sistem fizyolojisinde önemli olabilecek seks steroidleri ile IL- 2/IL-2R ekspresyonunun lenfosit düzeyindeki fonksiyonel iliþkisi insanda in-vivo ortamda incelenmemiþtir (11-13). Bilindiði gibi immün sistem cinsiyete baðlý olarak çeþitli farklýlýklar göstermekte ve otoimmün ve/veya romatolojik hastalýklar kadýnlarda ve hipogonadizmli erkeklerde daha sýk görülmektedir. Seks steroidleri ve immün sistem iliþkisinin varlýðý klinik olarak insanda gösterilmekle birlikte bu iliþkinin mekanizmalarý halen açýk deðildir (5,14,15). Hipogonadizmli erkeklerde lenfosit alt guruplarýnda (CD3, CD4, CD8, CD19 düzeyleri) ve serum IL-2 düzeylerinde deðiþiklikler olabileceðini gösteren az sayýda klinik çalýþma vardýr; ancak bu çalýþmalarda mekanizma ile ilgili yeterli bilgi yoktur ve farklý sonuçlar rapor edilmiþtir (15,16). Seks steroidlerin immün sistem üzerine olan etkilerinin anlaþýlmasý, gerek otoimmün hastalýklarýn patogenezi gerekse de seks hormonlarýnýn bu hastalýklarda potansiyel kullanýmý yönünden klinik olarak çok önemlidir ve son yýllarda ilgi konusu olmuþtur. Yukarýda bahsedilen nedenlerden dolayý seks steroidleri ve lokal HPG aks arasýndaki fonksiyonel iliþkiyi in-vivo ortamda ortaya koymak amacýyla testosteron eksikliðinin en iyi klinik modeli olan idyopatik hipopogonadotropik hipogonadizmli (ÝHH) hastalarda çok yönlü bir araþtýrma projesi planladýk. ÝHH li hastlarda testosteron eksikliði ve tedavi ile düzeltilmesinin lenfosit alt guruplarý; serum IL-2, IL-4 ve soluble IL-2R düzeyleri; ve periferal mononükleer hücrelerde (PMBC) GnRH-I, GnRH-II ve IL-2R ekspresyonu üzerine olan etkileri araþtýrýlmaktadýr. Bu çalýþmada ise ÝHH li hastalarda konvansiyonel gonadotropin tedavisinin lenfosit alt guruplarý ve PMBC lerdeki IL-2R ekspresyonu üzerine etkileriyle ilgili ön çalýþma sonuçlarýný sunacaðýz. Hasta ve Metod Hasta özellikleri ve çalýþma planý: Çalýþmaya endokrinoloji polikliniðine baþvuran, ÝHH tanýsý alan 10 erkek hasta (ortalama yaþ 25.6 ± 7.1) ve yaþ/cinsiyet eþleþtirilmiþ 10 saðlýklý kontrol (ortalama yaþ 27.1 ± 3.9) alýnmýþtýr. Çalýþma Erciyes Üniversitesi etik kurulu tarafýndan onaylanmýþtýr (proje no: TA-O3-25 ). ÝHH tanýsý için kriter olarak, 18 yaþýndan sonra spontan püberte bulgularý olmamasý, ve serum testosterone, FSH ve LH düzeylerinin normalin alt sýnýrda olmasý alýnmýþtýr. MR ile hipofizer ve hipotalamik kitleler ekarte edilmiþtir, ve hastalarýn hiçbirinde anosmi ve aile hikayesi yoktur. Hastalar 12 ay boyunca haftada 3 gün; hcg (Profasi HP 2000 IU) ve human postmenopozal gonadotropin (Pergonal 75 IU FSH ve 75 IU LH) ile tedavi edilmiþtir. Tedavide etkinlik kriteri olarak serum total ve serbest testosteron düzeylerindeki artýþ alýnmýþtýr. Kan örnekleri hastalarda tedavi öncesi ve tedaviden 12 ay sonra alýnmýþtýr. Kontrollerin de kanlarý çalýþmanýn baþýnda alýnmýþtýr, ve detaylarý aþaðýda bahsedilen immünolojik ve genetik parametreler araþtýrýlmýþtýr. 2
Fatih Tanrýverdi, Ümit Demirkoparan, Fahri Bayram, Yusuf Özkul, Munis Dündar, Hilal Akalýn, Türkan Patýroðlu, Fahrettin Keleþtimur Ýmmünolojik parametreler: Tam kan sayýmý otoanalizör ile merkez biyokimya laboratuarýnda yapýlmýþtýr. Serum total ve serbest testosteron düzeyleri immünoradyometrik assay metodu ile nükleer týp laboratuarýnda ölçülmüþtür. Lenfosit alt guruplarýndan CD3, CD4, CD8, CD16 ve CD19 yüzdeleri monoklonal antikorlar kullanýlarak flow sitometri metotodu ile immünoloji laboratuarýnda ölçülmüþtür. Ayrýca serum immünoglobülin (Ig), C3c ve C4 düzeyleri de rutin kullanýlan metod ile analiz edilmiþtir. Periferal Mononükleer Hücre (PMBC) ekstraksiyonu ve Real-Time RT-PCR ile IL-2R ekspresyonunun tespiti Saðlýklý kontrollerden ve hastalardan (tedavi öncesi ve sonrasý) PMBC izolasyonu için standart metod olan Ficoll-Hypaque metodu kullanýlmýþtýr. Elde edilen PMBC lerden total RNA hazýr kit kullanýlarak izole edilmiþtir (RNeasy midi kit, Qiagen). Total RNA dan (2µg) komplementer DNA (cdna) eldesi için First Strand cdna Synthesis Kit (Fermentas, Life Sciences) kullanýlarak revers transkripsiyon (RT) yapýlmýþtýr. Quantitative real-time PCR Bio-Rad ÝCycler ÝQ sistemi kullanýlarak yapýlmýþtýr. Saðlýklý kontrollerden ve hastalardan (tedavi öncesi ve sonrasý) elde edilen cdna larda intron-spanning primerler kullanýlarak IL-2R (hedef gen) ve beta-aktin (referans gen) ekspresyonu analiz edilmiþtir. Primer dizeleri : IL-2R (sense 5 -CCAGGACCCACGGGAACCCA-3 ve anti sense 5 -GGTGGGAATTCGGGGCATCG-3 ) ve betaaktin (sense 5 -TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA- 3 ve anti sense 5 -CAGCGGAACCG CTCATTGCCAATGG -3 ) olarak seçilmiþtir. Kalýp cdna lar (2 µl); 25 l ÝQ SYBR Green Supermix ve her bir primerden 50 pmol içeren 50 µl lik PCR reaksiyonunda çoðaltýlmýþtýr. Hedef ve referans genin her ikisine de 35 döngü PCR reaksiyonu uygulanmýþ; denatürasyon 94ºC de 1 dk, annealing 61ºC de 40 sn, ekstensiyon 72ºC de 1 dk, ve son siklustan sonra final ekstension için 72ºC de 120 sn. Florasan data 585 nm dalga boyunda ve her siklusun 72ºC lik ekstensiyon fazýnda Real-Time PCR optik sistemi tarafýndan kaydedilmiþtir. Ürünlerin spesifitesi melt curve analysis ve agaroz jel elektroforezde koþturarak test edilmiþtir. Ekspresyon oranlarý hesaplanýrken Bio-Rad ÝCycler ÝQ tarafýndan saðlanan özel yazýlým programý kullanýlmýþtýr. Saðlýklý kontrollerden rasgele seçilen bir örnek kullanýlarak hem hedef gen hem de referans gen için farklý standart eðri elde edildi (1 üniteden 1/16 üniteye kadar 5 konsantrasyon kullanýldý). Standart eðriler üzerinden her örneðin eþik siklusu (C T) kullanýlarak hedef ve referans genlerin ünite cinsinden relatif konsantrasyonlar hesaplandý. Örnekler arasýndaki RNA kalite ve kantite farklýlýklarýný düzeltmek için IL-2R relative konsantrasyonu, beta aktin relatif konsantratsyonuna bölünerek normalize oranlar elde edildi. Elde edilen normalize oranlar kontrol ve hastalarýn (tedavi öncesi ve sonrasý) PMBC lerindeki IL-2R ekspresyonu olarak deðerlendirildi. Ýstatistik: Veriler ortalama ve standart hata (mean ± sem) veya median (minimum-maksimum) olarak ifade edildi. Kontrol ve hastalarýn tedavi öncesi deðerleri Mann- Whitney U testi ile, ve hastalarýn tedavi öncesi ve sonrasý deðerleri Wilcoxon testi ile karþýlaþtýrýldý. P<0,05 istatistiksel olarak anlamlý kabul edildi. Bulgular Hormonal ve immünolojik parametreler Hastalarýn tedavi öncesi ve sonrasý, ve saðlýklý kontrollerin ortalama testosteron düzeyleri ve immünolojik parametreleri Tablo I de özetlenmiþtir. Tedavi öncesinde hastalarýn ortalama total ve serbest testosteron düzeyleri kontrollerden anlamý olarak düþük bulundu (P<0,05). Hastalarda tedavi öncesi ve sonrasý testosteron düzeyleri karþýlaþtýrýldýðýnda istatistiksel olarak anlamlý yükselme saptandý (P<0,05). Hasta gurubunda tedavi öncesi total lenfosit sayýsý kontrollere göre anlamlý olarak yüksek ve ortalama CD4 yüzdesi ise anlamlý olarak düþüktü (P<0,05). Tedavi sonrasýnda hastalarda lenfosit sayýlarý azaldý ve CD4 düzeyleri ise normalize oldu (P<0,05). Hastalarýn bazal ortalama immünglobulin düzeyleri, kompleman aktivitesi, CD4 dýþýndaki diðer lenfosit alt guruplarý ve CD4/CD8 oraný kontrollerden farklý deðildi ve tedavi sonrasýnda da anlamlý bir deðiþiklik saptanmadý. Periferal Mononükleer Hücrelerde (PMBC) Quantitative Real-Time RT-PCR ile IL-2R ekspresyon düzeyleri Hasta gurubu (tedavi öncesi ve sonrasý) ve saðlýklý kontrollerde, IL-2R nin ekspresyon düzeylerini belirlemek için hedef ve referans genlerin standart eðrilerden elde edilen relatif miktarlarýnýn oranlanmasýyla (hedef gen miktarý / referans gen miktarý) elde edilen, normalize oranlar kullanýldý. IL-2R mrna düzeyleri kontrolün yüzdesi (ortalama ± SEM) olarak ifade edildi (Þekil 1). 3
Ýdiyopatik hipogonadotropik hipogonadizmli hastalarda konvansiyonel gonadotropin tedavisinin lenfosit alt guruplarý üzerine etkileri ve IL-2 reseptör (IL-2R) ekspresyonu ile iliþkisi Hastalarýn ortalama bazal IL-2R mrna düzeyi % 273.3 ± 50 olarak bulundu ve kontrole gore anlamlý olarak yüksekti (Þekil 1). Tedavi sonrasýnda ise IL-2R mrna düzeyi anlamlý olarak azaldý (%93 ± 13, P<0,05). Tartýþma Çalýþmamýzda ÝHH li hastalarda immünolojik parametrelerden sadece total lenfosit sayýsý ve CD4 (Yardýmcý T hücreleri, T H) yüzdesindeki deðiþiklik dýþýnda kontrol guruba göre anlamlý fark bulunamamýþtýr. Ancak mononükleer hücre düzeyinde incelediðimiz IL-2R ekspresyon oraný testosteron eksikliðinde belirgin olarak artmýþtýr, ve gonadotropin tedavisi sonrasýnda testosteron düzeylerinin yükselmesiyle IL-2R ekspresyon oraný normalize olmuþtur. Otoimmün hastalýklarýn cinsiyetler arasýnda farklýlýk göstermesi ve kadýnlarda immün cevabýn erkeklerden farklý olmasý bilim adamlarýný seks steridlerin immün sistem üzerine etkilerini incelemeye yöneltmiþtir. Seks steroidlerin immün sistem etkisini inceleyen birçok deneysel çalýþma yapýlmýþtýr. Ýmmün sistem organlarýnda (timus, dalak, lenf bezi, kemik iliðinde) hem östrojen reseptörü hem de androjen reseptörünün varlýðý gösterilmiþtir (17). Ancak matür T ve B lenfositlerde androjen reseptörü gösterilememiþtir ve bu hücrelere olan androjen etkisinin dolaylý veya non-genomik olabileceði öne sürülmüþtür (18). Ýn-vitro ve farede yapýlan in-vivo deneysel çalýþmalarýn çoðunda, testosteronun CD4/CD8 oranýný azalttýðý, östrojenin ise CD4/CD8 oranýný artýrdýðý gösterilmiþtir (5). Çalýþmamýzda ise testosteron replasmanýnýn CD4 düzeylerini artýrarak normalize ettiðini saptadýk. Deneysel çalýþmalardan farklý olarak testosteron replasmanýnýn CD4 üzerine etkisini östrojene benzer þekilde bulduk. In-vivo ve in-vitro arasýndaki bu farklýlýk erkeklerde testosteronu periferik dokularda östrojene çeviren aromataz aktivitesi ile açýklanabilir (19-21). ÝHH li hastalarýmýzýn tedavi öncesindeki estradiol düzeylerinin düþük olup gonadotropin tedavisi ile yükselmesi (tedavi öncesi 21,7 ± 4,4; tedavi sonrasý 71,9 ± 7,4) aromataz aktivitesini dolaylý olarak göstermekte ve hipotezimizi desteklemektedir. Ancak aromataz aktivitesinin direkt ölçümü ve erkeklerde lenfositlerdeki ekspresyonunun gösterilmesi ile östrojenin erkeklerde immün regülasyondaki önemi anlaþýlabilir. Literatürde ÝHH li hastalarda immün parametrelerin incelendiði iki in-vivo insan çalýþmasý yapýlmýþtýr (15,16). Yesilova ve ark. ÝHH li hastalarda Ig düzeyleri, CD3 yüzdeleri, CD19 yüzdeleri ve CD4/CD8 oranýný kontrole göre anlamlý olarak yüksek bulmuþtur ve tedavi ile bu deðerler düzelmiþtir (15). Kiess ve ark. ise ayný hasta gurubundaki immün parametrelerde kontrole göre fark bulamamýþ ve testosteron replasmanýnýn etkisini gösterememiþtir (16). Bizim çalýþmamýzda ise lenfosit sayýsý ve CD4 düzeyindeki hafif deðiþiklikler dýþýnda, ÝHH li hastalarda tedavi öncesi ve sonrasýnda lenfosit alt guruplarý ve Ig düzeylerinde anlamlý farklýlýk saptayamadýk. Elde ettiðimiz bulgular ÝHH li hastalardaki bilinen artmýþ immün reaktivitenin tek baþýna lenfosit alt gurup yüzde deðiþiklikleri ile açýklanamayacaðýný göstermektedir. T H (CD4) lenfositler salgýladýklarý sitokinlere göre TH1 ve TH2 altguruplarý olarak ayrýlýrlar. TH1 lenfositler IL- 2 ve TNF-alfa salgýlayýp hücresel immüniteyi destekler, TH2 lenfositler ise IL-4 ve IL-10 salgýlayarak humoral immüniteyi destekler. Son yýllarda otoimmün hastalýklarýn geliþiminde ve immün cevapta TH1/TH2 dengesinin önemi anlaþýlmýþtýr (22). Çalýþmamýzda tedavi öncesi ÝHH li hastalarýn mononükleer hücrelerinde IL-2R ekspresyonunu yaklaþýk olarak üç kat artmýþ olarak bulduk. Böylelikle elde ettiðimiz veriler testosteron eksikliðindeki TH1/TH2 dengesindeki bozulmanýn hipogonadizmdeki immün disregülasyonun önemli nedenlerinden birisi olduðunu düþündürmektedir. ÝHH li hastalarda tedavi öncesinde gösterdiðimiz artmýþ hücresel immün reaktivite, testosteron replasmaný ile normalize olmaktadýr (Þekil 1). Bulgularýmýzý destekleyen bir in-vivo deneysel çalýþmada, yanýk hasarýna maruz býrakýlan erkek farelerde testosteron reseptör blokajýnýn IL-2 ve IL-2R ekspresyonunu artýrarak hücresel immün sistemi yeniden yapýlandýrdýðý rapor edilmiþtir (12). IL-2R ekspresyonundaki testosterona baðlý deðiþikliklerin mekanizmasý ve PMBC lerdeki GnRH-I ve/veya GnRH- II ekspresyonu ile iliþkisinin ileri in-vivo ve in-vitro çalýþmalarla araþtýrýlmasý gerekmektedir. Sonuç olarak bu çalýþmada literatürde ilk defa ÝHH de in-vivo olarak seks hormonu ile sitokin reseptörünün iliþkisi lenfosit düzeyinde gösterilmiþ oldu. ÝHH li hastalardaki gerek lenfosit alt tiplerinde gerekse de daha belirgin olarak IL-2R ekspresyonunda normale göre farklýlýklar bulunmakta ve testosteron düzeyinin artmasýyla bu deðiþiklikler düzelmektedir. Ýmmün sistem ve endokrin sistem etkileþiminin gelecek çalýþmalarla anlaþýlmasý birçok otoimmün hastalýðýn patogenezinin çözülmesini ve yeni tedavi seçeneklerinin geliþmesini saðlayacaktýr. 4
Fatih Tanrýverdi, Ümit Demirkoparan, Fahri Bayram, Yusuf Özkul, Munis Dündar, Hilal Akalýn, Türkan Patýroðlu, Fahrettin Keleþtimur IL-2R mrna (kontrolünün yüzdesi %) 350 300 250 200 150 100 50 0 * kontrol ve tedavi öncesi P<0,05 ** tedavi öncesi ve tedavi sonrasý P < 0,05 * kontrol tedavi öncesi tedavi sonrasý Gruplar ** Þekil 1: ÝHH li hastalarda IL-2R ekspresyonunun tedavi öncesi ve sonrasý deðerlerinin kontrol gurubu ile karþýlaþtýrýlmasý (IL-2R mrna düzeyleri kontrolün yüzdesi (ortalama SEM) olarak ifade edildi). Tablo 1: Hata ve kontrol gurubunda analiz edilen hormonal ve immünolojik parametreler Hasta Gurubu Parametreler Kontrol Gurubu Tedavi Öncesi Tedavi Sonrasý Total testosteron (ng/dl) 431 (222-1341)* 31 (12-99) 708 (439-1069) ** Serbest testosteron (pg/ml) 15 (10-26)* 0.86 (0.01-2.24) 25 (10-36)** Ig G (mg/dl) 1200 (983-1410) 1200 (998-1510) 1195 (995-1550) Ig A (mg/dl) 203 (96-269) 202 (96-418) 234 (78-964) Ig M (mg/dl) 106 (56-165) 94 (74-260) 102 (62-268) Ig E (IU/dL) 66 (0.3-224)) 44 (0.3-250) 22 (0.4-147) C3c (mg/dl) 131 ( 65-179) 131 (83-213) 114 (66-163) C4 (mg/dl) 16 (11-46) 19 (13-39) 17 (9-31) Lenfosit (mm 3 ) 2090 (1500-3770)* 2350(1900-3500) 2245 (1830-2800) ** CD4 + (%) 44 (30-50)* 34 (19-50) 41 (21-56) ** CD8 + (%) 27 (19-38) 31 (23-50) 32 (23-56) CD3 + (%) 72 (54-79) 70 (48-85) 70 (65-88) CD16 + (%) 13 (8-15) 18 (2-26) 14 (6-22) CD19 + (%) 11 (7-19) 13 (3-77) 13(7-17) CD4 + / CD8 + 1,55 (0,95-2,56) 1,17 (0,49-1,48) 1.24 (0,38-2,03) median (minimum-maksimum) * kontrol ve tedavi öncesi P<0,05 ** tedavi öncesi ve tedavi sonrasý P < 0,05 5
Ýdiyopatik hipogonadotropik hipogonadizmli hastalarda konvansiyonel gonadotropin tedavisinin lenfosit alt guruplarý üzerine etkileri ve IL-2 reseptör (IL-2R) ekspresyonu ile iliþkisi Kaynaklar 1. Conn PM, Crowley WF Jr. Gonadotropin-releasing hormone and its analogues. N Engl J Med 1991; 324:93-103. 2. Kakar SS, Musgrove LC, Devor DC, Sellers JC, Neill JD. Cloning, sequencing, and expression of human gonadotropin releasing hormone (GnRH) receptor. Biochem Biophys Res Commun 1992;189:289-295. 3. Azad N, La Paglia N, Jurgens KA, et al. Immunoactivation enhances the concentration of luteinizing hormone-releasing hormone peptide and its gene expression in human peripheral T-lymphocytes. Endocrinology 1993;133:215-223. 4. Azad N, LaPaglia N, Kirsteins L, et al. Jurkat cell proliferative activity is increased by luteinizing hormone-releasing hormone. J Endocrinol 1997; 153:241-249. 5. Tanriverdi F, Silveira LF, MacColl GS, Bouloux PM. The hypothalamic-pituitary-gonadal axis: immune function and autoimmunity. J Endocrinol 2003;176:293-304. 6. White RB, Eisen JA, Kasten TL, Fernald RD. Second gene for gonadotropin-releasing hormone in humans. Proc Natl Acad Sci U S A 1998;95:305-309. 7. Chen A, Ganor Y, Rahimipour S, Ben-Aroya N, Koch Y, Levite M. The neuropeptides GnRH-II and GnRH-I are produced by human T cells and trigger laminin receptor gene expression, adhesion, chemotaxis and homing to specific organs. Nat Med 2002;8:1421-1426. 8. Tanriverdi F, Gonzalez-Martinez D, Silveira LF, et al. Expression of Gonadotropin-Releasing Hormone Type-I (GnRH- I) and Type-II (GnRH-II) in Human Peripheral Blood Mononuclear Cells (PMBCs) and Regulation of B- Lymphoblastoid Cell Proliferation by GnRH-I and GnRH-II. Exper Clin Endocrinol & Diabetes 2004;112:587-594. 9. Batticane N, Morale MC, Gallo F, Farinella Z, Marchetti B. Luteinizing hormone-releasing hormone signaling at the lymphocyte involves stimulation of interleukin-2 receptor expression. Endocrinology 1991;129:277-286. 10. Chen HF, Jeung EB, Stephenson M, Leung PC. Human peripheral blood mononuclear cells express gonadotropinreleasing hormone (GnRH), GnRH receptor, and interleukin- 2 receptor gamma-chain messenger ribonucleic acids that are regulated by GnRH in vitro. J Clin Endocrinol Metab 1999;84:743-750. 11. Barak V, Mordel N, Zajicek G, Kalichman I, Treves AJ, Laufer N. The correlation between interleukin 2 and soluble interleukin 2 receptors to oestradiol, progesterone and testosterone levels in periovulatory follicles of in-vitro fertilization patients. Hum Reprod 1992;7:926-929. 12. Messingham KA, Messingham KA, Shirazi M, et al. Testosterone receptor blockade restores cellular immunity in male mice after burn injury. J Endocrinol 2001;169:299-308. 13. Posma E, Moes H, Heineman MJ, Faas MM. The effect of testosterone on cytokine production in the specific and nonspecific immune response. Am J Reprod Immunol 2004;52:237-243. 14. Kocar IH, Yesilova Z, Ozata M, Turan M, Sengul A, Ozdemir I. The effect of testosterone replacement treatment on immunological features of patients with Klinefelter's syndrome. Clin Exp Immunol 2000;121:448-452. 15. Yesilova Z, Ozata M, Kocar IH, Turan M, Pekel A, Sengul A et al. The effects of gonadotropin treatment on the immunological features of male patients with idiopathic hypogonadotropic hypogonadism. J Clin Endocrinol Metab 2000;85:66-70. 16. Kiess W, Liu LL, Hall NR. Lymphocyte subset distribution and natural killer cell activity in men with idiopathic hypogonadotropic hypogonadism. Acta Endocrinol (Copenh) 1991;124:399-404. 17. Olsen NJ, Kovacs WJ. Gonadal steroids and immunity. Endocr Rev 1996;17:369-384. 18. Olsen NJ, Kovacs WJ. Effects of androgens on T and B lymphocyte development. Immunol Res 2001;23:281-288. 19. Berstein LM, Santner SJ, Brodie AM, Koos RD, Naftolin F, Santen RJ. Pseudoaromatase in circulating lymphocytes. J Steroid Biochem Mol Biol 1993;44:647-649. 20. Berstein LM, Larionov AA, Poroshina TE, Zimarina TS, Leenman EE. Aromatase (CYP19) expression in tumor-infiltrating lymphocytes and blood mononuclears. J Cancer Res Clin Oncol 2002;128:173-176. 21. Brodie A, Inkster S, Yue W. Aromatase expression in the human male. Mol Cell Endocrinol 2001;178:23-28. 22. Huang WT, Lu HK, Chou HH, Kuo MY. Immunochistochemical analysis of Th1/Th2 cytokine profiles and androgen receptor expression in the pathogenesis of nifedipine-induced gingival overgrowth. J Periodont Res 2003; 38:422-427. 6