ORAL BÖLGE KÖK HÜCRE ELDE EDİLME KAYNAKLARI VE KULLANIMI

T.C. Ege Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesi Ağız,Diş ve Çene Cerrahisi Anabilim Dalı ORAL BÖLGE KÖK HÜCRE ELDE EDİLME KAYNAKLARI VE KULLANIMI BİTİRME TEZİ Stj. Diş Hekimi: Eda ŞAHİN Danışman Öğretim Üyesi : Prof. Dr. Hüseyin KOCA İZMİR-2013

ÖNSÖZ Oral Bölge Kök Hücre Elde Edilme Kaynakları ve Kullanımı konulu bitirme tezimi hazırlarken,tez çalışmamda benden hoşgörü ve yardımlarını esirgemeyen değerli hocam sayın Prof.Dr. Hüseyin KOCA ya,iyi niyet ve yardımlarını esirgemeyen sayın Dt.Yasin ER e,araştırmalarımda bana yardımcı olan ve her zaman yanımda olan Yunus AKALIN a,en önemli destekçilerim,beni bugünlere getiren aileme;annem:leyla ŞAHİN ve babam:ismail Hayati ŞAHİN e ve bu süreçte sıkıntılarımı paylaşan tüm arkadaşlarıma sonsuz teşekkürlerimi sunarım. İZMİR-2013 Stj. Diş Hekimi Eda ŞAHİN

1.GİRİŞ VE AMAÇ Tarih boyunca insanoğlunun en büyük hedeflerinden biri hastalıklara çare bulmak ve insan ömrünü uzatmak olmuştur. Çeşitli bitkilerden elde edilen karışımların binlerce yıl önce tedavide kullanıldığına dair bilgiler mevcuttur. İnsanoğlunun bilinç altında ki ölümsüzlüğe ulaşma isteği bugüne kadar tıp biliminin itici gücü olmuştur. Genlerin yapılarındaki bozukluklara bağlı hastalıklarda, hastalığın kökenine yönelik tedavi yöntemlerinin geliştirilmesi belki de bu hastalıkların kesin ve kalıcı çözümü olacaktır. Ayrıca böbrek, kalp ve karaciğer gibi hayati organlarda ortaya çıkabilen hastalıklarda insan ölümlerinde önemli rol almaktadır. Bu hastalıkların ilaçla tedavisi bazen mümkün olabilmekte; ancak kimi zaman organ yetmezlikleri kaçınılmaz bir son olmaktadır. Son yıllarda doku mühendisliği alanındaki yeni gelişmeler sayesinde insan vücudunu oluşturan herhangi bir hücre kullanılarak; deri, kemik ve kalp kası gibi çeşitli biyouyumlu dokular üretilebilmektedir. Otolog olarak elde edilen organların nakli, hem organ bağışı azlığı probleminin hem de vücudun organı reddetme olasılığının ortadan kaldırılması açısından önemli bir hal almaktadır. Dişhekimliği uygulamalarında da tümör, konjenital anomaliler, travma gibi nedenlerle meydana gelen diş dokularındaki kayıpların kök hücrelerin kullanımıyla birlikte tedavi edilebilirliğine dair çalışmalar rapor edilmiştir. Oral bölgedeki farklı kaynaklardan otolog olarak elde edilen kök hücrelerin kullanımı sayesinde maksillofasiyal bölgedeki sert doku ve diş hastalıklarının tedavisinde yeni bir çağa geçilmektedir.

Bu tezin amacı maksillofasiyal cerrahi ve dişhekimliği uygulamalarındaki kök hücre özelliklerinin, elde edilme kaynaklarının ve kullanım alanlarının incelenmesidir.

İÇİNDEKİLER 1. GİRİŞ VE AMAÇ...1 2.Kök Hücre Tarihçesi...2 3.Kök Hücre Tanımı...4 3.1.Kök Hücre Nedir?...4 4.Kök Hücre Özellikleri..5 4.1.Kök Hücre Bölünmesi..5 4.1.1.Asimetrik Hücre Bölünmesi..5 4.1.2.Simetrik Hücre Bölünmesi...5 4.2.Kök Hücre Farklılaşması....5 4.2.1.Farklılaşma Kapasitelerine Göre Kök Hücre Çeşitleri.. 7 4.2.1.1.Embriyonik Kök Hücreler...8 4.2.1.2.Erişkin Kök Hücreler.....11 4.2.1.2.1.Hematopoetik Kök Hücre (HKH)...14 4.2.1.2.2.Mezankimal Kök Hücreler (MKH)....16 5.Klinik Kök Hücre Uygulamaları....18 5.1.Kök Hücre Klinikte Kullanılabilir mi?...18 5.2.Nasıl Uygulanabilir?...19

5.2.1.Tür..19 5.2.2.HLA (İnsan Lökosit Antijenleri) Doku Grubu Uyumu......20 5.2.3.Akrabalık Durumu.20 6.Diş Hekimliğinde Kök Hücre 21 6.1.Epitelyal Kök Hücreler (EpSCs).23 6.2.Mezenşimal Kök Hücreler (MSCs)...23 6.3.Dental Pulpa Kök HÜCRELERİ 24 6.4.Eksfoliye Süt Dişlerindeki Kök Hücreler (SHED) 25 6.5.Yetişkin Dental Pulpa Kök Hücreleri (DPSCS)..26 6.6.Apikal Papilla Kök Hücreleri (SCAPS).27 6.7.Dental Folikül Kök Hücreleri (DFSCS).28 6.8.Periodontal Ligament Kök Hücreleri (PDLSC)...29 6.9.Kemik İliği Esaslı Mezenşimal Kök Hücreler (BMSCS).31 7.Diş Hekimliğinde Kök Hücre Kullanımı 31 7.1.Kemik ve Kıkırdak...32 7.2.Dentin ve Dental Pulpa..33 7.3.Tükürük Bezi ve Oral Mukoza 34

8.SONUÇ 35 9.KAYNAKLAR... 37 10.ÖZGEÇMİŞ......48

2.KÖK HÜCRE TARİHÇESİ İnsanlık tarihi boyunca sorulmuş olan; ''Hasara uğramış bir organın fonksiyonlarını restore etmenin, onun yerine yenisini koymaktan daha iyi bir yolu var mıdır?'' sorusu kök hücre kavramı ile birlikte tekrar gündeme gelmiştir. Tarih boyunca transplantasyon düşüncesi bu soru üzerine yoğunlaşmış olup sfenksler, deniz kızları ve kantaronlar mitolojide birer xenotransplantasyon örneği olarak yerini almıştır. Mitolojide ateşi Olimpos Dağı'ndan, tanrılardan çalarak insanlığa hediye etmesi üzerine Zeus tarafından cezalandırılan Prometheus un hikayesi de buna bir örnektir. Zeus tarafından Kaf dağında bir kayaya bağlanarak karaciğerinin hergün bir kartal tarafından yenmesi şeklinde bir cezaya çarptırılan Prometheus un karaciğeri hergün kendisini yenilemektedir. Bu, karaciğer hücresinin rejenerasyon yeteneği ve dolayısı ile kök hücre kavramını ortaya koyan ilk hikayedir. Araştırmacı Aygün (1) günümüzde kök hücre tedavisi üzerine ilk çalışmaları yaparak, insan ömrünü uzatmanın yolunun, doğum sonrası atılan plasentalarda, kordon hücrelerinde olduğunu belirtmiştir. 1950-1960 lı yıllarda hayvanlardan elde ettiği fetal ve kordon kanı greftleri ile çeşitli hastalıkların tedavisinde araştırmalar yapmış ve Alman tıp dergilerinde yayınlamıştır. İlk olarak 1967 yılında tanımlanan embriyonel karsinoma hücrelerinin kültür ortamında çoğaltılması da bu alanda ileri doğru atılmış önemli bir adım olarak bilinmekte olup o zamandan beri insan ve fare teratokarsinomlarından çok sayıda hücre serisi tanımlanmıştır. Bu hücrelerin diferansiyasyonu; 2

embriyoid cisimcikler olarak adlandırılan embriyo benzeri oluşumların meydana gelmesiyle sonuçlanan hücre agregasyonu ile geliştiği bildirilmiştir.(1) Söz konusu embriyoid cisimcikler ilk olarak, embriyonal karsinomlu farelerin asit sıvılarında gözlenmiştir.(1) Bu hücreler biyologlar için de önemli bir model oluşturmaktadır. Çünkü in-vitro diferansiyasyon paternlerinin, embriyogenezin çeşitli yönlerini açıkladığı ve 3 germ tabakasının tümünü temsil edici hücrelerin oluşumu ile sonuçlandığı görülmektedir. Aynı zamanda, in vitro fertilizasyon laboratuvarlarından alınan fazla embriyolar kullanılarak, insan embriyonik kök hücrelerinin üretilmesine yönelik çalışmalar da başlamıştır. Bu çalışmaların başlangıçta başarısız olmasına karşın pre-implantasyon blastosistlerinden izole edilen hücrelerde diferansiyasyonu incelemek için yapılan bir girişimde tavşan embriyo hücrelerinin kültür ortamına getirilebildiği rapor edilmiştir.(1) İnsan çalışmalarında embriyonik kök hücreleri ilk olarak 1998 yılında kültüre edilebilmiştir.(1) Aynı zaman diliminde, insan primordial germ hücrelerinden embriyonik germ hücreleri de elde edilmiştir.(1) Bu kök hücrelerin gelecekte birçok hastalığın tedavisi için kullanılabilecek olması büyük bir heyecan yaratırken, henüz çözümlenmemiş etik sorunlar ciddi bir direnç yaratmaktadır. Bu hücrelere karşı gösterilen etik reaksiyonlar sonucu, erişkin kök hücreleri ile ilgili çalışmalar da yoğunlaşmış ve bu hücrelerin belirgin plastisiteleri kemik iliğinden kas, beynin kana çevrilmesi, kanın beyne çevrilmesi gibi başlıkların görülmesine neden olmuştur. Bu ilk çalışmalardan sonra erişkin ve embriyonik kök hücrelerle ilgili çok sayıda 3

çalışmalar yapılmıştır.(1) Bu çalışmaların hepsi aynı amacı taşımaktadır : ''Kök hücre esaslı tedavi''.(1) 3.KÖK HÜCRE TANIMI 3.1.Kök hücre nedir? Kök hücre, bir canlının vücudunda çok uzun bir süre bölünmeye devam ederek kendini yenileyebilen ve köken aldıkları doku tipinden farklı hücre tiplerine dönüşebilen ana hücrelerdir. Bir hücrenin kök hücre olarak nitelendirilebilmesi için bu özellikleri taşıması gerekmektedir. Vücudumuzdaki kas, karaciğer, deri, kalp hücreleri özelleşmiş hücreler olup bölündükleri zaman yine aynı doku tipine ait hücreler oluştururlar. Oysa kök hücrelerin bu hücrelerden farkı, belirlenmiş bir fonksiyonlarının bulunmamasıdır. Bu yüzden kök hücreler dış ortamdan aldıkları sinyallere göre farklı hücre tiplerine dönüşebilirler. Bunu belirleyen en önemli etkenler de dış ortam genetik yolakları ve lokal mikroçevredeki sinyallerdir. Vücudumuzdaki herhangi bir hücre grubunda ölüm ya da hasar meydana gelince kök hücreler hangi hücreye ihtiyaç varsa o hücreye dönüşüm gösterirler. 4.KÖK HÜCRE ÖZELLİKLERİ özellikleri; Bir hücrenin kök hücre olarak adlandırılabilmesi için gerekli olan 4

Uzun süre bölünebilmeli ve kendini yenileyebilmeli, Farklılaşmamış olmalı ve özelleşmiş hücrelere dönüşebilmelidir. 4.1.Kök Hücre Bölünmesi Bir kök hücre popülasyonun var olmasını sağlayan 2 mekanizma vardır: 4.1.1.Asimetrik Hücre Bölünmesi (zorunlu asimetrik replikasyon) : Bir kök hücre, kendiyle özdeş olan bir ana hücreye bölünür, diğer hücre ise farklılaşır. 4.1.2.Simetrik Hücre Bölünmesi (stokastik farklılaşma) :Bbir kök hücre iki farklı oğul hücreye bölündüğünde başka bir kök hücre mitoza gider ve ana hücreye özdeş iki kök hücreyi üretir.(2) 4.2.KÖK HÜCRE FARKLILAŞMASI Son yıllarda; belli bir dokudan alınan hücrelerin farklı bir dokuya diferansiye olabilme özelliği gösterdiğini bildiren çalışmaların sayısı giderek artmıştır ve bu çalışmalar, kök hücre plastisitesi çatısı altında toplanmışlardır. Kök hücre plastisitesi olarakta bilinen hücre farklılaşması; bir hücrenin köken aldığı dokunun dışındaki farklı doku tipine ait hücrelere diferansiye olabilme özelliğini tanımlamaktadır. Bunun örnekleri arasında endotele, kas hücrelerine, kalp kasına ve hepatositlere dönüşebilen kemik iliği kökenli hücreler ve hatta kemik iliği kökenli hücreler ve hatta purifiye edilmiş hematopoetik kök hücreler bulunmaktadır. 5

Embriyonik gelişim süresince döllenmiş yumurtadan bir çok hücre tipi meydana gelmektedir. Bir canlının tüm vücut hücrelerinde genom aynıdır, hücrelerin farklılaşmasını sağlayan genlerin ifade edilmesi ya da edilmemesidir. Erken dönemli embriyonun hücreleri arasında, bölünme öncesinde yumurtada bulunan sitoplazmik bileşenlerin eşit olmayan dağılımından kaynaklanan farklılıklar vardır. Fakat, çoğu embriyonal hücrelerin çevrelerindeki yerel değişikliklerden etkilenmekte oldukları bir gerçektir. Aynı zamanda hücresel çeşitlenmede, hücrelerin birbirleriyle ve çevreyle olan etkileşimleri de rol oynamaktadır. Memeli yumurtaları, simetrik olmaları nedeniyle istisnai bir durum yaratırlar. Bundan dolayı, erken memeli embriyosundaki tüm hücreler başlangıçta birbirine benzerdir ve ancak birbirleriyle etkileştiklerinde değişirler. Normal gelişim koşulları ve komşu hücrelerden ayrılan fare embriyo hücreleri, ilerideki aşamalarda embriyonik kök hücrelerinin elde edilebileceği teratokarsinomaları oluşturmak üzere çoğalırlar. Fakat, normal bir embriyoya implante edilirlerse, hücreler normal davranışlarına geri döner ve çevresel şartlara bağlı olarak farklılaşıp sağlıklı bir hayvanın oluşumuna katkıda bulunurlar. Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi nden Gerard Bain ve David I. Gottlieb ile çalışma arkadaşları ( 2 ), fare embriyonik kök hücrelerinin bir A vitamini türevi olan retinoik asitle muamele etmekle, bu hücreleri sinir hücrelerine dönüşmelerini uyarmışlardır. Bu basit kimyasal madde hücreler üzerinde gösterdiği bu etkisini, sadece nöronlar tarafından kullanılan bir dizi geni aktive ederken, hücre farklılaşması ile ilgili diğer yolları ifade eden genleri inhibe ederek ortaya koymuştur. Kan hücreleri hakkında yapılan bir diğer çalışmada da benzer bir başarı elde edilmiş; bazı özel büyüme 6

faktörlerinin embriyonik kök hücrelerden kaynaklanan hücreleri, kandaki tüm tiplerini üretmek üzere uyardıkları gözlenmiştir.(2) 4.2.1.Farklılaşma Kapasitelerine Göre Kök Hücre Çeşitleri Sperm ile ovumun birleşmesi ile ortaya çıkan zigot tek başına tüm organizmayı meydana getirebilecek genetik bilgiye ve güce sahiptir. Tüm hücrelere dönüşebilme potansiyeline sahip ilk embriyonel hücreye totipotent hücre adı verilmektedir. Döllenmeyi takip eden ilk 4-5 gün içerisinde bu hücreler aynı güce sahip olup her biri tek başına bir organizma meydana getirebilme yeteneğine sahiptir. 5. gün sonunda oluşan hücre kitlesine de 'blastosist' denir ki bu kitle içindeki hücreler de (iç hücre kitlesi) vücuttaki tüm hücrelere dönüşebilme yeteneğine sahiptir. 200 farklı hücre tipine dönüşebilen bu hücreler tek başlarına bir organizmayı oluşturma kapasitesinden yoksundurlar. Bu nedenle bu hücrelere pluripotent hücre denir. Bu aşamadan sonra hücreler daha özel fonksiyonlara sahip olmakta ve erişkin kök hücreleri oluşturmaktadır. Biraz daha özelleşmiş olan bu kök hücrelere ise multipotent hücre denmektedir. Buna en iyi örnek hem çocukluk döneminde hem de erişkin dönemde kemik iliğinde bulunan hematopoetik kök hücrelerdir. İnsan vücudunda ancak birkaç hücre türüne dönüşebilen bu hücreler, laboratuvar koşullarında gerekli destekleyici ortam ve sinyaller sağlandığında çok daha fazla hücre türüne dönüşebilmektedir. 7

Resim 1 : Oocyte hücrelerinde başkalaşım 4.2.1.1.Embriyonik Kök Hücreler Embriyonik kök hücre denilince blastosistin iç hücree kitlesinden elde edilen pluripotent özellikteki hücrelerr kastedilmektedir. Bu hücreler üç embriyonik germ tabakasınat a farklılaşma yeteneğine sahiptirler. Üç germ tabakası bir yetişkindeki 220 den fazla hücre tipini oluşturur.. Bazı farklılaşmış pluripotent hücrelerr yetişkinlerde multipotent hücreler (örneğin kemik iliğinde) olarak bulunabilirler ancak bu hücrelerin farklılaşma yetenekleri sınırlıdır. Sınırsız olarak kendilerini yenileyebilmeleri ve plastisite (farklı hücre tiplerine t dönüşebilme) yetenekleri sebebiyle rejenatif tıp ın enn önem verdiği konulardan biri embriyonik kök hücre araştırmalarıdır. Embriyonik kök hücreler 1981 yılında ilk kez bağımsız iki grup tarafından fare embriyosundan elde edilmiştir..(3) İnsan embriyonik kök hücreleri 1994 yılında izole edilebilmiş, 1998 yılında ise kültüre edilebilmiştir. (3)Kök hücreler teratoma (teratokarsinoma) adı verilen bir kanserr tipinin 8

alanizi sırasında kaeşfedilmiştir.(3) 1964 yılında araştırıcılar teratomadan izole edilen tek bir hücrenin farklılaşmadan kültürde kaldığını gözlemişlerdir.(3) Bu tip kök hücreler embriyonik karsinoma hücreleri (EC) olarak isimlendirilirler. Ayrıca embriyonik primordial germ hücrelerinin de (EG) kültüre edilebildiği ve farklı hücreleri oluşturmaları için uyarılabildikleri fark edilmiştir.(3) Embriyonik kök hücrelerinin laboratuar ortamında büyütülebilmesi için değişik kültür yöntemleri üzerine çalışmalar devam etse de, gelişimleri için destek hücrelere ihtiyaçları vardır. Ayrıca başkalaşmamış yapılarının korunması için yetiştirildikleri kültür ortamlarının LIF (Leukemia indibitory factor), B-FGF gibi ajanlar ile desteklenmesi gerekir. Bazı araştırma ve geliştirme Laboratuarlarında bu amaçla Balb/c inbred farelere ait 12-14 günlük fetuslardan elde edilen embriyonik fibroblast hücreleri destek hücresi olarak kullanılmaktadır. Hücrelerin bölünme kapasitesini, bir bakıma ömrünü belirleyen faktörlerden biri, telomerler ve telomeraz aktivitesidir. Telomer ökaryotik hücrelerin kromozomlarında bulunan özgül bir gen bölgesidir. Tekrarlayan TTAGGG bölgesinden oluşur. Bu bölge kromozom degredasyonunu önler ve replikasyonu güçlendirir. Böylece hücreye çoğalma yeteneği kazandırır. Birçok kanser hücresinde ve embriyonik kök hücrelerde bu gen bölgesinin aşırı aktivitesi görülür. Bu nedenle kök hücreler uzun süre boyunca bölünebilirler. Özellikle birçok kanser tipinde bu genin supressor genlerinde inaktivasyon vardır. Apoptosisde ise telomeraz aktivitesinin inhibisyonu gerçekleşir. Ayrıca sadece embriyonik kök hücreler ve kanser hücrelerinde ifade edilen ve trankripsiyon faktörü olarak da görev yapan Oct-4 geninin 9

hücrelere bölünme yeteneği kazandırdığı düşünülmektedir. Oct-4 geninin farklılaşmış hücrelerde ifade edilmediği gösterilmiştir.(3) Embriyonik kök hücre hatlarını oluşturma sürecinin çeşitli aşamalarında kültürasyonu yapılmış hücreler, embriyonik kök hücrelerin temel özelliklerini taşıyıp taşımadıklarını kontol etmek amacıyla test edilmektedir.(3) Bu süreç, karakterizasyon olarak bilinmektedir. Uygulanan testler: Mikroskop incelemesi Yüzey marker varlığının saptanması Karyotip analizi Pluripotensi özelliklerinin test edilmesi Embriyonik kök hücrelerin tanımlanabilmeleri için erken dönemde ifade edilen belirteç (SSEA-1,3,4, TRA-1-60 ve 81) veya gen ürünlerinin (OCT-4) immunositokimyasal yöntemlerle boyanması tekniği kullanılmaktadır.(3) Embriyonik kök hücreler, herhangi bir özel müdahaleye gerek olmaksızın bazı yararlı dokuları üretebilmektedirler. Araştırmacılar bu tür transformasyonların meydana gelmesini sağlayabilir ve istedikleri hücre tipi neyse bu yönde bir seçim ve yönlendirme yapabilirler.(3) Indiana Ünv. Tıp Fakültesi nde Loren J. Field ve arkadaşları bunu başarabilmişlerdir.(3) Basit fakat etkin bir yöntem uygulayarak kendiliğinden farklılaşan kalp kası hücreleri veya kardiyomiyositleri- %99 un da üstündeki bir saflıkta elde edebilmişlerdir. Field ve grubu,(3) bu amaca ulaşabilmek için öncelikle 10

kendini sadece kardiyomiyositlerde ifade edebilen bir antibiyotik dirençlilik genini fare embriyonik kök hücrelerine vermişler, hücrelerin farklılaşmasına olanak sağlandıktan ve bu geni kaybetmiş hücreleri ölmelerine neden olacak kadar antibiyotikle muamele ettikten sonra saf kardiyomiyositleri elde edebilmişlerdir. Bu hücreler yetişkin bir farenin kalbine transplante edildiğinde kardiyomiyositler gelişebilmiş ve sağlanabilen en uzun bir periyod olan 7 hafta boyunca canlı kalabilmişlerdir. 4.2.1.2.Erişkin Kök Hücreler Erişkin kök hücre olarak adlandırılan hücreler ve bu hücreleri destekleyen hücreler mikroçevre olarak adlandırılan bir yörede ve erişkinde kemik iliği, kalp, böbrek, beyin, deri, göz, gastrointestinal sistem, karaciğer, pankreas, akciğer, meme, over, prostat ve testis gibi organlarda tespit edilmiştir.(3) Erişkin kök hücreler, adı geçen organda kendilerine ait bir mikroçevre içerisinde kısa veya uzun bir süre dinlenmede kalabilirler. Bunlar, özel mikroçevre içerisinde yüksek telomeraz aktivitesine sahip oldukları halde embriyonik kök hücrelerle karşılaştırıldıklarında daha kısıtlı bir farklılaşma potansiyelleri vardır ve daha sınırlı sayıda progenitör hücre oluştururlar. Erişkin kök hücreleri, bir doku veya organdaki farklılaşmamış hücre olup, mikro çevrelerindeki değişiklikleri takiben bu hücreler kendisini yenileyebilir ve bulunduğu doku veya organın özel hücre tiplerine farklılaşabilirler. Erişkin kök hücrelerin organizmadaki asıl görevleri, bulundukları dokuyu tamir etmek ve dokunun devamlılığını sağlamaktır. Kök hücrelerin bulundukları ortam, kök hücrelerin fonksiyonları üzerinde önemli etkilere sahiptir. Mikro çevreden kaynaklanan değişikliklerle, kök hücrenin 11

gen ekspresyonundaki değişim yeni hücrelere farklılaşmasına yol açmakta ve yeni oluşan bu hücreler de dokuya uyum sağlamaktadırlar. Şimdilerdeki görüş, erişkinlerdeki çoğu dokularda sessiz biçimde bölünmeden bekleyen kök hücreler olduğu yönündedir. Ancak bu hücreleri bulundukları yörede etkinleştirecek çevresel uyaranların, normalden çok düşük yada eksik olduğu düşünülmektedir.(3) Nitekim, tip I diabetes mellitus da olduğu gibi vücudun kendi kendini tamir etme yeteneğinin olmadığına inanılmaktadır.(3) Erişkin kök hücreleri, özellikle hematopoetik kök hücreler bazı fizyolojik veya patolojik koşullarda dolaşım yoluyla diğer uzak dokulara yayılabilirler. Bir organizma olgunlaşırken, kök ve öncül hücrelerin sayısı azalır. Dolayısıyla, erişkin kişilerdeki dokular az sayıda kök hücre içerir. Olgun bir dokudaki hücrelerin çoğu, kendi bulundukları çevreye uyum sağlamış, belirli fenotipik özellikleri olan farklılaşmış hücrelerdir. Bu nedenle, bir organın yenilenme kapasitesi, yaşla birlikte ve etkin biçimde bölünebilen kök hücrelerin sayısıyla orantılı olarak azalır. Bununla birlikte vücut, dokuların yerine konulması ve yenilenmesi için iki yol geliştirmiştir. İlk yolda, farklılaşmış hücrelerdeki çoğalma kapasitesi söz konusudur. Hasar sonrası, o bölgede hücre kaybının sınırlı bir şekilde yerine konmasını yönlendirmeye yetecek kadar mitojenlerin salındığı ve böylece hücre bölünmesinin uyarıldığı karaciğer, iskelet kası ve damar endotel hücreleri bu gruba girmektedir. Diğer yolda ise, bölünebilen kök hücrelerden gelen yeni nesil hücreler farklılaşmış hücrelerin yerini alır. Bu kategoride bulunan hücre grubu, hematopoetik hücrelerdir. 12

Hematopoetik serideki bütün hücreler, kendisini yenileyebilen, sınırlı sayıdaki çoğalma potansiyeline sahip hücrelerden oluşurlar ve bu hücreler, olgun kan hücrelerine farklılaşmayı kontrol eden uygun sitokin ve büyüme faktörlerinin etkisi altındadır. Daha önce bahsedilen çoğu dokuda da kök hücre bulunmasına rağmen, en sık kullanılanı ve elde edilmesinin en kolay olması nedeniyle burada hematopoetik kök hücreden bahsedilecektir. Günümüzde üzerinde en çok çalışma yapılan hematopoetik kök hücre grubu (HKH) en azından in vivo olarak kendi-kendini yenileyen hücre bölünmelerine uğramakta, tek hücre düzeyinde bütün matür kan elemanlarına diferansiye olabilmekte ve myeloablasyona uğramış bir insanın veya hayvanın kemik iliğini yeniden popule edebilmektedir. Diğer erişkin kök hücreler ise daha yakın zamanlarda tanımlanmış olup, bu nedenle de üzerlerinde daha az çalışılmıştır.(3) Bununla beraber nöronal kök hücreler (NKH), mezenkimal kök hücreler (MKH) ve epidermal kök hücreler yukarıda açıklanan temel kriterlere uymaktadırlar. Korneal kök hücreler ve angioblastlar ya da endoteliyal kök hücreler olarak adlandırılan diğer kök hücreler de tek bir diferansiye hücre tipine diferansiye olabilme özelliklerinin dışında bu kriterlere uymaktadırlar (3). Yetişkinde her organ ve dokuda aynı sayı ve potansiyelde kök hücrelere rastlanmaz. Örneğin, beyinde bu hücreler oldukça az sayıda bulunmaktadır. Bu nedenle beyin hasarlarında bir kemik veya doku gibi organ yenilenmesi olmaz, hasar genellikle kalıcıdır ve ciddi sonuçlar doğurur. Günümüzde, araştırmacılar yetişkin dokulardan elde edilen kök hücrelerin diğer organ ve dokulara farklılaşması yönünde çalışmalar yapmaktadırlar. (4) 13

4.2.1.2.1.Hematopoetik Kök Hücre (HKH) Hematopoez memelilerde embriyogenezin geç dönemlerinde kemik iliğinde gözükmeye başlar. Kemik iliği patolojik durumlarda ekstramedullar yörelere yer değiştirmediği sürece ömür boyunca hematopoez burada devam eder. Periferik kanda gözlenen tüm kan elemanları hematopoetik kök hücreden (HKH) kaynaklanırken, kemik iliğinde HKH nin kendini yenilemesi ve farklılaşması destekleyici mikroçevrenin veya niş in (niche) varlığına çok sıkı olarak bağlıdır. Niş kavramı bir türün yaşadığı çevre şartlarının toplamı iken, hematopoetik niş HKH yi destekleyen mikroçevre olarak tanımlanmıştır.(4)kemik iliği, stroma ve hematopoetik hücrelerden oluşan çok organize bir dokudur. Stromada bulunan osteoblastlar granulosit koloni stimüle edici faktör, interlökin-6, Notch ligandı jagged 1 gibi çeşitli faktörleri ifade ederek HKH lerin proliferasyon ve farklılaşmasını etkileyebilirler. Doğum sonrası, HKH ler kemik iliği, kordon kanı ve mobilize edilmiş periferik kan gibi dokularda bulunurlar. HKH lerin en önemli belirteçlerinden birisi CD34 dür. Erken progenitorlarda bulunurken daha olgun hücrelerde bulunmaz. HKH ler kemoterapi ve/veya radyoterapi ile miyeloablasyon sağlanan hastalara verildiğinde adezyon molekülleri sayesinde kemik iliğinde yerleşir ve yeni kan hücrelerini oluşturur, yani engraftment özelliği gösterir (6). Allojeneik kemik iliği transplantasyonu ile lösemiler, kemik iliği yetmezlikleri, prelösemik sendromlar tedavi edilirken, yüksek dozda kemoterapi 14

uygulanmasına imkan sağlayacak otolog nakil ile çoğu solid tümörlerin tedavisi mümkün olmaktadır. Kemik iliğindeki HKH ler pluripotent özellikte olup, en azından 10 farklı fonksiyonel (nötrofil, monosit/makrofaj, bazofil, eozinofil, eritrosit, trombosit, mast hücreleri, dendritik hücreler, B ve T lenfositler) hücre tipini oluşturabilirler. Kemik iliği mikroçevresinde bulunan HKH ler Sca-1, CD34 gibi yüzey belirteçlerini taşır. Hematopoesis esnasında, periferik kanda az miktarda CD34+ hücrelerin bulunması, HKH lerin kemik iliği ile diğer organlar arasında sürekli bir hareketini akla getirir. Kemoterapiden sonra kemik iliğinin tekrar yapılanması ve büyüme faktörlerinin uygulanması, CD34+ hücrelerin periferik kan içerisine mobilizasyonunu kolaylaştırır. Kemik iliği ve mobilizasyondan sonra periferik kanda bulunan CD34+ hücrelerde transkripsiyon faktörlerinin tanımlanması, CD34+ hücrelerin kendi kendilerini yenileme, farklılaşma, mobilizasyon ve migrasyon özelliklerini de ortaya çıkarır. HKH lerin kemik iliğinde varlığını gösteren en önemli bulgu, kemoterapi ve/veya radyoterapi ile myeloablasyona uğratılmış kişiye verilen kemik iliğinin hematopoetik yapılandırmayı sağlamasıdır. HKH lerin hematopoetik yapılandırmayı sağlamasının en önemli sebebi, HKH lerin kendi kendini yenileme yeteneklerinin olması ve daha olgun hücre gruplarına farklılaşabilmesindendir. Hematopoetik organlardan elde edilen kök hücrelerin, hematopoetik hücrelerden farklı olarak kemik, kıkırdak, nöral hücreler, pnömositler, kas, deri, endotel, epitel hücreleri, hepatositler gibi hücreleri oluşturma kapasiteleri vardır. HKH lerden başka, hematopoetik hücreleri oluşturan dokularda en azından üç tane primitif progenitor/kök 15

hücre tipi tanımlanmıştır: i) Hemanjioblast (HB): hematopoetik ve kan damar endotel hücrelerinin prekürsörüdür. ii) Mezankimal kök hücre (MKH): mezodermal kökenli kemik, kıkırdak, kas, nöral hücreler, adipoziti oluşturur ve hematopoetik stromayı destekler. iii) Multipotent erişkin progenitor hücreler (MAPC): Ekdodermal, endodermal, mezodermal kökenli hücrelerin çoğunu oluşturur. (7)MKH ler ve MAPC ler, hematopoetik hücrelerin en önemli belirteci olan CD45 i taşımazlar. Kemik iliğinde bulunan çekirdekli hücrelerin % 0.0001 gibi küçük bir kısmını oluştururlar. Mezodermal kökenli dokulara diferansiye olabilirler. İn vitro koşullarda T lenfosit proliferasyonunu inhibe ederler. En önemli özellikleri sistemik dolaşıma verildiklerinde mezodermal kökenli dokulardaki infarkte dokuya yerleşebilirler. Bu özellikleri, MKH lerin kültür süreleri arttıkça ve infarkt eskidikçe azalır. 4.2.1.2.2.Mezankimal Kök Hücreler (MKH): Kemik iliği kökenli mezankimal hücrelerini kemik iliği aspirasyonu ile elde etmek mümkündür ve kemik iliğindeki toplam çekirdekli hücre sayısının küçük bir kısmını oluştururlar (%0,0001). KI haricinde bu hücreler kas, fetal KI, karaciğer, kan ve kordon kanında da bulunurlar (7). Standart kültür teknikleri ile in vitro koşullarda çoğaltılabilirler, morfolojik olarak fibroblastları andırırlar. Kemik iliğindeki bu hücre popülasyonunu gösterebilmek için birçok monoklonal antikor oluşturulmuştur.(8) Stro 1, nonhematopoetik progenitor kemik iliği stroma hücrelerini tanımlamakta kullanılır. SB-10, diferansiye olmamış mezankimal hücrelerde bulunan bir antijenle reaksiyona giren antikordur. Spesifik SB-10 antijeni CD166 (aktif lökosit adezyon molekülü, ALCAM) olarak tanımlanmıştır ve hücrenin 16

osteojenik diferansiyasyonunda sorumlu olabilir. SH-2 antikoru da insan mezankimal hücrelerini tanımlamakta kullanılır, TGF- β üzerindeki epitopla (CD105) reaksiyona girer. Bu antikor insan mezankimal hücrelerinin immünomagnetik seleksiyonunda da kullanılmıştır.(8) Ancak, CD105 sıklıkla endotel hücreleri ile birlikte bulunur. SH-3 ve SH-4 antikorları da membrana bağlı ekto-5 -nükleotidazlarındaki (CD73) farklı epitopları tanır. SH-2 gibi bunlar da osteosit veya hematopoetik hücrelerle reaksiyona girmezler. Ancak bu belirteçlerin hiçbirisi mezankimal hücreler için spesifik değildir. MKH ler özellikle hücre bağlanması ve homing özelliklerinden sorumlu olmak üzere integrinlerden yüksek oranda α1, α5, β1 ve düşük oranda α2, α3, α6, αv, β2 ve β4 eksprese ederken, α4, αl, β2 ekspresyonu yoktur. İnsan mezankimal hücreleri HLA-ABC ekspresyonu gösterirken, HLA- DR ekspresyonu yoktur, HLA-DR ancak γ-interferon tedavisini takiben upregüle olur. T lenfositlerin allojeneik periferik lenfositler, dentritik hücreler ve fithemaglutinin tarafından proliferasyonu mezankimal hücrelerince baskılanır. Bu etki, TGF-β1 ve hepatosit büyüme faktörüne karşı antikorlarca tersine çevrilir. İnsan mezankimal hücreleri farklı immünofenotipik özelliklerine bakılmaksızın, HLA-II ekspresyonunun olmaması ve düşük oranda kostimulatuar moleküllerin olması nedeniyle nonimmünojenik veya hipoimmonojeniktir. MKH lerin IV infüzyonunu takiben, kemik kırığı, miyokard enfarktüsü ve iskemik serebral hasarlı yörelere özel migrasyon kapasiteleri vardır. Serebral iskemik dokudaki kemokin monosit kemoatraktan protein (MCP-1) verilen mezankimal hücrelerin hasar yöresine migrasyonuna sağlar. Normal beyinde bulunmayan MCP-1, ratlarda orta serebral arter oklüzyonunu takiben süratle upregüle olur ve mezankimal hücreler için kemotaktiktir. 17

Hücrelerin homing özellikleri uzun süreli kültürü takiben azalır, bu nedenle tedavi amacıyla bu hücrelerin hazırlanışı esnasında dikkat edilmesi gerekli bir konudur. MKH ler doku mühendisliği açısından kemik, kıkırdak, KI stroması, kas, yağ, tendon rejenerasyonunda ve gen tedavisi, vasküler destek, nöronal çevre temininde önemlidir. MAPC ler, MKH lerden farklı olarak besin desteği-fakir kültür ortamında ve çok daha yavaş olarak büyürler (izolasyondan 100 gün sonra). ROSA 26 fareden alınan MAPC ler fare blastosisti içine enjekte edildiklerinde oluşan şimerik farenin beyin, akciğer, myokard, karaciğer, barsak ve böbrek gibi çoğu somatik dokularını oluşturabilirler. Subletal ışınlanmış immünyetersiz bir fareye IV olarak verildiğinde kemik iliği, kan ve dalaktaki hematopoetik hücrelere ve karaciğer, akciğer ve mide epiteline diferansiye olabilirler (8). İn vitro koşullarda süresiz olarak büyüme ve in vivo kendini yenileme özellikleri ile uyumlu olarak MAPC ler telomeraz eksprese ederler, telomer uzunluğu birçok bölünmeden sonra bile korunur. 5.KLİNİK KÖK HÜCRE UYGULAMALARI 5.1.Kök Hücre Klinikte Kullanılabilir mi? Yüzyıllar boyunca hekimler öğrendiklerini hastaları üzerinde uygulamışlardır. Önceleri usta-çırak ilişkisinde güç alan bu durum sonrasında günümüz kabul gören pozitif bilim ilkelerine göre sürdürülmüştür. Klinik ilaç araştırmaları bu konuda gelinen son noktadır. Bilinmesi ve unutulmaması gereken husus kök hücrelerin de günümüzde yasal otoriterlerce tedavi amaçlı bir ilaç olarak kabul edildiğidir. Bu durum hekimlerin kök hücre kullanmasını gerektiren hastalıklarda gerekli şartları yerine getirmesini 18