Clinical Chemistry 55:12 2113 2120 (2009) Endokrinoloji ve Metabolizma Plazma VLDL Yağ Asit Oranlarından Hepatik Lipid Bileşimi ve Stearol-Koenzim A Desaturaz 1 Ekspresyonunun Belirlenmesi Hepatic Lipid Composition and Stearoyl-Coenzyme A Desaturase 1 Expression Can Be Estimated from Plasma VLDL Fatty Acid Ratios Andreas Peter, 1* Alexander Cegan, 2 Silvia Wagner, 3 Rainer Lehmann, 1 Norbert Stefan, 1 Alfred Konigsrainer, 3 Ingmar Konigsrainer, 3 Hans-Ulrich Haring, 1 and Erwin Schleicher 1 GİRİŞ: Stearoil-koenzim A desaturaz 1 (SCD1) insanlarda doymamış mono yağ asitlerinin sentezinin sınırlayıcı basamağını katalizler ve trigliserid üretiminde önemli rol oynar. SCD 1 in metabolik ve inflammatuar hastalıkların patojeneziyle ilişkili olduğu defalarca gösterilmiştir. Bu yüzden insan örneklerinde SCD1 aktivitesinin saptanması önemli bir yer tutar. Bu çalışmada insanlarda hepatik SCD1 ekspresyonunu değerlendirmek için plazma VLDL trigliserid bileşiminden elde edilmiş hepatik SCD1 aktivite indeksinin değerlendirilmesini hedefledik. Buna ek olarak biraz daha ileri giderek plazma VLDL ve hepatik yağ fraksiyonlarında yaygın olarak kullanılan yağ asidi oranlarını (elongaz, de novo lipojenez ve Δ5 veδ6 desaturaz) değerlendirdik. MATERYAL ve METOD: Karaciğer biyopsileri ve plazma örnekleri 15 bireyden eş zamanlı olarak toplandı. Plazma VLDL ultrasantrifujle elde edildi. Hepatik ve plazma VLDL lipidleri ince-tabaka kromatografisiyle ayrıldı ve her fraksiyon yağ asid bileşimi gaz kromatografisiyle analiz edildi..hepatik SCD1 ekspresyonu Real-time PCR ile saptandı. BULGULAR: Hepatik SCD1 ekspresyonu hepatik lipid fraksiyonlarının ürün/öncü(prekürsör) oranlarıyla(16:1 / 16:0 ve 18:1 / 18:0 ) ilişkilendirildi. Hepatik ve VLDL trigliseridlerde 16:1 / 16:0 oranı gibi plazma VLDL 18:1 /18:0 oranı hepatik SCD1 ekspresyonu ile yakından ilişkilendirildi. Trigliseridlerden hepatik de novo lipojenez indeksi lipojenik genlerin(yağ asid sentaz (FASN) ve sterol düzenleyici eleman bağlayan transkripsiyon faktör 1 (SREBP-1) in ekspresyonuyla ilişkilendirildi ve VLDL trigliseridler de novo lipoenez indeksiyle ifade edildi. SONUÇLAR: Açlık plazma VLDL inde SCD1 aktivitesini rutin kan örneklerinden noninvasif olmadan ölçerek hepatik SCD1 ekspresyonunun gösterilebileceğini ilk defa kanıtladık. 2009 American Association for Clinical Chemistry Stearol-koenzim A desaturaz 1 (SCD1) doymamış mono yağ asid sentezinin sınırlayıcı basamağı olarak Δ9 desatürasyonunu katalize eden mikrozomal bir enzimdir(1). Kısa ömürlü enzim SCD1 in sellüler aktivitesi hücrede bulunan enzimlerin miktarıyla belirlenir ve düzenlenir. SCD1 ekspresyonu hormonal(1), besinsel(2),çevresel ve genetik faktörlerden(3,4) etkilenir ve organizmanın ihtiyaçları doğrultusunda enzim seviyelerini hemen ayarlar. Kemirgen ve hücre kültürü çalışmaları obezite(1,5), insulin direnci(1,5,6), diabete mellitus(7), ve ateroskleroz (8,11) gibi inflammatuar hastalıkların da (3,12-16) patogenezinde SCD1 in önemli bir rolü olduğunu desteklemektedir. Bu nedenle,scd1 aktivitesinin insan örneklerinde saptanması, klinik çalışmalarda ve müdahalede sağlık ve hastalık için SCD1 in rolünün açığa kavuşturulmasının son zamanlarda önemli yararı olmuştur(3,4,13-16). In vivo SCD1 desatürasyon aktivitesinin direk olarak saptanmasında kararlı izotop tekniğinden başka çeşitli dokularda da (adipoz doku, iskelet kası) SCD1 desatürasyon ürün ve prekürsör yağ asitleri oranı (18:1 n9/18:0 ve 16:1n7 16:0) insan kohortlarında yapılan 1 Department of Internal Medicine, Division of Endocrinology, Diabetology, Vascular Medicine, Nephrology and Clinical Chemistry, University of Tu bingen, Tu bingen Germany; 2 University of Pardubice, Faculty of Chemical Technology, Department of Biological and Biochemical Sciences, Strossova Pardubice, Czech Republic; 3 Department of General, Visceral and Transplant Surgery, University Hospital Tu bingen, Tu bingen, Germany. * Address correspondence to this author at: Department of Internal Medicine, Division of Endocrinology, Diabetes, Vascular Medicine, Nephrology and Clin-ical Chemistry, University of Tu bingen, Germany, Otfried-Mu ller Straj3e 10, 72076 Tu bingen, Germany. Fax +49-7071-293188; e-mail Andreas.Peter@ med.uni-tuebingen.de. Received March 31, 2009; accepted July 28, 2009. Previously published online at DOI: 10.1373/clinchem.2009.127274 4 Nonstandard abbreviations: SCD1, stearoyl-coenzyme A desaturase 1; FFA, free fatty acid; CE, cholesterol esters; PL, phospholipids; TG, triacylglycerides; TLC, thin-layer chromatography; DNL, de novo lipogenesis; DG, diacylglycerides. 2113
çalışmada enzim aktivitesinin yerine geçmesinde kullanılır (3,14,17). Buna ek olarak, desatürasyon aktivite indeksi çeşitli plazma lipid fraksiyonlarında gösterilmesine rağmen hangi dokuların SCD1 aktivitesinin bu plazma belirteçleri (işaretleyici) ile ifade edildiği teoride bir tartışma noktası olarak kalır. Yağ asidi oranlarının tam plazma yerine tanımlanmış plazma lipid fraksiyonlarından saptanması tavsiye edilir(18,19). Majör yağ asit içeren plazma lipid fraksiyonlarının{serbest yağ asitleri(ffa), esterler (CE), fosfolipidler (PL) ve triaçilgliseridler (TG)} spesifik yağ asidi bileşimlerinden dolayı, tam plazmadan SCD1 desatürasyon indeksinin ( ya da 18:1/18:0) saptanmasıyla elde edilen sonuçlar bütünüyle SCD1 aktivitesini göstermeyebilir ancak kuvvetlice plazma trigliserid düzeyi ile korelasyon gösterir(15,18,19,21). Şimdiye kadar, sadece açlık plazma FFA 16:1n7/16:0 oranı insanlarda adipoz doku yağ asid bileşimini gösterir(18). Karaciğer lipid homeostazisinde temel organdır ve hepatik lipid deposu insulin direnci,diabetes mellitus ve obeziteyle bağlantılıdır(22).. Etik sebeplerden ötürü karaciğer doku örnekleri klinik araştırmalar için az bulunur; bundan dolayı hepatik SCD1 ekspresyonu ve aktivitesini gösteren kan belirteçlerini (işaretleyici) kurmayı hedefledik. Çünkü VLDL karaciğerde toplanır ve buradan salınarak dolaşıma katılır (3,16,18). VLDL-TG nin SCD1 eskpresyonunu ve hepatik yağ asidi bileşimini gösterebileceğine dair bir hipotez kurduk. Yukarıdaki soru işaretlerini cevaplamak için, eş zamanlı olarak hem karaciğer örnekleri hem de kan örnekleri 15 hastadan elde edildi ve plazma VLDL- TG de yağ asidi örneklerı belirlendi ve 5 hepatik lipid fraksiyonları ince tabaka kromotografisi ile (TLC) ayrıldı. Sonrasında, SCD1 aktivite indeksleri ( ve 18:1/18:0) hepatik lipid fraksiyonları ile plazma VLDL-TG leri ve hepatik SCD1 ekspresyonlarını karşılaştırdık. Ayrıca Δ5 ve Δ6 desaturaz aktivite indeksleri gibi elongaz ve yağ asidi örneklarından de novo lipojenez(dnl) indeksleri ve ilişkili enzimlerin ekspresyonunu da değerlendirdik. Hastalar, Materyaller ve Metodlar Hastalar Bu çalışmada 15 bireyin tamamı (6 kadın, 9 erkek, ortalama(se) yaş 66 (9), vücut kütle indeksi 24(4)kg/m²) karaciğer ameliyatı için bir programa kondu. Ameliyat için belirtiler, hepatik hemanjioma(1), kolorektal karsinomların hepatik metastasının kurative reseksiyonu (11) ya da hepatosellüler karsinoma (2), ve karaciğer apsesiydi (1). Çalışma hastaları viral hepatit için negatif olarak test edildi ve karaciğer sirozları yoktu..bütün çalışma katılımcıları bu araştırma çalışmasına katılmaya izin verdiklerini belirten yazılı belge verdiler, Helsinki bildirgesine bağlı olarak Tübingen Üniversitesinin (protokol no: 168/2005) Etik Kurulunun da onayı alındı. Karciğer biyopsi örnekleri ameliyat sırasında normal, hastalıksız dokudan alındı ve hemen sıvı nitrojen de dondurularak -80C de saklandı..açlık plazma örnekleri aynı günde edinildi ve yağ asidi örneğinin analizi için -80C de saklandı. Yağ Asidi Örneği Öncelikle, plazma VLDL fraksiyonu HDL ve LDL fraksiyonlarından ayrıldı. Bu prosedür için, eşit miktarlarda NaCl çözeltisi (1.006g/ml) ve insan plazması ultrasantrifujde (Optima;Beckman Coulter) 18 saat 10 C de 817480 g de ultrasantrifuj edilir. Sonra en üst tabaka(vldl fraksiyonu) alınır ve sonraki prosedür için analiz edilir. Karaciğer örnekleri %1Triton X-100 içeren PBS de TissuLyser (Qiagen) kullanılarak homojenize edilerek lipid analizi için hazır hale getirilir. VLDL fraksiyonunu ayırmak için TLC kullandık ve karaciğer homojenatı fosfolipid,diaçilgliserol, FFA,TG,ve CE içeren 5 alt fraksiyona ayrılır. Örnekler 2-propanol,n-heptan ve 2mol/L fosforik asid kullanılarak proteinden ayrılır. Toluol, metanol,ve su eklenir ve 8175g de santifuj edildikten sonra üst tabaka nitrojen altında kurutulur. Lipidler CHCL 3 -CH 3 OH 2 da çözdürülür ve silika jel kromatografisi (Merck) uygulanır. Fosfolipidler, diaçilgliseroller, FFA, TG, ve CE n-hekzan ve dietileter ile çözücü olarak asetik asit kullanılarak ayrıştırılır. Fraksiyonların yerlerini tespit etmek için kontrol plazmalar da her tabakada ayrıca ayrıştırılmış ve lipid fraksiyonları UV altında 2,7-diklor-florosenle görüntülenmiştir. Fraksiyonlar TLC tabakadan kaldırılarak vida kapaklı viallere aktarılır ve iç Standard olarak cis-13,16,19-dokosatrienoikasid içeren metanol/toluol karşımında (4:1,vol/vol) çözündürülür. Trans-esterifikasyon 1saat 10 0 C de asetil klor inkubasyonuyla gerçekleştirilir. Soğuk örnek K 2 CO3 ile nötralize edilir ve üst tabaka nitrojen altında 80µL ye konsantre edilir. Yağ asit metil esterleri daha önce tanımlandığı üzere alev iyonizasyon dedektörüyle gaz kromatografisi kullanılarak ölçüldü(9). Hesaplama ve Aktivite İndeksleri 18:1n9/18:0 ve 16:1n7/16:0 oranları SCD1 (Δ9) desaturaz indeksi olarak hesaplandı. Ayrıca, 20:4n6/20:3n-6 ve 20:3n6/18:2n6 oranları Δ5 ve Δ6 desaturaz aktivitelerinin indeksleri olarak hesaplandı.18:0 ın 16:0 a oranı elongaz indeks olarak ve 16:0 nın 18:2 e oranı DNL indeks olarak hesaplandı(13,23). Homojenattan plazma trigliserid ve doku trigliseridleri içeriği ADVIA 1650 klinik kimya analizörü (Siemens Healthcare Diagnostics) kullanılarak ölçüldü.. Kantitatif PCR Analizi İle Hepatik Ekspresyonunun Belirlenmesi Dondurulmuş dokular TissueLyzer(Qiagen) da homojenize edilerek RNeasy Tissue Kit(Qiagen) ile RNA elde edilir. Total RNA nın revers transkripsiyonu ve SCD1 in kantitatif PCR ı ve 2114 Clinical Chemistry 55: 12 (2009)
Hepatik SCD1 Aktivite Indeksi ß-aktin Light Cycler sistem (Roche) SYBR green ile çalışıldı. 5 VE 6 desaturaz ekspresyonunu saptamak için Xiang ve arkadaşları tarafından tanımlanan metoda benzer niteliktedir. Bilgiler ortalama (SE) değerlerle verilmiştir. Lineer regresyon analizleri lipid fraksiyonları arasında aktivite indekslerini karşılaştırmak için yapılmıştır. İstatistiksel yazılımlar paketlenmesi JMP 4.0 (SAS Enstitüsü) kullanıldı ve P değerleri 0.05 istatistiksel olarak anlamlıydı..p değerleri çoklu test için ayarlanmıştı. Sonuçlar Hepatik ve Plazma VLDL Lipid Fraksiyonlarının Yağ Asidi Bileşimi Hepatik ve lipid fraksiyonlarında yağ asidi dağılımı makalenin online sürümünde görülür (Tablo 1) (http://www.clinchem.org./content/vol55/issue12) Karaciğer örneklerimizde çalışma katılımcılarından alınan yağ asitleri ana olarak TG,( % 52,4) PL ( % 34,6) ve FFA( % 6,5) ve sadece küçük miktarda CE den gelen ve diaçilgliseridler(dg) dir. (online ilave Tablo 1,en üst satır). Hepatik TG fraksiyonu anlamlı şekilde daha az stearat( 4 kat), eikosatrienoik asid C20:3n6 (26-kat) araşidonik acid C20:4n6 (17 kat), ve dokosahekzaenoic asid C22:6n3 (22kat) içermektedir. Ayrıca PL den daha fazla anlamlı olarak oleat (4 kat ) içermektedir.. (bütün P 10-10 ) Bu değerlerden hesaplanan,elongaz için indeksler DNL v e 9 desaturaz aktivitesi hepatik lipid fraksiyonları arasında önemli farklılıklar gösterdi(online ilave Tablo1). Hepatik SCD1 Ekspresyonu ve Karaciğerin Lipid Fraksiyonlarında SCD1 Aktivite İndeksleri, VLDL Trigliserid ve Total VLDL Hepatik SCD1 ekspresyon seviyeleriyle hepatik lipid fraksiyonlarında SCD1 aktivite indeksinin karşılaştırılmasında,scd1 ekspresyon seviyeleriyle hepatik TG, FFA, CE,ve PL- SCD1 aktivite indeksleri arasında kuvvetli bir ilişki olduğunu ancak DG-SCD1 için bunun söz konusu olmadığını gördük(tablo1, Şekil 1A).SCD1 ekspresyonu ile en zayıf SCD1 aktivite indeksi 18:1/18:0 olarak gözlemlendi. Sadece hepatik PL-ve FFA-SCD1 değil TG-,DG-, ve CE-SCD1 aktivite indeksi ile SCD1 ekspresyonu arasında anlamlı bir korelasyon söz konusuydu. (Tablo 2, Şekil 2A). SCD1 ekspresyonunun ölçümü için rutin olarak karaciğer örnekleri bulunamamasından dolayı hepatik SCD1 ekspresyonu için karaciğer örneklerinin yerine geçecek VLDL den lipid fraksiyonları elde edilerek kullanıldı. Böylece hepatik SCD1 ekspresyonu ile hepatik lipid fraksiyonlarının SCD1 aktivite indeksleri ile plazma VLDL-TG de bu indekslere denk gelen lipid fraksiyonlarını karşılaştırdık. VLDL-TG lipid fraksiyonlarında SCD1 aktivite indeksleri buna karşılık gelen tüm hepatik lipid fraksiyonlarını yakın bir biçimde yansıtır(tablo 1, Şekil 1B). ancak 18:1/18:0 aktivite indeksine karşılık gelen hepatik TG dışında diğer hepatik lipid fraksiyonlarıyla ilişkili Tablo 1. SCD1 aktivite indeksi ve SCD1 expresssiyonu. a SCD1/13-actin Liver-TG Liver-DG Liver-FFA Liver-CE Liver-PL SCD1/ fi-actin VLDL-TG VLDL r P r P r P 0.67 0.006 0.57 0.03 0.54 0.04 0.91 <0.0001 0.94 <0.0001 0.42 0.12 0.51 0.04 0.56 0.03 0.71 0.003 0.82 0.0001 0.84 <0.0001 0.60 0.02 0.87 <0.0001 0.90 <0.0001 0.70 0.005 0.88 <0.0001 0.89 <0.0001 VLDL 0.57 0.03 0.99 <0.0001 a a Hepatik yağ asidi oranları, VLDL yağ asidi oranları,ve hepatik gen ekspresyonları arasında tek değişkenli ilişki.15 bireyin lineer regresyonunun sonuçları gösterilmiştir.anlamlı değişimler koyultulmuş ve italik olarak işaretlenmiştir. Bulunmadı (Tablo 2,Şekil 2B). Hepatik SCD1 ekspresyonu ile 16:1/ 16:0 aktivite indeksi arasında iyi bir korelasyon bulunmasına rağmen (Şekil 1C),18:1/18:0 aktivite indesi ile ilgili bir korelasyon bulunmadı (Şekil 2C). Bütün bu sonuçlar plazma VLDL-TG den elde edilen aktivite indeksinin karaciğerdeki lipid fraksiyonlarını yansıttığını ve hepatik SCD1 ekspresyonuyla korelasyonu olduğunu gösterir. Bu sonuçlar bizi total VLDL SCD1 aktivite indeksiyle hepatik parametrelerin muhtemel ilişkisini araştırmaya teşvik etti çünkü VLDL büyük oranda trigliseridler içeriyordu. Araştırmamızda aktivite indeksinin total VLDL ve VLDL-TG birbirinin nerdeyse aynı olduğu bulundu (Şekil 1D) ve VLDL aktivite indeksi ayrıca SCD1 ekspresyonunu yansıttığı gibi bütün fraksiyonlarda hepatik yağ asidi bileşimi konusunda da fikir verdi (Tablo 1 ve Şekil 1,E ve F).VLDL 18:1/18:0 aktivite indeksi hepatik PL yağ asidi bileşimini ve SCD1 mrna ekspresyonunu yansıtırken hepatik FFA ile eğilimli bir korelasyon gösterdi(tablo 2 ve Şekil.2, E ve F). Hepatik ve VLDL Lipid Fraksiyonlarının Yağ Asidi Bileşimleri ve Aktivite İndeksleri ve 5 ve 6 Desaturaz ve Elongazların Ekspresyonu 5 ve 6 desaturazların aktivite indeksleri doku ürün/prekürsör oranlarından hesaplandığı gibi yağ asid elongaz aktivitesi insulin direnciyle ilişkili olduğu saptanmıştır(8, 25, 26). İnsanlarda VLDL yağ asid bileşimiyle bu enzimlerin hepatik aktivite indekslerini yansıtıp yansıtmadığını denedik. Yağ asid elongaz indeksleri (18:0/ 16:0, P 0.2 and R 0.3), 5 desaturase (20:4n6/20: 3n6, P 0.7 and R 0.1), 6 desaturase (20:3n6/ (18:=/16:0,P 0.2 ve R 0.3), VLDL deki ve 5 desaturaz (20:4n6/20:3n6, P 0.7 ve R 0.1) ve 6 desaturaz ve hepatik lipid Clinical Chemistry 55:12 (2009) 2115
Şekil 1 Hepatik ve plazma VLDL yağ asidi fraksiyonlarının oranı ve hepatik SCD1 ekspresyonları gösterilmiştir. (A),Karaciğer trigliseridlerinde oranı hepatik SCD1 ekspreyonuyla pozitif ilintili ve ß-aktin ile normalize edilmiştir.(b),karaciğer trigliseridlerindeki oranı karaciğerden salınıp biraraya getirilen VLDL trigliseridlerindeki oranı ile güçlü korelasyon gösterir.(c), ß-aktin için normalize edilen hepatik SCD1 ekspresyonu ve VLDL trigliseridlerinde oranı arasında pozitif bir korelasyon gözlenmiştir.(d),total VLDL trigliseridlerinde oranı total VLDL yağ asitlerindeki oranı ile güçlü bir korelasyon gösterir.(e),karaciğer trigliseridlerinde oranı ve total VLDL yağ asitleri oranı yakın bir şekilde yansıtır.(f), ß-aktin ile normalize edilmiş hepatik SCD1 ekspresyonu total VLDL yağ asitlerinde oranı ile pozitif korelasyon gösterir. ve hepatik lipid fraksiyonları arasında herhangi bir ilişki bulmadık. Buna ek olarak,hepatik ya da VLDL 5 ve 6 desaturaz aktivite indeksleri karaciğer doku örneklerinde 5 ve 6 desaturaz ekspresyonlarıyla anlamlı bir korelasyon gösterir. Sadece hepatik PL de desaturaz aktivite indeksinin 6 desaturaz ekspresyonuyla ilişkili olduğu saptanmıştır.(p=0.014,r=0.61) Hepatik ve VLDL Lipid Fraksiyonlarında DNL İndeksi ve Lipojenik Genlerin Ekspresyonları Yükselmiş lipojenezin hepatik steatoz ve insulin direncinin patojeneziyle ilişkili olduğu anlaşılmıştır. DNL ana ürününü gösteren DNL indeksi ve diyetdeki lipidlerden gelen esansiyel lipidler, insanlarda yağ asidi sentezini değerlendirmek için araç olarak kullanılması düşünüldü. DNL indeksi, hepatik ve VLDL-TG yağ asidi bileşiminden hesaplanır. Hepatik TG de 16:0 ın 18:2 ye oranı buna karşılık gelen VLDL-TG ve total VLDL oranlarıyla benzeşir. DNL indeksi adipoz dokuya diyetetik 18:2 nin içeriğiyle eşleşen katı kontrollü 6 sentaz(fasn), Asetil Koenzim A karboksilaz alfa (ACACA),ve sterol düzenleyici eleman bağlayan transkripsiyon faktör-1(srebp-1) in hepatik ekspresyonunu ölçtük. Günlük diyetlerini tüketen bireylerde bile, hepatik TG DNL indeksi FASN ve ACACA ekspresyonuyla anlamlı bir şekilde korelasyon ve SREBP-1 ekspresyonu için eğilim gösterdi (Table3, Ek Şekil3, B-D). 2116 Clinical Chemistry 55:12 (2009)
Hepatik SCD1 Aktivite Indeksi Tablo 2 18:1/18:0 SCD1 Aktivite İndeksi ve SCD1 Ekspresyonu a SCD1/ fi-actin VLDL-TG 18:1/18:0 VLDL 18:1/18:0 r P r P r P SCD1/13-actin 0.38 0.16 0.72 0.004 Liver-TG 18:1/18:0 0.10 0.72 0.41 0.12 0.28 0.32 Liver-DG 18:1/18:0 0.19 0.49 0.13 0.62 0.14 0.61 Liver-FFA 18:1/18:0 0.56 0.03 0.18 0.51 0.46 0.08 Liver-CE 18:1/18:0 0.24 0.38 0.25 0.36 0.27 0.99 Liver-PL 18:1/18:0 0.59 0.03 0.34 0.22 0.70 0.005 VLDL 18:1/18:0 0.72 0.004 0.63 0.01 a Hepatik yağ asidi oranları, VLDL yağ asidi oranları,ve hepatik gen ekspresyonları arasında tek değişkenli ilişki.15 bireyin lineer regresyonunun sonuçları gösterilmiştir.anlamlı değişimler koyultulmuş ve italik olarak işaretlenmiştir. VLDL-TG indeksi, ACACA ve SREBP-1 ile pozitif korelasyon gösterirken VLDL DNL indeksi sadece FASN için eğilim gösterdi (Tablo 3, Ek Şekil E-G). Bu sonuçlar hepatik DNL in VLDL-TG DNL indeksinden tahmin edilebileceğini gösterir. Tartışma Hepatik SCD1 aktivitesinin belirlenmesi, metabolik, vasküler ve inflammatuar hastalıkları daha ileri düzeyde anlamamız için önemlidir. Hepatik SCD1 aktivite belirteçini saptamak için, insan karaciğer örnekleri ve eş zamanlı alınmış plazma örneklerini inceledik.ilk defa açlık VLDL- TG 16:1 in 16:0 a oranının çoklu lipid türlerinde hepatik aktivite indeksini yansıttığı gibi insanlarda hepatik SCD1 ekspresyonunu da yansıttığını gösterdik. Bu oranın ölçümü böylece hepatik SCD1 aktivitesinin noninvasif olarak hesaplanmasını sağladı. Bu bulguyu destekleyen bilgi yağ asidi oranlarından tahmini SCD aktivitesinin belirlenmesi ile paralellik göstermiş aynı zamanda DNL ile VLDL-TG de C16:0 ve C16:1 in kararlı bir izotop ile invazif olmayan dönüşümü de yakın zamanda Chong ve arkadaşları tarafından raporlamıştır. SCD1 in substratı olarak palmitatın stearata tercih edilmesinden dolayı, plamitatın desatürasyon aktivite indeksi ve stearatın değil palmitatın hepatik SCD1 ekspresyonunu daha yakın yansıtması şaşırtıcıdır. Bunun sebeplerinden biri karaciğerdeki 2 ayrı trigliserid havuzunun varlığı olup Donelly tarafından yapılan bir çalışma ile de desteklenmiştir(30). DNL ya da FFA alımından gelmiş hepatik yağ asidlerinin büyük bir kısmı trigliseridlere katılır ve 1 saatten daha kısa zamanda VLDL olarak dışarıya verilir(31). Ancak bu ekzojenik ve de novo sentezlenen yağ asidleri birkaç günden haftalara kadar sürebilecek iş miktarıyla büyük sellüler trigliserid depo havuzuna doğru yol alırlar(23,30). Bu sellüler trigliseridler günler önceden SCD1 aktivitesi farklıyken oluşturulabilir. Depo havuzundan gelen yağ asitleri SCD1 ürünlerinin ölçümü sonrasında seyreltilebilinir ve böylece gizli VLDL-TG lerde SCD1 aktivite indeksini etkileyebilirler. Çünkü oleat hepatik TG den zenginleştirilmiştir((42.5% vs 39.1%, hepatik TG vs VLDL-TG, P 0.0001, online Ek Tablo ) ve palmitoleattan 13 kat daha yaygındır, bu seyreltme 18:1/18:0 oranını önemli derecede etkiler. Buna ek olarak,18:1/18:0 oranı diyetetik yağdan oranından daha kolay etkilenir. Diyetetik lipidler sadece küçük miktarda palmitolat içerir ancak oleat diyetetik yağ asidinde yüksek miktarda bulunur ve primer 18:1/18:0 oranını etkiler(18). Kısa ömürlü hepatik lipid fraksiyonları PL(32) ve FFA,18:1/18:0 oranı hepatik SCD1 ekspresyonuyla VLDL-TG 18:1/18:0 oranı anlamlı olarak ilişkilendirilir (Tablo 2). Bu durumda, VLDL-TG de 18:1/18:0 oranı uzunömürlü ortalama hepatik SCD1 aktivitesini daha yakın bir şekilde ifade edebilir. VLDL-TG de yağ asidi indekslerinin belirlenmesi ultrasantrifuj, TLC ayırımı yağ asidi trans esterifikasyonu ve gaz kromatografisini içerir( uzun süren örnek hazırlamayı gerektirir). Bu usandırıcı ve zaman harcayıcı prosedür küçük örnek boyutları için analizi sınırlandırır. TG nin VLDL deki ana yağ asidi kaynağı (18,30) olmasından dolayı VLDL-TG total VLDL yağ asidi bileşiminde karşılaştırıldı. Total VLDL de aktivite indeksi neredeyse aynıydı ve VLDL SCD1 aktivite indeksi ayrıca hepatik yağ asidi bileşimini ve ekspresyonunu yansıttı. Bu nedenle daha geniş çaptaki çalışmalarda bu parametrenin kullanılması mantıklı olacaktır. Elde ettiğimiz bilgiler doğrultusunda, doku örneklerinden fraksiyonlanmamış yağ asitleri büyük dikkat ile yorumlanmalıdır ve tanımlanmış lipid fraksiyonlarının analizleri tercih edilmelidir..karaciğer dokusundan 5 analizlenmiş TLC lipid fraksiyonu yağ asidi ayrılmasının açık bir işaretidir ve yağ asidi bileşimininin tipik özelliğidir. Daha önceki yayınlarla uyumlu olarak (33), TG fraksiyonundan yağ asidi miktarı artan karaciğer TG (%0,6- % 9) içeriğiyle yükselir, (r= 0.96, P 0.0001) ancak PL fraksiyonundaki yağ asitleri değişmeden kalır. (r = - 0.13, P =0.28). TG fraksiyonunun önemli miktarda daha az sterat ve çoklu doymamış yağ asidi içermesinden (C20:3N6, C20:4N6, C22:6N3) ve PL fraksiyonundan daha fazla oleat içermesi, elongaz indekslerini,dnl,ve SCD1 aktivitesi hepatik lipid fraksiyonları arasında güçlü farklılıklar gösterir. Bu tip farklılıklar total, fraksiyonlanmamış yağ asidleri doku örneklerinde farklı TG içeriğiyle analiz edilmesi gibi önemli etkilere yol açar(34). Trigliserid fraksiyonlarında artış, TG içeriği ve desaturaz ve DNL indeksleri arasında pozitif korelasyona yol açmasının yanı sıra TG içeriği ve elongaz indeksi ve çoklu doymamış yağ asidi içeriği TG den gelen yağ asitlerinin artan oranından dolayı negatif korelasyon gösterir. Benzer zorluklar total plazma lipidlerinden yağ asidi oranı analiz edildiğinde oluşabilir(15,18,19). Clinical Chemistry 55:12 (2009) 2115
Şekil 2..Hepatik ve plazma VLDL yağ asidi fraksiyonlarının 18:1/18:0 oranı ve hepatik SCD1 ekspresyonları gösterilmiştir. (A),Karaciğer trigliseridlerinde 18:1/18:0 oranı ß-aktin ile normalize edilmiş hepatik SCD1 ekspresyonuyla korelasyon gözlenmez.(b),karaciğer trigliseridlerindeki 18:1/18:0 oranı karaciğerden salınıp biraraya getirilen VLDL trigliseridlerindeki 18:1/18:0 oranı ile pozitif korelasyon gösterir.(c), ß-aktin için normalize edilen hepatik SCD1 ekspresyonu ve VLDL trigliseridlerinde 18:1/18:0 oranı arasında pozitif bir korelasyona eğilim gözlenmiştir.(d),vldl trigliseridlerinde 18:1/18:0 oranı total VLDL yağ asitlerindeki 18:1/18:0 oranı ile güçlü bir korelasyon gösterir.(e),karaciğer trigliseridlerinde 18:1/18:0 oranı ve total VLDL yağ asitleri 18:1/18:0 oranı güçlü korelasyon gösterir.(f), ß-aktin ile normalize edilmiş hepatik SCD1 ekspresyonu total VLDL yağ asitlerinde 18:1/18:0 oranı ile pozitif korelasyon gösterir. Tablo 3. 16:0/18:2 DNL indeksi ve Yağ Asidi Sentez genleri FASN, ACACA, SREBP-1. a ekspresyonu Liver-TG DNL index VLDL-TG DNL index VLDL DNL index r P r P r P VLDL-TG DNL 0.89 <0.0001 0.91 <0.0001 VLDL DNL 0.88 <0.0001 0.91 <0.0001 FASN/J3-actin 0.51 0.05 0.44 0.10 0.33 0.24 ACACA/ 0.59 0.02 0.62 0.01 0.49 0.08 J3-actin SREBP-1/ J3-actin 0.49 0.07 0.61 0.02 0.47 0.09 a Hepatik yağ asidi oranları,vldl yağ asidi oranları,ve hepatik gen ekspresyonları arasında tek değişkenli ilişki.15 bireyin lineer regresyonunun sonuçları gösterilmiştir.anlamlı değişimler koyultulmuş ve italik olarak işaretlenmiştir. Bundan dolayı tanımlanmış lipid fraksiyonlarının analizleri, enzim aktivite indeksleri olarak yağ asitlerinin yanlış yorumlanmasından kaçınmak için önemlidir. Δ5 ve Δ6 desaturaz ve VLDL-TG ya da total VLDL de elongaz indeksleri hepatik lipidlerde bu enzimlerin aktivite indeksleride herhangi bir bilgi sağlamaz ve değerlendirilmemelidir. Hepatik TG de 16:0/18:2 oranı DNL çıktısını destekler niteliktedir ve katı kontrollü besinsel şartlar altında değerlendirilir(13,23). Çalışmada yer alan bireyler VLDL de DNL indeksi hepati TG fraksiyonunu yansıtır ve önemli hepatik lipojenik enzimlerin (FAS, ACC, ve SREBP-1) ekspresyon seviyeleriyle bağlantılıdır. Plazma VLDL-TG DNL indeksinin belirlenmesi böylece günlük diyetteki bireylerde hepatik yağ aisidi sentezinde yararlı bilgi sağlar. 2118 Clinical Chemistry 55: 12 (2009)
Hepatik SCD1 Aktivite Indeksi Çalışmalarımızda ilgi çekici ve yüksek anlamlı gözlemlere ulaşılmış olmasına rağmen, küçük örnek boyutundan ötürü daha zayıf bağları tespit etmek için sınırlı bir güç söz konusu oldu. Buna bağlı olarak,hepatik SCD1 ekspresyonu ve VLDL-TG 18:1/18:0 oranı arasında net bir korelasyon saptayamadık ancak daha geniş çaptaki çalışmalarda bu da mümkün olabilir.bununla beraber,anında elde edilmiş hepatik dokular ve plazma örnekleri bulunması zor ve sağlıklı bireylerden karaciğer biyopsi örneklerinin eldesi etik olarak kabul edilmemektedir. Buna ek olarak, obeziteye bağlı hastalıklardan yakınan hastalık grubuyla spesifik olarak çalışmadık ve böylece çalışma katılımcılarından ağır obez olanlardan elde edilen farklı sonuçları dışarıda tutmadık. Sonuç olarak, insanlarda hepatik SCD1 ekspresyonu belirteç olarak kullanılarak açlık plazma VLDL de SCD1 aktivite indeksini ilk kez kullandık ve klinik çalışmalarda rutin kan örneklerinden invasif olmadan belirlenebilir olduğunu da göstermiş olduk. Yazarların Katkıları: Yazarların hepsi bu makalenin düşünsel içeriğine katkıda bulundukları ve şu üç gerekliliği karşıladıklarını doğrulamıştır: (a) verilerin kavram, tasarım, elde edilmesi, analiz ve yorumlanmasına önemli katkılar; (b) düşünsel içeriği için makalenin yazılması veya gözden geçirilmesi ve (c) yayınlanmış makalenin nihai onaylanması Yazarların potansiyel çıkar çatışmaları açıklamaları: Makalenin sunumuyla birlikte yazarların tümü Potansiyel Çıkar çatışmaları formunu doldurmuştur. Potansiyel çıkar çatışmaları:: İstihdam ve Başkanlık Beyan edilmemiştir. Danışmanlık veya İstişari Görev: Beyan edilmemiştir. Stıok Mülkiyeti: : Beyan edilmemiştir. Hizmet karşılığı ücret: Beyan edilmemiştir. AraştırmaFonu: Aşağıdaki kuruluşlar tarafından araştırma desteklenmiştir. Diabetes mellitus (Competence Network Diabetes mellitus) - German Federal Ministry of Education and Research (FKZ 01GI0803-04); Ministry of Education, Youth and Sport of Czech Republic (MSM0021627502); Deut sche Forschungsgemeinschaft (GRK 1302/1). N. Stefan, Heisenberg- Grant of the Deutsche Forschungsgemeinschaft (STE 1096/1-1). Uzman Tanıklığı: Beyan edilmemiştir. Sponsorun Rolü: Fon sağlayan kuruluşlar çalışma tasarımı, çalışmaya alınan hastaların seçimi, verilerin gözden geçirilmesi, yorumlanması, metnin hazırlanması veya onaylanmasında herhangi bir rol oynamamıştır. Teşekkür: Çalışmanın tüm katılımcılarına ve işbirlikçilerine teknik yardımlarından dolayı I. Mertens ve kritik tartışmalardaki desteği için R. Schlaberg e teşekkür ederiz.. Kaynaklar 1. Flowers MT, Ntambi JM. Role of stearoylcoenzyme A desaturase in regulating lipid metabolism. Curr Opin Lipidol 2008;19:248 56. 2. Houdali B, Wahl HG, Kresi M, Nguyen V, HaapM, Machicao F, et al. Glucose oversupply increases Delta9-desaturase expression and its metabolites in rat skeletal muscle. Diabetologia 2003;46:203 12. 3. Riserus U, Tan GD, Fielding BA, Neville MJ, Currie J, Savage DB, et al. Rosiglitazone increases indexes of stearoyl-coa desaturase activity in humans: link to insulin sensitization and the role of dominantnegative mutation in peroxisome proliferator-activated receptor-gamma. Diabetes 2005;54:1379 84. 4. Warensjo E, Ingelsson E, Lundmark P, Lannfelt L, Syvanen AC, Vessby B, Riserus U. Polymorphisms in the SCD1 gene: associations with body fat distribution and insulin sensitivity. Obesity (Silver Spring) 2007;15:1732 40. 5. Miyazaki M, Flowers MT, Sampath H, Chu K, Otzelberger C, Liu X, Ntambi JM. Hepatic stearoyl-coa desaturase-1 deficiency protects mice from carbohydrate-induced adiposity and hepatic steatosis. Cell Metab 2007;6: 484 96. 6. Pinnamaneni SK, Southgate RJ, Febbraio MA, Watt MJ. Stearoyl CoA desaturase 1 is elevated in obesity but protects against fatty acid-induced skeletal muscle insulin resistance in vitro. Diabetologia 2006;49:3027 37. 7. Flowers JB, Rabaglia ME, Schueler KL, Flowers MT, Lan H, Keller MP, et al. Loss of stearoyl-coa desaturase-1 improves insulin sensitivity in lean mice but worsens diabetes in leptin-deficient obese mice. Diabetes 2007;56:1228 39. 8. Brown JM, Chung S, Sawyer JK, Degirolamo C, Alger HM, Nguyen T, et al. Inhibition of stearoylcoenzyme A desaturase 1 dissociates insulin resistance and obesity from atherosclerosis. Circulation 2008;118:1467 75. 9. Peter A, Weigert C, Staiger H, Rittig K, Cegan A, Lutz P, et al. Induction of stearoyl-coa desaturase protects human arterial endothelial cells against lipotoxicity. Am J Physiol Endocrinol Metab 2008; 295:E339 49. 10. Qin X, Tian J, Zhang P, Fan Y, Chen L, Guan Y, et al. Laminar shear stress up-regulates the expression of stearoyl-coa desaturase-1 in vascular endothelial cells. Cardiovasc Res 2007;74:506 14. 11. Macdonald ML, van Eck M, Hildebrand RB, Wong BW, Bissada N, Ruddle P, et al. Despite antiatherogenic metabolic characteristics, SCD1- deficient mice have increased inflammation and atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2009;29:341 7. 12. Chen C, Shah YM, Morimura K, Krausz KW, Miyazaki M, Richardson TA, et al. Metabolomics reveals that hepatic stearoyl-coa desaturase 1 downregulation exacerbates inflammation and acute colitis. Cell Metab 2008;7:135 47. 13. Chong MF, Hodson L, Bickerton AS, Roberts R, Neville M, Karpe F, et al. Parallel activation of DNL and stearoyl-coa desaturase activity after 3 d of high-carbohydrate feeding. Am J Clin Nutr 2008;87:817 23. 14. Hulver MW, Berggren JR, Carper MJ, Miyazaki M, Ntambi JM, Hoffman EP, et al. Elevated stearoyl-coa desaturase-1 expression in skeletal muscle contributes to abnormal fatty acid partitioning in obese humans. Cell Metab 2005;2:251 61. 15. Mar-Heyming R, Miyazaki M, Weissglas-Volkov D, Kolaitis NA, Sadaat N, Plaisier C, et al. Association of stearoyl-coa desaturase 1 activity with familial combined hyperlipidemia. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2008;28:1193 9. 16. Stefan N, Peter A, Cegan A, Staiger H, Machann J, Schick F, et al. Low hepatic stearoyl-coa desaturase 1 activity is associated with fatty liver and insulin resistance in obese humans. Diabetologia 2008;51:648 56. 17. Sjogren P, Sierra-Johnson J, Gertow K, Rosell M, Vessby B, de Faire U, et al. Fatty acid desaturases in human adipose tissue: relationships between gene expression, desaturation indexes and insulin resistance. Diabetologia 2008;51:328 35. 18. Hodson L, Skeaff CM, Fielding BA. Fatty acid composition of adipose tissue and blood in humans and its use as a biomarker of dietary intake. Prog Lipid Res 2008;47:348 80. 19. Karpe F, Hodson L. Caution on the interpretation of plasma fatty acid composition as a proxy marker for SCD1 activity: particular implications for using the ratio in QTL studies involving hyperlipidemic patients. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2008;28:e152. 20. Warensjo E, Riserus U, Gustafsson IB, Mohsen R, Cederholm T, Vessby B. Effects of saturated and unsaturated fatty acids on estimated desaturase activities during a controlled dietary intervention. Nutr Metab Cardiovasc Dis 2008;18:683 90. 21. Attie AD, Krauss RM, Gray-Keller MP, Brownlie A, Miyazaki M, Clinical Chemistry 55:12 (2009) 2119
Kastelein JJ, et al. Relationship between stearoyl-coa desaturase activity and plasma triglycerides in human and mouse hypertriglyceridemia. J Lipid Res 2002;43:1899 907. 22. Stefan N, Kantartzis K, Machann J, Schick F, Thamer C, Rittig K, et al. Identification and characterization of metabolically benign obesity in humans. Arch Intern Med 2008;168: 1609 16. 23. Hudgins LC, Hellerstein M, Seidman C, Neese R, Diakun J, Hirsch J. Human fatty acid synthesis is stimulated by a eucaloric low fat, high carbohydrate diet. J Clin Invest 1996;97:2081 91. 24. Xiang M, Rahman MA, Ai H, Li X, Harbige LS. Diet and gene expression: delta-5 and delta-6 desaturases in healthy Chinese and European subjects. Ann Nutr Metab 2006;50:492 8. 25. Matsuzaka T, Shimano H, Yahagi N, Kato T, Atsumi A, Yamamoto T, et al. Crucial role of a long-chain fatty acid elongase, Elovl6, in obesity-induced insulin resistance. Nat Med 2007;13: 1193 202. 26. Petersson H, Lind L, Hulthe J, Elmgren A, Cederholm T, Riserus U. Relationships between serum fatty acid composition and multiple markers of inflammation and endothelial function in an elderly population. Atherosclerosis 2009;203:298 303. 27. Stefan N, Kantartzis K, Haring HU. Causes and metabolic consequences of fatty liver. Endocr Rev 2008;29:939 60. 28. Shorten PR, Upreti GC. A mathematical model of fatty acid metabolism and VLDL assembly in human liver. Biochim Biophys Acta 2005;1736:94 108. 29. Ntambi JM, Miyazaki M. Regulation of stearoylcoa desaturases and role in metabolism. Prog Lipid Res 2004;43:91 104. 30. Donnelly KL, Smith CI, Schwarzenberg SJ, Jessurun J, Boldt MD, Parks EJ. Sources of fatty acids stored in liver and secreted via lipoproteins in patients with nonalcoholic fatty liver disease. J Clin Invest 2005;115:1343 51. 31. Parks EJ, Hellerstein MK. Thematic review series: patient-oriented research. Recent advances in liver triacylglycerol and fatty acid metabolism using stable isotope labeling techniques. J Lipid Res 2006;47:1651 60. 32. Schmid PC, Johnson SB, Schmid HH. Remodeling of rat hepatocyte phospholipids by selective acyl turnover. J Biol Chem 1991;266:13690 7. 33. Puri P, Baillie RA, Wiest MM, Mirshahi F, Choudhury J, Cheung O, et al. A lipidomic analysis of nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology 2007;46:1081 90. 34. Kotronen A, Seppanen-Laakso T, Westerbacka J, Kiviluoto T, Arola J, Ruskeepaa AL, et al. Hepatic stearoyl-coa desaturase (SCD)-1 activity and diacylglycerol but not ceramide concentrations are increased in the nonalcoholic human fatty liver. Diabetes 2009;58:203 8. 2120 Clinical Chemistry 55:12 (2009)