ATIK Agaricus bisporus KOMPOSTUNDAN LAKKAZ ENZĠMĠNĠN KISMĠ SAFLAġTIRILMASI, KARAKTERĠZASYONU, ĠMMOBĠLĠZASYONU VE BĠYOTEKNOLOJĠK UYGULAMASI

ÖZEL EGE LĠSESĠ ATIK Agaricus bisporus KOMPOSTUNDAN LAKKAZ ENZĠMĠNĠN KISMĠ SAFLAġTIRILMASI, KARAKTERĠZASYONU, ĠMMOBĠLĠZASYONU VE BĠYOTEKNOLOJĠK UYGULAMASI Esin ARSLAN, Cerensu AKDAĞ DanıĢman Öğretmen: AyĢe TÜRKER 2013 ĠZMĠR

1.GĠRĠġ... 2 2. MATERYAL VE METOD... 4 2.1 Materyal... 4 2.2 Protein Tayini... 4 2.3 Lakkaz Aktivite Tayini... 5 2.4 Atık Mantar Kompostundan Lakkazın Kısmi Saflaştırılması.... 5 2.5 Lakkazın Amberlite XAD-7 Taşıyıcısına İmmobilizasyonu... 6 2.5.1 Optimum İmmobilizasyon Süresinin Belirlenmesi... 6 2.5.2 İmmobilizasyon Verimi Üzerine ph Etkisi... 6 2.5.3 Enzim Miktarının İmmobilizasyon Verimi Üzerine Etkisi..... 2.6 Kısmi Saflaştırılan Lakkazın Amberlite XAD-7 Üzerinde İmmobilizasyonu ve İmmobilizasyon Veriminin Hesaplanması 2.7 İmmobilize Lakkazın Karakterizasyonu. 2.8 Serbest ve İmmobilize Enzimin Kararlılık Testleri... 2.9 İmmobilize Enzim İşlem Kararlılığı.... 6 7 7 8 8 2.10 Direct Green B Tayini, Serbest ve İmmobilize Enzimin Direct Green B Boyasının Gideriminde kullanılması 8 3. SONUÇLAR VE TARTIġMA... 9 3.1 Protein Tayini... 9 3.2 Lakkazın Atık Mantar Kompostundan Kısmi İzolasyonu... 10 3.3 Lakkazın İmmobilizasyon Koşullarının Optimizasyonu... 3.3.1 Sürenin İmmobilizasyon Verimi Üzerine Etkisi. 3.3.2 ph nın İmmobilizasyon Verimi Üzerine Etkisi 3.3.3 Enzim Miktarının İmmobilizasyon Verimi Üzerine Etkisi. 10 10 11 12 3.4 Optimum İmmobilizasyon Koşullarında Enzim İmmobilizasyonu... 12 3.5 İmmobilize Lakkazın Aktivite Gösterdiği Optimum ph Değerinin Saptanması.. 12 3.6 İmmobilize Lakkazın Aktivite Gösterdiği Optimum Sıcaklığın Saptanması... 13 3.7 Serbest ve İmmobilize Enzimin Optimum Koşullarda Kararlılıklarının Belirlenmesi... 3.8 İmmobilize Enzim İşlem Kararlılığı. 3.9 Direct Green B Tayini... 14 15 15 3.10 Serbest ve İmmobilize Enzimin Direct Green B Boyasının Gideriminde Kullanılması.. 4. GENEL DEĞERLENDĠRME... 17 17 5.TEġEKKÜR... 19 6.KAYNAKLAR... 19 1

1. GĠRĠġ Dünya genelinde sanayileşme, kentleşme, nüfus artışı ve bunlara bağlı çevresel problemler ile gün geçtikçe verimli tarım alanları azalmaktadır. Özellikle protein açığı olan ve gelişmekte olan ülkelerde besin ihtiyacını karşılayacak alternatif kaynaklara ihtiyaç vardır. Toprak ve tarım arazisi gerektirmeden üretilen ve besin değeri yüksek olan kültür mantarları, bu ihtiyacı karşılayacak en etkili besin maddesi olarak görülmektedir (1). Ülkemizde kültür mantarı yetiştiriciliğinin geçmişi çok kısadır. İlk olarak 1960 yılında Ankara Ziraat Fakültesi nde üretim yapılmıştır. Kültür mantarcılığı son yıllarda ülkemizde de hızlı bir gelişme göstermiş, 1982 de 750 ton olan üretimimiz 2008 yılında yaklaşık 26.500 ton olarak gerçekleşmiştir (1). Dünyada genel olarak ticareti yapılan başlıca kültür mantarı türleri Agaricus spp, Agrocybe aegerita, Auricularia polytricha, Flammulina velutipes, Ganoderma lucidium, Grifola frondosa, Hericium erinaceus, Lentinula edodes, Morchella spp., Pleurotus spp., Volvariella volvacea dir. Agaricus bisporus, Türkiye'de en çok bilinen ve kültür mantarı olarak adlandırılan bir mantar türüdür. Portabello mantarı olarak bilinen büyük mantarlar aslında Agaricus bisporus'un erginleşmiş halidir. Ticari olarak pastörizasyon işleminden geçirilmiş kompost üzerinde yetiştirilir. Kompost içerisinde sap-saman artıkları, at gübresi, buğday sapı bulunmaktadır. Diğer adı da şapkalı mantarlardır. Bu mantarlar eşeyli veya eşeysiz "sporlar" oluşturarak ürerler. Şekil 1 de Agaricus bisporus görülmektedir (2). ġekil 1. Agaricus bisporus Çoklu-bakır içeren bir enzim olan lakkaz, radikal-katalizli reaksiyon mekanizması ile aromatik ve aromatik-olmayan farklı bileşiklerin oksidasyonu için moleküler oksijeni kullanmaktadır. Kullanılan moleküler oksijenin ise suya indirgenmesi sağlanarak, fenolik bileşiklerin oksidasyonu katalizlenmektedir. Lakkaz enzimleri düşük substrat özgüllükleri ile karakterize edilmekte olup, difenoller, polifenoller, farklı sübstitiye fenoller, diaminler, 2

aromatik aminler ve hatta iyodin gibi inorganik bileşikler de dahil olmak üzere çok fazla çeşitlilikteki substratları okside etmektedirler (3). Lakkazlar delignifikasyon, boya giderimi, biyolojik iyileştirme ajanı olarak, etanol üretiminde, biyosensör, biyoyakıt gibi birçok endüstriyel ölçekte kullanımı giderek artan bir enzimdir. Günümüz şartlarında lakkazlar ucuz ve kolay elde edilememektedir. Kirlenmiş sistemleri iyileştirmek için büyük ölçekli lakkaz uygulaması büyük miktarlarda üretimi gerektirmektedir. Ham enzim preparasyonlarının kullanımı da pahalı olabilir. En etkili lakkaz üreten kaynağı bulmak için; en uygun fungal türü seçme, yeniden üretilebilir ve pahalı olmayan izolasyon yöntemlerini bulma, enzim üretim koşullarını optimize etme açısından çeşitli çalışmalar yapılmaktadır (4). Tekstil sanayi, toplam boyarmadde pazarının üçte ikisini oluşturmakta ve tekstil yas işlemleri için büyük hacimlerde su ve kimyasal tüketmektedir. Kullanılan kimyasal maddeler, inorganik bileşenlerden polimerlere ve organik ürünlere kadar değişen çeşitli kimyasal yapılardır. Kimyasal yapıları nedeniyle boyarmaddeler, ışık, su ve farklı kimyasallar etkisinde solmaya karşı dirençlidir ve bunların çoğu sentetik esaslı olduğundan renksizleştirilmeleri zordur. Ancak çevresel nedenlerle boyarmaddelerin endüstriyel atıklardan uzaklaştırılmaları gerekmektedir. Bu yüzden lakkaz esaslı yöntemlerin geliştirilmesi, lakkazların tekstil sanayinde sürekli kullanılan sentetik boyarmaddeler de dahil olmak üzere çeşitli kimyasal yapıdaki boyarmaddeleri parçalayabilme potansiyelleri nedeniyle uygun bir çözüm gibi görünmektedir (5). Bu projede, lakkaz kaynağı olarak mantar üretiminde hasat sonrası kalan mantar atıklarından oluşan atık mantar kompostu kullanılarak, lakkaz enzimi kısmi olarak saflaştırılmış ve enzim biyoteknolojik kullanım amacıyla Amberlite XAD-7 taşıyıcısıda immobilize edilmiştir. İmmobilizasyon koşullarının optimizasyonunun ardından, immobilizasyon sonrası enzimin optimum reaksiyon koşulları ve kararlılık testleri yapılarak serbest enzim ile kıyaslanmıştır. İmmobilize lakkaz ve serbest lakkazın tekstil boyar maddesi olan ve yaygın olarak kullanılan Direct Green B (Şekil 2) boyar madde gideriminde kullanılabilirliği araştırılmıştır. Amberlite XAD-7 reçinesi poliakrilik asit ester polimerleridir, hidrofilik yüzeye ve orta seviyede polariteye sahiptirler. Reçine yüksek adsorpsiyon kapasitesine sahip olduğu için lakkaz immobilizasyonunda seçilmiştir. Çalışmamızda kullanılan mantar kompost atığı lakkazının, ticari üretimi bulunmamakta olup mantar kompostu lakkazının, saflaştırılması ve immobilizasyonu çalışmalarına literatürde rastlanmamıştır. 3

ġekil 2. Direct Green B (6) 2. MATERYAL VE METOT 2.1 Materyal Lakkaz kaynağı olarak atık mantar kompostu kuru formda E.Ü. Fen Fakültesi Mikrobiyoloji ABD öğretim üyesi Doç. Dr. İhsan YAŞA dan temin edildi. Amberlite XAD-7 ve ABTS Sigma firmasından sağlandı. Çalışmada kullanılan diğer kimyasallar ve çözgenler analitik saflıktadır. 2.2 Protein Tayini Protein tayini Bradford metodu kullanılarak gerçekleştirildi (7). Reaktif, 40 mg Coomassie Brilliant Blue G-250 boyası %95 lik 50 ml etanolde çözülüp, 55 ml % 85 lik fosforik asit eklenmesinin ardından hacmi distile su kullanılarak 1 l ye tamamlanması ve filtre (Whatman No.6 filtre kağıdı) edilmesi ile hazırlandı. Protein tayini, 100 µl örnek üzerine 2 ml Bradford reaktifi eklenerek 10 dakika oda sıcaklığında inkübasyonu sonucunda 595 nm de spektrofotometrik (Perkin Elmer UV/Vis Spektrofotometre) ölçümlerinin alınması ile gerçekleştirildi. Bradford yöntemi ile bilinmeyen örneklerdeki protein miktarlarının belirlenebilmesi için 0,02 0,2 mg/ml konsantrasyonlarda albumin çözeltileri kullanılarak protein standart grafiği oluşturuldu. 4

2.3 Lakkaz Aktivite Tayini Lakkaz enziminin aktivitesi, substrat olarak ABTS (2,2 -azino-di-3-etil-benzo-tiazolinsülfonat) kullanılarak spektrofotometrik olarak tayin edildi (8). ph 3.0 0.1 M asetat tamponu üzerine 1 mm ABTS eklendi. Serbest enzim ilave edilerek 10 sn aralıklarla 420 nm de Perkin Elmer UV/Vis spektrofotometre de absorbans ölçümleri alındı. İmmobilize enzim aktivitesinin ölçümünde immobilize enzim üzerine asetat tamponu ve ABTS eklenerek belirli süre 100 rpm hızla çalkalanarak inkübe edildi. Süre sonunda immobilize enzim ayırılarak üst fazın 420 nm de absorbans ölçümü yapıldı. Serbest lakkaz ve immobilize lakkaz aktivitesi hesaplanırken aşağıda belirtilen bağıntı kullanıldı: (U/ml) 2.4 Atık Mantar Kompostundan Lakkazın Kısmi SaflaĢtırılması 10 g mantar kompostu 100 ml su içerisinde 30 dak. oda sıcaklığında karıştırıldı. Bu çözeltide protein ve aktivite tayinleri gerçekleştirildi. Çözeltide % 80 lik amonyum sülfat çöktürmesi gerçekleştirildi. Amonyum sülfat ilavesinin ardından çözelti karıştırılarak tuz çöktürmesi gerçekleştirildi. Ardından, çözelti +4 C de 6000 rpm de 20 dakika santrifüjlendi. Santrifüjlenen örneğin üst fazından örnek ayrılarak alt faz 5 ml distile su ile çözülerek distile suya karşı (12000 MW) gece boyu diyaliz edildi. Diyalizattan örnek ayrılarak protein ve aktivite tayinleri gerçekleştirildi. Örneğin Millipore 30 kda por çaplı membran ile ultrafiltrasyonu gerçekleştirildi. Son elde edilen örneğin hem alt hem de üst fazında protein ve aktivite tayinleri gerçekleştirildi. Kısmi saflaştırma aşamalarındaki kat saflaştırma oranları 5

mantar kompostunun aktivitesinin izolasyon aşamasındaki örneklerin aktivitesine oranlanması ile hesaplandı. 2.5 Lakkazın Amberlite XAD-7 TaĢıyıcısına Ġmmobilizasyonu 2.5.1 Optimum Ġmmobilizasyon Süresinin Belirlenmesi 200 mg Amberlite XAD-7 taşıyıcısı üzerine enzim içeren ph 4.0 asetat tamponu eklendi ve oda sıcaklığında 240 rpm hızda orbital karıştırıcı üzerinde inkübasyona bırakıldı. Optimum immobizasyon süresinin belirlenmesi için 10-120 dakika arasında değişen belirli sürelerde örneklerde protein tayinleri yapılarak immobilizasyon verimleri hesaplandı. 2.5.2 Ġmmobilizasyon Verimi Üzerine ph Etkisi İmmobilizasyon verimi üzerine ph etkisini belirleyebilmek amacıyla ph değeri 2-8 aralığında değişen tampon çözeltiler (ph 2 ve 3 glisin tamponu; ph 3-6 asetat tamponu; ph 6-8 fosfat tamponu) kullanılarak enzim immobilizasyonu gerçekleştirildi. Optimum sürede inkübasyonun ardından her bir örneğin üst fazlarında protein tayini yapılarak immobilizasyon verimleri hesaplandı. 6

2.5.3 Enzim Miktarının Ġmmobilizasyon Verimi Üzerine Etkisi Değişen enzim miktarının immobilizasyon verimi üzerine etkisinin belirlenmesi için 20 mg Amberlite XAD-7 taşıyıcısına değişen konsantrasyonlarda enzim konularak son hacim immobilizasyon işlemi optimum koşullarda gerçekleştirildi. İşlem sonrası her bir örneğin üst fazında protein ve aktivite tayinleri yapılarak immobilizasyon verimleri hesaplandı. 2.6 Kısmi SaflaĢtırılan Lakkazın Amberlite XAD-7 Üzerinde Ġmmobilizasyonu ve Ġmmobilizasyon Veriminin Hesaplanması Kısmi saflaştırılan lakkaz büyük miktarlarda taşıyıcıya optimum koşullarda immobilize edilerek immobilize enzimin optimum çalışma koşullarının belirlenmesi amacıyla stoklandı. Bu amaçla, 300 mg taşıyıcıya enzim eklenerek 30 dakika boyunca oda sıcaklığında 240 rpm de orbital karıştırma altında enzimin immobilizasyonu sağlandı. Üst fazda protein ve aktivite tayinleri gerçekleştirildi. Alt fazda ise aktivite tayini yapılarak immobilizasyon sırasındaki aktivite kaybı belirlendi. Ardından alt faz liyofilize edilerek liyofilizasyon sırasındaki aktivite kaybının olup olmadığı tespit edildi. 2.7 Ġmmobilize Lakkazın Karakterizasyonu 5 mg immobilize enzimin ph sı 3-6 arasında değişen asetat tamponu kullanılarak aktiviteleri ölçüldü. Serbest enzimin aynı ph koşullarında aktiviteleri ölçülerek serbest ve immobilize enzimin optimum ph değerleri saptandı. Optimum ph nın belirlenmesinin ardından serbest ve immobilize enzimin 25-75 C sıcaklıklarda aktiviteleri standart koşullarda ölçülerek serbest ve immobilize enzimin optimum sıcaklık değerleri belirlendi. 7

2.8 Serbest ve Ġmmobilize Enzimin Kararlılık Testleri Serbest ve immobilize enzimin depo kararlılığının belirlenmesi amacıyla kısmi saflaştırılan enzim distile suda ve immobilize enzim ise kuru formda -20 o C de depolanarak belirli periyotlarda aktiviteleri ölçüldü ve başlangıç aktivite değerleriyle kıyaslanarak % aktivite kayıpları tespit edildi. Serbest ve immobilize enzimin optimum koşullarında aktivite kayıplarının belirlenmesi amacıyla optimum ph ve optimum sıcaklık değerlerinde serbest ve immobilize enzim örnekleri inkübe edilerek belirli sürelerde her bir enzim örneğinin standart koşullarda aktivite tayinleri yapılarak başlangıca kıyasla zamanla aktivite kayıpları belirlendi. 2.9 Ġmmobilize Enzim ĠĢlem Kararlılığı İmmobilize enzim aktivitesi belirtilen standart koşullarda ölçümünün ardından ph 3,5 tampon çözelti (5 ml) ile immobilize enzim 3 kez yıkandı ve yıkamanın ardından tekrar aktivite ölçümü gerçekleştirildi. Her ölçüm sonrası tekrar yıkama işlemleri gerçekleştirildi ve işlem 10 kez tekrarlanarak immobilize enzim için bağıl aktivite değerleri saptandı. Tekrar kullanım sonrası başlangıç aktiviteye kıyasla % bağıl aktivite değerleri hesaplandı. İmmobilize enzimler için tekrar kullanılabilirliği kapsayan işlem kararlılıkları önemlidir. Serbest enzimler biyoteknolojik kullanımlarında sadece tek kez kullanılırlar ve işlem sonrası reaksiyon ortamından ayırılamadığı için tekrar kullanımları mümkün değildir. Ayrıca serbest enzim ortamda kirlilikte yaratabilmektedir. Biyoteknolojik uygulamalarda enzimin defalarca kullanılabilmesi amacıyla immobilizasyon işlemleri gerçekleştirilmektedir. Çalışmamızda bu amaçla serbest lakkaz enzimi taşıyıcıya immobilize edilerek defalarca kullanıma olanak verip vermediği araştırılmıştır. 2.10 Direct Green B Tayini, Serbest ve Ġmmobilize Enzimin Direct Green B Boyasının Gideriminde Kullanılması Boya gideriminde kullanılacak boya olarak seçilen Direct Green B tekstil boyasının öncelikle spektrum taraması yapılarak ışığı maksimum absorbladığı dalga boyu tayin edildi. Dalga boyunun tayin edilmesinin ardından konsantrasyonu 0,01-0,1 mg/ml arasında değişen boya konsantrasyonlarına karşı absorbans değerleri ölçülerek standart grafiği çizildi. Aynı aktivitelere sahip immobilize ve serbest enzim, 50 ml optimum ph ve sıcaklıktaki 0,1 mg/ml konsantrasyonda Direct Green B tekstil boyası içeren çözeltiye eklenerek sabit karıştırma hızı altında belirlenen zaman aralıklarında örnekler alınarak boya konsantrasyonları ölçüldü ve her bir örnekte boya giderim verimi hesaplandı. Kontrol olarak 8

A(595nm) 50 mg Amberlite XAD-7 reçinesi immobilize enzim ile aynı koşullarda boya ile muamele edilerek taşıyıcının adsorpladığı boya miktarı belirlendi. 3. SONUÇLAR VE TARTIġMA 3.1 Protein Tayini Albuminin 0,02 0,25 mg/ml konsantrasyon aralığında Bradford yöntemiyle elde edilen standart grafik Şekil 3 de görülmektedir. 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 y = 2,114x R² = 0,985 0 0,1 0,2 0,3 [BSA] (mg/ml) ġekil 3. Protein standart grafiği 9

3.2 Lakkazın Atık Mantar Kompostundan Kısmi Ġzolasyonu Lakkazın kısmi izolasyonu çalışmasında her adımda örnek ayırılarak protein tayinleri, aktivite tayinleri yapılarak her örneğin protein konsantrasyonları, hacimsel aktiviteleri, spesifik aktiviteleri, total aktiviteleri ve saflaştırma katları belirlendi (tablo 1). Tablo 1. Lakkazın kısmi saflaştırılması Protein konsantrasyonu (mg/ml) Hacimsel Aktivite (U/ml) Spesifik Aktivite (U/mg) Total Aktivite (U) SaflaĢtırma Katı Mantar kompostu 7,93 2,64 0,333 134,6 Amonyum Sülfat 0,24 - - - - çöktürmesi sonrası Santrifüjat Diyalizat 19,89 21,16 1,064 169,3 3,20 Ultrafiltrat Alt fazı 0,34 - - - - Ultrafiltrat 89,72 96,16 1,072 211,6 3,22 Kısmi saflaştırma sırasında amonyum sülfat çöktürmesi sonrasında yapılan santrifüj işleminde santrifüjatta herhangi bir aktivite beklenmez ve tüm aktivitenin pellette kalması istenir. Benzer şekilde ultrafiltrasyon adımında, ultrafiltrasyon alt fazında lakkazdan daha küçük moleküllü proteinlerin bulunması ve bu fazda aktivite görülmemesinin yanı sıra ultrafiltratta tüm aktivitenin kalması istenir. Tablo 1 den görülebileceği gibi hem santrifüjat hem de ultrafiltrat alt fazında aktivite görülmedi. Elde edilen sonuçlar, kısmi saflaştırma işleminin başarı ile gerçekleştiğini göstermektedir. Saflaştırma katı 3.22 olarak Lakkaz enziminin mantar kompostundan kısmi saflaştırma işlemi gerçekleştirilmiştir. 3.3 Lakkazın Ġmmobilizasyon KoĢullarının Optimizasyonu 3.3.1 Sürenin Ġmmobilizasyon Verimi Üzerine Etkisi İmmobilizasyon aşamasında süre tayinin yapılması, immobilizasyon veriminin değişen sürelerde belirlenmesinin gerekliliği ve ekonomik olarak zamandan tasarruf açısından önemli bir parametredir. 10

İmmobilizasyon verimi (%) İmmobilizasyon verimi (%) 100 90 80 70 60 50 0 50 100 150 t(dakika) ġekil 4: Sürenin immobilizasyon verimi üzerine etkisi Şekil 4 de görüldüğü gibi; Lakkazın Amberlite XAD-7 taşıyıcısına immobilizasyonununda, 10 dakika gibi kısa bir sürede % 95 lik bir verime ulaşıldı ve ardından 30 dakika sonunda verim %97 ye yükselerek bu süreden sonra immobilizasyon verimi sabitlendi. Bu nedenle enzim immobilizasyonunda optimum süre 30 dakika olarak seçildi. 3.3.2 ph ın Ġmmobilizasyon Verimi Üzerine Etkisi Lakkazın immobilizasyonu sırasında taşıyıcı ve enzim arasındaki etkileşimin maksimum olduğu ph değerinin belirlenmesi, immobilizasyon veriminin belirlenmesi için gerekli bir adımdır. Değişen ph değeri, ortam ph sından etkilenen taşıyıcı ve enzimin immobilizasyon verimini oldukça etkileyen bir unsurdur. ph ın immobilizasyon verimi üzerine etkisi Şekil 5 de verildi. 100 90 80 70 60 50 0 5 10 ph ġekil 5. ph ın immobilizasyon verimi üzerine etkisi 11

Elde edilen sonuçlara göre ph değişimi immobilizasyon verimi üzerinde etkili değildir. Amberlite XAD-7 taşıyıcısı iyonlaşabilen uçlar taşımadığından immobilizasyon, iyonik etkileşimlerle değil non-kovalent etkileşimler ile sağlanmıştır. 3.3.3 Enzim Miktarının Ġmmobilizasyon Verimi Üzerine Etkisi İmmobilizasyon sırasında taşıyıcının bağlanacağı enzim miktarından fazlasına geçilmesi, immobilize enzimin kullanımı sırasında taşıyıcı üzerinden enzimin kaybına neden olur. Ayrıca ekonomik açıdan, taşıyıcının bağlayabileceği enzimden fazlasının immobilizasyon sırasında kullanılması da ek maliyet getirebilmektedir. Bu nedenle, taşıyıcının üzerine bağlayabileceği maksimum enzim miktarının belirlenmesi gerekmektedir. Deneme sonucunda elde edilen veriler Şekil 6 da görülmektedir. 100 80 60 40 20 0 100 80 60 40 20 0 0,63 1,26 3,16 6,32 12,64 enzim miktarı (mg-protein) protein bağlanma verimi (%) aktivite verimi (%) ġekil 6. Enzim miktarının immobilizasyon verimi üzerine etkisi Grafikten görüldüğü gibi en uygun enzim miktarına deneysel olarak 100 µl (6.32 mgprotein) enzim ile ulaşıldı ve optimum değer olarak belirlendi. 3.4 Optimum Ġmmobilizasyon KoĢullarında Enzim Ġmmobilizasyonu Optimum immobilizasyon koşullarında Lakkaz immobilizasyonu gerçekleştirilerek immobilizasyon sonrası üst fazda ve yıkama sularında aktivite, protein tayinleri yapılarak % verim hesaplandı. İmmobilizasyon ortamına konulan enzim aktivitesi 782.5 U iken immobilizasyon sonrası üst faz ve yıkama sularında toplam 78.25 U aktivite ölçüldü. Ortama konulan enzim aktivitesinden çıkılarak aktiviteye göre immobilizasyon verimi yaklaşık % 90,0 olarak hesaplandı. Protein tayinleri her bir aşamada yapıldığında ise proteine göre 12

(%) Maksimum aktivite immobilizasyon verimi yaklaşık % 95,0 olarak hesaplandı. Bu verilere bakıldığında %5.0 enzim aktivitesinin immobilizasyon işlemi sırasında kaybı söz konusudur. 3.5 Ġmmobilize Lakkazın Aktivite Gösterdiği Optimum ph Değerinin Bulunması Farklı ph değerlerinde tampon çözeltiler kullanılarak standart koşullarda immobilize enzim aktivitesi ölçülerek % bağıl aktivite değerleri saptandı. Şanlıer ve arkadaşları tarafından yürütülen yayınlanmamış bir çalışmada, mantar kompostundan izole edilen Lakkaz enzimi kullanılmış ve optimum ph değeri 3.0 olarak tespit edilmiştir. Çalışmamızda, immobilize enzim için optimum ph değeri 3.0 olarak saptandı (Şekil 7). ph 3.5 dan sonra immobilize enzim aktivitesinde büyük düşüş gözlendi. ph değerinde serbest enzime kıyasla çok büyük bir farklanma saptanmadı. 100 80 60 40 20 0 0 2 4 6 8 ph ġekil 7. İmmobilize enzim optimum ph taraması 3.6 Ġmmobilize Lakkazın Aktivite Gösterdiği Optimum Sıcaklığın Saptanması İmmobilize enzim için optimum ph değeri olan ph 3.5 daki tampon çözeltisinde ve farklı sıcaklıklardaki immobilize enzim aktiviteleri Şekil 8 de görülmektedir. Mantar kompostundan izole serbest enzim için optimum sıcaklık değeri 65 o C olarak bilinmektedir. Çalışmamızda immobilize enzim için optimum sıcaklık değeri serbest enzime kıyasla değişmedi ve 65 o C olarak saptandı. 13

(%) Bağıl aktivite (%)Maksimum aktivite 120 100 80 60 40 20 0 0 20 40 60 80 T( C) ġekil 8. İmmobilize enzim optimum sıcaklık taraması 3.7 Serbest ve Ġmmobilize Enzimin Optimum KoĢullarında Kararlılıklarının Belirlenmesi Optimum aktivite koşullarında serbest enzim ve immobilize enzim için kararlılık testleri yapıldı. Bu amaçla serbest enzim ph 3.0 tampon çözeltisi içinde 65 o C de inkübe edilerek belirlenen sürelerde ve standart koşullarda ABTS ilave edilerek aktivite izlendi. Benzer bir şekilde immobilize enzim, ph 3.5 tampon çözeltisi içinde 65 o C de inkübe edilerek, belirlenen sürelerde ve standart koşullarda ABTS ilave edilerek aktiviteler izlendi. Şekil 9 da serbest enzim ve immobilize enzim için optimum koşullarda kararlılık test sonuçları görülmektedir. 120 100 80 60 40 20 0 0 50 100 150 t(dakika) Serbest enzim İmmobilize enzim ġekil 9. Optimum koşullarında kararlılık testleri 14

(%) Bağıl aktivite 3.8 Ġmmobilize Enzim ĠĢlem Kararlılığı İmmobilize enzim aktivitesi ölçümünün ardından ph 3,5 tampon çözeltisi ile immobilize enzim 3 kez yıkanarak tekrar aktivite ölçümü gerçekleştirildi ve işlem 10 kez tekrarlanarak immobilize enzim için bağıl aktivite değerleri saptandı. Şekil 10 da görüldüğü gibi 10. ölçüm sonrasında bile %84.40 başlangıç aktivitesinin korunduğu belirlendi. İşlem kararlılığı immobilize enzim için defalarca tekrar kullanıma olanak sağlamaktadır. 105 100 95 90 85 100 98,6 97,3 95,24 93,07 90,85 89,93 89,61 84,8584,41 80 75 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Ölçüm sayısı ġekil 10. İşlem kararlılığı 3.9 Direct Green B Tayini Boyanın dalga boyu taraması sonucunda, maksimum absorbans değeri 631 nm de saptanması nedeniyle boyanın spektrofotometrik ölçümlerinde 631 nm dalga boyu olarak belirlendi (Şekil 11). 15

ġekil 11. Direct Green B boyar madde spektrum taraması Batch sistemde boya gideriminde bilinmeyen örneğin miktarının belirlenebilmesi için hazırlanan Direct Green B standart grafiği Şekil 12 de görülmektedir. ġekil 12. Boya standart grafiği Grafikten de görüldüğü gibi çizilen standardın doğruluğunu gösteren R 2 değeri 0,9985 olup grafikten elde edilen denklem y=8,4103x tir. Boya konsantrasyonu hesapları bu denklemden faydalanılarak yapılmıştır. 16

(%) Boya giderim 3.10 Serbest ve Ġmmobilize Enzimin Direct Green B Boyasının Gideriminde Kullanılması Serbest enzim ile aynı aktiviteye sahip immobilize enzim (1U/mg) ve serbest enzim, optimum ph ve sıcaklıktaki 50 ml ve 0,1 mg/ml konsantrasyonda Direct Green B tekstil boyası içeren çözeltiye eklenerek sabit karıştırma hızı altında belirlenen zaman aralıklarında örnekler alınarak boya konsantrasyonları ölçüldü ve her bir örnekte boya giderim verimi hesaplandı. Serbest enzim için 3 kez tekrarlanan her bir denemede, serbest enzimin boya çözeltisi içinde inhibe olduğu ve hiçbir aktivite göstermediği tespit edildi. İmmobilize enzim için ise boyanın enzim üzerinde bu şekilde bir inhibisyon yaratmayarak boya giderimi sağladığı tespit edildi. Kontrol deneme olarak immobilize enzim ile aynı miktarda 50 mg Amberlite XAD-7, aynı koşullarda 0,1 mg/ml boya içeren 50 ml ph 3.5 sitrat tamponu ile inkübe edilerek adsorpladığı boya miktarı tespit edildi. Süre sonunda Amberlite XAD-7 reçinesinin %19 boya giderimi gerçekleştirdiği belirlendi. İmmobilize enzimin boya giderim verimi Şekil 13 de görülmektedir. 180. dakikada immobilize enzimin boya giderim verimi % 53 olarak saptandı. 60 50 40 30 20 10 0 0 50 100 150 200 t(dak) ġekil 13. İmmobilize enzim kullanılarak boya giderimi 4. GENEL DEĞERLENDĠRME Günümüzde tekstil sanayinde Direct Green B gibi azo boyar maddeler sıklıkla kullanılmaktadır. Atık sulardan boyar maddelerin gideriminde kullanılan geleneksel yöntemlerin tümü yüksek maliyetlere, uygulama güçlüğüne ve büyük miktarda atığa sahiptir. Bu nedenle düşük maliyet ve giderim veriminin artırılması amacıyla son yıllarda ticari lakkaz kullanım çalışmaları sürdürülmektedir. 17

Lakkaz, bakır içeren elektron alıcısı olarak moleküler oksijeni kullanmak suretiyle çeşitli fenolik bileşiklerin oksidasyonunu katalizleyen polifenol oksidaz grubu bir enzimdir. Lakkaz, substrat spesifikliğinin geniş olması nedeniyle delignifikasyon, boya giderimi, biyolojik iyileştirme ajanı, etanol üretimi, biyosensör ve biyoaktif gibi birçok çalışmada yer alan bir enzimdir. Ticari olarak üretimi bulunan serbest lakkaz, birçok endüstriyel kuruluşta rutin olarak kullanılmaktadır. Çalışmamızda kullanılan mantar kompost atığı lakkazının, ticari üretimi bulunmamakta olup saflaştırılması ve immobilizasyonu çalışmalarına literatürde rastlanmamıştır. Lakkaz, geniş spektrumda boya gideriminde kullanılan bir enzim olmasına karşın, atık su arıtımında kullanıldığında termal ve ph kararlılığının düşük olması nedeniyle kolaylıkla aktivitesini kaybedebildiği, atık su ortamında inhibitörlerce inaktif olabildiği literatürlerde belirtilmiştir. Bu nedenle serbest lakkazın boya gideriminde rutin kullanımı sınırlıdır. Çalışmamızda, bir atık olan atık mantar kompostundan çıkılarak lakkaz enzimi basit saflaştırma prosedürleri kullanılarak (amonyum sülfat çöktürmesi-santrifüj-diyaliz- Ultrafiltrasyon-Liyofilizasyon) 3,22 kat kısmi olarak saflaştırıldı. Elde edilen lakkaz, enzim immobilizasyon tekniği kullanılarak ucuz, operasyon kararlılığı, depolama kararlılığı ve işlem kararlılığı serbest enzime kıyasla yüksek immobilize lakkaz hazırlandı. 10. kullanım sonrası bile immobilize enzimin başlangıç aktivitesinin % 84,41 oranında koruduğu tespit edildi. Serbest enzim optimum aktivite koşulları olan ph 3.0, 65 o C sıcaklıkta boya ile inkübe edildiğinde hemen aktivitesi kaybolurken immobilize enzimin optimum aktivite koşulları olan ph 3.5 ve 65 o C de boya ile inkübasyonunda %53 boya giderimi saptandı. İmmobilize enziminde bu sıcaklık ve ph koşullarında aktivite kaybı düşünüldüğünden deneme 180. dakikada kesildi. Lakkaz enziminin ticari kullanımlarında ortama mediyatör ilavesi gerçekleştirilir. Çalışmamızda herhangi bir mediyatör ilave edilmeden boya giderim gerçekleştirildi. Mediyatör varlığında immobilize enzim aktivitesinin bu koşullarda daha kısa zaman içinde yüksek aktivite ile giderim yapabileceği düşünülmektedir. Böylelikle inkübasyon süresini kısaltmanın optimum koşullarda gerçekleşecek inhibisyona da engel olunabilecektir. Literatürde yer alan çalışmalar incelendiğinde; Wong ve arkadaşları tarafından gerçekleştirilen bir çalışmada, lakkaz, PEG içeren aljinat/jelatin boncuklarda immobilize edilmiş ve glutaraldehit ile boncuklar çapraz bağlanmıştır. Optimum koşullarda hazırlanılan lakkaz içeren boncuklar tekstil boyar maddesi Red B-3BF gideriminde kullanılmıştır. 10. kez kullanımda % 50 boya giderim verimi saptandığı ifade edilmiştir (9). Bayramoğlu ve arkadaşlarının bir çalışmasında, poli (4-vinil piridin), poli (VP) yeni metal şelat yapıcı polimerlerle manyetik kürelere graft polimerizasyon yöntemi uygulanarak Trametes versicolor lakkaz immobilizasyonunda kullanılmıştır. Metal bağlanmış manyetik kürelerde immobilize edilen lakkaz Reactive Green 19, Reactive Red 2 ve Reactive Brown 10 tekstil boyalarının 18

gideriminde kullanılmıştır. Batch sistem boya giderim çalışmalarında, 6 saat sonunda Reactive Green 19 için %38, Reactive Red 2 için %51 ve Reactive Brown 10 için %59 oranında giderim sağlandığı ifade edilmiştir (10). Cristovao ve arkadaşlarının bir çalışmasında, yeşil coconut fiber kullanılarak lakkazın immobilizasyonu gerçekleştirilmiştir. Çalışmada boya giderim verimleri; Reactive Blue 114 için % 40, Reactive Yellow 15 için % 48, Reactive Black 5 için % 23, Reactive Yellow 176 için % 4, Reactive Red 180 için % 7 ve Reactive Red 239 için ise % 0 olarak saptanmıştır. Mediyatör varlığında ise boya giderim verimleri sırasıyla %90, %93, %90, %0, %93, %96 olduğu belirtilmiştir. Çalışmada ayrıca immobilize enzimin serbest enzime kıyasla termal stabilitesinde artış gözlendiği ifade edilmiştir. Serbest enzim 60 C de 5 dakika deaktive olurken immobilize enzim için aynı oranda deaktivasyon 1 saat sonunda saptanmıştır. İmmobilize lakkazın operasyonel kararlılığına bakıldığında 5 kez kullanımda % 30 aktivite kaybı gözlenirken 13 kez kullanımda aktivite kaybının % 45 olduğu belirtilmiştir (11). Çalışmamızda, literatür bulgularına kıyasla defalarca kullanıma olanak sağlayan, mediyatörsüz ortamda bile boyar madde giderimi sağlayabilen bir immobilize lakkaz preparatı hazırlanmıştır. 5. TEġEKKÜR Proje Ege Üniversitesi Fen Fakültesi Biyokimya Laboratuarlarında gerçekleştirilmiştir. Teorik ve laboratuar desteklerinden dolayı Doç. Dr. Şenay Şanlıer, Asistan Güliz Ak ve Habibe Yılmaz a, çalışmalarımız sırasında bize danışmanlık yapan Bilim Kurulu Eş Başkanımız Dr. Ayşe Baran Türker e, bize her konuda destek olan okul yöneticilerimize ve ailelerimize teşekkür ederiz. 6. KAYNAKLAR 1) Şen S. ve,yalçın M., (20-22 Mayıs, 2010), Dünya ve Türkiye de Kültür Mantarcılığı ve Geliştirilmesi, III. Ulusal Karadeniz Ormancılık Kongresi. 2) http://tr.wikipedia.org/w/index.php?title=dosya:portobello_mushrooms.jpg&filetimesta mp=20050822031620. 3) Tuncer, M., (2010) Lakkaz, Kısım 1: Yapısı, Katalitik Özellikleri ve Dağılımları, Fen Bilimleri Enstitüsü Dergisi, 22, 19-63. 4) Gedikli, S. ve ark., (2010), Lakkaz Enzimi ile Kot Boyarmaddesinin Dekolorizasyonu, Anadolu University Journal of Science and Technology-C Life Sciences and Biotechnology, 1, 59-70. 5) Arık, B. Ve ark., (2008), Lakkaz Enzimlerinin Tekstilde Kullanımları, Tekstil Teknolojileri Elektronik Dergisi, 2, 17-22. 19

6) http://www.chinachemnet.com/38478/direct-green-b-1709871.html 7) Bradford MM, (1976), A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.,anal. Biochem; 72, 248-254. 8) Hamarat Sanlier, Ş., Gider, S. ve Köprülü, S., (2012), Immobilization of laccase for biotechnology applications, Art. cells Blood Subs. Imm. Biotechnol.,(doi: 10.3109/10731199.2012.731414). 9) Wong P., Fan X., Cui L., Wong Q., and Zhan A., (2008), Decolorization of reactive dyes by laccase immobilized in alginat/gelatin blent with PEG, Journal of Environmental Sciences, 20, 1519-1522. 10) Bayramoglu G., Yilmaz M. and Arica Y.M., (2010), Reversible immobilization of laccase to poli(4- vinil piridin) grafted and Cu(II) chelated magnetic beads: Biodegradation of reactive dyes, Biosource Technology, 101, 6615-6621. 11) Cristovao R.O., Tavares A.P.M., Brigida A.I., Loureiro J.M., Boaventura R.A.R., Macedo E.A. and Coelho M.A.Z., (2011), Immobilization of commercial laccase onto gren coconut fiber by adsorption and its application for reactive textile dyes degradation, Journal of Molecular Catalysis B : Enzymatic, 72, 6-12. 20