ABSORPSİYON SPEKTROFOTOMETRİSİ Işının absorpsiyon düzeyinin ölçülmesi ile gerçekleştirilen analizlere absorpsiyometri denir. ENSTRÜMANTAL ANALİZ Spektrofotometrik yöntemler Doğal olarak renkli veya sonradan renklendirilen bir bileşiğin görünür bölgeye ait bir ışığı absorplamasına dayanan absorpsiyometrik yöntemlere kolorimetri denir. Spektrofotometri ise görünür bölge (visible, GB), Ultraviyole (UV), infrared (IR) bölgelerdeki belli dalga boyundaki herhangi bir ışının madde tarafından absorplanmasına dayanan yöntemlerdir. UV ve GB ışınları, daha çok kantitatif analizlerde, IR ışınları ise kalitatif analizlerde kullanılmaktadır FOTOMETRİ, çok genel bir terimdir. Absorpsiyon dışında emisyon ölçümlerini de içine alır. Fotometri bir maddenin absorbe ettiği veya yaydığı ışının miktarının ölçülmesidir. Fotometri tekniği 4 genel grupta toplanır. 1) Kolorimetrik veya spektrofotometrik analizler 3) Nefelometrik analiz metotları: Bir süspansiyon tarafından saçılan ışın miktarının ölçülmesi prensibine dayanır. 4) Türbidimetrik analiz metotları: bulanık bir çözelti içinden geçen ışın miktarının ölçülmesine dayanır. 1) Florometrik analiz metotları (Floresans özelliğe sahip maddelerin yaydığı ışının şiddetinin ölçülmesidir Absorpsiyometride kullanılan temel kavramlar Kolorometrik ve spektrofotometrik analizler, kimyasal maddelerin ışığın bir kısmını absorbe edip bir kısmını da geçirmesi prensibinden yararlanılarak geliştirilen analiz yöntemleridir. Tabakaya gelen ışık Şiddeti: I 0 Lambert-Beer Yasası absorpsiyon ölçümlerinin dayandığı kanundur. Absorplanan fotonların sayısı, ortamdaki absorpsiyon yapan türlerin sayısı ile orantılıdır. Monokromatik ve I 0 şiddetinde ışıma, ortamı daha küçük olan I şiddetinde terk eder. Tabakadan çıkan ışık Şiddeti: I Homojen bir absorplayıcı ortam 1
Çözeltiden çıkan ışık şiddetinin çözeltiye giren ışık şiddetine oranı (I/Io), transmittans (T) olarak tanımlanır. Transmittans, genellikle %Transmittans (%T) olarak ifade edilir. Transmittansın tersinin logaritması absorbans (Optik yoğunluk, A) olarak tanımlanır. Bu, çözeltinin içinden geçen ışığın ne kadarının absorbe edildiğinin (soğurulduğunun) ifadesidir. Bir çözeltide çözünmüş olan maddenin miktarı veya konsantrasyonu ile %Transmittans (%T) arasında doğrusal olmayan bir ilişki olduğu halde absorbans (A) arasında doğrusal bir ilişki vardır. Lambert-Beer Yasası Absorbans (A), yüzde transmittans (%T) ve çözeltideki maddelerin konsantrasyonu (c) arasındaki ilişkiyi Lambert-Beer yasası ifade eder: İçinde çözelti bulunan bir küvetten geçen ışığın transmittansı (I/Io), ışık yolu veya küvet genişliğinin(l) artmasıyla azalır; ayrıca çözeltinin absorbansı (A), çözeltinin konsantrasyonu (c) ile doğru orantılıdır. absorpsiyon katsayısı (ekstinksiyon katsayısı) olarak gösterildiğinde Lambert-Beer yasasının matematiksel ifadesi şu şekilde olur. ε=absorpsiyon katsayısı (L/mol.cm) C=Maddenin konsantrasyonu (mol/l) l=işık yolu (cm) ε: belirlenmiş bir dalga boyu ve çözücü koşullarında 1 cm lik küvettte saf absorbans materyalin 1 mol konsantrasyonun absorbansı Lambert-Beer kanununun sağlıklı bir şekilde uygulanabilmesi için aşağıdaki şartların sağlanması gerekir: Kullanılan ışın monokromatik olmalı Seyreltik çözeltilerle (düşük konsantrasyonlarda) çalışılmalı Çözelti hem homojen olmalı hem de floresans özellik göstermemeli Kolorimetre Çözelti içindeki madde miktarını çözeltinin renginden faydalanarak ölçme işlemine kolorimetri, bu tip ölçümde kullanılan cihazlara da kolorimetre denir. Kolorimetrik ölçümde, konsantrasyonu ölçülecek çözeltinin rengi değişik konsantrasyonlardaki standartların rengiyle karşılaştırılarak değerlendirilir. Sadece görünür bölgede analiz yapılabilir. Çözelti içerindeki analizi yapılacak madde kullanılan ışık ile fotokimyasal reaksiyonlara girerek değişim göstermemeli Çözünen madde, içerisinde çözündüğü çözücü ile değişken özellikler gösteren ilişkiler sergilememeli 2
İstenilen dalga boyunu ayarlamak için monokromatör olarak filtreler kullanılır prizmalar aracılığı ile bu seçiciliği yapan aletler spektrofotometre olarak adlandırılırlar. UV ve Görünür bölge spektrofotometresi Maddenin ışığı absorplamasını incelemek için kullanılan düzeneğe absorpsiyon spektrometresi veya absorpsiyon spektrofotometresi adı verilir. Bir spektrofotometrenin bölümleri; 1. Işık Kaynağı, 2. Dalga Boyu Seçicisi (Monokromatör) 3. Küvet 4. Dedektör 5. fotometre veya yazıcı Spektrofotometrenin çalışma prensibi: Lamba tarafından yayılan ışın demeti monokromatör (prizma) yardımıyla tek bir dalga boyundaki ışına (monokromatik ışına) dönüştürülür. Bu ışın örneğin içinde bulunduğu odaya girer. (Ölçümü yapılacak örnek, küvet içine konulur.) Örnekten geçen ışığın şiddeti dedektör tarafından algılanır ve kaydedici ya da yazıcıya elektrik sinyali şeklinde gönderilir. Işık Kaynakları Tungsten flaman lambası, görünür ve yakın IR bölgede (320-3000 nm) ışık yayar. Monokromatör: tek bir dalga boyundaki ışının seçilmesi için kullanılır Döteryum (D2) lamba: UV ışık için Tungsten (W) lamba: görünür ışık için kullanılır. Hidrojen ve döteryum lambaları: Ulraviyole bölgede en çok kullanılan lambalar, Bu lambalar 180-380 nm arasında ışık yayar. Daha pahalı ve daha uzun ömürlü olan D 2 lambasının yaydığı ışığın şiddeti H 2 lambasına göre çok daha fazladır. Xe ark lambası, UV-görünür bölgenin tümünde (150-700 nm) kullanılabilecek şiddetli ve sürekli ışık kaynağıdır. Civa buhar lambası, her iki bölgede ışıma yapabilen bir ışık kaynağıdır. 3
Dalga boyu seçicileri (monokromatörler) ışık kaynağından gelen polikromatik ışıktan tek bir dalga boyunda monokromatik ışık elde edilmesini gerçekleştiren düzeneklerdir. ışık filtresi: filtreli fotometrelerde kullanılır Camdan yapılmış, uygun boyalarla boyanmış filtreler Portatiftir Uygun dalga boyundaki filtre cihaza istendiğinde takılabilir. Filtrelerin üzerinde geçirdikleri dalga boyu yazılıdır Monokromatörler Işık prizması: Spektofotometrelerde kullanılır Cam veya kuartz olabilir Görünür bölgede cam Kuartz prizmalar hem görünür hem UV bölgede kullanılabilir. Kuartz prizmalar pahalı spektrofotometrelerde bulunur Spektrofotometre küvetleri örneğin konulduğu örnek kapları, yuvarlak bir tüp veya dört köşe olabilir. Küvetler, soft veya borosilikat camdan, kuartz veya plastikten yapılır. Soft camlar asidik çözeltiler, borosilikat camlar kuvvetli alkali çözeltiler için uygundur. Corex gibi bazı camlar 340 nm de kullanılabilse de kısa UV dalgalar için uygun değildir. Kuartz küvetler hem UV hem görünür dalga boyları için uygundur. Plastik küvetler özel üretilmiş ise 200-700 nm arasında rahatlıkla kullanılabilir. Küvetlerin temizliği: Küvetler kullanıldıktan hemen sonra bol çeşme suyu ve ardından distile sudan geçirilmelidir. Aşırı kirlenen veya koyu renkli reaktiflerin okunduğu küvetler deterjanlı su, çeşme suyu ve distile su ile yıkanmalıdır. Kesinlikle fırça kullanmamalıdır. Deterjanla temizlenemeyen küvetler, %20 lik nitrik asitte bir gece bekletildikten sonra, distile sudan geçirilip kullanılır. Küvet temizliğinde bikromat solüsyonu kullanılmamalıdır. %10 luk NaOH kullanılabilir; ancak küvetler bu çözeltide uzun süre kalmamalıdır. Dedektörler (Fototüpler) Gelen ışınların miktarını belirlemeye yarayan aletlerdir. Bunlara ayrıca foton dedektörleri de denir. Bu aletlerde 0-1 milivolta çevrilebilecek derecedeki absorbans (A) veya transmittans (T) değerleri, elektrik enerjisine dönüştürülerek bir fotometre veya bir yazıcıya aktarılır. Böylece analiz sonucunda elde edilen sinyal, T veya A değeri şeklinde takip edilebilmektedir. Spektrofotometrelerde çok sayıda değişik fototüp veya dedektör kullanılmaktadır. En önemlileri: Fotovoltaj hücreleri: Burada ışık enerjisi ile bir akım üretilir. Bu sistem genellikle 350-750 nm dalga boyu arasında ölçüm yapılması için uygundur. Fototüp: Işığa hassas bir yüzeyden elektron üretimi yapılarak bunlar elektrik akımına dönüştürülür. Bu tüplerle, UV den IR bölgesine kadar oldukça geniş bir aralıkta ölçüm yapılabilmektedir. 4
Fotoçoğaltıcı tüp: Fototüpe benzer özellik gösterir. Ancak burada elektron şelaleleri şeklinde akım üretilir. Bu aletler çok hızlıdır ve diğerlerine nazaran daha hassas ölçüm yapabilmektedirler. Özellikle UV ve görünür bölgede hassasiyetleri çok fazladır. Fotokondüktivite dedektörleri: Burada da yine elektronlarla bir akım üretilir ve özellikle uzun dalga boylu ışınlarla çalışıldığında hassasiyetleri yükselmektedir. Bunlar IR bölgede ve dalgaboyları 3 µm ye kadar olan bölgelerde tercih edilirler. Fotometre veya yazıcı Dedektörden alınan sinyalin analizcinin anlayabileceği bir formata dönüştürülmesini sağlayan dijital bir gösterge veya bir skala üzerindeki ibre hareketi, bir bilgisayar sistemi ya da yazıcıda çizilen bir grafiktir. Spektrofotometre çeşitleri Tek ışınlı spektrofotometreler Bu cihazlarda tek bir ışın demeti kullanılır. Sıfırlama ve ölçüm işlemleri ayrı ayrı yapılır. Avantajı ucuz ve basit olmalarıdır. Aynı zamanda hassas ölçüm yapmalarıdır. Kantitatif analizlerde sağlıklı sonuçlar vermektedir. Çift ışınlı spektrofotometreler Örnek ve referans çözeltilerine aynı anda ışın gönderilebilen iki ışın kaynağı vardır. Işın şiddeti elektronik devrelerle kontrol edilir. Kullanıcıya önemli miktarda zaman kazandırmaktadırlar. Sonuçları güvenilirdir. Spektrofotometrik ölçümler Spektrofotometrik ölçümler iki farklı şekilde yapılabilir: Belli bir dalga boyunda absorbans ölçülür. Konsantrasyon veya absorpsiyon katsayısının belirlenmesine yarar. Çeşitli konsantrasyonlardaki standart çözeltilerin, belirli uygun bir dalga boyunda ışık için absorbans değerleri bir köre (absorbansı sıfır kabul edilen) karşı ayrı ayrı ölçülüp bir grafik kağıdına konsantrasyonlara karşı işaretlenerek standart grafiği çizilir. Örneğin absorbansı da aynı köre (absorbansı sıfır kabul edilen) karşı ölçülür ve ölçülen absorbansa karşı gelen konsantrasyon standart grafikten bulunur. Belli bir dalga boyu aralığında absorbans taraması yapılır. Böylece ABSORPSİYON SPEKTURUMU elde edilir. Maddenin kimyasal karakteri hakkında bilgi sağlar. 5
Spektrofotometre ile bir maddenin nicel analizinin yapılacağı dalga boyunu kararlaştırmak için, örneğin absorpsiyon spektrumunu bilmek gerekir. Bunun için, maddenin 1 molar çözeltisinin çeşitli dalga boylarındaki absorbans değerleri ölçülür. Standart çözeltilerin bilinen derişimlerine karşı Abs değerleri grafiğe geçirilerek kalibrasyon doğrusu elde edilir. Kantitatif analiz: Derişimi bilinmeyen örneğin A değeri ölçülür ve kalibrasyon doğrusunda bu değere karşılık gelen derişim saptanır. Spektrofotometrede ölçüm yapılırken absorbans değerleri 0.1-0.8 arasında olmalıdır. Bu absorbans değerlerine hangi konsantrasyon değerlerinde ulaşılacağı ile ilgili bir kural yoktur. Bu çözelti içerisindeki analiz yapılan bileşiğin özelliğine göre değişir ve denemelerle belirlenmelidir. Absorbansın 0.1-0.8 aralığında çalışılması en sağlıklı sonuç alınmasına neden olmaktadır. UV-VIS Spektrofotometrsinin kullanım alanları Kimya ve gıda laboratuvarlarında yapılan analizlerde, absorpsiyon spektroskopisi vazgeçilmez öneme sahip tekniklerden birisidir. Çok çeşitli analizler yapılabilir Karbonhidrat analizleri Aminoasit analizleri Protein analizleri Nükleik asit ve nükleotit analizleri Lipit ve steroid analizleri Vitamin analizleri Fenolik bileşikler Mikrobiyolojik analizler FLORİMETRİ Bazı kimyasal bileşikler, UV veya görünür bölge ışınlarına maruz bırakıldıklarında ortama, absorpladıkları ışının dalga boyundan daha uzun dalga boyuna sahip ışınlar yayarlar (emisyon). Bu olaya fotolüminesans özellik veya kısaca floresans özellik denir. Bu şekilde ortaya çıkan ışınları veya maddenin bu özelliğini kullanan enstrümantal analiz yöntemlerine de florimetri denir. Maddelerin ışık saçma özellikleri, 1852 yılından beri bilinmesine karşın analitik yöntem olarak kullanımı yenidir. Florimetride hedeflenen kimyasal bileşik, uygun bir dalga boyuna sahip (genellikle UV) ışınlarla uyarıldığı zaman, yüksek enerjili bir seviyeye çıkar (uyarılmış hal). Uyarılmış maddenin atom veya molekülleri, kararsız bir haldedir ve çok kısa bir süre içerisinde başlangıçtaki enerji seviyesine (temel hal) geri dönmek ister. İşte bu maddenin eski haline dönebilmesi için sahip olduğu enerji fazlasını, ısı enerjisi şeklinde değil de floresans radyasyonu, yani foton enerjisi şeklinde dışarı vermesi fotolüminesans olayı ile ilgilidir. 6
Burada uyarılmış atom veya moleküllerden etrafa yayılan ışınların dalgaboyu(λ) gönderilen ışının dalgaboyundan daha uzundur. Floresans özellikler taşımayan maddeler ise, bu uyarımla yükselen enerjilerini, genellikle ısı enejisi şeklinde dışarı verirler. Yani sadece floresans özellik gösteren maddeler dışarı foton enerjisi verirler, diğer maddeler ise veremez. İşte yayılan bu ışınlar çok hassas dedektörlerle tespit edilerek analizi gerçekleştiren maddenin kimyasal bazı özellikleri ile kalitatif ve kantitatif analizleri kolaylıkla yapılabilmektedir Fotolüminesans olayları sayesinde normal (UV-VIS) spektrofotometrelerden 1000 hatta 10000 kat daha hassas (10-9 -10-10 g) tayinler gerçekleştirilebilmektedir. Floresans olayının daha uzun süreli ve genellikle daha uzun dalga boylu ışın yayması olayına da fosforesans adı verilir. Organik bileşiklerin yaklaşık %10 luk bir kısmı floresans özelliktedir. Bunun dışındaki bileşiklerin çoğu kimyasal modifikasyonlarla (türevlendirme) floresans yapabilir hale getirilebilir. Florometreler veya spektroflorometreler Temel olarak, maddelerin floresanslığının ölçümünde kullanılan aletlere, florometre adı verilir. Spektroflorometreler daha kompleks yapıda olan florometrelerdir. Bu aletler genelde 4 temel bölümden oluşur: a) Işın kaynağı (H, De, Hg, Xe vb) b) Işınlayıcı ve yayılan ışının algılandığı bölüm c) Örneğin konulduğu bölüm d) Dedektör ve okuma bölümü Genel olarak florometrenin çalışma prensibi: Seçilen dalga boyundaki ışınlar örneğe ulaşır ve bu enerjiyi absorbe eden analit (örnek içerisinde analizi yapılacak bileşik) belli bir dalga boyunda başka bir ışın yaymaya başlar. Yayılan bu ışınlar 90 lik bir açıyla yerleştirilen dedektörler tarafından tespit edilir ve bir fotometreye aktarılır. Burada yapılan ölçümün 90 lik bir açıyla olmasının nedeni yayılan ışınların tüm boyutlarda (açılarda) dağılması ve dolayısıyla, uyarıcı ışınları yayılan ışınlara karışmasından kaynaklanabilecek hataların önlenmesi içindir. Ayrıca florometrelerde örnekten yayılan ışınların, maksimum derecede olduğu dalga boyu seçilerek analiz hassasiyeti arttırılabilmektedir. Örneklerin konulduğu kuvetler, cam, silika veya kuvartz olabilir. Ancak 320 ve daha düşük dalga boylu ışınlarda yapılan ölçümler için cam kullanılmamalıdır. UV bölgede özellikle 200 nm dalga boyu civarında magnezyum florid den yapılan küvetler tercih edilmelidir. 7
Florometrenin kullanım alanlar İlaç analizi, birçok organik aktif ilaç maddesinin floresansı yardımıyla yapılabilir. Metal iyonlarının analizi, bunların oluşturdukları bazı floresan kompleksleri yardımıyla yapılabilir. Biyolojik örneklerde bazı amino asitler (tripofan, sistein) florometrik yoldan tayin edilebilir. Çeşitli vitamin analizler (A, B6) Antibiyotikler Mikotoksinler vb Bazı biyokimyasal bileşiklerin florometrik tayini, bunların bir floresan madde ile tepkimeye sokulup yeni bir floresan ürün veya etiketlenmiş ürün oluşturularak yapılır. 8