T.C. İZMİR KÂTİP ÇELEBİ ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJELERİ KOORDİNASYON BİRİMİ

T.C. İZMİR KÂTİP ÇELEBİ ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJELERİ KOORDİNASYON BİRİMİ DONÖR LENFOSİT VE ENDOTEL ÖNCÜL HÜCRELERİNE KARŞI GELİŞEN ANTİKORLARIN EŞ ZAMANLI OLARAK AKIM SİTOMETRİ ÇAPRAZLAMA TESTİ İLE TESPİTİ Proje No: 2013-1-TSP-04 Proje Türü Bağımsız Araştırma Projesi SONUÇ RAPORU Proje Yürütücüsü: Yrd.Doç.Dr.Mustafa SOYÖZ Birimi/Bölümü Tıp Fakültesi/Tıbbi Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalı Proje Yardımcısı Adı Soyadı Doç.Dr. Tülay Kılıçaslan Ayna Birimi/Bölümü Tıp Fakültesi/Tıbbi Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalı Proje Yardımcısı Adı Soyadı Prof.Dr. İbrahim PİRİM Birimi/Bölümü Tıp Fakültesi/Tıbbi Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalı Aralık,2016 İZMİR

2

İÇİNDEKİLER İÇİNDEKİLER... Hata! Yer işareti tanımlanmamış. ÖZET... 4 ABSTRACT... 5 TEŞEKKÜR... 6 GİRİŞ / AMAÇ VE KAPSAM... 7 GENEL BİLGİLER... 9 GEREÇ VE YÖNTEM... 13 BULGULAR... 19 TARTIŞMA VE SONUÇ... 222 KAYNAKLAR... 23 3

ÖZET Donör Lenfosit ve Endotel Öncül Hücrelerine Karşı Gelişen Antikorların Eş Zamanlı Olarak Akım Sitometri Çaprazlama Testi İle Tespiti Donör organlarının endotel hücreleri, allogreft rejeksiyonu sırasında konağın bağışıklık sistemi için en birincil hedeftir ve anti-endotel hücre antikorlarının (AECAs) böbrek, kalp ve karaciğer transplantasyonunda klinik açıdan önemli olduğu bildirilmiştir. Bu çalışmada amaç nakil öncesi lenfosit çapraz uyum testleri negatif olan ve nakil sonrası rejeksiyon şüphesiyle laboratuvarımıza başvuran hastaların XM-ONE yöntemi ile endotelyal çapraz uyumlarının belirlenmesidir. Sağlık Bakanlığı İzmir Tepecik Eğitim ve Araştırma Hastanesi Doku Tiplendirme Laboratuvarına nakil öncesi doku tiplemesi ve çaprazlama testleri için gönderilen 14 verici-hasta çifti çalışmaya dâhil edildi. Tüm hastaların endotelyal çapraz uyum test sonucu negatif olarak değerlendirildi. PRA, çapraz uyum ve XM-ONE test sonucu negatif çıkmasına rağmen rejeksiyon atağı geçiren bu hastalara uygulanan immünsupresif tedavi protokolleri veya cerrahi komplikasyonların rejeksiyona sebep olduğu düşünülmektedir. Anahtar Kelimeler: Transplantasyon, XM-ONE, Endotelyal çapraz uyum 4

ABSTRACT Simultaneous Detection of Antibodies Produced Against Donor Lymphocyte and Precursor Endothelium Cells by Flow Cytometry Test Endothelium cells of donor organs are primer targets for immunological system of the host during allograft rejection and it was reported that anti-endothelium cell antibodies (AECAs) were clinically significant for kidney, heart, and liver transplantation. In this study, it was aimed to determine the endothelial crossmatch compatibilities of the patients, who were lymphocyte crossmatch negative before transplantation and applied to our laboratory with post-transplant rejection episode, by XM-ONE method. Totally 14 donor-patient couples who applied to Izmir Tepecik Education and Research Hospital Tissue Typing Laboratory were included. All of the patients were endothelial crossmatch negative. In conclusion, it was considered that immunsuppressive therapy protocols or surgery complications might lead to rejections in these patients who had rejections episodes, although they have negative PRA, crossmatch, and XM-ONE test results. Keywords: Transplantation, XM-ONE, Endothelial cross match 5

TEŞEKKÜR Bu çalışmayı destekleyen İzmir Kâtip Çelebi Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinasyon Birimi ne teşekkür ederiz. 6

GİRİŞ / AMAÇ VE KAPSAM Transplantasyon, çeşitli malign ve son dönem organ hastalıkları için çok önemli bir tedavi seçeneğidir. Alloimmüniteye bağlı akut ve kronik rejeksiyon transplantasyonun başarısını belirler. Allografta karşı verilen immün yanıtta immün sistemin hem hücresel hem de sıvısal komponentleri yer almaktadır. Allograftlardaki başlıca antijenik hedefler, İnsan Lökosit Antijenleri (HLA), ABO Kan grubu antijenleri, Minör Doku uygunluk antijenleri ve çeşitli organ spesifik antijenlerdir. Doku uygunluk antijenlerinin, kendinden olanı tanıma molekülleri olduğu artık bilinmektedir. Bu kapasiteleri ile T-hücre-bağımlı immün yanıtı tetikler ve yabancı maddelerle infekte hücrelerin immün eliminasyonuna aktif olarak katılırlar. Böbrek transplantasyonunda HLA sınıf I ve II için spesifik antikorların (Abs) klinik önemi tartışmasızdır (1). Konvansiyonel sitotoksik ve flow sitometrik lenfosit çaprazlama testleri (LXM) donöre özgü HLA antikorlarını tespit etmek için çok uygundur (2,3). Aynı şekilde, bir kısım katı faz teknikleri böbrek nakli bekleyen hastalara özgül HLA antikorlarının tanımlanması ve belirlenmesi için özelleştirilmiştir (4,5). Biliyoruz ki organ nakillerinden önce yapılan LXM testleri negatif olmasına rağmen rejeksiyonlar gerçekleşmektedir (6,7,8). HLA antikorlarıyla yapılan negatif sonuçlu çaprazlama testlerine rağmen nakil sonrası 1 yıl içinde böbrek kaybı yaklaşık olarak %10-15 tir (9). Bu rejeksiyonlar, non-hla antijenik sisteminin de antikor aracılı rejeksiyonda önemli rol oynadığını göstermektedir. Başlangıçta non-hla antijenlerinin endotel ve epitel hücreleri üzerinde bulunduğu ifade edilmişti. Buna ek olarak, çeşitli parankimal hücrelerin yanı sıra dolaşımdaki immün hücrelerin de non-hla antikorları için hedef olabileceği belirtilmiştir. Nakledilmiş organın endoteli organ ve doku uyumunda gelecekteki tartışma ve incelemelerde önemli bir hedef olabilecek olan non-hla antijenlerini sentezler (9). 7

Terasaki, HLA doku uyumlu kardeşler arası nakillerde, başarısızlığın % 43 nün immünolojik olmayan faktörlerden, %18 inin HLA antijenlerinden, % 38 inin ise non-hla antijenlerinden kaynaklandığını bildirmiştir (10). Minor doku uygunluk antijenleri veya non- HLA antijenlerinin antikorları bağışıklık yanıtının potansiyel hedefleri olarak kabul edilmelidir. Bu minör veya non-hla antijenleri ilk defa, fare üzerinde deri nakil modellerinde ortaya çıkan hızlı rejeksiyonlar esnasında tanımlandı ve diğer hayvan çalışmalarında endotel hücre apoptozu nedeni olarak gösterildi (11,12). Jackson AM ve arkadaşlarının sunduğu vaka çalışmasında da antikor aracılı rejeksiyon imareleri görülmemesine rağmen anti-endoteliyal cross-match in pozitif geldiği ve bu nedenle hastanın nakledilen böbreği kaybettiği bildirilmiştir (13). Çok sayıda az denekli yapılan çalışmalarda da non-hla antijenlerin, nakil sonrası akut ve kronik rejeksiyonlarla ilişkili olduğu gösterilmiştir. Fakat, non-hla antijenlerin tanımlanabilmesi için gerekli uygun deneylerin üretimi ve ticari olarak uygunluğunun azlığı bu antijenlerin hedeflerinin tanımlanmasını ve bulunmasını sınırlandırdı (10). Donör organlarının endotel hücreleri, allogreft rejeksiyonu sırasında konağın bağışıklık sistemi için en birincil hedeftir (14) ve anti-endotel hücre antikorlarının (AECAs) böbrek (7,15,16), kalp (17) ve karaciğer (18) transplantasyonunda klinik açıdan önemli olduğu bildirilmiştir. Anti-endotel hücre antikorlarının rutin olarak laboratuvarlarda klinik tanı için kullanılmaları zaman ve çalışan kişi sayısı açısından uygun değildi. Yakın zamanda geliştirilen bir yöntemle, akım sitometri cihazı kullanılarak endoteliyal haberci hücre çaprazlama ve LXM testinin aynı anda yapılması mümkün hale gelmiştir. Nakledilen dokunun ömrü için önemli olan bu yöntem Avrupa da belirli merkezlerde kullanılırken henüz ülkemizde rutin olarak kullanılmamaktadır. Araştırmamızda, canlı nakillerde lenfosit çaprazlama testi ile tespit edilemeyen ve HLA-spesifik olmayan antikorların nakil öncesinde tespit edilmesi amaçlanmaktadır. Rejeksiyon evreleriyle ve nakil sonrası 3-6 aylık dönemde 8

azalan böbrek fonksiyonları ile doğrudan ilişkili bu anti-endotel hücre antikorlarının tespiti, büyük fedakarlıklarla bulunan böbrek dokusunun rejeksiyon riskini azaltabilir ve immünsüpresif tedavi protokolünün hastaya uygun bir şekilde düzenlenmesini sağlayabilir. GENEL BİLGİLER Organ ve doku yetmezlikleri ile seyreden hastalıklarda veya tedavi uygulamaları sonucu organ ve doku yetmezlikleri oluşan durumlarda organ ya da dokuların transplantasyonu hayat kurtarıcı bir tedavi yöntemi olarak kullanılmaktadır. Ancak otolog nakiller dışındaki uygulamalar oldukça kısıtlıdır. Bunun sebebi, hem organ ve doku alınabilecek kaynakların yetersiz olması hem de immün sistemin yabancı olarak algıladığı organ ve dokulara tolerans göstermeyerek, immün yanıt vermesidir. Organ ya da dokulara verilen özgül immün yanıtlar, bu organ ve dokulardaki antijenik yapıların B ve T lenfositler tarafından tanınmasıyla oluşturulan, hem sıvısal ve hem de hücresel immün yanıtlardır. Kendisinde olmayan antijenleri tanıma ve yanıt verme yeteneği, immün sistemin en temel özelliklerinden biridir. Antijenik reseptör olarak adlandırılan yapılar, hedef antijenlerle karşılaşıp, onlara bağlandığında immün sistem uyarılarak bir yandan çoğalma, bir yandan da etkisizleştirme ve tahrip etme şeklinde yanıt verir. Temelde dış etkenlerden organizmamızı korumaya ve yaşantımızı sürdürmemize yönelik bu yetenek, transplanta yönelik olunca onun red edilmesine dolayısı ile de organizmanın ihtiyacı olan bir doku ya da organın kaybedilmesine yol açar (19). Bağışıklık sisteminin kendinden olanı ve olmayanı tanıması için gerekli olan doku antijenleri ni kodlayan gen bölgesi, Büyük Doku uyum Kompleksi, MHC olarak adlandırılır. İlk olarak kemirgenlerde tanımlanan bu bölgenin insandaki karşılığı, 6. kromozomun kısa kolunda yerleşmiş olup; ilk olarak beyaz kan hücrelerinde gösterilen bu genler, Human Leukocyte Antigens, HLA bölgesi olarak da adlandırılır. Çok sayıda genin yer aldığı 9

yaklaşık 4000 kilobaz (kb) büyüklüğündeki bu bölgede immun yanıtla ilgisi tanımlanamamış bazı genler de yer alır (20). HLA moleküllerinin immunolojik reaksiyonlardaki rolü, 1965 de yapılan başarısız böbrek nakli sonucunda Terasaki tarafından ortaya çıkarılmıştır (21). HLA antikorları multipar gebeliklerde, rejeksiyon ile sonuçlanmış transplantasyonda, kan transfüzyonu, viral ve otoimmün hastalıklarda tespit edilmiştir (22,23). Antikorun sınıfı, aviditesi ve afinitesi, konağın immün durumu, immün savunmadaki hücre sunumunun tipine ve immünizasyonun gidiş yönüne göre farklılık gösterir (24). Donör organının antijenlerine karşı oluşan antikorların varlığında transplantasyondan sonra dakikalar içinde bile rejeksiyon olabilir (25). Bu rejeksiyonları engellemek için solid organ transplantasyonu öncesinde uygulanan, alıcının serumu ile vericinin lenfositlerinin karşılaştırıldığı testlere çapraz uyum (crossmatch) testleri denir. Serolojik (CDC), ELISA ve flow sitometri yöntemleri kullanılarak yapılır. Flow sitometri yöntemi komplemana bağlı olmayan dolayısıyla serolojik yöntem ile tespit edilemeyen antikorların tespitinde önemlidir. Nakil öncesi en az 2 farklı yöntem ile hasta ve vericisine uygulanır (20). Aktive olmuş greft endoteli HLA sınıf I ve II antijenlerini sunar, bu antijenler daha önce oluşmuş HLA antikorlarının hedefi olabilir (25). Verici lenfositleriyle aktive edilmiş özgül-hla antikorları organ allograft nakilleri öncesi ve/veya sonrasında çok iyi belirlenebilmektedir. Ancak, HLA antikorlarının yokluğunda meydana gelebilen hiperakut ve akut reddetmelerde endoteliyal hücrelerden salınan diğer birçok non-hla antijenik belirteç rol oynayabilir. Bu da non-hla antijenik sisteminin organ allogreftinde önemli bir yerinin olduğunu gösterir (9). HLA antijenlerindeki yaygın polimorfizimler, son on yılda doğal olarak HLA antikorlarının üzerine yoğunlaşılmasına neden olmuştur ve non-hla antijenik sistem üzerine çok az değinilmiştir. Başlangıçta non-hla antijenlerinin endotel ve epitel hücreleri üzerinde 10

bulunduğu ifade edilmişti. Buna ek olarak, çeşitli parankimal hücrelerin yanı sıra dolaşımdaki immün hücrelerin de non-hla antikorları için hedef olabileceği belirtilmiştir. Nakledilmiş organın endoteli organ ve doku uyumunda gelecekteki tartışma ve incelemelerde önemli bir hedef olabilecek olan non-hla antijenlerini sentezler (9). Opelz tarafından yapılan çalışmada, nakil sonrası uzun dönemde görülen organ kayıplarına non-hla bağışıklık sisteminin katkısının olduğu bildirilmiştir. Opelz, HLA doku tiplendirmesi eşleşen panel reaktif antikorları (PRA) yüksek seviyelerde olan alıcıların, PRA sı düşük olanlara göre nakillerinin daha fazla başarısızlıkla sonuçlandığını tespit emiş ve bu immün yanıtta non-hla antijenlerinin önemli bir rol oynadığını bildirmiştir (26). MHC sınıf-i ile ilişkili zincir A (MICA) ve B (MICB) olarak adlandırılan MHC sınıf I ilişkili genler yani non-klasik HLA molekülleri, böbrek allogreft naklinde önemlidir ve polimorfik non-hla antikor hedefleri olarak ortaya çıkmaktadır. MICA ve MICB genleri HLA-B gen bölgesinin yakınında bulunmaktadır ve 62 kda hücre yüzey glikoproteinlerini kodlar. Bu glikoproteinler HLA sınıf I molekülleri ile sınırlı dizi homolojisi gösterir ve ß2- mikroglobulin ile ilişkili değildir (27). Endotelyal hücreler ve monositleri içeren birkaç hücre tipleri MICA yı eksprese edebilirken (28) lenfositler eksprese edemez. MICA nın transplantasyon yapılmış hastalarda anti-greft immün cevaplar sırasında bir hedef olabileceği ihtimali Stastny ve arkadaşları tarafından gösterilmiştir (29,30). Böbrek allogreft alıcılarında donöre spesifik olan HLA antikorlarının yokluğunda MICA antikorlarının varlığı ve erken immünolojik komplikasyonlar arasında klinik bir ilişki olduğu da Sumitran-Holgersson tarafından gösterilmiştir (31). Opelz ile birlikte Statsny nin grubu tarafından bildirilen 1910 hastayı içeren önemli bir çalışma MICA antijenlerine karşı böbrek transplant alıcılarının duyarlılığının greft kaybının artmasıyla ilişkili olduğu ve HLA bakımından uyumlu olan alıcılar arasında allogreft kaybına katkıda bulunabileceğini göstermektedir (32). Buna ek olarak Terasaki nin grubu MICA antikorlarının varlığı ile kronik böbrek allogreft 11

rejeksiyonları arasında yakın bir ilişki olduğunu bildirmiştir (33,34). Aynı zamanda kalp nakillerinde de bu antikorların önemli olduğu bildirilmiştir (35). Donör organlarının endotel hücreleri, allogreft rejeksiyonu sırasında konağın bağışıklık sistemi için en birincil hedeftir (11) ve anti-endotel hücre antikorlarının (AECAs) böbrek (26-28), kalp (29) ve karaciğer (30) transplantasyonunda klinik açıdan önemli olduğu bildirilmiştir. Altı farklı merkezin katıldığı çok merkezli bir çalışmada AECA larını tespit edebilmek için rutin tanı testi olarak geliştirilmekte olan bir çaprazlama kiti kullanılmıştır. XM-ONE adı verilen bu kit ile öncül endoteliyal hücreler hedef hücre gibi kullanılarak akım sitometri çaprazlama (FCXM) testinde donöre özgü AECA tespit edilebilmektedir. Donöre özgül endoteliyal hücreler Tie-2-spesifik antikorla kaplı nanoboncuklar ile elde edilmektedir. Bu yöntemin lenfositlerin hedef hücre olarak kullanıldığı konvensiyonel FCXM den daha kolaylıkla yapıldığı bildirilmiştir. Bu çalışmada, 147 hastanın 35 inde (%24) XM-ONE testi ile AECA pozitif bulunmuş ve pozitifliğin nakilden sonraki ilk iki hafta içerisindeki ve üç aya kadar ki rejeksiyonlarla kuvvetli bir ilişkisi olduğu gösterilmiştir (6). Paul ve arkadaşları renal allogreft alıcısı 61 hastanın 7 sinde T ve B lenfosit çaprazlaması negatif olmasına rağmen vasküler endoteliyal hücre çaprazlamasını (VEC XM) pozitif bulmuşlardır ve bu hastalardan 6 sı vasküler rejeksiyondan dolayı greftlerini kaybettiklerini bildirmişlerdir (36). Cerilli ve arkadaşları da benzer şekilde VEC XM + hastaların rejeksiyon riskinin fazla olduğunu doğrulamışlardır (15). 12

GEREÇ VE YÖNTEM Çalışma Grubu Sağlık Bakanlığı İzmir Tepecik Eğitim ve Araştırma Hastanesi Doku Tiplendirme Laboratuvarına nakil öncesi doku tiplemesi ve çaprazlama testleri için gönderilen vericiler ve hastalar çalışmaya dâhil edildi. Nakil öncesi lenfosit çapraz uyum testleri negatif ve nakil sonrası rejeksiyon atağı şüphesiyle laboratuvarımıza yönlendirilen 14 verici-hasta çifti çalışma grubunu oluşturmaktadır. Rutin olarak testleri yapılacak hastalara çalışmanın önemi anlatıldı ve onam formlarını imzalayan vericiler ve hastaların rutin testleri yürütülürken eş zamanlı olarak projede yer alan testler de yapıldı. Nakil sonrası çaprazlama testleri için gerekli kanlara ek olarak dört adet Vacutainer CPT tüplerine toplam 32 ml periferik kan alındı. Periferal Mononükleer Kan Hücreleri, Tie-2+ ve Tie-2- hücrelerinin ve Lenfositlerin İzolasyonu; Tie-2+ hücreler, üretici firmanın tanımladığı gibi ticari olarak üretilmiş mevcut kitlerle (XM- ONE) vericiden alınan tam kan örneğinden izole edildi (AbSorber AB, Stockholm, İsveç). Bunun için, 32 ml kan örneği heparin içeren dört adet Vacutainer CPT (BD, Franklin Lakes, NJ) tüplerine konularak 15 dk 1650 g de santrifüj edilir, daha sonra periferal mononükleer kan hücreleri (PBMC) jel tabakanın üzerinden toplanır ve soğuk İzotonik solüsyon ile yıkanır. Yıkama sonrasında hücre süspansiyonu polipropilen tüpe aktarılır ve paramanyetik nanoboncuk taşıyan Tie-2- spesifik antikorları ile karıştırılarak +4 O C de hafif karıştırmalı olarak 30 dk. inkübe edilir. İnkübasyon sonunda bu karışıma 4.5 ml PBS eklenerek 20 dk. oda sıcaklığında mıknatıs içerisinde inkübe edilir. Mıknatısla ayrılan hücreler tüpün içerisinde bırakılır ve geriye kalan supernatant kısmı başka bir tüpe toplanır. Kalan Tie-2+ hücrelerinin üzerine 350 µl izotonik solüsyon eklenerek hücre süspansiyou hazırlanmış olur. Ayrılmış olan 13

süpernatanttaki hücreler ise rutin olarak laboratuvarımızda yapılan T ve B hücre crossmatch prosedürü için kullanılmıştır. XM-ONE ile izole edilen hücrelerin akış sitometri ile fenotiplenmesi Tie-2+ hücre süspansiyonu (herbir fraksiyonda 1x 10 6 hücre) 12x75 mm flow sitometri tüplerine paylaştırıldı (Neg, Poz ve crossmatch tüpleri olmak üzere IgG ve IgM için toplamda 6 tüp). Üzerlerine 4 ml izotonik solüsyon eklenip 450 xg de santrifüjlenerek hücrelerden boncuklar uzaklaştırıldı. Bu işlem 2 kez tekrar edildi. Son yıkama basamağından sonra hücrelerin üzerlerine 50 µl kontrol ve hasta serumları eklendi (hasta serumları kullanılmadan önce 4000 rpm de 5 dk. santrifüj edilmiştir), 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edildi. İnkübasyon sonunda herbir tüpe 4 er ml izotonik solüsyon eklendi ve 450 xg de santrifüjlenerek yıkama işlemi yapıldı. Bu yıkama işlemi 3 kez tekrar edildikten sonra her bir tüpe ticari kitin içerisinden çıkan 10 µl CD3 ve CD19 monoklonal antikorları eklendi. Üzerlerine de 10 µl ilgili sekonder antikor eklendi (IgG tüpleri için anti-human IgG ve IgM tüpleri için anti-human IgM) ve 30 dakika karanlıkta +4 O C de inkübe edildi. İnkübasyon sonunda 2 kez soğuk izotonik solüsyonla yıkama yapıldı. Yıkama sonunda 300 µl izotonik solüsyon eklenerek FacsCalibur Flow sitometri cihazında okuma ve analizleri yapıldı. Deneysel prosedürün şematik tanımı şekil 1 de gösterilmiştir. Endotelyal hücre crossmatch testine paralel olarak eş zamanlı T ve B hücre crossmatch testi de yapıldı. Bunun için magnetik ayırmada başka bir tüpe alınan hücre süspansiyonu kullanıldı. Bu prosedüre göre, 25 er µl hücre süspansiyonlarından 3 tüpe (neg, poz ve xm) dağıtıldı. Üzerlerine 25 er µl kontrol ve hasta serumları eklenerek 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edildi. İnkübasyon sonunda 3 defa 1 ml izotonik solüsyonla 1900 rpm de yıkama yapıldı. Tüplere 5 er µl CD3 ve CD19 (BD, CA, ABD) monoklonal antikorları ile 50 şer µl anti-human IgG-FITC (Dako, Glostup, Danimarka) sekonder antikoru eklenmiştir. 30 dakika oda sıcaklığında karanlıkta inkübasyondan sonra 2 kez yıkama yapıldı. Yıkama 14

basamaklarından sonra herbir tüpe 500 er µl izotonik solüsyon eklenerek FacsCalibur Flow sitometri cihazında eş zamanlı olarak okuma ve analizleri yapıldı. Analiz aşamasında endotelyal crossmatch tüplerinde T ve B lenfosit crossmatch analizleri de yapıldı. Rutin farklı tüplerde yapılan T ve B lenfosit crossmatch analizleriyle karşılaştırıldı. Flow sitometri analizi esnasında ilk olarak SSC-FSC dağılım grafiğinde hücre grupları seçildi (Şekil 2). Aynı tüpte hem endotelyal crossmatch hem de T-B hücre crossmatch testleri yapıldı. Bütün crossmach sonuçları için Hücre/IgG-FITC grafiklerindeki M1 değerleri değerlendirildi (Şekil 3a, 3b, 3c). Buna göre pozitif kontrolün M1 değeri (Şekil 3b) de göz önüne alınarak, hastanın crossmatch M1 değeri/negatif kontrol M1 değeri (Şekil 3a) oranı değerlendirildi. Endotelyal crossmatch tüplerinde T ve B lenfosit crossmatch M1 değerleri de değerlendirilebildi (Şekil 3c). Elde edilen sonuçlar rutin yapılan crossmatch yönteminin sonuçlarıyla karşılaştırıldı. 15

Şekil 1. Endotelyal ve T/B lenfosit crossmatch prosedür şeması Magnetik boncuklarla izole edilmiş Tie-2+ hücre süspansiyonu Süpernatanttan elde edilen lenfosit hücre süspansiyonu Kontrol veya hasta serumu 50 µl 25 µl Kontrol veya hasta serumu 10 µl 25 µl 30 dakika oda sıcaklığında inkübasyon 30 dakika oda sıcaklığında inkübasyon 4 ml izotonik solüsyon 1 ml izotonik solüsyon 1900 rpm de santrifüj 1900 rpm de santrifüj 10 µl CD3 ve CD19 monoklonal antikoru 10 µl anti-human IgG veya IgM sekonder antikorları 5 µl CD3 ve CD19 monoklonal antikoru 50 µl anti-human IgG-FITC sekonder antikorları 30 dakika +4 C de karanlıkta inkübasyon 30 dakika oda sıcaklığında karanlıkta inkübasyon 4 ml izotonik solüsyon 1 ml izotonik solüsyon 1900 rpm de santrifüj 1900 rpm de santrifüj 300µl izotonik solüsyon 500µl izotonik solüsyon 1900 rpm de santrifüj 1900 rpm de santrifüj 16 FacsCalibur Flow sitometri

Şekil 2. Kırmızı küme lenfosit hücre kümesi. Yeşil küme endotelyal hücre kümesi Şekil 3a. Negatif kontrol IgG grubu endotelyal crossmatch M1 değeri Şekil 3b. Pozitif kontrol IgG grubu endotelyal crossmatch M1 değeri 17

Şekil 3c. kontrol piki. Hasta serumu IgG grubu endotelyal crossmatch M1 değeri. Yeşil pik: Negatif 18

BULGULAR Sağlık Bakanlığı İzmir Tepecik Eğitim ve Araştırma Hastanesi Doku Tiplendirme Laboratuvarına rejeksiyon şüphesiyle gönderilen 14 hasta rutin testlerinin yanında antiendoteliyal hücre antikorlarını araştırmak için çalışmamıza dâhil edildi. Hastaların demografik ve alloimmünizasyon bilgileri tablo 1 de verildi. Çalışmamıza dâhil olan hastaların 3 ü kadın (% 21,4) 11 i (% 78,6) erkekti. Çalışma grubunun ortalama yaşı ise 32,14 dü. Hastaların ortalama diyaliz süreleri ise 23,5 ay olarak bulundu. Hastaların kliniğine yansıyan laboratuvar bulguları Tablo 1 de verildi. Transplantasyon öncesi tüm hastaların PRA ve çapraz uyum test sonuçları negatif çıktı. Transplantasyon sonrasında 2 hastada hem sınıf I hem de sınıf II HLA antijenlerine karşı antikor üretildiği belirlendi. 4 hasta da ise yalnız sınıf II HLA antijelerine karşı antikor tanımlandı (Tablo 2). Nakil sonrasında yapılan Endotelyal Cross Match sonucunda tüm hastalar negatif olarak belirlendi. 5 hastaya Flow sitometrik cross match yapıldı ve bir tanesinin donörün sınıf I ve sınıf II HLA antijenlerine karşı antikor ürettiği belirlendi. Komplemana bağımlı sitotoksik cross match testi dört hastaya uygulandı ve bir tanesinde donörün sınıf II antijenlerine karşı antikor geliştirdiği saptandı. 5 hastaya uygulanan donöre spesifik antikor testinde de yine bir hastada donörün hem sınıf I hem de sınıf II antijenlerine karşı antikorlar belirlendi. XM-ONE testinde kullanılan tüplerden izole edilen lenfositlerle yapılan cross match testi sonucunda 4 hasta hem sınıf I hem sınıf II pozitif, 3 hasta sadece sınıf II pozitif, 2 hastanın ise sınıf I sonucu pozitif olarak bulundu. 1 kişi IGG T ve B hücre pozitif, 1 kişi IGG B hücre pozitif, 2 kişi IgM B hücre pozitif olarak değerlendirildi. 1 hastanın XM-ONE lenfosit cross match i ile klasik flow cross-match yöntemi sonuçları birbiri ile uyumlu ve sınıf ı ve sınıf II pozitif olarak değerlendirildi. XM-ONE lenfosit cross match T ve B sonuçları pozitif olan bir hastanın ise CDC ve DSA sonucu negatif olarak belirlendi. Yine XM-ONE lenfosit cross match T ve B sonuçları pozitif olan bir diğer hastanın DSA sonucu snıf I ve sınıf II için pozitif olarak değerlendirildi. 19

Tablo 1: Demografik bilgiler HASTA NO DOĞUM YILI CİNSİYET PRİMER TANI PROTEİNÜRİ (gr) KREATİNİN KT (ÜNİTE) GEB DİYALİZ (AY) TX YILI DONÖRÜ 1 1986 K FMF AMİLOİDOZİS Yok 2,1 6 2 84 2 1985 K BİLİNMİYOR 2,9 1,5-2 2 0 4 2004 ANNESİ 3 1999 E GLOMERÜLER HASTALIK ÇALIŞILMAMIŞ 8,8 4 - PREEMPTİF İLKİ ANNEDEN, İKİNCİSİ BABAANNEDEN 4 1967 E GLOMERÜLER NEFRİT Yok yok 6-8 2003 KARDEŞİ 5 1981 E VEZİKOÜRETERAL REFLÜ (VUR) NEG 2,5 - - PREEMPTİF 2009 ANNESİ 6 1966 E HT Yok yok 15-24 2014 EŞİ 7 1998 E FSGS PROTEİN 3,5 1,5 B - 9 2009 ANNESİ KAÇAĞI 8 1996 E NEFROPATİK 98,1 4,7 1-15 2015 BABASI SENDROM 9 1997 K NEFROTİK SENDROM 2+ 2,8-0 72 ANNESİ 10 1983 E HT 1+ 10 4-7 KARDEŞİ 11 1980 E HT DM 1+ 5,2 - - 4 EŞİ 12 1964 E BİLİNMİYOR 3+ 3,6 - - 42 EŞİ 13 1971 E DM Yok 4,7 2-24 KARDEŞİ 14 2001 E BİLİNMİYOR TRACE 1,3 B - 36 BABAANNE K, kadın; E, erkek; FMF, Familial Mediterrean Fever,; HT, Hiper tansiyon, DM, diabetis mellitus; NEG, Negatif; B, bilinmiyor; KT, kan transfüzyonu; GEB, Gebelik; TX, transplantasyon 20

Tablo 2 : Transplantasyon öncesi ve sonrası PRA sonuçları ile XM-ONE, FCXM, CDCXM, DSA sonuçlarının karşılaştırılması Hasta No PRE TX PRA POST-TX PRA XM-ONE SONUCU FCXM CDCXM DSA IGG CI CII CI CII T B ECM LCM T LCM B T B ECM CI CII CI CII CI CII LENFOSİT LENFOSİT LENFOSİT LENFOSİT 1 NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG POZ NEG NEG NEG NEG NEG YOK YOK YOK YOK 2 NEG NEG YOK YOK NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG YOK YOK YOK YOK YOK YOK 3 NEG NEG POZ POZ NEG NEG NEG POZ POZ NEG NEG NEG POZ POZ YOK YOK YOK YOK 4 NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG YOK YOK 5 NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG POZ NEG NEG NEG NEG YOK YOK YOK YOK NEG NEG 6 NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG POZ NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG YOK YOK 7 NEG NEG POZ POZ NEG NEG NEG POZ POZ NEG NEG NEG YOK YOK YOK YOK POZ POZ 8 NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG YOK YOK NEG NEG 9 NEG NEG NEG POZ NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG YOK YOK YOK YOK YOK YOK 10 NEG NEG NEG POZ NEG NEG NEG NEG POZ NEG NEG NEG YOK YOK YOK YOK NEG NEG 11 NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG POZ POZ NEG NEG NEG YOK YOK YOK YOK YOK YOK 12 NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG POZ POZ NEG NEG NEG YOK YOK NEG NEG NEG NEG 13 NEG NEG NEG POZ NEG POZ NEG NEG POZ NEG POZ NEG YOK YOK YOK YOK YOK YOK 14 NEG NEG NEG POZ POZ POZ NEG ÇIKMADI ÇIKMADI NEG POZ NEG YOK YOK NEG POZ NEG NEG IGM IGG,Immünoglobulin G; IGM, Immunoglobulin M; ECM, Endotelyal Cross Match; LCM T, Lenfosit Cross Match T Lenfosit; LCM B, Lenfosit Cross Match B Lenfosit; FCXM, Flow Sitometrik Cross Match; CDCXM, Complement Dependent Cytotoxisic Cross Match; DSA, Donor Spesific Antibody; CI, Class I; CII, Class II. 21

TARTIŞMA VE SONUÇ Donöre spesifik antikorların belirlenmesinde kullanılan yöntemlerin gelişmesiyle, nakil sonrası rejeksiyon riski azalmakta, başarılı immünsupresif tedavi protokolleri ile akut ve hiperakut red daha az görülmektedir. Fakat, HLA antijenleri uyumlu olan kişilerde de rejeksiyonlar meydana gelmektedir. Rejeksiyon sırasında donör organlarının endotel hücreleri, alıcının immün yanıtının temel hedefi haline gelir (14). Terasaki, HLA doku uyumlu kardeşler arası nakillerde, başarısızlığın % 43 nün immünolojik olmayan faktörlerden, %18 inin HLA antijenlerinden, % 38 inin ise non-hla antijenlerinden kaynaklandığını bildirmiştir (10). Minor doku uygunluk antijenleri veya non- HLA antijenlerinin antikorları bağışıklık yanıtının potansiyel hedefleri olarak kabul edilmelidir. Bu minör veya non-hla antijenleri ilk defa, fare üzerinde deri nakil modellerinde ortaya çıkan hızlı rejeksiyonlar esnasında tanımlandı ve diğer hayvan çalışmalarında endotel hücre apoptozu nedeni olarak gösterildi (11,12). Çok sayıda az denekli yapılan çalışmalarda non-hla antijenlerin, nakil sonrası akut ve kronik rejeksiyonlarla ilişkili olduğu gösterilmiştir. Fakat, non-hla antijenlerin tanımlanabilmesi için gerekli uygun deneylerin üretimi ve ticari olarak uygunluğunun azlığı bu antijenlerin hedeflerinin tanımlanmasını ve bulunmasını sınırlandırdı (10). Alheim ve arkadaşları, XM-ONE yöntemiyle eş zamanlı olarak, HLA sınıf I, sınıf II için spesifik antikorları ve non-hla antijenlerini Tie-2 + endoteliyal öncül hücreler kullanılarak akım sitometrisi ile tespit etmişlerdir (36). Xavier ve arkadaşları da XM-ONE kullanılarak bulunan AECA pozitif sonucun, kötü prognoza sahip 20/31 vakadaki geri dönüşümsüz progresif greft fonksiyon bozukluğu ile anlamlı bir ilişkisi olduğunu ortaya koymuşlardır. HLA sensitizasyonu olmayan ve akut rejeksiyon gelişen önemli bir grup hastanın AECA testleri ile tanımlanabileceğini bildirmişlerdir (48). Çalışmamızda 14 kronik böbrek yetmezliğine sahip hastaya XM-ONE yöntemi uygulandı ve hastalardan hiçbirinde beklenen Tie-2 reseptör pozitif hücre hedeflerine spesifik antikorlar tespit edilmedi. Daha önce birden fazla merkezi kapsayan bir çalışmada XM-ONE pozitifliği ile rejeksiyonun arasındaki korelasyon gösterilmiştir. (18). Bu farklılığın hastalara uygulanan immünsupresif tedavi protokolleri veya cerrahi komplikasyonlardan kaynaklı olduğu düşünülmektedir. Ayrıca hastaların farklı kliniklerden gelmesinin de sonuçları etkilediği düşünülmektedir. 22

KAYNAKLAR 1. Terasaki PI. Humoral theory of transplantation. Am J Transplant. 2003: 3: 665 73. 2. Scornik JC. Detection of alloantibodies by flow cytometry: relevance to clinical transplantation. Cytometry 1995: 22: 259 63. 3. Terasaki PI, McClelland JD. Microdroplet assay of human serum cytotoxins. Nature 1964: 204: 998 1000. 4. Pei R, Lee JH, Shih NJ, Chen M, Terasaki PI. Single human leukocyte antigen flow cytometry beads for accurate identification of human leukocyte antigen antibody specificities. Transplantation 2003: 75: 43 9. 5. Zachary AA, Delaney NL, Lucas DP, Leffell MS. Characterization of HLA class I specific antibodies by ELISA using solubilized antigen targets: I. Evaluation of the GTI QuikID assay and analysis of antibody patterns. Hum Immunol 2001: 62: 228 35. 6. Breimer ME, Rydberg L, Jackson AM et al. Multicenter evaluation of a novel endothelial cell crossmatch test in kidney transplantation. Transplantation 2009: 87: 549 56. 7. Cerilli J, Bay W, Brasile L. The significance of the monocyte crossmatch in recipients of living-related HLA identical kidney grafts. Hum Immunol 1983: 7: 45 50. 8. Kalil J, Guilherme L, Neumann J et al. Humoral rejection in two HLA identical living related donor kidney transplants. Transplant Proc 1989: 21: 711 3. 9. Sumitran-Holgersson S. Relevance of MICA and other non-hla antibodies in clinical transplantation. Curr Opin Immunol. 2008 Oct;20(5):607-13. 10. Terasaki PI: Deduction of the fraction of immunologic and nonimmunologic failure in cadaver donor transplants. In Clinical Transplants. Edited by Cecka JM, Terasaki PI. Los Angeles, CA:UCLA Tissue Typing Laboratory; 2003:449-452. A meticulously performed study demonstrating the degree to which HLA, non-hla and nonimmunological factors play a role in organ graft loss. 11. Derhaag JG, Duijvestijn AM, Damoiseaux JG, van Breda Vriesman PJ: Effects of antibody reactivity to majör histocompatibity complex (MHC) and non-mhc alloantigens on graft endothelial cells in heart allograft rejection. Transplantation 2000, 69:1899-1906. 12. Wu GD, Jin YS, Salazar R, Dai WD, Barteneva N, Barr ML, Barsky LW, Starnes VA, Cramer DV: Vascular endothelial cell apoptosis induced by anti-donor non-mhc antibodies: a possible injury pathway contributing to chronic allograft rejection. J Heart Lung Transplant 2002, 21:1174-1187. 23

13. Jackson AM, Kuperman MB, Montgomery RA. Multiple hyperacute rejections in the absence of detectable complement activation in a patient with endothelial cell reactive antibody. Am J Transplant. 2012, 12(6):1643-9. 14. Glotz D, Lucchiari N, Pegaz-Fiornet B, et al. Endothelial cells as targets of allograft rejection. Transplantation 2006; 82: S19. 15. Cerilli J, Clarke J, Doolin T, et al. The significance of a donor-specific vessel crossmatch in renal transplantation. Transplantation 1988; 46: 359. 16. Paul LC, Claas FH, van Es LA, et al. Accelerated rejection of a renal allograft associated with pretransplantation antibodies directed against donor antigens on endothelium and monocytes. N Engl J Med 1979; 300: 1258. 17. Fredrich R, Toyoda M, Czer LS, et al. The clinical significance of antibodies to human vascular endothelial cells after cardiac transplantation. Transplantation 1999; 67: 385. 18. Sumitran-Holgersson S, Ge X, Karrar A, et al. A novel mechanism of liver allograft rejection facilitated by antibodies to liver sinusoidal endothelial cells. Hepatology 2004; 40: 1211. 19. Şengül A. Transplantasyonda HLA ve Non-HLA Antijenler. J Int Med Sci 2007, 3(8):1-6. 20. Kerman RH, Stepkowski SM. Clinical significance of HLA antigens and non-hla antigens in solid organ transplantation. Curr Opin Organ Transplant 2006; 11: 418-424. 21. Dausset J. The HLA adventure. Transplant Proc 1999; 31: 22 24. 22. Holgersson SS. HLA-specific alloantibodies and renal graft outcome. Nephrol Dial Transplant 2001; 16: 897-904. 23. Gould DS, Auchincloss H Jr. Direct and indirect recognition: the role of MHC antigens in graft rejection. Immunol Today 1999; 20: 77-82. 24. Braud VM, Allan DSJ, O Callaghan C ve ark. HLA-E binds to natural killer cell receptors. Nature 1998; 391: 795-797. 25. Cecka JM, Zhang Q, Reed EF: Preformed cytotoxic antibodies in potential allograft recipients: recent data. Human Immunol 2005, 66:343-349. 26. Opelz G, Collaborative Transplant Study: Non-HLA transplantation immunity revealed by lymphocytotoxic antibodies. Lancet 2005, 365:1570-1576. 27. Bahram S, Bresnahan M, Geraghty DE, Spies T: A second lineage of mammalian major histocompatibility complex class I genes. Proc Natl Acad Sci U S A 1994, 91:6259-6263. 24

28. Zwirner NW, Dole K, Stastny P: Differential surface expression of MICA by endothelial cells, fibroblasts, keratinocytes, and monocytes. Human Immunol 1999, 60:323-330. 29. Zwirner NW, Marcos CY, Mirbaha F, Zou Y, Stastny P: Identification of MICA as a new polymorphic alloantigen recognized by antibodies in sera of organ transplant recipients. Human Immunol 2000, 61:917-924. 30. Stastny P: Introduction: MICA/MICB in innate immunity,adaptive immunity, autoimmunity, cancer, and in the immune response to transplants. Hum Immunol 2006, 67:141-144. 31. Sumitran-Holgersson S, Wilczek HE, Holgersson J, So derstro mk: Identification of the nonclassical HLA molecules, MICA, as targets for humoral immunity associated with irreversible rejection of kidney allografts. Transplantation 2002, 74:268-277. 32. Zou Y, Stastny P, Su sal C, Do hler B, Opelz G: Antibodies against MICA antigens and kidney-transplant rejection. N Engl J Med 2007, 357:1293-1300. 33. Terasaki PI, Ozawa M, Castro R: Four-year follow-up of a prospective trial of HLA and MICA antibodies on kidney graft survival. Am J Transplant 2007, 7:408-415. 34. Ozawa M, Terasaki PI, Castro R, Alberu J, Morales-Buenrostro L, Alvarez I, Toledo R, Alvez H, Monteiro M, Teixeira J et al: 14th International HLA and Immunogenetics Workshop: report on the Prospective Chronic Rejection Project. Tissue Antigens 2007, 69 (Suppl. 1):174-179. 35. Sua rez-alvarez B, Lo pez-va zquez A, Gonzalez MZ, Fdez- Morera JL, Dı az- Molina B, Blanco-GelazF M.A., Pascual D, Martı nez-borra J,MuroM, Alvarez-Lo pez MR, Lo pez-larrea C: The relationship of anti-mica antibodies and MICA expression with heart allograft rejection. Am J Transplant 2007, 7:1842-1848. 36. Paul LC, van Es LA, van Rood JJ, et al. Antibodies directed against antigens on the endothelium of peritubular capillaries in patients with rejecting renal allografts. Transplantation 1979; 27: 175. 37. Alheim M, Johansson SM, Hauzenberger D, Grufman P, Holgersson J. A flow cytometric crossmatch test for simultaneous detection of antibodies against donor lymphocytes and endothelial precursor cells. Tissue Antigens. 2010 Mar;75(3):269-77. 38. Xavier P, Aires P, Sampaio S, Mendes C, Monteiro M, Alves H, Oliveira G. XM- ONE detection of endothelium cell antibodies identifies a subgroup of HLA-antibody negative patients undergoing acute rejection. Transplant Proc. 2011 Jan-Feb;43(1):91-4. 25