REF TB6-100FRT IVD İn Vitro Diagnostik Kullanım için RotorGene 3000/6000 (Corbett Research), SmartCycler (Cepheid), iq icycler ve iq5 (Biorad), Applied Biosystems 7300/7500 Real Time PCR Systems (Applera), MX3000P ve MX3005P (Stratagene) ile kullanılan Trichomonas vaginalis Real-TM Kullanılan Semboller REF Liste Numarası 2-8 C/ -20 C de saklayın IVD in Vitro Diagnostik kullanım için Dikkat! LOT Lot Numarası VER Versiyon Son Kullanma Tarihi Kullanım Bilgileri Reaktif İçerir Üretici İSİM Trichomonas vaginalis Real-TM GİRİŞ STDs (cinsel yolla bulaşan hastalıklar) cinsel aktivite yoluyla elde edilen viral, bakteriyel ve paraziter enfeksiyonların bir çeşididir. Frengi ve gonorrhea gibi bazı STD ler yüzyıllardır bilinmektedir ve HIV gibi diğerleri ise son birkaç yılda tespit edilmiştir. STD'ler 25 organizmdan daha fazla enfeksiyonlardan kaynaklanmaktadır. Daha fazla organizma tanımlandığı için STD'lerin sayısı artmaya devam ediyor. STD'ler içerenler şunlardır: klamidya, gonorrhea, herpes, HIV, HPV, frengi, Ureaplasma, Mycoplasma, Gardnerella ve trichomoniasis. Nükleik asit amplifikasyon teknolojisine dayalı testlerin gelişmesi STD teşhis alanında en önemli ilerleme olmuştur. Nükleik asit amplifikasyon çok duyarlı ve yüksek derecede spesifik olduğu için normalde klinik bakıma ihtiyaç duyulmayan asemptomatik kişilerde enfeksiyonlar tarama için noninvaziv örnekleme teknikleri kullanmaya fırsat sağlar.
KULLANIM AMACI Kit Trichomonas vaginalis Real-TM ürogenital swablar, idrar, prastatik sıvı ve diğer biyolojik materyallerde Trichomonas vaginalis in kalitatif tespiti için bir testtir. TEST PRENSİBİ Kit Trichomonas vaginalis Real-TM iki temel aşamaya dayanır: örneklerden DNA izolasyonu ve Real Time amplifikasyon. Trichomonas vaginalis DNA örneklerden ekstre edilir, Real-Time amplifikasyon kullanılarak amplifiye edilir ve Trichomonas vaginalis DNA ve Internal Kontrol için floresan reporter spesifik boya probları ile tespit edilir. İnternal Kontrol (IC) her biri tek tek işlenen örneğin amplifikasyon kontrolünü ve olası reaksiyon inhibisyonu tanımlanmasını sağlar. IC, Trichomonas vaginalis den başka bir kanalda tespit edilir. KİT İÇERİĞİ Part N 1 DNA-Sorb-A : örnek hazırlama; Part N 2 Trichomonas vaginalis TM :Real Time amplifikasyon. Part N 1 DNA-sorb-A : Lizis Solüsyonu, 30 ml; Sorbent, 2 x 1,0 ml; Yıkama Solüsyonu, 100 ml; DNA-eluent, 2 x 5 ml. Transport ortamı, 30 ml. 100 test için gerekli reaktifler içerir. Part N 2 Trichomonas vaginalis TM : PCR-mix-1-FRT, 1,2 ml; PCR-Buffer-FRT, 2 x 0,35 ml; TaqF Polymerase, 0,06 ml; Trichomonas vaginalis C+, 0,2 ml; Negatif Kontrol C-, 1,2 ml; Internal Kontrol IC, 1,0 ml; DNA-buffer, 0,5 ml; 110 test için gerekli reaktifler içerir. KİT İÇERİĞİNDE BULUNMAYAN GEREKLİ MATERYALLER Zone 1: örnek hazırlama: Biyolojik kabin eppendorf tipi tüpler için masa mikrosantrifüj 60 C ± 2 C kuru ısı bloğu Vorteks mikser Aerosol bariyerli pipetörler ( 5-40 µl; 40-200 µl; 200-1000 µl) 1,5 ml polipropilen steril tüpler (Sarstedt, QSP, Eppendorf) Biyo tehlikeli atık konteynarı Buzdolabı Dondurucu Zone 2: Real Time amplifikasyon: Real Time Thermalcycler Reaksiyon tüpleri Workstation Pipetler (ayarlanabilir) Filtreli steril pipet ucu 1,5/2,0 ml tüpler için rotorlu masa santrifüjü Vorteks mikser Buzdolabı, Dondurucu
UYARILAR VE ÖNLEMLER 1. Lizis Solusyonu, guanidine tiyosiyanat içerir. Guanidine tiyosiyanat solunursa, deri ile temas ederse ya da yutulursa zararlıdır. Asitler ile teması toksik gaz oluşumuna neden olur. (Xn; R: 20/21/22-36/37/38; S: 36/37/39). 2. Örnekler ve reaktifler ile çalışırken tek kullanımlık eldivenler, laboratuar giysisi ve göz koruyucu kullanın. Çalışmalardan sonra ellerinizi yıkayın. 3. Ağızla pipetleme yapmayın. 4. Laboratuar çalışma alanında yemek yemeyin, bir şey içmeyin, kozmetik uygulamayın ya da kontak lenslerini ellemeyin. 5. Son kullanma tarihi geçmiş kitleri kullanmayın. 6. Tüm örnekleri ve kullanılmayan reaktifleri yasal düzenlemelere göre yok edin. 7. Örnekler potansiyel enfeksiyon faktörü olarak kabul edilmeli ve biyolojik kabinlerde Biyo güvenlik Seviye 2 ya da diğer uygun biyo güvenlik pratiklerine göre çalışılmalıdır. 8. Örnekler ve reaktiflerin deri, gözler ve mukoz membranlar ile temasından kaçının. Eğer bu solüsyonlar ile temas ederse bol su ile yıkayın ve doktorunuza başvurun. 9. Material Safety Data Sheets (MSDS) istenildiğinde verilebilir. 10. Bu kiti ancak DNA amplifikasyon tekniği bilgisi olan kişiler kullanmalıdır. 11. Laboratuardaki iş akışı Ekstraksiyon alanından başlayıp Amplifikasyon ve Belirleme alanlarına doğru tek bir kişinin yönetiminde olmalıdır. Örnekleri, ekipmanları ve reaktifleri bir önceki çalışma alanına geri götürmeyin. SAKLAMA KOŞULLARI Trichomonas vaginalis Real-TM +2-8 C de saklanabilir. TaqF Polimeraz -20 C de saklanmalıdır. Bu kit 2-8 C de taşınır fakat -8 C ve -20 C de saklanmalıdır. KARARLILIK Trichomonas vaginalis Real-TM etiketi üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabil kalır. Ürünün performansı etiket üzerinde yazılı kontrol tarihi ile sağlanacaktır. Işık, ısı ya da neme maruz kalmak bazı kit bileşenlerin raf ömrünü etkileyebilir. Tekrarlanan çözdürme ve bu reaktiflerin dondurulması duyarlılığı azaltabildiği için bu durumdan kaçınılmalıdır. KALİTE KONTROL Komplete kit bir RotorGene 6000 (Corbett Research) de test edildi. Analiz sertifikaları info@sacace.com de bulunmaktadır. ÖRNEK SAKLAMA, TOPLAMA VE TRANSPORT Trichomonas vaginalis Real-TM aşağıdaki materyallerden DNA-Sorb-A (REF K-1-1/A) ekstre edilmiş DNA ile analiz edilebilir: servikal, üretral, konjonktival swablar: nükleaz-free 1,5 ml tüpe swabı ekleyin ve 0,2 ml Transport medyum ekleyin. 15-20 saniye boyunca ortamda swabı yavaşça sallayın. İdrar sediment( ilk akıntıyı kullanın); steril bir konteynırda 10-20 ml kadar ilk akıntıyı toplayın. 30 dakika 3000 x g de santrifüj edin, süpernatantı atın ve yeklaşık 200 µl solüsyon bırakın. Sedimenti tekrar süspanse edin. prostatik sıvı Eppendorf tüpte saklanan; seminal sıvı: DNA ekstraksiyonu için 100 μl kullanın. Toplamadan hemen sonra örneklerin çalışılması önerilir. 24 saatten daha uzun olmamak kaydıyla örnekleri 2 8 C de ya da daha uzun saklamak için 20/80 C de saklayın. Klinik örneklerin transportu, etiyolojik ajanların transportu için ülkesel, federal, lokal ve yasal düzenlemelere göre yapılmalıdır. ÖRNEK VE REAKTİF HAZIRLAMA 1. Lizis Solüsyonu ve Yıkama Solüsyonu (diğerleri +2-8 C de saklanmasına rağmen) buz kristalleri çözülene kadar 60 65 C ye kadar ısıtılır. Negatif Kontrol Ekstraksiyonu için bir tüp içeren 1,5 ml polipropilen tüplere gerekli miktarda hazırlayın. 2. Her bir tüpe 300 μl Lizis Solüsyonu ve 10 µl Internal Kontrol ekleyin. 3. Uygun tüplere 100 μl örnek ekleyin.
4. Aşağıdaki gibi Kontrolleri hazırlayın: Cneg işaretli tüpüne 100 μl C Negatif Kontrol ekleyin. 5.Tüpleri vorteksleyin ve 65 C de 5 dakika inkübe edin. 5-7 saniye santrifüj edin. Eğer örnek tamamen çözülmezse, maksimum hızda (12000-16000g.) 5 dakika tüpleri tekrar santirifüj edin ve DNA ekstraksiyonu için yeni bir tüp içine supernatantı aktarın. 6. Sorbenti şiddetlice vorteksleyin ve her bir tüpe 20 μl ekleyin. 7. 5-7 saniye vorteksleyin ve tüm tüpleri oda ısısında 3 dakika inkübe edin. Bu adımı tekrar edin. 8. Tüm tüpleri 5000g de 30 sn santrifüj edin ve aerosol bariyerli mikropipet kullanarak pellete zarar vermeden her bir tüpten dikkatlice supernatantı atın. Yeni bir tüpe geçerken pipet ucunu değiştirin. 9.Her bir tüpe 500 μl Yıkama Solüsyonu ekleyin. Şiddetlice vorteksleyin ve 8000g de 30 saniye santrifüjleyin. Her bir tüp için alın ve supernatantı atın. Tüpler arası geçişte pipet uçlarını değiştirin. 10. Adım 9 tekrar edin ve 65 C de 5-10 dakika açık kapakla bütün tüpleri inkübe edin. 11.Pelleti 100 μl DNA-eluent içinde yeniden suspense edin. 65 C de 5 dakika inkübe edin ve periyodik olarak vorteksleyin. 12.12000g da 1 dakika tüpleri santrifüj edin. 13. Supernatant amplifikasyon için hazır DNA içerir. Eğer amplifikasyon aynı gün çalışılmayacaksa, işlenen örnekler 2-8 C de 5 güne kadar yada 20 /-80 C de dondurularak saklanabilir. PROTOKOLU: 1. Örnekler (N) ve kontroller (N+2) için gerekli miktarlarda reaksiyon tüpleri hazırlayın. 2. 10*(N+1) µl PCR-mix-1-FRT, 5,0*(N+1) PCR-Buffer-FRT ve 0,5*(N+1) TaqF DNA Polymerase her örnek için steril yeni tüpte hazırlayın. Vokteksleyin ve 2-3 saniye santrifüjleyin. 3. Uygun tüplere 15 μl Reaction Mix ve 10 µl extracted DNA örneği ekleyin. Pipetleyerek karıştırın. 4. Her bir panel için 2 kontrol hazırlayın: Amplifikasyon Negatif Kontrol işaretli tüpe 10 µl DNA-buffer ekleyin; Amplification Pozitif Kontrol işaretli tüpe 10 µl Positive Control C+ ekleyin. 5. Termacycler içine tüpleri ekleyin. Trichomonas vaginalis, FAM (Green) kanalında ve IC DNA, JOE(Yellow)/HEX/Cy3 kanalında tespit edin. SmartCycler (Cepheid) ile Real Time Amplification Aşağıdaki gibi SmartCycler programlayın: 1. Mikrosantrifüj rotoruna SmartCycler tüpleri transfer edin ve kısa süre santrifüjleyin (5-7 sn). 2. Ana menüde Define Protocols (Protokoller tanımla) seçin ve sol alt köşedeki New Protocol (Yeni protokol) seçeneğini seçin. Protokol için bir isim belirleyin ve aşağıdaki parametreleri ayarlayın: 3. Save Protocol (Protokol kaydet) seçin. 4. Ana menüden Create Run (Çalışma Oluştur) seçeneğini seçin ve Run Name (Çalışma ismi) penceresinde deney için bir isim girin. 5. Dye Set (Boya Ayarı) düğmesini tıklayın ve FCTC25 seçin. 6. Add/Remove Sites (Ekle/Çıkar Site) seçin ve analiz için yeni bir pencerede Protokol ve Sites seçin. OK tıklayın. 7. SmartCycler içine reaksiyon tüplerini koyun ve Start Run (Çalışmayı başlat) düğmesine basarak deneyi başlatın.
8. View Results (Sonuçları gör) menüsünde Results Table (Sonuç tablosu) basın ve Sample ID (örnek ID) kolonuna örnek isimlerini ekleyin. SONUÇ ANALİZİ 1. Analysis settings (Analiz ayarları) basın ve Manual Thresh Fluor Units kolonunda Fam ve Cy3 kanaları için 30 a threshold (eşik) çizgisinin değerini ayarlayın. Update Analysis ( Analiz güncelleme) tıklayın. 2. Results Table (Sonuç Tablosu) menüsünde Save Run (Çalışmayı Kaydet) tıklayın. 3. Eğer FAM Std/Res kolonunda sonuçlar POZ (FAM Ct değeri sıfırdan farklıdır) olarak görünürse, örnek Pozitif olarak düşünülür. Eğer IC in Ct değeri 40 dan yüksekse, numunenin tekrar test edilmesi gerekir. 4. Eğer FAM Std/Res sütununda sonuç NEG (FAM Ct değeri = sıfır) olarak ve СY3 Std/Res sütununda sonuç POZ olarak görünürse, örnek Negatiftir. Cy3 kanalında Negatif örnek Ct değeri 40-42 döngü aralığında verimsiz bir DNA eksatraksiyonu gösterir (Eğer değer Ct > 40 ise örnek tekrar test edilmelidir). 5. Eğer FAM Std/Res ve СY3 Std/Res sütununda sonuç NEG (Ct = 0) olarak görünürse, sonuç geçersizdir. Aynı hazırlama ve amplifikasyon içeren testlerin girişini tekrar edin. 6. Amplifikasyonun Pozitif ve Negatif Kontrolleri ve DNA izolasyonu geçerli olduğunda, sonuç kabul edilir. Tablo 2. Kontroller için sonuçlar Kontrol Kontrol adımı Ct kanal Fam Ct kanal Cy3 Yorumlama NCS DNA izolasyon NEG POZ Geçerli sonuç DNA-buffer Amplifikasyon NEG NEG Geçerli sonuç C+ Amplifikasyon POZ NEG Geçerli sonuç Örnek: FAM Kanal Trichomonas vaginalis DNA tespit (Pozitif örnek): Cy3 Kanal Internal Kontrol DNA tespit: Rotor-Gene 3000/6000 ile Real Time Amplifikasyonu 1. Advanced sistemini programlayıp New Run penceresinde etkinleştirerek Urogenital Assays için bir şablon oluşturun. Dual Labeled Probe/Hydrolysis probes seçin ve New düğmesini tıklayın. 2. Yeni bir pencerede karusel tipini 36-Well Rotor ya da 72-Well Rotor ve Reaction Volume (μl) 25 olarak seçin. 3. Edit Profile penceresinde STD 65-60-45 RG-TaqF programını ayarlayın (bu program bütün Sacace Urogenital testleri için evrenseldir):
1. Bekleme: 95 С - 15 dk. 2. Döngü: 95 С - 20 sn. 65 С - 20 sn. 72 С - 20 sn. Döngü tekrarı 10 kez 3.Döngü 2: 95 С - 20 sn. 60 С -30 sn.-fam (Yeşil), Joe (Sarı) da tespit 72 С - 15 sn. Döngü tekrarı 35 kez 4. Floresan kanal duyarlılık düzenlemesi yapın: Channel Setup (Kanal Kurulum) Calibrate (Kalibrasyon) (RG6000 için optimizasyon sağlayın) Auto Gain Calibration (Otomatik Kalibrasyon Ayarı) (Optimizasyon) Setup (Kurulum) Calibrate Acquiring (Kalibrasyon Elde edilmesi) (Optimizasyon Elde edilmesi) ve Perform Calibration (Perform Kalibrasyon) (Optimizasyon) 1. devralmadan önce seçin. Fam/Sybr (Yeşil) kanal için Min Okuma 5, Max Okuma 10, Joe (Sarı) kanalı için Min Okuma 4, Max Okuma 8 görünür. Tüp pozisyon kolonunda Rotor-Gene 2000/3000/6000 karuselinde tüp pozisyonunu programlayın (1ci pozisyon reaktifli reaksiyon tüpü içerir) Auto Gain Calibration Setup (Otomatik Kalibrasyon Ayarı Kurulumu) penceresini kapatın. 5. Program dosyası / RotorGene 6 / Şablonlar (RG6000 Programm files / RotorGene 6000 Software / Templates için) dosyasında protokolu kaydedin ve New Run Wizard penceresini kapatın. Yeni şablon New Run penceresinde şablonların listesinde görünür ve Sacace Real-TM Urogenital Assays için kullanılabilir. AMPLİFİKASYON VE TESPİTE BAŞLAMA 1. New Run penceresinde Quick Start (Advanced Start for RG6000) seçin ve STD 65-60-45 RG- TaqF şablonlarından seçin. 2. Karusel tip seçin ve 36-Well Rotor için No Domed 0,2 Tüpler ya da 72-Well Rotor için Locking Ring Attached işaretleyin. Next tıklayın. 3. Sample Setup penceresinde tüplerin pozisyonlarını programlayın. 4. Deneye başlamak için Next ve Start Run tıklayın. ANALİZ SONUÇLARI: 1. Sonuçlar, threshold line (eşik çizgisi) ile flüoresan eğrisinin kesiştiği noktada Rotor-Gene 3000/6000 software ile yorumlanır. Trichomonas vaginalis, FAM (Yeşil) kanalında, İnternal Kontrol, JOE (Sarı) kanalında tespit edilir. 2. Analysis bastıktan sonra Quantitation (Kantitasyon) düğmesini seçin. Fam(yeşil) kanalı (Cycling A FAM or Cycling A. Green for RG6000) için ve sonra JOE (Sarı) kanalı (Cycling A JOE or Cycling A. Yellow) için işlemi gerçekleştirin. 3. Fam(Yeşil) kanalı ( Trichomonas vaginalis ) için Dynamic Tube, More Setting (Outlier Removal for RG6000) 0%, and Threshold: 0,05 seçin. 4. JOE (Sarı) kanalı (IC) için Dynamic Tube, More Setting (Outlier Removal for RG6000) 5%, Threshold: 0,1 seçin. 5. Fam (Yeşil) kanalında (Quant. Resultes Cycling A. FAM/Green) Ct < 33 değerli örnekler pozitif olarak yorumlanır. 6. JOE (Sarı) kanalında (Quant. Resultes Cycling A.JOE/Yellow) Ct < 30 değerli örnekler ve Fam (Yeşil) kanalında flüoresan sinyal yoksa negatif olarak yorumlanır. 7. FAM (Yeşil) ve JOE (Sarı) (ya da Ct > 30) de sinyal bulunmayan örnekler geçersiz olarak yorumlanır. Tablo 2. Kontroller için sonuçlar Kontrol Kontrol adımı Ct kanal Fam(Yeşil) Ct kanal Joe(Sarı) Yorumlama NCS DNA izolasyonu Sinyal yok < 30 Geçerli sonuç DNA-buffer Amplifikasyon Sinyal yok Sinyal yok Geçerli sonuç C+ Amplifikasyon < 30 Yok Geçerli sonuç
Örnek 20f, 21f, 22f, 23F Negatif örnek 24f, 28f, Pozitif örnek Chl+ : Pozitif kontrol Chl- : DNA-tampon iq icycler ve iq5 (Bio-Rad) ile Real Time Amplifikasyonu 1. Edit Plate Setup of Workshop modül penceresinde Fam ve Hex kanallarında bütün tüplerdeki flüoresans sinyal tespitini ve tüp pozisyonlarını programlayın. Run with selected protocol (Seçilmiş protokol ile çalışma) düğmesini etkinleştirerek bu şemayı kullanın ve kaydedin. iq5 cihazı için Whole Plate loading (Tüm plakaları yükleme) sisteminde şemayı düzenleyin. Sample Volume 25: μl, Seal Type: Domed Cap, Vessel Type: Tubes seçin. Save &Exit Plate Editing (Kayıt ve çıkış plaka düzenleme) düğmesini tıklayın. 2. iqicycler ya da iq5 da program STD 65-60-45 iq-taqf başlatın, View Protocols (protokol görüntüleme) modülünde programı seçin veya oluşturun ve Run with selected plate setup (Seçilen plaka ayarı ile çalıştırma) düğmesini etkinleştirerek başlatın. 95 C 13 dakika 30 sn. 10 Döngü: 95 C 10 sn, 65 C 20 sn, 72 C 20 sn 35 Döngü: 95 C 10 sn, 60 C 30 sn, 72 C 20 sn 2ci adımda (60 C) Fam ve Joe kanallarında flüoresans tespiti 3. Dynamicwf için aşağıdaki iq icycler ayarlarının seçili olduğundan emin olun: 4. Önceden oluşturulmuş modele göre termalcycler içine tüpleri transfer edin. 5. Select well factor source çizgisi altında Experimental Plate seçin ve reaksiyon hacmini 25 µl olarak tercih edin (iq icycler için) 6. Run düğmesine basın. ANALİZ VERİLERİ Sonuçlar, eşik çizgisi ile flüoresan eğrisinin kesiştiği noktada iq icycler ya da iq5 software ile yorumlanır. Trichomonas vaginalis, FAM kanalında ve IC DNA, HEX kanalında tespit edilir.
Fam ve Hex kanalları için Log View düğmesi etkinleşir. Flüoresans eğrisinin doğrusal olduğu düzeylerde eşik çizgisine (farenin sol tuşu ile) yerleştirin. Fam (Select a Reporter penceresinde FAM-490 ) kanalında Ct değeri (Ct < 33) sıfırdan farklı ise, örnekler Trichomonas vaginalis için pozitif olarak yorumlanır. HEX (Select a Reporter penceresinde HEX-530 ) kanalında Ct 33 ise ve FAM kanalında flüoresans sinyali yoksa örnekler negatif olarak yorumlanır. FAM ve HEX kanalında örneklerin Ct değeri yoksa ya da > 33 ise geçersiz olarak yorumlanır. Tablo 2. Kontroller için sonuçlar Kontrol Kontrol adımı Ct kanal Fam Ct kanal HEX Yorumlama NCS DNA izolasyonu Sinyal yok 33 Geçerli sonuç (negatif) DNA-buffer Amplifikasyon Sinyal yok Sinyal yok Geçerli sonuç (negatif) C+ Amplifikasyon 33 Yok Geçerli sonuç (pozitif) FAM Kanal Trichomonas vaginalis DNA tespit (iq5) HEX Kanal Internal Control DNA tespit (iq5) Unkn-1, 2, 3, 4, 5, 6 = Pozitif örnek; К+ = Pozitif kontrol; Unkn-7, 8, 9 = Negatif örnek; Unkn-11 = Negatif Kontrol. MX3000P ve MX3005P (Stratagene) programı aşağıdaki gibidir: 1. Programı açın, Quantitative PCR (Multiple Standarts) seçin ve OK tıklayın. 2. Pencerenin üst kısmındaki Plate Setup seçin.
3. Well type penceresinde örnekler için Unknown ayarlayın. 4. Pencerede Collect fluorescence data Fam ve Joe kanalında tüm örnekler için seçin. 5. Pencerenin sağ üst kısmındaki Thermal Profile Setup düğmesini seçin. 6. Amplifikasyonun aşağıdaki parametrelerini ayarlayın: Bekleme 95 C 15 dk Döngü 1 95 C 20 sn 65 C 30 sn 72 C 20 sn Döngü Tekrarı 10 kez Döngü 2 95 C 25 sn 65 C 50 sn* 72 C 20 sn Döngü Tekrarı 35 kez *Flüoresans 2ci döngüde 65 C de ölçülür. 7. Run düğmesini tıklayın, deney için bir isim girin ve kaydedin. ANALİZ SONUÇLARI 1. Ampifikasyon bittikten sonra, pencerenin sol üst kısmındaki Analysis düğmesini seçin. 2. Results düğmesini seçin. 3. Area to analyze penceresinin sağ açı kısmında Amplification plots seçin. 4. Sonuçlar, eşik çizgisi ile flüoresan eğrisinin kesiştiği noktada cihazın software ile yorumlanır. Trichomonas vaginalis, FAM kanalında ve Internal Control, JOE kanalında tespit edilir. 5. IC inhibisyonu, Trichomonas vaginalis nın ilk yüksek konsantrasyonlu örneklerde oluşabilir. 6. Fam kanalında Ct<40 değerli örnekler, Joe (IC) kanal sonuçlarına bakmaksızın Trichomonas vaginalis için pozitif olarak yorumlanır. 7. Fam kanalında Ct değerli örnekler yoksa veya Ct>40 değerli örnekler Trichomonas vaginalis için negatif olarak yorumlanır. 8. FAM ve JOE kanallarda sinyal veren örnek yoksa geçersiz olarak yorumlanır. Tablo 2. Kontroller için sonuçlar Kontrol Kontrol adımı Ct kanal Fam Ct kanal Cy3 Yorumlama NCS DNA izolasyon NEG POZ Geçerli sonuç DNA-buffer Amplifikasyon NEG NEG Geçerli sonuç C+ Amplifikasyon POZ NEG Geçerli sonuç SORUN GİDERME 1. Ekstraksiyonun Negatif Kontrolu için IC (Joe/Hex/Cy3 kanal) sinyal vermez ya da zayıf verir. PCR inhibe olur. Size önerilen DNA ekstraksiyon yöntemini kullandığınızdan ve üreticinin talimatlarını izlediğinizden emin olun. Ekstre edilmiş DNA pipetlenmeden önce maksimum hızda (12000-16000 g) 2 dakika boyunca bütün tüpleri tekrar santrifüj edin ve dikkatlice süpernatantı alın. Reaksiyonda inhibe olan sorbent pellete dokunmayın. Reaktif saklama koşulları talimatlara uygun değildir. Saklama koşullarını kontrol edin. PCR koşulları talimatlara uygun değildir. PCR şartlarını ve protokolde rapor edilmiş flüoresans kanalını IC tespit için seçin. Reaktifleri pipetleme işlemi sırasında örneğe IC eklenmedi. DNA ekstraksiyon prosedürü sırasında dikkat edin. 2. Pozitif control sinyal vermez ya da zayıf verir. PCR koşulları talimatlara uygun değildi.
Amplifikasyon protokolunu kontrol edin ve manuel de rapor edilmiş fluoresans kanalını seçin. 3. Negatif Kontrol ekstraksiyonu herhangi bir sinyal verir. DNA ekstraksiyon prosedürü sırasında kontaminasyon olabilir. Tüm örneklerin sonuçları geçersizdir. Sodyum hipoklorit ve etanol ile cihazın tüm yüzeyleri dekontamine edin. Ekstraksiyon prosedürü sırasında sadece filtre uçları kullanın. Tüpler arası geçişte uçları değiştirin. Reaktiflerin yeni bir seti ile DNA ekstraksiyonunu tekrar edin. 4. PCR Negatif Kontrolu (DNA-buffer) ile herhangi bir sinyal verir. PCR hazırlık işlemi sırasında kontaminasyon olabilir. Tüm örneklerin sonuçları geçersizdir. Sodyum hipoklorit ve etanol veya özel DNA dekontaminasyon reaktifleri ile cihazın tüm yüzeyleri dekontamine edin. Sonunda Pozitif kontrolü pipetleyin. Reaktiflerin yeni bir seti ile PCR hazırlanmasını tekrar edin. PERFORMANS ÖZELLİKLERİ Analitik özgüllük Primerler ve probların analitik özgüllüğünü negatif örnekler ile doğrulanmıştır. Bu örnekler spesifik Trichomonas vaginalis primerler ve probları ile sinyal vermezler. Trichomonas vaginalis Real-TM kitin özgüllüğü 100% dir. Kit Trichomonas vaginalis Real-TM ın potansiyel çapraz-reaktivitesi kontrol grubuna karşı test edilmiştir. Diğer patojenler ile herhangi bir çapraz-reaktivite gözlenmez. Analitik hassasiyet Kit Trichomonas vaginalis Real-TM, 500 kopya/ ml den az olmayan %100 duyarlılıkla testlerin Trichomonas vaginalis DNA tespitini sağlar. Tespit, negatif numuneler tarafından kontrol standardını ve dilüsyonlarını gerçekleştirir. Hedef bölge: G3 hypothetical protein *icycler and iq5 are trademarks of Bio-Rad Laboratories * The Rotor-Gene Technology is a registered trademark of Corbett Research * SmartCycler is a registered trademark of Cepheid Sacace Biotechnologies Srl 18 San Carlo str., 81100 Caserta, Italy *PCR: The Polymerase Chain Reaction (PCR) process is covered by patents owned by Hoffmann-La Roche and applicable in certain countries. Sacace does not encourage or support the unauthorized or unlicensed use of the PCR process. Use of this kit is recommended for persons that either have a license to perform PCR or are not required to obtain a license