Kullanım Talimatı Protein C Rocket EID Kat. No. 5357

Kullanım Talimatı Protein C Rocket EID Kat. No. 5357 1

KULLANIM AMACI Protein C Rocket EID (electroimmunodiffusion) prosedürü Laurell roket elektroforez tarafından plazma protein C antijenin kantitatif tespiti için tasarlanmıştır 1, 2. Protein C, fibrin oluşumunu düzenleyici olarak görev yapan vitamini K bağımlı bir plazma proteinidir. Aktif formunda, aktive faktörler V ve VIII in inaktivasyonu ile trombin oluşumunu engeller 3, 4. Protein C eksikliği en sık görülen klinik özellik olan yüzeyel tromboflebit bir trombotik risk faktörü 5, 6 oluşturmaktadır 7. Plazma protein C in virtüel yokluğu yeni doğanlarda ölümcül trombozuna yol açar 8. Helena Protein C Rocket EID Prosedürü protein C için spesifik antiserum içeren % 1 agaroz jel ortamında yapılır. Plazma örneği agarozda kuyulara uygulandıktan sonra, elektroforez antikor alanında proteinlerin göç etmesini sağlar. Bir roket şeklinde presipite patern göç ekseninde oluşturur. Bu roket patern uzunluğu antijen konsantrasyonu ile doğru orantılıdır. UYARILAR VE ÖNLEMLER Kitte bulunan reaktifler sadece in-vitro diagnostik kullanımı içindir- YUTMAYIN. Çalışma yaparken eldiven giyin. Atık bilgisi, risk ve güvenlik fazları için ürün güvenliği veri sayfasına bakın. Plazma ürünleri tarandı ve Hepatit B antijen (HbsAg) HIV 1 ve 2 antikorları ve HCV antikor varlığında negatif tespit edilmiştir (kit kutusu veya şişesi üzerinde belirtilmediği sürece); ancak insan plazma örneklerinde gözlenen aynı önlemler ile ele alınmalıdır. BİLEŞENLER 1. Protein C Antijen Rocket Plakalar (Kat. No. 5357) Koruyucu olarak sodyum azid ve Tris-trisin buffer 8 de agaroz insan protein C için koyun veya keçi antikoru içerir. Zehirli buhar oluşumunu önlemek için sodyum azid asidik solüsyonlar ile karıştırılmamalıdır. Hazırlama: Paketinden plakayı çıkarın ve 15...30 C ye ulaşması için agarozu 5-20 dakika bekletin. 2. Tris-trisin Buffer (Kat. No. 5358 dahil değil) Dilüe tampon 0.08 M Tris ve 0.024 M trisin içerir. Hazırlama: Deiyonize veya distile su ile 1000 ml ye tamponun bir paketini dilüe edin. Tampon tüm materyaller tamamen çözüldüğünde kullanıma hazırdır. 3. Rocket Boya (Kat. No. 5362 - dahil değil) Rocket Boya Coomassie Brilliant Blue boyasıdır. Hazırlama: Şişe içeriğini 450ml deiyonize su, 450ml metanol ve 100ml asitik asit ile çözün. İyice karıştırın ve gerekirse kullanım öncesi filtreleyin. 4. Diğer kit bileşenleri Her bir kit kullanım talimatları, bir roket cetvel ve rapor formatı içerir. SAKLAMA VE RAF ÖMRÜ Açılmamış reaktifler şişe veya kit etiketi üzerinde belirtilen koşullar altında saklandığında verilen son kullanım tarihine kadar stabildir. 1. Protein C Antijen Rocket Plakalar (Kat. No. 5357) Rocket Plakalar 2...6 C de SAKLANMALIDIR ve torba içerisinde nemli durumda korunmalıdır. DONDURMAYIN. Plakalar ambalaj üzerinde belirtilen son kullanım tarihine kadar stabildir. 2

Bozulma göstergesi: Eğer plakalar görünüm olarak kuruysa veya kuyular yuvarlak değilse atın. Bir kristal görünümü donmuş agarozu gösterir. 2. Tris-trisin Buffer (Kat. No. 5358) Ambalajlı tampon 15...30 C'de saklanmalıdır ve bir etiket üzerinde belirtilen son kullanım tarihine kadar stabildir. Dilüe tampon 15...30 C de 2 ay boyunca stabilidir. Bozulma göstergesi: Eğer materyalde renk değişikliği veya nem varsa ambalajlı tamponu atın. Eğer bulanıklık oluşursa, dilüe tamponu atın. 3. Rocket Boya (Kat. No. 5362) Boya 15...30 C'de saklanmalıdır ve bir etiket üzerinde belirtilen son kullanım tarihine kadar stabildir. Bozulma göstergesi: Eğer metanolde buharlaşma oluşursa, bir metalik parlaklık boya yüzeyinde görünür. Eğer boya bu prosedürde belirtilen protein rockets için yetersizse boyayı atın. GEREKLİ FAKAT SAĞLANMAYAN ÖĞELER Kat. No. 5358 Tris - Tricine Buffer Kat. No. 5362 Rocket Stain Kat. No. 5185 SARP reference plasma Kat. No. 1283 / 4063 Zip Zone Chamber / Titan Gel Chamber Kat. No. 5014 Development Weight Kat. No. 1520 EWS Power Supply Kat. No. 9015 Sponge Wicks Kat. No. 5037 Blotter Pads Kat. No. 1558 TITAN GEL Multi-staining Set Kat. No. 9025 IEP VuBox Kat. No. 5116 I.O.D. - Incubator, Oven, Drier Kat. No. 6210, 6211 Microdispenser and Tubes (10μl) Lint free tissue Arındırıcı solüsyon: 200ml deiyonize su, 200ml metanol ve 50ml glacial asidik asit karıştırın. NUMUNE ALMA VE HAZIRLAMA Plastik veya silikonlu cam boyunca kullanılmalıdır. Kan (9 parça) % 3.2 veya% 3.8 sodyum sitrat antikoagülan (1 kısım) içine toplanmalıdır. 2000-3000 xg de 15 dakika boyunca santrifüj sonrası plazmayı ayırın. Plazma 2 6 C de tutulmalıdır. Testin yapılması için -70 C de 1 ay veya -20 C de 2 hafta boyunca dondurularak saklanan plazma veya örnek alma 2 saat içinde tamamlanmalıdır. Test öncesi 37 C de hızlıca eritin. 5 dakikadan daha fazla 37 C'de tutmayın. ADIM-ADIM PROSEDÜRE NOT: Buzdolabından plakayı alın, kullanım öncesi aşırı nemin emilmesi ve 15...30 C ye ulaşması için yaklaşık 5-20 dakika plakayı bekletin. 1. 1.0ml deiyonize veya distile su ile S.A.R.P. ın bir şişesini çözün. Aşağıdaki gibi Standart Eğri in hazırlanması için dilüsyonlar yapın: 3

2. 0.85% serum fizyolojik ile kontrol ve her bir hasta örneğini dilüe edin. Bir 1:2 oranında dilüsyon (1 part hasta örneği ve 1 part serum fizyolojik ) ve bir 1:4 oranında dilüsyon (1 part hasta plazması ve 3 parts serum fizyolojik ) hazırlayın. Ek dilüsyonlar hasta geçmişine bağlı olarak gerekli olabilir. Dilüe edilmemiş test edilecek şüpheli anormal örnekler gerekebilir. 3. Hazırlama: Zip Zone tankı kullanıyorsanız: Tankın (toplam 400ml tampon gerekli) dış bölümlerinin içine 200ml Tris-trisin Tampon dökün ve tankın iç duvarı boyunca tampon içine sünger fitil koyun. TITAN GEL tankı kullanıyorsanız: Tankın her bir iç kısmına 65ml Tris-trisin tamponu dökün. 4. Plaka kuyularından fazla olan tamponu alın. NOT: Plaka üzerindeki fazla neme kötü roketler neden olabilir. 5. İlgili kuyulara 10μl dilüe hasta örnekleri ve kontrolleri uygulayın. NOT: Standart eğri örnekleri her plaka üzerinde çalıştırılmalıdır. Hasta örnekleri için çift çalışma önerilir. Plaka kuyulara örnekler uygulandığında, pipet ucunu kuyuların köşesine değdirmeden çalışın, bu durum kuyulara zarara neden olabilir. 6. Agaroz içinde diffüze olması için örnekleri 5 dakika bekletin. 7. Elektroforez: Zip Zone tankı kullanıyorsanız: Sünger fitiller üzerinde tank içine, agaroz tarafı aşağı, plakayı koyun. Tankın katot (negatif) tarafına doğru uygulama noktasını (kuyu) yerleştirin. TITAN GEL tankı kullanıyorsanız: Yerine jeli yavaşça koyarak tankın iç kısmına,agaroz tarafı aşağı, plakayı yerleştirin. Kuyular tankın katot (-) tarafında ve agarın köşesi tamponun içinde olacak şekilde jeli (leri) yerleştirin. 8. 3 saat için plaka başına 16mA sabit bir akımda plakaları elektroforez yapın. 9. Elektroforezin ardından tanktan plakaları çıkarın. Her bir çalışma sonrası tanktaki tamponu atın. NOT: Tankı boyamak ve durulamak için TITAN GEL Multi-Boyama Seti (Kat. No 1558) kullanın. 10. Deiyonize su veya distile su ile plakayı durulayın ve 0,85% serum fizyolojikte bir gece yavaşça karıştırarak yıkayın. 11. Gecelik yıkama sonrasında, deiyonize veya distile su ile plakayı durulayın. 12. Agaroz tarafı yukarı olacak şekilde düz bir yüzeye plakayı koyun. Tüysüz bir doku ile agarozu kapatın. 13. 15 dakika için plaka üzerinde Development Weight ve 2-3 Blotter Pads koyun ve sonra alın. 14. Kuru bir plaka 60...70 C'de 10-20 dakika kurutma fırında plakayı kurutun. Plakaların üzerini kurutmayın. Plakaların kuruması tamamlandığında saydam olacaktır. NOT: Eğer bir kurutma makinesi / fırın yoksa, plakalar ıslak tüysüz doku ile örtülebilir ve 15... 30 C'de bir gece ya da iklim koşullarına göre 15...30 C de 3 saat boyunca bir fan altında kuruması için bırakılabilir. 15. Kurutma ardından Rocket Boya içinde 20 dakika kadar daldırarak plakayı boyayın. 16. Plakayı 1-3 dakika boyunca boya arındırıcı solüsyon içine koyun. NOT: Kolayca roket pikleri ayırmak için arka plan yeterince temizlendiğinde boya arındırma tamamlanır. NOT: Aşırı boya arındırma zor doğru ölçüm yapan roketlerin rengini soldurabilir. Eğer boya arındırıcı üzerinde oluşursa, Adım F.7 tekrarlayın ve yine roketleri boyayın. 4

17. Her bir durulama için 5-10 dakika saf su içinde plaka iki kez durulanır. 18.Kuruyana kadar 15...30 C de ya da 5 dakika boyunca 37 C'de plakaları çıkarın. 19. Roketleri daha kolay görüntülemek için VuBox altına beyaz bir kağıt kullanarak Helena I.E.P. VuBox üzerine plakayı yerleştirin. İşatleyici ile her bir roket pikin ucunu işaretleyin. 20. Helena Rocket Ruler kullanarak milimetre olarak her bir pikin uzunluğunu ölçün. Pik her bir kuyunun tepesinden roketin uç tepesine ölçülür. 21. Rocket Antijen Report Formunda yada 3 cycle yarı logaritmik kağıt üzerinde her roket yüksekliğine karşı standart eğri değerlerini çizin. Dört nokta için en uygun best line çizin. Tamamlanmış Rocket Plate in bir örneği için ve Rocket Antijen Report Formu üzerinde standart bir eğri çizmek için Şekil 1 ve 2 de SONUÇLARIN YORUMLANMASINA bakın. SONUÇLARIN YORUMLANMASI Standart eğriden hasta değerlerini okuyun ve uygun dilüsyon faktörü ile her birini çarpın. Rocket Referans Plazma standart eğrisi hazırlamak için kullanılırsa, dilüsyon faktörü yanında Rocket Referans Plazmanın uygun lotunun atanmış Protein C Antijen değeri ile çarpılan eğriden hasta değeri okunur. Eğriden alınana hasta değeri=30% Dilüsyon faktörü =2 S.A.R.P. verilen değer =98% Mevcut Hasta Faktör Protein C Antijen=30% x 2 x 0.98 = 58.8% Standart eğri aralığından daha büyük olan Protein C Antijen seviyeleri hasta örnekleri uygun dilüsyonları kullanarak tekrar test edilmelidir. Şekil 1: Bir Protein C Antijen Rocket Plaka üzerinde Rocket paternler. Standart dilüsyonların roket uzunlukları (milimetre olarak) Standart eğrisi hazırlamak için kullanılır. Hasta sonuçları eğriden okunur. Şekil 2: 3 siklüs yarı logaritmik kağıt üzerinde S.A.R.P. ile hazırlanan bir standart eğri örneği. 5

KALİTE KONTROL Her bir laboratuar bir kalite kontrol programı oluşturmalıdır. Normal ve anormal kontrol plazmalar cihaz yeterliliğini ve işlem performansını sağlamak için hasta numunelerinin her bir lotu öncesi test edilmelidir. Eğer kontroller beklenildiği gibi yapılmazsa, hasta örnekleri geçersiz kabul edilir. Helena BioSciences bu ürünlerin kullanımı için aşağıdaki kontrolleri sağlar: Kat. No. 5301 S.A.C.-1 Kat. No. 5302 S.A.C.-2 REFERANS DEĞERLER Referans değerleri kullanılan tekniklere ve sistemlere bağlı laboratuarlar arasında değişebilir. Bu nedenle, her laboratuar kendi normal aralığını oluşturmalıdır fakat Protein C antijen için henüz uluslararası standart kabul edilmemiştir. Protein C antijen değerleri genelde toplanmış normal plazma standardına göre relatif yüzde olarak ifade edilir. Roket elektroforezi ile yapılan çalışma protein C antijeni için beklenen normal aralığı 50% seviyesinden daha az gösteren yeni doğanların % 65-129 aralığında rapor etmiştir. Bertina et al. 7, antikoagülan tedavi sonrası bulunan azalan seviyelere sahip sağlıklı bireylerde 65-145% aralığı bildirdi. Sağlıklı erkek ve kadınlar arasında protein C antijen düzeyleri farkı saptanmamıştır 9. Helena tahminen sağlıklı erkek ve kadından alınan 39 plazmadan test etti. Sonuçlar aşağıdaki gibidir: X = 101% SD = 24 Range = 53-149% SINIRLAMALAR Konjenital protein C eksikliği olan çoğu hasta tip I eksikliği 7 olarak da adlandırılan hem immünolojik hem de fonksiyonel aktivitenin azalmış düzeylerini gösterir. Ancak, protein C antijenin ve azalmış fonksiyonel protein C aktivitenin, tip I eksikliği 7, normal seviyesine sahip 6

bazı hastalarında görülen bulgular teşhisi zorlaştırır. Helena prosedürü sadece tip I eksikliklerini tespit eder. PERFORMANS ÖZELLİKLERİ Presizyon çalışmaları Çalışma içi: Bir kontrol plazması aşağıdaki sonuçlar veren bir plaka üzerinde tekrarlanarak test edildi. n = 8 X = 91.8% SD = 2.83 CV% = 3.0 Çalışma arası: Bir kontrol plazma aşağıdaki bilgileri veren dört farklı plaka üzerinde tekrarlanarak test edildi. n = 26 X = 85.2% SD = 6.47 CV% = 8.0 Karşılaştırma Çalışmaları Korelasyon çalışmaları Helena Protein C yöntemi ve referans Protein C yöntemi ile 43 normal ve anormal hasta örnekleri üzerinde yapılmıştır. Çalışmada mükemmel bir doğrusal regresyon denklemi ve korelasyon katsayısı elde edilmiştir. n = 43 Y = 0.614X + 27.006 r = 0.937 X = Helena s Protein C Y = Referans Protein C yöntemi BİBLİYOGRAFİ 1. Laurell, C.B., Electroimmuno Assay, Scan J Clin Lab Invest 29 Suppl 124, 21-37, 1972. 2. Laurell, C.B., Quantitative Estimation of Proteins by Electrophoresis in Agarose Gel Containing Antibodies. Anal Biochem, 15:45-52, 1966. 3. Nesheim, M.E., Canfield, W.M., Kisiel, W., Mann, K.G. Studies of the Capacity of Factor Xa to Protect Factor Va from Inactivation by Activated Protein C. J Biol Chem, 257:1443-1447, 1982. 4. Marlar, R.A., Kleiss, A.J., Griffin, J.H. Human Protein C: Inactivation of Factor V and VIII in Plasma by the Activated Molecule. Ann N.Y. Acad Sci, 370:303-310, 1981. 5. Griffin, J.H., Evatt, B., Zimmermann, T.S., Kleiss, A.J. Wideman, C. Deficiency of Protein C in Congenital Thrombotic Disease. J Clin Invest, 68:1370-1373, 1981. 6. Broekmans, A.W., Veltkamp, J.J., Bertina, R.M. Congenital Protein C Deficiency and Venous Thrombo-embolism. A Study in Three Dutch Families. N Engl J Med, 309:340-344, 1983. 7. Bertina, R.M., Broekmans, A.W., Krommenhoek-Van Es, C., Van Wijngaarden, A. The Use of a Functional and Immunologic Assay for Plasma Protein C in the Study of the Heterogeneity of Congenital Protein C Deficiency. Thromb Haemostas, 51:1-5, 1984. 8. Seligsohn, U., Berger, A., Abend, M., Rubin, L., Attias, D., Zivelin, A., Rapaport, S.I. Homozygous Protein C Deficiency Manifested by Massive Venous Thrombosis in the Newborn. N Engl J Med, 310:559-562, 1984. 9. Pabinger-Fasching, I., Bertina, R.M., Lechner, K., Niesser, H., Korninger, Ch. Protein C Deficiency in Two Austrian Families. Thromb Haemostas, 50:810-813, 1983. 7