RD-1i OSNA Meme kanserinde yeni nesil sentinel lenf nodu analizi www.sysmex.com.tr
RD-1i OSNA Meme kanserinde yeni nesil sentinel lenf nodu analizi Sentinel nod biyopsisi erken evre, klinik açıdan nod-negatif meme kanseri hastaları için tercih edilen cerrahi prosedür olarak hızla ön plana çıkmıştır. Sentinel lenf nodunun (SLN) konvansiyonel intra-operatif analizi şimdiye kadar hızlı H&E (hematoksilen ve eozin) boyalı touch imprint sitolojisi veya frozen section yöntemi ile gerçekleştirilmiştir. Bu histopatolojik yöntemlerin duyarlılığı düşüktür çünku lenf nodu dokusunun yalnızca küçük bir kısmı intra-operatif (ameliyat esnasında) koşullarda araştırılabilir. Bunun bir sonucu olarak, yalnızca post-operatif (ameliyat sonrası) yapılacak inceleme ile tanımlanabilen yalancı negatif sonuçlar elde etme riski yüksektir. OSNA (Tek Adımlı Nükleik Asit Amplifikasyonu) ilk kez intraoperatif süreçte tüm lenf nodunun analizinin gerçekleştirilebildiği yeni ve yaygın olarak kullanılan tanı yöntemidir. Eksiksiz bilgiye dayalı nihai bir klinik karar, ikinci bir cerrahi prosedür veya doğrulayıcı bir histopatolojik analize gerek kalmadan güvenle alınabilir.
Klinik validasyon çalışmaları ve sonuçları OSNA yöntemi, farklı ülkelerde yapılan çok merkezli birçok çalışmada değerlendirilmiştir [1 5]. OSNA bu çalışmaların tümünde, kapsamlı bir histopatolojik inceleme ile karşılaştırılmıştır. Lenf nodları özel bir kesme cihazı ile kesilerek 1 veya 2 mm genişliğinde 4 kesite ayrılmıştır. Birbirini takip eden kesitlere ya OSNA analizi uygulanmış ya da devamlı kesitler çok düzeyli histoloji için kullanılmıştır. 1, 2 veya 25 μm'lik aralıklı şeritler ile 5 düzeyden kesitler elde edilmiştir. Özet olarak, 2313 lenf nodu analiz edilmiş ve sonucunda aşağıdaki performans verileri elde edilmiştir: Konkordans oranı % 96.5 Duyarlılık % 95.6 Özgüllük % 96.7 Japonya'da yapılan bir çalışmanın parçası olarak, pn hastalarda (144 lenf nodunun analiz edildiği) OSNA özgüllüğünün % 1 olduğu gösterilmiştir (Tablo 1). OSNA n = 144 (++) (+) ( ) makro pozitif patolojik inceleme mikro Özgüllük: %1 (%95 GA:,935 ~,993) Tablo 1 6 pn hastadan elde edilen 144 lenf nodunun analizi % 1 oranında özgüllük göstermiştir negatif 144 Bu özgüllük çalışmasında test edilen negatif lenf nodlarının CK19 mrna kopya sayısı, OSNA tetkikinde tanımlanan sınır (cut-off) değerinin önemli ölçüde altında kalmıştır. Bu veriler, yalancı pozitif sonuç riskinin neredeyse tamamen dışlanabileceğini göstermektedir (Şekil 4). Lenf nodu sayısı 9 8 7 6 5 4 3 2 1 ND 25 25 5 Özgüllük çalışması sonuçları 5 75 75 1 1 125 Şekil 4 6 pn hastadan elde edilen 144 lenf nodunun CK19 mrna kopya sayısının dağılımı. Tüm klinik değerlendirmelerin sonuçları CK19 mrna'sının meme kanseri lenf nodu metastazlarının saptanmasında mükemmel bir moleküler belirteç olduğunu göstermektedir. Sonuç olarak, OSNA tetkiki meme kanseri hastalarından elde edilen sentinel nod biyopsi örneklerindeki metastazların hızlıca saptanmasını sağlayan bir tanı aracı olarak uygulanabilir. 125 15 15 175 175 2 CK19 mrna (kopya/μl) 2 225 Sınır değeri (Cut-off) 225 25 25 275 IVD ile tam uyumludur ve AB genelinde tanı amaçlı kullanım için tam olarak onaylanmıştır. 275 3 Yayın referansları [1] Tsujimoto M et al. (27): One-Step Nucleic Acid Amplification for Intraoperative Detection of Lymph Node Metastasis in Breast Cancer Patients. Clin Cancer Res 13(16). 487. [2] Visser M et al. (28): Intra-operative rapid diagnostic method based on CK19 mrna expression for the detection of lymph node metastases in breast cancer. Int. J. Cancer. 122.2562. [3] Schem C et al. (29): One Step Nucleic Acid Amplification a molecular method for the detection of lymph node metastases in breast cancer patients; results of the German study group. Virchows Arch. 454.23. [4] Tamaki Y et al. (29): Molecular detection of lymph node metastases in breast cancer patients: Results of a multicenter trial using one-step nucleic acid amplification assay. Clin Can Res. 15 : 2879 84. [5] Snook KL et al. (21): Multicentre evaluation of intraoperative molecular analysis of sentinel lymph nodes in breast carcinoma. Br J Surg, DOI: 1.12/bjs.7347. [6] Frère-Belda MA et al. (212): Diagnostic performance of one-step nucleic acid amplification for intraoperative sentinel node metastasis detection in breast cancer patients. Int J Cancer. 212 May 15 : 13(1) : 2377 86.
İleri teknoloji OSNA, Sitokeratin 19 (CK19) mrna ekspresyonunun saptanmasına yönelik hızlı bir nükleik asit amplifikasyon teknolojisinden (RT-LAMP*) yararlanan otomatize edilmiş moleküler tanı yöntemidir. CK19 epitel hücre belirtecidir ve normalde lenf nodu dokusunda mevcut değildir. CK19 mrna ekspresyon miktarı, metastatik odakların büyüklüğü ile korelasyon gösterir: Sistem, metastatik tümör yükünün boyutuna işaret eder. Hasta sonucunun değerlendirilmesi standart eğrinin üç farklı kalibratör ile karşılaştırılmasına dayalıdır. Belirteç seçimi OSNA yönteminin geliştirilmesi sırasında Sysmex, halka açık insan gen ekspresyonu veritabanından 45 aday mrna belirteci seçmiştir. Seçim kriterleri, normal lenf nodu dokusunda minimal düzeyde olan veya hiç gözlenmeyen ekspresyon ile birlikte meme bezi dokularında yüksek mrna ekspresyon düzeyi olarak tanımlanmıştır. Bu mrna belirteçlerinin ekspresyon oranı histopatolojik olarak pozitif ve negatif lenf nodları kullanılarak değerlendirilmiştir (Şekil 1 a + b). 45 potansiyel belirteç gen testi İkinci bir adımda, metastatik pozitif lenf nodlarında yüksek mrna ekspresyonu gösteren ve negatif lenf nodlarında minimal ekspresyon sergileyen, en çok ümit vaat eden yedi aday belirteç daha fazla sayıda lenf nodunda daha ayrıntılı şekilde değerlendirilmiştir (Şekil 2). Bunun sonucunda, CK19 mrna'sının metastatik lenf nodlarında yüksek ekspresyon seviyesi ve metastatik olmayan lenf nodlarında düşük ekspresyon seviyesi göstermesine ve dolayısıyla yüksek duyarlılık potansiyeli ve metastatik lenf nodlarını metastatik olmayanlardan ayırt edebilme kapasitesi sunmasına bağlı olarak en uygun belirteç olarak tanımlanmıştır. + + + + + + + CK19 FOXA1 SPDEF CEA MGB1 TACSTD2 MUC1 FOXA1 (forkhead box A1), SPDEF (ETS transkripsiyon faktörü içeren SAM pointed domain), CEA (karsinoembriyonik antijen), TACSTD2 (tümörle ilişkili kalsiyum sinyal transdüseri 2), MGB1 (mammaglobin 1), MUC1 (musin 1) Şekil 2 Histopatolojik olarak pozitif ve negatif lenf nodlarında mrna ekspresyonu Şekil 1a Histopatolojik olarak pozitif ve negatif lenf nodları arasındaki mrna ekspresyonu oranı Şekil 1b Histopatolojik olarak pozitif lenf nodlarında her mrna belirtecinin ekspresyonu * RT-LAMP = Ters transkriptaz loop-aracılı izotermal amplifikasyon; Eiken Chemical CO., LTD ile anlaşma uyarınca lisanslıdır.
RT-LAMP teknolojisi Yenilikçi amplifikasyon teknolojisi RT-LAMP, konvansiyonel PCR yöntemlerine göre çeşitli avantajlar sağlayan hızlı bir izotermal prosedürdür. Amplifikasyon reaksiyonu 16 dakika sürmekte ve öncesinde hiçbir RNA saflaştırması gerekmemektedir. Örnek hazırlama koşulları ve özel primer tasarımı, yüksek spesifikliğin sağlanması ve yalancı pozitif sonuçların bertaraf edilmesi amacıyla özel olarak ayarlanmaktadır. Süreç, RD-1i otomatik amplifikasyon ve saptama sisteminde gerçek zamanlı olarak izlenmektedir. Sonuçlar, analiz edilen SLN sayısına bağlı olarak yaklaşık 3 45 dakika içinde elde edilmektedir (Şekil 3). CK19 psödogenlerinin veya transkriptlerinin amplifikasyonunu engellemek ve buna ek olarak tetkikin reaksiyon hızını arttırmak amacıyla özel olarak tasarlanmış RT-LAMP'ta altı farklı primer kullanılmaktadır. LAMP Primeri Genomik DNA'nın istenmeyen amplifikasyonu örnek hazırlama süreci boyunca düşük ph'de (3,5) ve 65 C'de izotermal reaksiyon sıcaklığında DNA presipitasyonu ile engellenmektedir. Şekil 3 Reaksiyonun gerçek zamanlı olarak izlenmesi Tüm reaktifler kullanıma hazırdır. 5 B1 B2 3 Hedef RNA SLN'nin tanımlanması için kullanılan mavi boyalar veya radyoizotop kolloidler OSNA reaksiyonu ile etkileşmez. 3 5 cdna F2 F1 n 65 C'de izotermal prosedür n Yüksek hızda reaksiyon (16 dakika) n RNA saflaştırma gerekmez L1 3 5 L2 n İstenmeyen psödogen ve genomik amplifikasyonu yoktur F1: İleri Primer 1 F2: İleri Primer 2 B1: Geri Primer 1 B2: Geri Primer 2 L1: Loop Primer 1 L2: Loop Primer 2 veya : DNA domaini veya : komplementer domain n 6 primer sayesinde yüksek spesifiklik
Teknik Özellikler Araç Yöntem Parametre Teknoloji Saptama Görüntülenen parametreler Verim Örnek başına doku aralığı Örnek hacmi Reaktifler Veri depolama Kalite kontrol Arayüzler Ağırlık Boyutlar (g x y x d) Gen Amplifikasyonu Saptama Sistemi RD-1i OSNA (Tek Adım Nükleik Asit Amplifikasyonu) CK19 mrna RT-LAMP (ters transkriptaz loop-aracılı izotermal amplifikasyon) Reaksiyonun derecesine bağlı magnezyum pirofosfat presipitasyonundan kaynaklanan yayılan ışık değişimi CK19 Q (CK19 Kalitatif Sonucu) CK19 (CK19 Yükselme Zamanı) CK19 C (CK19 mrna-konsantrasyonu) seri başına 4 örnek 5 6 mg 2 μl homojenize edici reaktif LYNORHAG amplifikasyon reaktifi LYNOAMP BC tüm reaktifler kullanıma hazırdır 2 örnek pozitif ve negatif kontrol dosya başına 18 veri noktası ana bilgisayar bağlantısı (RS232, LAN) yazıcı bağlantısı (USB) yaklaşık 66 kg 596 x 548 x 622 mm Sysmex Servis Yetkilisi ve uzaktan erişim ile isteğe bağlı SNCS Tasarım ve özellikler gelecekteki ürün gelişimlerine bağlı olarak değişiklik gösterebilir. Değişiklikler, yapıldıkları tarihe bağlı olarak yeni dökümanlarda yer almak suretiyle ve doğrulama yapılarak onaylanır. Copyright 215 Sysmex Europe GmbH Türkiye Distribütörü: Sysmex Turkey Diagnostik Sistemleri Ltd. Şti Rüzgarlıbahçe Mah. Şht. Yzb., Sinan Eroğlu Cad. No:6, Akel İş Merkezi A Blok Kat -5, Kavacık Beykoz, İstanbul, Türkiye Telefon +9 216 681 66 Fax +9 216 68 6 info@sysmex.com.tr www.sysmex.com.tr Yetkili temsilci: Sysmex Europe GmbH Bornbarch 1, 22848 Norderstedt, Almanya Telefon +49 4 52726- Fax +49 4 52726-1 lifescience@sysmex-europe.com www.sysmex-europe.com Üretici: Sysmex Corporation 1-5-1 Wakinohama-Kaigandori, Chuo-ku, Kobe 651-73, Japonya Telefon +81 78 265-5 Fax +81 78 265-524 www.sysmex.co.jp www.sysmex-europe.com/contacts adresi üzerinden yerel Sysmex temsilcinize ulaşabilirsiniz. ZE547.TR.N.12/15