.Ü. Cerrahpafla T p Fakültesi Sürekli T p E itimi Etkinlikleri Kanama ve Tromboza E ilim Sempozyum Dizisi No: 36 Kas m 2003; s. 37-60 Trombosit Fonksiyon Bozukluklar ve Vasküler Nedenli Kanamalar Doç. Dr. Tiraje Celkan Vasküler yada trombosit nedenli kanamalar n ço unda trombositlerin say lar nda azalma saptan r. Ancak klinik olarak trombositopeniler gibi petefli, purpura, kolay morarma, özellikle mukozalardan hafif-orta fliddette kanamaya neden olan durumlar n çok az nda trombosit fonksiyon bozukluklar saptan r. Trombosit fonksiyon bozukluklar n incelemeden önce trombosit ve normal fonksiyonlar n hat rlamak yerinde olur. Trombositler 2-5 µ çap nda 5-7 µ 3 hacminde kemik ili inin en büyük hücreleri olan megakaryositlerden meydana gelen ve periferik kandaki en küçük hücreler oldu u için kan pulcuklar ad ile de an lan çok fonksiyonlu hücrelerdir. Bir megakaryositten ortalama 1500-2000 (500-4000) trombosit oluflmaktad r. Trombosit eskiden membran, hyalomer ve granulomer adl üç bölümde incelenirken morfolojik s n flama art k fizyolojik fonksiyonlar na göre üçe ayr larak incelenmektedir. 1. Kabuk (sitoskeleton) ya da Periferik Bölüm: Bu bölüm plazma membran ve aç k kanallar sisteminden (OCS, open canalicular system) oluflur. 2. Sol-gel Bölümü: Daha merkezde bulunan bu k s m trombosit sitoplazmas ve kontraktil protein olan aktin a ndan oluflur. 3. Organeller Bölümü: Çeflitli trombosit granülleri, mitokondri, lizozom ve peroksizomlardan oluflur. Trombositler içinde tüm aminoasidler bulunur. Trombositlerin çekirde i olmad halde bu aminoasidleri kullanarak protein sentezleyebilir. Protein sentezinin mitokondrial nükleik asitler sayesinde gerçekleflti i düflünülmektedir. Trombositlerin membranlar sialik asidden zengindir. Bu trombosit yüzeyine (-) elektrik yük kazand rmaktad r. Yüzeydeki sialik asid nörominidaz gi- 37
Tiraje Celkan bi enzimlerin etkisiyle azal nca, negatif yükte de azalma sonucunda aggregasyon bafllar. Damar endotelinde hasar oldu unda önce damar düz kaslar nda vazokontraksiyon olur ve normalde dolafl mda disk halinde bulunan trombositler biraraya gelerek trombosit t kac n oluflturur; buna primer hemostaz denilir (fiekil 1). A. Hasar B. Tr. t kac C. Fibrin a D. Sa lam p ht E. Tamir fiekil 1. Damar hasarlanmas na cevap olarak t kaç oluflumu 38
Trombosit Fonksiyon Bozukluklar ve Vasküler Nedenli Kanamalar Dense body (δ-granül) Agonistler ADP ATP Serotonin Kalsiyum Sitoplazma α-granül Lizozom Lizozom enzimleri Sitoplazmik faktörler Faktör XII PDECGF Adezyon proteinleri Fibrinojen Fibronektin vwf Trombospodin Vitronektin Büyüme faktörleri PDGF TGFβ Trombosit faktör 4 Trombospondin 1. Dense (Kaba) granül: δ granül çlerinde ADP, ATP, serotonin, kalsiyum ve pirofosfat vard r. 2. Alfa granüller α granül: Trombosit ve plazmada bulunan bir çok protein içerir. 3. Lizozomlar λ granül: Asit hidrolazlar bulundurur. 4. Mikroperoksizomlar: Peroksidaz aktivitesi içerirler. Koagülasyon faktörleri Faktör V HMWK CI INH Fibrinojen Faktör XI Protein S PAI-1 fiekil 2. Trombosit içi granüllerin içerikleri Bu olay endoteldeki zedelenme sonucunda subendotelden aç a ç kan adezyon proteinlerine trombositlerin ba lanmas ile gerçekleflir. Trombosit yüzeyinde, adezyon molekülleri ailesinde integrinler alt s n f na dahil olan, çok say daki glikoproteinler reseptör görevi görürler Tablo 1. Trombositin GP Ib/IX kompleksi ile subendotel dokuya ba lanmas s ras nda vwf köprü görevi görür. Önce trombositlerde ki kontraktil sistem aktive olur ve aktin kas l r, psödopodlar n uzat r, bu s rada hücre içindeki organeller ortaya toplan r. Bu s rada aktin demetlerinden oluflan psödopodlar daha da uzar. Aktin trombosit aggregatlar n stabilize eder ve adezyonu h zland r r. Normal trombositler içinde 4 çeflit granül bulunur (fiekil 2). 39
Tiraje Celkan Tablo 1. Trombosit granülleri ve içerikleri 1. Dense Body: ATP, ADP, serotonin, kalsiyum, fosfat, guanin nükleotid 2. Alfa Granüller: a. Enzimler: α1 antitripsin α2 makroglobulin α2 antiplasmin C1-esteraz inhibitörü b. Adezyon proteinleri: Fibrinojen Fibronektin VWF Trombospondin Vitronektin GP IIbIIIa P-Selektin c. Büyüme faktörleri: PDGF (Platelet Derivated Growth Factor) TGFβ (Transforming Growth Factor β) Epidermal Growth Factor Endotelial Growth Factor d. Sitokin benzeri proteinler: IL 1 CD 40 Ligand PF4 (Trombosit faktör 4) β-tromboglobulin (BTG) e. Koagülasyon faktörleri: HMWK Plazminojen PAI-1 Faktör V Faktör XI Fibrinojen Pr. S 3. Lizozomlar: β Galaktosidaz β Glukuronidaz α arabinosid N-asetil glukozamidaz Elastaz Kollejenaz Katepsin Trombositin uyar lmas sonucunda merkezde toplanan bu granüllerin membranlar, hücre membran ile ba lant l aç k kanal sistemi ile birlefltikten sonra granül içindeki maddeler ortam d fl na at l r (fiekil 3). Bu s rada trombosit membran ndan araflidonik asit, hücre içinden de prostaglandin sal n m da gerçekleflir. Granüllerden sal n m sonras nda aç a ç kan ADP, Ca, serotonin, pirofosfat, lizozom ve koagülan protenlerin etkisi ile çok say da trombosit ha- 40
Trombosit Fonksiyon Bozukluklar ve Vasküler Nedenli Kanamalar sar bölgesinde toplan r ve aralar nda çapraz ba lar oluflturur. Bu s rada en aktif molekül GP IIbIIIa adl integrindir. Bu kez köprü görevini fibrinojen üstlenir ama vwf de reaksiyona kat labilir. Trombositlerin oluflturdu u bu t kaç güçlü olmad için plazmada inaktif flekilde bulunan p ht laflma proteinlerinin aktifleflmesi sonucunda oluflan fibrinle sa lamlaflmal d r. Faktörlerin aktifleflmesini bafllatmak için gerekli olan trombin ve enzim komplekslerinin toplanmas için gerekli olan yüzey aktive olmufl trombositler taraf ndan sa lan r. Trombositin bu aktivitesi Trombosit Faktör III olarak bilinir. Normal diskoid yap aktivasyon Aktivasyonla flekilde de iflme kollar nda uzama flekilde de iflme rreversibl olarak de iflim, kollarda daha belirgin uzama fiekil 3. Trombosit aktivasyonu ve de iflimi 41
Tiraje Celkan Dolafl mdaki trombositler Adezyon bozukluklar Adezyon yapm fl trombositler Sal n m yetersiz Aggregasyon bozukluklar (Trombasteni) Aggrege olmufl trombositler Trombopati Trombosit Faktör III fiekil 4. Trombosit fonksiyon bozukluklar n n fizyopatolojisi Tablo 2. Kalitatif trombosit bozukluklar n n trombosit içi görevlerine göre s n flamas A. Glikoprotein Bozukluklar 1. Gp IIbIIIa eksikli i: Glanzmann Trombastenisi: (CD41/61) α IIBβ3 2. GP Ib, IX ve V eksikli i: Bernard Soulier : (CD 42b,c) (CD42, a) 3. GP Ib eksikli i: Trombosit Tip ya da pseudo vwf: (CD 42b, c) 4. GP Ia, IIa eksikli i: (CD49B/CD29)(α2β1) 5. GP IV eksikli i: (CD36) 6. GP VI eksikli i B. Anormal Membran-Sitoskeleton liflkisi WAS proteinin aktin proteini aktiflefltirmesi C. Granül Anormallikleri 1. Granül Bozuklu u 2 α ve α granül Bozuklu u 3. Gri trombosit hastal (α granül depo hastal ) 4. Trombosit Quebec D. Trombosit Koagülan Aktivite Bozukluklar E. Sinyal leti ve Sal n m Bozukluklar 1. Araflidonik Asit ve Tromboksan üretim bozukluklar 2. Fosfolipaz C, Ca mobilizasyon ve Ca cevap bozukluklar 3. Trombosit reseptör agonist ve sinyal ileti bozukluklar 42
Trombosit Fonksiyon Bozukluklar ve Vasküler Nedenli Kanamalar Trombosit fonksiyon bozukluklar denildi inde adezyon (yap flma), aggregasyon (toplanma), sekresyon (sal nma) ya da prokoagülan aktivitenin oluflum aflamalar ndan her hangi basamaktaki bozukluk ifade edilmektedir (fiekil 4). Bu ya kal tsal ya da edinsel olabilir. Trombosit aggregasyonu 1. dalga ADP ile çizmiyor kollagen ristosetin Trombasteni 2. dalga kollagen ve ADP ( ) ristosetin (+) Arafl. asit agg. bak Kollagen, ADP (+), Ristosetin ( ) Fak VIII agg. N A N Anormal vwd BS SPD Endoperosit analog agg. TP N A Siklooksijen az ASA Nükleotid içeri i TxA2 Ca flux boz SPD fiekil 5. Trombosit aggregasyon testlerinin yorumu için algoritm (N: normal, A: Anormal, SPD: Depo havuz hastal, TxA2: Tromboksan A2, ASA: Asetil salisilik asit) 43
Tiraje Celkan TANIDA LABORATUAR Trombosit fonksiyonlar n de erlendirilmesinde birçok yöntem ve test vard r. Ancak bu testler hem pahal hem de zahmetli testler olup, en basit ve ucuzundan bafllanarak en komplike olana do ru tercih edilmelidirler. Tablo 3. Trombosit fonksiyon testleri Periferik kan yaymas Trombosit say s Ivy- Mielke yöntemi ile in vivo kanama zaman Rumpel-Leede testi MPV Ortalama trombosit hacmi Aggrogometre Tam kan Aggrogometresi RPFA (Rapid Platelet Function assay) Kratzer Born yöntemi ile in vitro kanama zaman Luminometrik olarak salg lama reaksiyonlar Sekresyon markerlar (BTG, PF4) Trombosit spesifik eicosanoid metabolitlerinin ölçümü Flow Sitometrik ölçümler P ht retraksiyonu Tromboelastografi 1. Mutlaka testin nitelikli yap ld ndan emin olunmal d r. P ht laflma testleri yap l rken test sonuçlar n olumlu yada olumsuz yönde etkilieyen bir çok faktör vard r. Antikoagülan tip ve miktar, bileflenlerin ph s, s s, tüplerin cam ya da plastik olmas, aggrogometrideki dönme h z, trombosit say s ve yo unlu u, fibrinojen düzeyi, hemoliz varl ve eritrosit kontaminasyonu, lipemi ve venöz kan al m yöntemleri bunlardan bir kaç d r. Sa l kl bir tan için kan alma, tüp özellikleri, al nan kan n transferinin istenilen flartlar sa lad ndan emin olunmal en ufak bir flüphede test mutlaka tekrarlanmal d r. Trombosit fonksiyon testlerinin incelenmesi s ras nda antikoagülan olarak heparin ve EDTA tercih edilmemelidir. Genellikle 0.1 M sitrat 1/9 oran nda önerilmektedir. Trombosit fonksiyon testleri için al nan kan mutlaka 37 C s da ve ph (7,2-7,4) olmal, so uk temas olmamal d r. Oysa p ht oluflumunun baz al nd PT ve PTT için ya normal s yada transport s ras nda erimifl buz içinde tutulmal d r. So uk labil prokoagülan faktör V ve VIII in aktivitesini stabilize ederken faktör VII yi de aktive ederek hatal sonuca neden olur. Test iki saat içinde ya- 44
Trombosit Fonksiyon Bozukluklar ve Vasküler Nedenli Kanamalar p lmal d r, süre daha uzayacaksa tüp santrifüj edildikten sonra plastik pipetle baflka tüpe al n p -20 C de 2 hafta, -70 C de 6 ay saklanabilir. Test için kan tercihen 19-20 nolu i ne ucu ile plastik enjektöre al nmal çift i ne uçlu ve vakumlu tüp kullan lmamal d r. Trombositopeni olmad ndan emin olunmal ve fonksiyon bozuklu u ile beraber olan trombositopeni varl incelenmelidir. Trombositlere ba l kanamalar n ço u trombositopenilere ba l oldu u için trombosit fonksiyon testleri yap lmadan önce mutlaka trombosit say s ve formül yap lmal d r. Kanama nedeni olarak kal tsal trombosit fonksiyon bozukluklar çok nadir saptan r. Kazan lm fl trombosit fonksiyon bozukluklar ise daha s kt r. Baz nadir hastal klarda hem fonksiyon bozuklu u hem de trombositopeni birlikteli i incelenmelidir (WAS, gri trombosit hastal, BS). 2. Kanama Zaman basit ucuz ama de erli bir testtir. Trombosit adezyon ve aggregasyon bozukluklar n n iyi bir göstergesidir. Ayr ca C vit eksikli inde ve vaskülitik hastal klarda da KZ uzar. ntra kapiller bas nç sabit tutulmas amac yla ön kola 40 mmhg bas nç uygulan r ve antekübital sahaya yak n ön kol iç yüzünde 5 mm uzunluk ve 1 mm derinlikte bir kesi genellikle lansetle yap l r. Kesi ile ayn anda zaman tutulmaya bafllan r ve her 30 sn de yara dudaklar na de memeye özen göstererek kurutma ka d ile sadece kan temizlenir. Normal s n rlar 2-9 dakikad r. Trombosit say s 100000/mm 3 alt na indi inde kanama zaman nda uzama görülür. Öyküde ilaç al m mutlaka sorgulanmal d r örne in tek doz aspirin al m KZ de normale göre %50 uzama yapar. Kanama zaman n uzatan nedenler: 1. Trombositopeniler 2. Herediter ve akiz trombosit fonksiyon bozukluklar 3. vwf eksikli i 4. Afibrinojemi ya da disfibrinojemi 5. Vasküler hastal klar d r. Trombosit fonksiyon testleri: Aggregometri ve Lumiaggregometri Trombositlerin aggregasyonunu ölçmek için planlanm fl tam kan veya trombositten zengin plazma (PRP platelet rich plazma) ile gerçeklefltirilir. Kan al m ndan sonra test öncesinde 30 beklenilmeli (bu s rada trombositler fonksiyon kazan rlar) ve mutlaka 3 saat içinde test tamamlanmal d r. Test için kontrol ve hasta örnekleri al narak 37 C da 10 inkubasyon kuyular nda test 45
Tiraje Celkan Transillüminasyon 100 50 kincil aggregasyon 0 Primer aggregasyon Aggregan 5 10 Dakika Normal aggregasyon fiekil 6. Trombosit fonksiyon bozukluklar n n fizyopatolojisi öncesi bekletilir. Alet 800-1200 rpm ile dönerek trombositlerin süspansiyon halinde kalmas n sa lar. Daha sonra agonist (aggregan ajan) kar fl ma konularak reaksiyon bafllat l r. Aggregasyon 6-10 da tamamlan r. Aggregometre PRP ile yap lacaksa özel fotometre kullan l r. Yaklafl k olarak örnek içinde 300X10 9 trombosit olmas istenildi inden gerekirse PPP (platelet poor plazma) ile kar flt r l r. Sonra örnekten beyaz fl k geçirilir. Geçen fl k bir fl k toplay c da topland nda agonist eklenmeden önce geçifl %0 d r. Örne e agonist eklendikten sonra fl k geçirmesi de erlendirilir. Agonist eklendi- inde trombositler önce diskoid yap dan sferik hale döner ve aggregasyon olur böylece fl k geçirmesi artar. Aggregometre tam kan ile yap lacaksa önce tam kan salinle dilue edilir ve süspansiyon içine paralel 2 elektrot konulur ve küçük bir elektrik ak m oluflturuldu unda aggregasyon oldukça elektrotlar üzerinde trombosit birikti i için ak m gücü de iflir. Ak m gücündeki de ifliklik direkt olarak aggrege olan trombosit say s ile do ru orant l d r. Bu yöntemle PRP haz rlanmas na gerek yoktur. Lumiaggregometri Lumiaggregometri trombositlerin hem aggregasyonlar n hemde sekresyonlar n ölçmek için kullan l r. Konvansiyonel aggrogometriden ufak bir de- 46
Trombosit Fonksiyon Bozukluklar ve Vasküler Nedenli Kanamalar Transillüminasyon 100 Aggregasyon ATP sal n m 3.0 µm 50 Sal n m 1.5 µm 0 Aggregan 5 Dakika 10 0 fiekil 7. Normal Lumiaggregometri e risi iflikli i vard r. Bu yöntemde dense granüllerden sal nan ATP Firefly Luciferin ile reaksiyona girerek bir kimyasal fl ma verir. Oluflan fl k emisyonu saptan p amplifiye edilerek aletle yazd r l r. Lumiaggregometrede hem tam kan hem de PRP kullan labilir. Örne e önce ATP sonra luciferin eklenir yada önce luciferin sonra agonist eklenir. Agonist sonradan eklenildi i zaman sekresyonda de erlendirilmifl olunur. Trombin ilk kullan lan ve en güçlü agonisttir. Prostaglandin ve siklooksijenaz yola ndan ba ms z olarak sekresyon sa lar. Di er agonistlerle ancak trombinin %50 si oran nda sal n m elde edilebilir. Tablo 4. Trombosit agonistleri ve yolaklar Agonist Konsantrasyon Yolak 1. Trombin 0,3Ü/ml direkt sal n m 2. ADP 10 µm GPIIbIIIa 3. ADP 5 µm ADP sal n m 4. Epinefrin 10 µm ADP sal n m 2 µm 5. Kollajen 5-10 µg/ml membran fosfolipaz 6. Araflidonik Asit 1mM siklooksijenaz 7. Ristosetin 1mg/ml agglutinasyon 47
Tiraje Celkan HERED TER TROMBOS T FONKS YON BOZUKLUKLARI 1. Trombosit-agonist iliflkisi bozukluklar : Reseptör bozukluklar Adrenalin reseptör bozukluklar Kollajen reseptör bozukluklar Tromboksan A2 reseptör bozukluklar 2. Trombosit-damar duvar iliflkisi bozukluklar : Adezyon = yap flma bozukluklar VWH Bernard-Soulier Sendromu 3. Trombosit-trombosit iliflkisi bozukluklar : Aggregasyon = Kümeleflme bozukluklar Afibrinojemi Trombasteni (Glanzmann) 4. Trombosit salg lama bozukluklar a. Depo havuz hastal : δ granül α granül: Gri trombosit hastal α δ granül b. Kaba (dense) granül hastal klar May-Hegglin (albinism) Hermasky-Pudlak sendromu Chediak-Higashi, TAR sendromu c. Araflidonik Asit Yola bozukluklar Araflidonik Asit salg lanmas nda bozukluk Siklooksijenaz eksikli i Trombaksan yap m bozukluklar De iflmifl nükleotid metabolizmas Glikojen depo hastal klar Fruktoz 1-6 difosfanat eksikli i 5. Normal granül deposu ve Tromboksan sentezi olan primer salg lama bozukluklar Kalsiyum mobilizasyon bozukluklar Fosfaditilinositol metabolizma bozukluklar Myosin fosforilasyon bozukluklar 48
Trombosit Fonksiyon Bozukluklar ve Vasküler Nedenli Kanamalar 6. Trombosit-Koagülan protein iliflkisi bozukluklar Trombosit yüzeyi ve Va ve Xa iliflkisi bozukluklar 7. Trombosit Faktör III eksikli i (Alport Sendromu) 8. Vasküler yada Konnektif doku bozukluklar Ehlers-Danlos Pseudoksantoma elastikum Marfan Sendromu Osteogenesis imperfekta Herediter hemorajik telenjiektazi (Osler-Weber- Rendu) TROMBOS T ADEZYON BOZUKLUKLARI Bernard-Soulier Trombositler üzerinde vwf 2 ayr reseptöre ba lan r. Ristosetin varl nda sialik asitten zengin GP Ib ye ba lan r. Bu reseptör ana adezyon reseptörüdür. Ayr ca trombositler uyar ld nda vwf GPIIbIIIa ya da ba lanabilir. Bernard- Soulier sendromlu olgular n GP Ib ekspresyonu yoktur. GP Ib membranda GP IX ve GPV ile ba lan r. Bu glikoproteinlerin eksikli- i sonucunda da normalde yüksek affiniteli trombin ba lanmas gereken trombositlerin aggregasyon h zlar azal r ama aggregasyon düzeyi azalmaz. Hasta trombositler Faktör V ve XI i ba layamaz ve kollajene ba l koagülasyon oluflamaz. Periferik kan yaymas nda normalden daha düflük say da ve normalden büyük trombositlerin varl yan nda flow sitometrik olarak CD42 ( GPIb/IX) özelli i saptanmamas tan koydurucudur. Trombositopeni düzeyi de iflkendir. Ayn hastada bile farkl l klar gösterebilir. Trombositlerin ço u (1/3 ünden fazlas nda trombosit çap 3.5 mikrondan büyüktür) normalden büyüktür boyut olarak lenfosit büyüklü ünde hatta daha büyük trombositler saptan r. Elektron mikroskopisinde trombosit membran n n normalden daha fazla deforme olma yetene i oldu u gösterilmifltir. KZ uzun, p ht retraksiyon ve ristosetin ve trombin haricindeki agonistlerle trombosit aggregasyonu normaldir. VWH dan ay r c tan için testler ortama vwf eklenerek tekrarlan r; düzelme saptan rsa tan da vwh düzelme olmazsa Bernard-Soulier sendromu düflünülür. Glanzmann Trombastenisinde oldu u gibi çok zor durumda kal nmad takdirde olas alloimmünizasyonu engellemek için trombosit transfüzyonundan kaç n lmal d r. Menorajide oral kontraseptifler önerilmektedir. DDAVP 49
Tiraje Celkan ile de iflik sonuçlar bildirilmektedir. Durdurulamayan kanamalarda Faktör VIIa (Novo Seven) önerilmektedir. Bernard-Soulier hastal trombositopeni ve dev trombositlerin birlikte izlendi i May-Hegglin, Ebstein Sendromu, Montreal Trombosit sendromu, Fehtner Sendromu ve Trombopatik Trombositopeni gibi nadir görülen kal tsal trombosit hastal klar ndan ay rt edilmelidir. TROMBOS T AGGREGASYON BOZUKLUKLARI Trombasteni Glanzmann-Naegeli Hastal Otozomal resesif kal t lan bir kanama bozuklu u hastal d r. Homozigotlarda her çeflit kanama gözlenebilir. Heterozigotlar ise genellikle asemptomatiktir. Bu hastalarda ana bozukluk GPIIbIIIa eksik ya da hatal olmas d r. Bunun sonucunda aktive olan trombositlerde GPIIb IIIa heterodimerleri oluflamaz ve trombosit fibrinojen ba lanmas yetersiz düzeyde ya da hiç gerçekleflemez. Trombosit aggregasyonu olmamas trombosit TFIII sal n m n n da az olmas - na neden olur. Trombosit içi granüller ve içindeki maddeler normaldir. Trombositte bulunan fibrinojen d fl di er katyonik proteinler (F XII, Ig G ve M) F XI ve plazminojen normal aktivitesini tam bafllatamazlar. Baz hastalarda trombosit alloantijeninde (PLA-1 ve Zwa) ve Lek-a antijen yoklu u tan mlanm flt r. Tan KZ uzamas ile beraber ADP, kollajen, epinefrin, trombin ve di er agonistlerle aggregasyon olmamas ile konulur. P ht retraksiyon testinin de bozuk bulunmas tan y destekler. Adezyon, flekil de iflikli i ve sal n m reaksiyonlar genellikle normaldir. Nadiren sal n m fonksiyonunda hafif anormallik saptanabilir. Trombosit say s normal ancak antikoagülans z yap lan periferik yaymada trombositlerin küme yapmad klar ve da n k durduklar dikkat çeker. Ayr ca flow sitometrik olarak trombositlerde CD 41/CD61 eksikli i saptanabilir. ki tipi vard r. Birinci tipte p ht retraksiyonu yoktur ve GP IIb IIIa belirgin azalm flt r, fibrinojen granül içinde ya da membrana ba l olarak bulunmaz. Alfa granül içinde bu hastal kta fibrinojen bulunmamas ; granül içi fibrinojen depolanmas için GPIIbIIIa ya gereksinim oldu unu göstermektedir. kinci tipte p ht retraksiyonu ve GP IIb IIIa vard r ancak normalin alt ndad r. Tedavi olarak özel bir yöntem bulunmamaktad r. Steroidlerin tedavide yeri yoktur. Çok zorda kal nmad kça trombosit transfüzyonlar ndan kaç n lmal d r. Çünkü her trombosit transfüzyonu ile birlikte oluflabilecek otoantikorlar transfüze edilen trombositlerde de trombastenik bozuklu a neden olabilir. To- 50
Trombosit Fonksiyon Bozukluklar ve Vasküler Nedenli Kanamalar pikal koagülan ve antifibrinolitikler yarar sa lamaktad r (Transamin ampül ve kapsül formlar ve surgey cell vb). Herediter Afibrinojemi Faktör eksikliklerinden farkl olarak t pk vwf eksikli inde oldu u gibi KZ uzun bulunur. Aggregasyon için fibrinojene gereksinim oldu u için trombosit aggregasyon testleri düflük dozlarda bozuktur. Ayr ca trombositlerin cama adezyonu da bozuktur. TROMBOS T SALINIM BOZUKLUKLARI Bu grup hastalarda trombositlerin adezyon ve aggregasyonu normaldir ancak granül içi maddeleri salg l yamad klar gibi bazende PG, PAF, TX A2 gibi mediatör sal n m da bozuk olabilir. Bu hastal k grubu 1. Depo havuz hastal (Granül eksiklikleri) 2. Anormal Sal n m Mekanizmas na ba l bozukluklar olarak ikiye ayr - larak incelenmektedir. I. Depo havuz hastal (Granül eksiklikleri) Gri trombosit hastal = alfa granül hastal Otozomal dominant kal t ld düflünülmektedir. Trombositlerin alfa granüllerinde TF4, BTG, fibrinojen, vwf, fibronektin içerikleri belirgin azalm flt r. Plazmada BTG ve TF4 artm fl saptanabilir. Bu hastalardaki kemik ili i fibrosisinin nedenide granüllerde depolanamad için plazmada yüksek saptanan BTG ve PDGF oldu u düflünülmektedir. Klinik olarak hafif bir kanama e ilimi vard r. Tan da KZ uzam flt r ve hafif orta derece trombositopeni olabilir (25-150 X 10 9 ): Ana özellik periferik kan yaymas nda trombositlerin hayalet görüntüsü denilecek kadar soluk gri renkte görülmesi ile konulur. Trombosit fonksiyon testlerinde trombine cevap yoktur, kollajene ise az ya da yoktur; di er agonistlere normal ya da normale yak n cevap vard r. Tedavide ancak çok ciddi kanamalarda trombosit transfüzyonu verilir. Desmopressin asetat (DDAVP) infüzyonu yarar sa layabilir. DDAVP 0,3 µg/kg 50 ml serum fizyolojik içinde 30 infüzyonla verilebilir. Dense (kaba) Granül Eksikli i Hastal =Delta granül hastal Trombositlerde sekresyonun bafllamas yla beraber kaba granüllerden sal - n m olur. Özellikle ADP primer trombosit cevab n n yay lmas ve t kac n büyümesinde etkilidir. 51
Tiraje Celkan Baz olgularda albinizm vard r. Orta veya hafif derecede kanama e ilimi gözlenir. KZ genellikle uzun ve trombosit aggrogometresinde ADP, epinefrin ve düflük konsantrasyonlu trombinle yap lan uyar mlarla aggregasyonun 2. dalgas oluflmaz. Düflük dozda kollajen cevab az yada yokken yüksek dozla normal yada normale yak n e ri elde edilir. Trombositlerin kollajene cevap olarak PG, Tx sentezi bozuk ve PG endoperoksitleri ile aggregasyon azalm flt r. Tedavide özellikle aspirin ve benzeri antiaggregan ilaçlardan sak n lmal DDAVP ile iyi sonuçlar bildirilmektedir. Kriyopresipitat infüzyonundan fayda görülmektedir. Bu düzeltici etkinin kriyopresipitatta yüksek oranda bulunan vwf yan nda içerdi i mikrotrombosit partiküllerine ba lanmaktad r.çok nadiren trombosit transfüzyonuna gerek duyulur. Bu tip olgularda cerrahi öncesi k sa süreli steroid kullan m n n cerrahi s ras nda kanama riskini azaltt - n belirten literatürler vard r. Hermansky-Pudlak, Chediak -Higashi, Wiscott Aldrich, TAR, Ehlers Danlos ve Osteogenesis Imperfecta Sendromlar nda Kaba granül eksikli i vard r. Ayr ca alfa ve delta granül eksikli inin birlikte oldu u sendrom yan nda Quebec trombosit sendromu da granül eksikli i hastal klar içinde incelenmektedir. II. Anormal Sal n m Mekanizmas na ba l bozukluklar Otozomal dominan kal t l r. Bu grup hastal klarda granüller normal olmas na ra men sal n mlar bozulmufltur. Aggrogometrede aspirin etkisine benzer anormallikler elde edilir. Ya sinyal iletisi yada trombosit içi metabolik yolaklardan birisinde bozukluk vard r (Siklooksijenaz, TX A2, fosfaditil inositol, aroflidonik asit yolaklar ). Klinik olarak a r kanama nadirdir, aspirin al m sonras belirgindir. KZ ayn hastada bile zaman zaman de ifliklik gösterir, trombosit say ve p ht retraksiyonu normaldir. Genellikle trombositler normalden küçüktür. Normal konsantrasyonda ADP, kollajen ve epinefrin ile aggregasyon bozuktur. Yüksek doz ADP ile ise aggregasyon normaldir. Epinefrin ve ristosetinle ise 2. aggregasyon dalgas izlenmez. Tan konulurken aspirin ve benzeri ilaçlar n al nmad ndan emin olunmal d r yoksa her iki durumda da benzer aggrogometrik e riler elde edilir. Tedavide DDAVP, steroid etkilidir. Steroidin trombasteni ve aspirin alanlarda kanama zaman n düzeltici etkisi yokken bu grup hastalarda 3 gün steroid kullan m sonras nda ortalama 1 hafta KZ normale yak n seyredebilir. 52
Trombosit Fonksiyon Bozukluklar ve Vasküler Nedenli Kanamalar ADP Epinephrine Collagen Arachidonate Ristocetin GT $NR B$R vwd, BSS Normal fiekil 8. Çeflitli hastal klarda trombosit fonksiyonlar ve agonistler aras ndaki iliflki (GT: Glanzmann Trombastenisi, PRD: trombosit sal n m bozukluklar, SPD: Depo havuz hastal, vwd: von Willilbrand hastal, BSS: Bernard-Soulier hastal ) B. ED NSEL TROMBOS T FONKS YON BOZUKLUKLARI 1.Sistemik Hastal klar Üremi Antiplatelet antikor varl Kardiopulmoner bypass Di er nedenler (kronik karaci er hastal klar, yayg n damar içi p ht laflmas (YDP), saman nezlesi ve atopik ast m, akut solunum yetersizli i, eosinofili ile seyreden nontrombositopenik purpura ve hyalüronik asit salg layan Wilms Tümörü) 2. Hematolojik Hastal klar Kronik miyeloproliferatif hastal klar Lösemi ve MDS Dis proteinemiler Kazan lm fl vwh 53
Tiraje Celkan 3. laçlar Aspirin ve di er non-steroidal antienflamatuar ilaçlar Antibiyotikler Thienopiridinler GPIIbIIIa antagonistleri Trombosit siklik nükleotid seviyesi ve fonksiyonlar n etkileyen ilaçlar Antikoagülan, fibrinolitik ve antifibrinolitik ajanlar Kardiovasküler ilaçlar Volüm geniflleticiler Psikotropik, anestezik ilaçlar ve kokain Onkolojik ilaçlar 4. Yiyecekler ve katk maddeleri Omega 3 den zengin dietler Çin yemekleri (siyah a aç mantar ) So an Sar msak (içerdi i ajoene maddesi) Baz baharatlar (kimyon) Edinsel trombosit fonksiyon bozukluklar fizyopatolojik nedenlere ba l s nfland r l rsa : 1. Vasküler ya da Konnektif Doku Bozukluklar C-Vitamin eksikli i (scurvy) Amiloid 2. Adezyon bozukluklar Kazan lm fl vwh Böbrek yetersizli i laçlar (dipridomol) 3. Trombosit Aggregasyon bozukluklar Fibrin veya fibrin y k m ürünleri varl : Karaci er hastal klar, YDP Makromolekül varl : Paraproteinler, dekstran laçlar: Penisilin, semisentetik penisilin, sefalosporinler 4. Salg lama Bozukluklar A. Depo Havuz Hastal α granül: Kardiyopulmoner bypass Kaba granül: ITP, SLE laçlar: Reserpine, trisiklik antideprasanlar, fenotiazinler 54
Trombosit Fonksiyon Bozukluklar ve Vasküler Nedenli Kanamalar B. Salg lama Bozuklu u Trombosit dispoezi: MDS, akut lösemiler, miyeloproliferatif hastal klar laçlar: Aspirin, non-steroidal anti-enflamatuar ajanlar, furosemid, nitrofuradantin Ethanol C. De iflmifl Nükleotid Metabolizmas laçlar: Fosfodiesteraz inhibitörleri Adenilsiklaz stimulatörlei 5. Di er laçlar: Heparin, sempatik blokerler, klofibrate, antihistaminikler Enfeksiyonlar: Viral Hipotiroidizm BÖBREK HASTALIKLARI VE TROMBOS T FONKS YON BOZUKLUKLARI Böbrek yetersizli inin tedavisinde dializin olmad dönemlerde böbrek hastalar n n %50 sinde kanama önemli bir bulgu ve %30 unda ölüm nedeni idi. Kanama genellikle deri, genitoüriner ve gastrointestinal bölgeden olur. Trombosit fonksiyonlar n n her aflamas nda -adezyon, aggregasyon ve prokoagülan aktivitesinde- patolojinin oldu unu gösteren çal flmalar yap lm flt r. Böbrek yetersizli i olan olgularda üre metabolitleri olan guinidosüksinik asitve hidroksifenolik asitler TF III aktivitesini bozar. Bu metabolitler dializle at ld için dializ sonras nda fonksiyonlarda düzelme saptan r. Ayr ca bu hastalarda mevcut olan a r aneminin de kanamay artt rd düflünülmektedir. fiekilli elemanlar n azalmas sonucunda defektli vasküler bölge ile trombosit iliflkisinin daha az oldu u, hemotokritin %30 un üstüne yükseltilmesi ile trombosit adezyon bozuklu unun azald gösterilmifltir. Adezyon bozuklu unu aç klamak için vwf ve GP Ib-IX düzey ve fonksiyonlar araflt r lm fl ve normal hatta vwf düzeyleri yüksek bulunmufltur. Trombosit aktivasyon sonras ancak vwf ve GP IIB IIIa interaksiyonu ve bunun sonras nda vwf ve GP Ib aras nda iliflki bafllar. Üremide trombosit aktivasyonunun ve dolay s ile adezyonun bozuldu u düflünülmektedir. Trombosit metabolizmas nda prostoglandin ve trombosit içi nükleotidleri bozulmufltur. Ayr ca kullan lan ilaçlar ve trombositopenide böbrek yetersizli inde ki kanama olas l n ve fliddetini artt r r. Trombositopeninin nedeni azalm fl kemik ili i yap m ve azalm fl yaflam süresi sonucudur. Özellikle dializ s ras nda kullan lan heparin ve β-laktam antibiyotiklerde kanamaya neden olur. Tedavide primer hastal n tedavisi ile birlikte dializ, DDAVP, konjuge östrojenler (0.6 mg/kg IV 5 gün kullan lmas ndan 72 saat sonra etki bafllar ve 55
Tiraje Celkan 5-7 günde maksimal etkiye ulafl r ve 14 gün etki sürer) trombosit, eritrosit ve kriyopresipitat transfüzyonlar kullan labilir. KARD PULMONER BYPASS VE TROMBOS T FONKS YON BOZUKLUKLARI Kardiak cerrahi s ras nda ekstrakorporal dolafl m uygulanan hastalarda çok çeflitli hemostatik bozukluklar izlenir. Ameliyat sonras nda masif kanama %5 oran nda saptan r. Kanama nedeni trombositopeni, trombosit fonksiyon bozukluklar ve hiperfibrinolizdir. Hipotermi, fibrinojenle kapl sentetik yüzeylerle ve ADP, trombin ve plasminle temas sonucunda trombosit fonksiyon bozukluklar izlenir. Riski azaltmak için ameliyat öncesinde kanama öyküsünün detayl al nmas ve hemostaz parametrelerine yönelik laboratuar incelemesi önerilmektedir. Tedavide böbrek hastal klar nda kullan lan yöntemlerin yan nda, proteaz inhibitörü aprotinin (Trasylol) kullan m öneren çal flmalar vard r. KARAC ER HASTALIKLARI VE TROMBOS T FONKS YON BOZUKLUKLARI Kronik karaci er hastal klar nda kanama nedeni çok çeflitlidir; azalm fl aggregasyon ve prokoagülan aktivite yan nda artm fl fibrinoliz sonucu oluflan FYÜ trombosit fonksiyonlar n bozar. Karaci er hastal klar nda yafll trombosit say s artar, bu trombositler hemostatik olarak daha az aktiftir. Karaci er hastal klar nda geliflen splenomegali sonucunda hipersplenizme ba l trombosit say s nda azalma saptan r. Defektif olan lipid metabolizmas sonucunda t pk eritrositlerin membranlar nda oldu u gibi trombosit membran yüzeyinde de fonksiyon de ifliklikleri oluflur. Trombosit aggregasyon testlerinde genellikle sekonder dalga oluflumunda defekt saptan r bazen de depo havuz hastal tipinde bozukluk izlenir. Kollajen, trombin, ristosetinle azalm fl aggregasyon ADP ve epinefrin ile sekonder aggregasyon dalgalar yoktur. Tedavide trombosit transfüzyonlar ve DDAVP kullan l r. Trombosit transfüzyonlar ile son dönem karaci er hastal n n en önemli bulgusu olan faktör V seviyesi düflüklü ü de belli ölçüde düzelir. Bunu trombosit içindeki granüllerde depo halinde bulunan faktör V sa lar. Kollajen doku hastal klar (romatoik artrit, SLE, skleroderma), akut ve kronik lösemi, disproteinemilerde, demir, folik asit ve B12 vitamin eksikli i anemilerinde de trombosit fonksiyon bozukluklar görülür. Ancak edinsel tipte trombosit fonksiyon bozukluklar nda herediter tipte olan fonksiyon bozukluklar nda saptanan n aksine tipik aggregasyon anormallikleri göstermezler. VASKÜLER BOZUKLUKLARA BA LI KANAMA HASTALIKLARI Damarlar adventisia, media ya da muskuler ve intima ya da endotel tabakas ndan oluflur. Arterlerin muskuler, venlerin ise adventisia tabakas kal nd r. Kapillerlerin ise muskuler tabakas yoktur, fibrosit, kollajen lif ve bazal 56
Trombosit Fonksiyon Bozukluklar ve Vasküler Nedenli Kanamalar membran içerirler. Damar endoteli hemoztazda çok önemlidir. Bir eriflkinde ortalama 3 kg olan endotelin art k bir sistem olarak kabul edilmesini öneren bilim adamlar vard r. Endotel vasküler bütünlü ü sa lad gibi bir çok bioaktif molekülünde sentez ve sal n m yeridir. Doku faktörü (TF), PAI, PAF, t- PA, u-pa, trombomodulin, Protein S, heparin benzeri molekül, PG, ATP, Endotel büyüme faktörü, anjiotansin, büyüme faktörleri CSF, PDGF bunlardan baz lar d r. Normalde endotelde lümene bakan k s mda bulunan glikozaminoglikanlar membran kayganl k ve bütünlü ünü sa lar. Endotelde hasar olufltu unda subendotel matrikste bulunan adezyon molekülleri ve trombosit etkileflimi olur ve koagülasyon tetiklenir. Bu s rada endoteldeki trombomodülinde trombinle kompleks yaparak antikoagülan mekanizman nda göreve bafllamas n sa lar bu sayede Protein C ve S aktifleflerek Fak Va ve Fak VIIIa n n etkisini bloke ederler. Vasküler bozukluklara ba l kanamalarda genelde trombosit ve koagülasyon mekanizmalar normaldir. Bu hastal klarda genellikle hematolojik bulgular yan nda di er sistem ve organlara ait bulgularda saptan r. VASKÜLER PURPURA A. Nonpalpable Purpura 1. Artm fl Transmural Bas nç a. Akut: Valsalva manevras, öksürük, kusma, do um, a rl k kald rma, emme b. Kronik: venöz staz c. Yüksek rak m 2. Azalm fl mekanik bütünlük ve destek doku a. Yafll l k purpuras b. Steroid fazlal ; Cushing sendromu ve topikal steroid kullan m c. Vitamin C eksikli i d. Anormal destek doku: Ehlers-Danlos sendromu ve psödoksantoma elastikum e. Kan damarlar n n amiliodle infiltrasyonu f. Hormonal: Kad nlarda daha fazla ekimoz görülmesi (Purpura Simpleks) g. MELAS sendromu 3. Travma a. Fiziksel: Hasarlanmalar, h rpalanm fl çocuk sendromu, b. Ultraviole fl nlar : Purpurik günefl yan, solaryum purpuras 57
Tiraje Celkan c. Enfeksiyöz d. Embolik: Tümörler, ya embolisi, e. Neoplastik f. Alerjik: Serum hastal, kontakt dermatit, disproteinemiler, piyoderma gangrenosum, inflamatuar hastal klar g. Toksik, kimyasal, böcek s r h. Trombotik: D C, Kumadine ve heparine ba l deri lezyonlar, protein C ve S eksikli i, purpura fulminans, antifosfolipid sendromu, paroksimal gece hemoglobinürisi i. laç iliflkili 4. Bilinmeyen Psikojenik purpura FMF hastal nda saptanan purpura B. Palpable Purpura 1. Kutanöz vaskülit a. Henoch-Schönlein b. Süt çocuklu unun akut hemorajik ödemi c. Kollajen vasküler hastal klar d. Sistemik vaskülit e. Hipersensivite vaskülitleri f. Embolik olmayan infeksiyöz vaskülitler g. Paraneoplastik vaskülit 2. Disproteinemiler a. Krioglobünemi b. Waldenström hiperglobunemik purpura c. Kriofibrinojemi 3. Primer Kütanöz hastal klar 4. Bilinmeyen Papüler Purpura (eldiven ve çorap sendromu) Bu grup hastal klarda kapiller frajilite testi pozitif bulunur. Endotel hasarlanmas sonucunda genellikle subendotel matrikste depolanmas gereken maddeler lümene geçer, bunlardan trombin, histamin ve vwf bir çok organda vasküler tromboz meydana getirir bu olay n kontroldan ç kmas ile D K oluflur. Purpura fulminanasda genellikle enfeksiyonlar n (meningokok ve suçiçe i en s k olarak) tetikledi i h zl ilerleyen deri nekrozu ve D K ile birlikte 58
Trombosit Fonksiyon Bozukluklar ve Vasküler Nedenli Kanamalar deriye olan kanamal tabloyu anlatmak için kullan l r. Ço unlukla altta yatan Protein C eksikli i saptanabilir. Mikroanjiopatik hemolitik anemi, genaralize petefli ve nörolojik bulgularla seyreden genellikle eriflkin hastal olarak bilinen trombotik trombositopenik purpura (TTP), etyolojisinin vwf cleaving proteaz aktivitesinde yada düzeyinde bozukluk oldu u son zamanlarda ortaya konulmufltur. Bu enzimin yetersizli i sonucunda ortamdaki büyük vwf multimerlerinin trombositleri aktiflefltirmesi söz konusudur. Tedavide plazma exchange, splenektomi, steroid ve IVIG denenmektedir. Kavernöz hemanjiom ve tüketim koagülopatisi olan hastalarda Kasabach- Merrit sendromundan bahsedilir. Tedaviside steroid, heparin ve p ht laflma faktörlerinin yerine konmas denenebilir. Herediter hemorajik telenjiektazi (Osler-Weber-Rendu) otozomal dominant geçiflli ve en s k epistaksis semptomu ile baflvuruya neden olan; vasküler yap da muskuler tabakan n kal nlaflt ama elastik liflerden yoksun oldu u bir hastal kt r. Ehlers-Danlos sendromu hipereksitabl deri ve eklemler yan nda kanama e ilimi olan bir hastal kt r. En s k tip III kollajen düzeyleri düflük olan Ehlers- Danlos tip IV de cilt, G S ve hemartroz fleklinde kanamalar görülür. Ayr ca Pseudoksantoma Elasticum, Marfan ve Osteogenezis mperfekta ve skorbütte kollajen sentez ve fonksiyonunda çeflitli aflamalarda bozukluklar neticesinde vasküler tipte kanama bozukluklar saptan r. Gardner-Diamond ya da otoeritrosit sensitizasyonu nadir bir hastal kt r. Hastalarda eritrosit membran na karfl otosensitizasyon geliflmifltir. Klinik olarak ekimoz yada kanama öncesi lokal yanma ve bazende s z vard r. 1. Non-Steroid Antienflamatuarlar Aspirin, sülfinpirazon, indometasin, ibuprofen, sulindak, naproksen, fenilbutazon, meklofenamik asit, mefenamik asit, diflunisal, piroksikam, tolmetin, zomepirak 2. Antibiyotikler Penisilinler, sefalosporinler, nitrofurantoin, mikonazol 3. Thienopiridinler Ticlopidine, klopidogrel 4. GP IIbIIIa Antagonistleri Abciximab, tirofiban, eptifibatide 5. Trombosit camp Düzey ve Fonksiyonlar n Etkileyen laçlar Prostasiklin, iloprost, dipridomole, 59
Tiraje Celkan 6. Antikoagülan, Fibrinolitik ve Antifibrinolitikler Heparin, steptokinaz, doku plazminojen aktivatörü, ürokinaz, α-aminokaproik asit 7. Kardiovasküler laçlar Nitrogliserin, isosorbit dinitrat, propronolol, nitroprussid, nifedipin, verapamil, diltiazem, kinidin 8. Volüm Geniflleticiler Dekstran 9. Psikotrop ve Anestezik Maddeler mipramin, amitriptilin, klorpromazin, prometazin, flufenazin, haloperidol Dibucain, tetrakain, metikain, cyclain, butakain, nuperkain, prokain, kokain, plaquanil, halotan 10. Onkolojik laçlar Mitramisin, daunorubisin, BCNU 11. De iflik laçlar Ketanserin, antihistaminikler - difenhidramin, klorfeniramin, mepiramin- Radyolojide kullan lan kontrast maddeler: opamidol, iotalamat, ioxalat, sodium ve meglumine diatrizoate 12. Yiyecek ve Katk Maddeleri ω3 ya asitleri, ethanol, Çinlilerin siyah a aç mantar, so an, ajoen, kimyon KAYNAKLAR 1. Coller BS, French DL. Hereditary qualitative platelet disorders. In: Beutler E, Lichtman MA, Coller BS, Kipps TJ, Seligsohn U eds. Williams Hematology. 6th Edition. McGraw-Hill, 2001; 1551-1581. 2. Shatt l SJ, Abrams CS, BennettJS. Acquired qualitative platelet disorders due to diseases,drugs and foods. In: Beutler E, Lichtman MA, Coller BS, Kipps TJ, Seligsohn U eds.williams Hematology. 6th Edition. McGraw-Hill, 2001; 1583-1602. 3. Schneiderman PI. The vascular purpuras. In: Beutler E, Lichtman MA, Coller BS, Kipps TJ, Seligsohn U eds. Williams Hematology. 6th Edition. McGraw-Hill, 2001; 1603-1616. 4. Ulutin O. The platelets. stanbul 1976; 217-253. 5. Lanzkowsky P. Manual of Pediatric Hematology and Oncology. 3th ed. San Diego: Academic Press 2000; 233-287. 6. Gawaz M. Blood Platelets. Stuttgart, New York: Thieme 2001; 42-57. 7. White MM, Jennings LK. Platelet Protocols. San Diego: Academic Press 1999; 28-80. 8. Southern D, Leclair SJ. Platelet maturation and function. In: Rodak BF. Diagnostic Hematology. Philadelphia: Saunders, 1995; 451-465. 9. Fristma GA. Laboratory evaluation of hemorrhage and thrombosis. In: Rodak BF. Diagnostic Hematology. Philadelphia: Saunders, 1995; 549-584. 60