Aspirin (=Asetil Salisilik asit)

HIZLANDIRILMIŞ STABİLİTE TESTİ Amaç: Değişik ph larda ve sıcaklıklarda asetilsalisilik asit in stabilitesini incelemek. Yöntem: Değişik ph larda ve sıcaklıklarda hazırlanmış su banyoları içinde bozunmaya bırakılmış etanol içinde aspirin çözeltisinin (0,6 mg/ml) 0, 30, 60 ve 90 ıncı dakikalarda alınan örneklerinin spektrofotometrik miktar tayini. Test edilecek sıcaklıklar 5, 35 ve 45 dereceye ayarlanmış su banyoları, asidite değerleri ise ph 1.45 Hidroklorik asit tamponu, ph 4.5 Nötralize ftalat tamponu, ve ph 10.35 Alkali borat tamponu. Renklendirme çözeltisi: Fe (III) Klorür, salisilik asit ile renkli çözelti verir ve bu renk şiddeti kolorimetrik olarak ölçülür. İşlem: Aspirin (-asetiloksibenzoikasit) zayıf asit yapıda bir bileşiktir ve kolayca hidroliz olarak Salisilik asit (-hidroksibenzoikasit) ve asetik asit ürünlerini verir. Deneyin esası oluşan salisilik asit miktarını kolorimetrik olarak tespit ederek aspirinin bozulmasını izlemektir. Aspirin (=Asetil Salisilik asit) Salisilik asit Etanolde hazırlanmış asetilsilisilik asit (6 mg/ml) stok çözeltisinden 5 ml alınarak ph 4,5 tamponu ile balon jojede 50 ml ye tamamlanarak hazırlanan çözeltiler 5 C, 35 C ve 45 C su banyolarına konulur. Fe (III) Klorir çözeltisinin 5 ml eklenerek köre karşı absorbans ölçümü yapılır. 30, 60, ve 90ıncı dakikalarda da alınan örnekler üzerinde bu işlem tekrarlanarak, sonuçlar tabloya geçirilir. Tablo değerleri üzerinde, belirlenen istatistiksel analizler yapılarak, ph 1.45 ve ph 10.35 tamponu içinde yapılan test sonucu çıkan istatistiksel veriler ile yine istatistiksel kıyaslamalar yapılır. Varılan sonuçlardan hareketle değişkenler olan ph ve Sıcaklığın Aspirin stabilitesi üzerine etkisi yorumlanır. Sonuçlar: ph 4,5 te ve belirlenen sıcaklıklarda belirtilen zaman aralıklarında yapılan kolorimetrik ölçümler sonucu bulunan absorbans değerleri tablosu (grup çalışması ortalaması alınmıştır): Absorbans (λ=540 nm) Zaman (Saat) 5 C 35 C 45 C t=0 ortalaması 0,00 0,00 0,008 t=0,5 ortalaması 0,00 0,010 0,038 t=1 ortalaması 0,018 0,038 0,090 t=1,5 ortalaması 0,04 0,095 0,15

İzlenen absorbanslar, Aspirinin bozunma ürünü olan salisilik asit in verdiği absorbanslardır. Başlangıç salisilik asit konsantrasyonu doğal olarak bozunma henüz olmaya başladığından 0 ya da çok yakın bir değer olacaktır. Salisilik asidin ph 4.5 tamponundaki kalibrasyon doğrusunun formülü y=63.76 x + 0.0588 Başlangıçtaki aspirin molar konsantrasyonu: Ağırlık konsantrasyonu 0,6 mg/ml 600mg /L 1 mol aspirin; 180 g olduğuna göre 0,6 g aspirin= 0,6/180 = 3,3 x 10-3 mol 0,6 mg/ml = 3,3 x 10-3 mol/l Aspirin in ph 4.5 tamponundaki kalibrasyon doğrusundan yola çıkarak, tablodaki absorbans değerlerini molar konsantrasyon a çevirelim. y = 63.76 x + 0.0588 denkleminde y yerine absorbans değerlerini koyup, molar konsantrasyonları bulduğumuzda, tablo aşağıdaki şekle gelmektedir. Salisilik Asit (mol/l) Zaman (Saat) 5 C 35 C 45 C 0-0,0001661-0,0001661-0,00019134 0,5-0,00014710-0,00018691-0,00007760 1-0,0001534-0,00007760 0,0001189 1,5-0,00006496 0,0001375 0,0003509 Yukarıda bulunan 0 ın altındaki sonuçlar, deneyin bu aşamasına kadar yapılan işlemlerde bir hata olduğunu açıkça göstermektedir. Salisilik asit için bulunan absorbans değerlerinden kalibrasyon doğrsu yöntemiyle salisilik asit derişimine geçtiğimizde negatif salisilik asit miktası görülmesi makul ve mantıklı değildir. Bunun olası sebebi spektrofotometre ile ilgili bir sorundur. Deney esnasında kullandığımız spektrofotometre oldukça eski tip bir cihazdı ve; yalnızca bir tane küveti vardı. Sürekli eski çözeltiyi döküp yenisini doldurmak suretiyle ölçümler yapılıyordu ve tüp boşaldıktan sonra tüpe bakıldığında açıkça ve kolayca tüpün renginde su ile durulamayla kaybolmayan bir kızıllık görülüyordu. Bu rengin kör ayarını bozarak diğer absorbsiyonların olması gerekenden düşük gözlenmesine neden olması kaçınılmazdır. Görünür bölge absorbsiyon spektrofotometrisi renk ve şiddetini ölçme esasına dayanan bir yöntem olduğu ve tüm ölçümler, aranan madde haricinde her şeyi içeren kör e karşı yapılması gerekirken, kör çözeltimiz tüp etrafında kistleşmiş olan renk yüzünden yeterli ve etkin bir sıfırlama yapamamıştır. Deneyin bundan sonraki kısımlarında varılacak sonuçlar bilimsellik açısından değersiz ve anlamsız çıkacaktır ancak, eğitimimize katkıda bulunması amacıyla ve deney sonuçlarını değerlendirme yeteneği kazanmak açısından rapora devam edilecektir. Aspirin in başlangıç konsantrasyonu 0,6 mg/ml, molar konsantrasyonu ise yukarıda da hesaplandığı üzere 3,3 x 10-3 mol/l dir. Aspirinin bozunma ürünün olan salisilik değişik sıcaklıklarda ve zamanlardaki derişimi de bilindiğinden, Yukarıdaki tablodaki derişimleri 3,3 x 10-3 mol/l den çıkartarak aşağıda görülen Aspirin derişim tablosuna ulaşılabilinir Aspirin (mol/l) Zaman (Saat) 5 C 35 C 45 C 0 0,00354994 0,00354994 0,0035467 0,5 0,00348044 0,003505 0,00341093 1 0,00348676 0,00341093 0,0031504 1,5 0,0033989 0,00319609 0,009815

Henüz yukarıdaki datalar bir şeyi açıkça göstermemektedir. Bu datalar, zamana bağlı çözeltide bozunmadan kalan aspirin miktarı tablosudur. Tabloyu daha rahat izlemek için bunu yüzde aspirin olarak tekrar düzenleyelim. Bunun için, (tablo dataları / 3,3 x 10-3 mol/l) x 100 formülünü kullandığımızda, aşağıdaki tabloya varılmaktadır. Aspirin (%) Zaman (Saat) 5 C 35 C 45 C 0 106,4983318 106,4983318 105,74006673 0,5 104,413108 105,60737034 10,378738 1 104,6066909 10,378738 96,45131938 1,5 101,9487418 95,886056 89,43736730 Tablo zamana karşı incelendiğinde zamana karşı bir azalma gözlenmektedir. Bu azalmanın nedeni zamanla aspirinin bozunarak salisilik asit e dönüşmesidir. Bu tablodaki azalma değerleriyle ve bunların logaritmalarıyla yapılan regresyon analizleri sonucunda elde edeceğimiz r değerleri parçalanmanın sıfırıncı derece mi yoksa birinci derece mi olduğuna karar vermemizi sağlayacaktır. Tabloları inceleyelim: Aspirin (%) Zaman (Saat) 5 C 35 C 45 C 0 106,4983318 106,4983318 105,74006673 0,5 104,413108 105,60737034 10,378738 1 104,6066909 10,378738 96,45131938 1,5 101,9487418 95,886056 89,43736730 r değerleri -0,93107478-0,94598614-0,9890844 r ² değerleri 0,866895959 0,88849147 0,97884041 Aspirin (Log %) Zaman (Saat) 5 C 35 C 45 C 0,073481,073481,043958 0,5,01875500,036943,00999395 1,0195477,00999395 1,98430817 1,5,00838187 1,98173990 1,95151901 r değerleri -0,930471986-0,93884491-0,985697316 r ² değerleri 0,865778117 0,88145 0,971599199 Tablo alt satırlarında görülen r değerleri Zamana karşı Aspirin (%) tablosunda, Zamana karşı Aspirin (Log %) tablosuna göre daha büyüktür. Aspirin yüzdesi azalışındaki doğrusallık, aspirin yüzdesinin logaritmasındaki azalmaya göre daha doğrusaldır. Buda bize, aspirinin zamanla bozulmasının konsantrasyona bağımlı bir hızda olmadığını göstermektedir. Dolayısıyla datalardan izlenene göre sıfırıncı derece kinetiğine göre parçalandığı sonucuna ulaşılır. Sözkonusu tabloyu, grafik haline getirir isek, zamana bağlı aspirin miktarındaki değişimi daha iyi izleyebiliriz.

108 Zamana Karşı Değişmeden Kalan Aspirin yüzdesi Grafiği 106 104 10 100 % Aspirin 98 96 94 t= 5 t= 35 t= 45 9 90 88 0 0,5 Zaman (saat) 1 1,5 Bir de aspirinin birinci dereceden parçalandığını varsayarak Zamana karşı Log % girafiğini izleyelim:,03 Zamana Karşı Değişmeden Kalan Aspirin Yüzdesinin Logaritması Grafiği,0 Log % Aspirin,01,00 1,99 1,98 1,97 1,96 t= 5 t= 35 t= 45 1,95 0 0,5 Zaman (saat) 1 1,5

Parçalanma hız sabitlerinin (K obs )tespit edilmesi: Bizim deney sonuçlarımız her nekadar Aspirinin sıfırıncı derece kinetiğine göre parçalandığını gösteriyor olsa da, gerçekte aspirinin birinci derece kinetiğine göre parçalandığını biliyoruz. Bu durumda yarılanma ömrü hesaplaması aşağıdaki şekilde yapılabilir. Bunun için kullanılacak formül Log C = Log C 0 k obs.(t/,303) Log C 0 : Başlangıçtaki aspirin konsantrasyonu logaritması. Log C : t anındaki aspirin konsantrasyonu logaritması. Aspirin [Log (mol/l)] Zaman (Saat) 5 C 35 C 45 C 0 -,44977845 -,44977845 -,4588167 0,5 -,4583665 -,4534703 -,4671730 1 -,45757849 -,4671730 -,4981308 1,5 -,46873939 -,49538136 -,55605 K obs 0,01796349 0,03995441 0,0919603 Her Sıcaklık için k obs değerleri aşağıdaki şekilde hesaplanmıştır. t= 5 º için: -,45757849 = -,44977845 - k obs. (1/,303) log C 0 = -,44977845 k obs = (,45757849,44977845) x,303 = 0,01796349 log C = -,45757849 Yarılanma ömürlerinin İncelenmesi: Yarılanma ömrü maddeinin ya da ilacın %50 sinin bozunması için geçmesi gerekli süreyi ifade eder. Hesaplaması K obs değerinden yola çıkılarak yapılır. Log 50 = log 100 - k obs (t/,303) denkleminden t yi çekersek t= [(log 100 log 50) x,303] / k obs log (100/50) x,303 / k obs 0,693 / k obs Raf ömürlerinin incelenmesi: Yukarıdakine benzer şekilde hesaplanır. İlacın % 10 unun bozunması için geçmesi gereken süredir. Diğer bir deyişle en az % 90 ının bozunmadığı süreçtir ve aşağıdaki gibi hesaplanır: Log 90 = log 100 - k obs (t/,303) t= [(log 100 log 90) x,303] / k obs log (100/90) x,303 / k obs 0,1054 / k obs Raf ömrü ve yarı ömürleri aşağıdaki tabloda gösterilmiştir: Aspirin K obs, t %50, t %10 5 C 35 C 45 C k obs 0,017963489 0,03995441 0,09196031 t %50 (saat) 38,59 17,35 7,54 t %10 (saat) 5,87,64 1,15

Sıcaklık ile bozunma hız sabiti ilişkisinin değişik ph değerleri için karşılaştırılması: T: Sıcaklık 1/T ph 1.45 ph 4.5 ph 10.35 (ºK) K obs Log K obs K obs Log K obs K obs Log K obs 98,15 0,00335 0,598-0,58536 0,01796-1,7456 0,677-0,1694 308,15 0,0034 0,3316-0,47939 0,03995-1,3984 1,003 0,00130 318,15 0,00314 0,497-0,30364 0,09196-1,0364,74 0,43775 Verileri grafiğe geçirdiğimizde karşımıza çıkan sonuç şöyledir: 0,5 Mutlak Sıcaklığın Tersine Karşılık Kobs Değerlerinin 3 ayrı ph Değerinde Gözlenmesi 1/T (1/K) 0 0,00314 0,0035 0,00335-0,5 log Kobs -1-1,5 ph 1.45 ph 4.5 ph 10.35 - Sıcaklığa karşı, çözünme hız sabiti regresyon analizi sonuçları: T: Sıcaklık (ºK) 1/T ph 1.45 ph 4.5 ph 10.35 Kobs Kobs Kobs 318,15 0,003143171 0,497 0,09,74 308,15 0,00345173 0,3316 0,040 1,003 98,15 0,003354016 0,598 0,018 0,677 Eğim (a) -1119,80-349,9946-9708,64158 Y'yi kesme noktası (b) 3,999304999 1,1849306 33,00169607 Korelasyon Katsayısı -0,97068405-0,9691664-0,9306573

Aktivasyon enerjisinin hesaplanması: Arrhenius denklemi : logk obs = -E a /,303Rx1/T + log A ( y = b χ (=1/T) + a ) b=-e a /,303R k obs : reaksiyon hız sabiti (saat -1 ) E a : bir mol reaktifin reaksiyona girebilmesi için gerekli olan enerji (kal/mol) R : gaz sabiti=1.99 kal/k.mol T: mutlak sıcaklık (K= 0 C+73) A: frekans faktörü (saat -1 ) ph=1,45 için aktivasyon enerjisi -1119,80=- E a /,303.1,99 E a =517,56 kal/mol ph=4,5 için aktivasyon enerjisi -349,30=- E a /,303.1,99 E a =1600,83 kal/mol ph=10,35 için aktivasyon enerjisi -9708,64 = E a /,303.1,99 E a =44494, kal/mol Doğrusallıktan ayrılış önem kontrolü (ph 4,5 için) Regresyon doğrusunu çizmeden önce doğrusallıktan ayrılış önem kontrolü yapmak gerekir. Eğer doğrusallıktan ayrılış önemli ise iki değişken arasındaki ilişki doğrusal değildir. Başka bir deyişle ilişki y=a+bχ doğrusal denklemi ile ifade edilemez. Bu nedenle regresyon doğrusu çizilemez. Datalarımızı bir kez daha hatırlayarak devam edelim: ph 4.5 1/T, log Kobs 1/T karesi 1/T Log Kobs Çarpımı Log Kobs Karesi 0,003143171-1,03639-0,00357556 9,87953E-06 1,0741079 0,00345173-1,39844-0,004538164 1,05311E-05 1,95561159 0,003354016-1,74561-0,00585480 1,1494E-05 3,04715184 TOPLAM 0,00974361-4,18044-0,0136505 3,16601E-05 6,0768808 1. Kareler toplamı bulunur a. Regresyon kareler toplamı (RKT) x. xy x n ( x) n y 3 9,74.10 ( 4,180) 0,01365 = 3 3 5 ( 9,74.10 ) 3,166.10 3 = 9 ( 5,5876.10 ),35.10 8 = 0,513 YOAKT = b. Y ortalamadan ayrılış kareler toplamı(yoakt) y ( y) n =0,019 6,07688- (17,476/3) = 0,515 c. Regresyondan ayrılış kareler toplamı (RAKT) RAKT= YOAK RKT 0,515 0,513= 0,000

. Serbestlik dereceleri bulunur: a. Regresyon serbestlik derecesi(rsd) RSD=1 b. Y ortalamadan ayrılış serbestlik derecesi(yoasd) YOASD=n-1 YOASD=3-1= c. Regresyondan ayrılış serbestlik derecesi(rasd) RASD=YOASD-RSD RASD=-1=1 3. Kareler ortalamaları: a. Regresyon kareler ortalaması(rko) RKO=RKT/RSD RKO=0,513/1=0,513 b. Regresyondan ayrılış kareler ortalaması(rako) RAKO=RAKT/RASD RAKO= 0,000/1= 0,000 4. İlk üç işlemden yola çıkarak analiz tablosu oluşturulur: Varyasyon (değişim) kaynakları Serbestlik derecesi Kareler toplamı Kareler ortalaması YOA 0,515 - R 1 0,513 0,513 RA 1 0,000 0,000 156,5 F F değeri : RKO/RAKO= 156,5 Test İşlemi: 1) Hipotez 0 (H 0 : Sıcaklık ile bozunma hız sabiti arasındaki ilişki doğrusal değildir.) ) Yanılma olasılığı olarak α: 0,05 seçilmiştir. 3) Test istatistiği F : 156,5 4) 1 ve 1 serbestlik derecelerinde F değerleri, tablodan bulunur. Örneğimizin tablo F değeri olarak 161,4 bulunmuştur. 5) hesapta bulunan F değeri, tablo F değerinden büyükse birinci maddedeki hipotez reddedilir. 156,5 > 161,4 olduğundan, Sıcaklık-Hız sabiti ilişkisinin doğrusal olmadığı hipotezi reddedildi. 6): Hız sabiti ile sıcaklık arasında doğrusal bir ilişki vardır. (F: 156,5 α < 0,05) Korelasyon katsayısı önem kontrolü: Korelasyon katsayısının(r) önemli bir katsayımı yoksa tesadüfe bağlı bir değer mi olduğu tespit edilir. İşlemler: 1. H 0 =korelasyon katsayısı tesadüfe bağlı bir değerdir, (r=0). Test istatistiğinin hesaplanması t=r/s r S r :korelasyon katsayısının standart hatasıdır. 1 r 1 0,999049307 S r = = = 0, 03083 n 3 t=-0,99954/0,03083=-3,4170 3. Yanılma olasılığı olarak α=0,05 seçilmiştir. 4. Serbestlik derecesi=n-

=3-=1 5. α=0,05 düzeyinde ve 1 serbestlik derecesindeki tablo t değeri 1,71 dir. 6. Karşılaştırma: Hesapla bulunan t değeri(3,4170) tablo t değerinden(1,71) büyük olduğu H 0 hipotezi reddedilir Karar: Korelasyon katsayısı tesadüfe bağlı bir değer değildir. Önemli bir değerdir. Sonuç ve Yorum: Aspirin ısıya hassas bir maddedir ve sulu ortamda ısıya maruz kaldığında da hızla bozunmaktadır. Endotermir bozunma gösteren bu maddenin bozunma hızının sıcaklıkla birlikte artması beklenmekteydi. Bu da demek oluyor ki yüksek sıcaklıklara çıkıldıkça, hazırlanmış aspirin çözeltisindeki aspirin miktarındaki azalmanın daha hızlı olması beklenmekteydi. zamana karşı değişmeden kalan aspirin yüzdesi grafiği, bu beklentimize uygun olarak şekillenmiştir ve, 45 derecede çalışılan çözeltideki aspirin miktarı azalması görünür derecede hızlı olmuştur. Ayrıca daha sonraki tablolarda izlenen Parçalanma hız sabiti ve yarılanma ömürleri de görüşümüzü destekler nitelikte çıkmıştır. Görüleceği gibi ph 4.5 tamponu içinde 5 derecede aspirinin yarı ömrü 38 buçuk saat seviyesindeyken, bu süre 45 derecede çalışıldığında, 7 buçuk saat civarına inmektedir. Tüm bunlarda tekrar göstermektedir ki, aspirin ısıya duyarlı bir maddedir ve daha serin suhunetlerde stabilitesi daha yüksektir. ph nın stabiliteye etkisine aktivasyon enerjileri (E a ) üzerinden baktığımızda, aspirinin asidik ve bazip ph değerlerinde aktivasyon enerjisinin ph4.5 tamponuna göre çok daha fazla olduğu görülmektedir. 1 mol aspirinin parçalanması için gerekli enerji, 4.5 tamponu içinde 1600 kalori düzeyindeyken, 1.45 tamponu içinde 5100 seviyesinde, 10.35 tamponunda ise 44400 kalori seviyelerindedir. Buna bağlı olarak parçalanmanın alkali ph da daha zor olduğunu ve aspirinin alkali ortamda daha stabil olduğunu söyleyebiliriz. Değişik ph larda yapılan incelemede, sıcaklığın parçalanma hız sabitine etkisi incelendiğinde, bu etkinin göstergesi olan doğru eğimi, alkali ph da ph 4.5e ve ph 1.45 e göre daha fazla değerde izlenmiştir. Bu veri, bize aspirinin ısı değişimine verdiği yanıtın, alkali ph larda daha fazla olduğunu göstermektedir. Alkali ph da daha stabil olan aspirin bu ph da ısıdaki değişikliklere, diğer ortamlardakinden daha şiddetli yanıt vermektedir. Daha önceden edindiğimiz bilgiler, aspirinin alkali değil asidik PH değerlerinde daha stabil, olduğuna işaret etmekteydi. Bu deney sonucü bunun aksi bir durum izlenmiştir. Alkali ph değerlerinde aspirin daha stabil çıkmıştır. Bunun muhtemel nedeni, aspirin varlığını dolaylı yoldan ve hidroliz bozunma ürünü olan salisilik asit üzerinden ölçmemizdir. Yapılan işlem, salisilik asitin renklendirilmesi ile oluşan ürünün verdiği renk şiddetinin ölçülmesi idi, ancak ortamdaki alkali varlığı nedeniyle hidroliz harici ya da hidrolize ek olarak nötrleşme bozunması gösteren aspirin alkali ortamda salisilat ya da asetilsalisilat anyonu olarak bulunacaktır. Renklendirme reaktifi olan Fe (III) klorürün, salisilik asite selektif olduğunu biliyoruz. Ortamdaki salisilat iyonları bu renk reaksiyonunu muhtemelen veremeyeceğinden deney sonucunda salisilik asit gözlenemeyecek ve deney esasına göre sözkonusu ortamda aspirin bozunma ürününe az miktarda rastlandığından, aspirin az miktarda bozunmuştur şeklinde yorumlanabilecektir. Bu yanlış yorum, bir etkin maddenin stabilitesi gibi çok önemli bir spesifikasyonu üzerinde kalamayacak kadar ciddi bir durumdur. Gözden kaçırılması çok ciddi ekonomik ve sağlıksal kayıplara neden olabilir. ph nın stabiliteye olan etkisi belirlenip stabil phlarda, başka değişkenleri değiştirerek çalışılması, ısının aspirin üzerine etkisini daha güvenilir bir şekilde incelebilme olanağı sunacaktır. Stabiliteye etkili iki bağımsız değişkenin

olduğu bir durumda, bunlardan bir tanesinin etkisini seçip görmek zahmetli ve güvenilirlikten uzak olmak durumundadır. Yüksek alkali ph larda ısı değişimine duyarlı olması da, muhtemelen ısıyla birlikte değişen iyonlaşma eğlimi sonucunda ortamda olağandan fazla açığa çıkan salisilik asit olabilir. Son olarak yapılan istatistiksel veri değerlendirme testleri, verilerimizin tesadüfi olmadığını ve birbirleriyle güçlü ilişkiler içinde olduklarını göstermiştir. Deney başında izlenen negatif ph değerleri, ilgili bölümde de belirttiğim gibi aşırı kirlenmiş küvet nedeniyle uygun bir kör çalışması yapamayışımızdan olması kuvvetli bir ihtimaldir. Ayrıca, absorbansı 1/1000 in altında görülen çözeltilerle çalışmak ta hata olasılığını yükseltmiştir. Spektrofotometride, en uygun çalışma aralığı 0,3 ila 0,7 arası iken, 0,001 gibi değerlerden öteye gidemeyen absorbans değerleri; okuma, data tutma ve değerlendirme aşamasında istenmeyen sonuçlara neden olabilir. Söz konusu maddenin spektrumu çıkarılıp izlenerek daha uygun bir dalga boyunda çalışılması, daha derişik çözeltilerle çalışılması gibi önlemlerle bu durum bertaraf edilebilir. Serkan TÜRKMEN 0568