MEME KANSERİ BELİRTEÇLERİNİ TANIMLAMADA PROTEOMİK YÖNTEMLER Yasemin BASKIN Tıp Doktoru, Biyokimya Doktoru, Temel Onkoloji Doktoru Bölge Hıfzıssıhha Enstitüsü İZMİR, 2008
Amerika da Kadınlarda Görülen Kanser Olguları: 2006-2007 CA Cancer J Clin 2006; 56:106-130; CA Cancer J Clin 2007;57:43-66
Türkiye de kadınlarda görülen kanser olgularının, görüldüğü organa göre dağılımları (2000) Organlar Sayı Yüzde İnsidans(Yüzbinde) Meme 3.354 24.96 10.02 Mide 836 6.22 2.50 Deri 797 5.93 2.38 Akciğer 692 5.15 2.07 Yumurtalık 634 4.72 1.89 Kolon 572 4.26 1.71 Beyin 536 3.99 1.60 Endometriyum 432 3.22 1.29 Serviks 417 3.10 1.25 Rektum 417 3.10 1.25 Diğerleri 4.750 35.35 14.35 TOPLAM 13437 100.0 40.16 Kaynak: SB (2004), Sağlık İstatistikleri, 2003.
Meme Kanseri Evreleri (http://www.cancer.gov/cancer_information/pdq/ Bilgiye Ulaşım Zamanı: 20.02.2008
Meme kanseri evrelerine göre sağkalım oranları SEER: Relative Survival Rates by Stage at Diagnosis 1988-2002 Surveillance, Epidemiology, and End Results (SEER) Program (www.seer.cancer.gov) SEER*Stat Database: Incidence - SEER 17 Regs Public-Use, Nov 2005 Sub (1973-2003 varying), National Cancer Institute, DCCPS, Surveillance Research Program, Cancer Statistics Branch, released April 2006, based on the November 2005 submission
Kanserlerin yıllara göre sağkalım yüzdeleri (%) Bölge 1974-1976 1983-1985 1995-2000 Bütün bölgeler 50 53 64 Meme (dişi) 75 78 88 Kolon 50 58 63 Lösemi 34 41 46 Akciğer ve Bronş 13 14 15 Derinin melanoması 80 85 91 Non-Hodgkin lenfoma 47 54 59 Yumurtalık 37 41 44 Pankreas 3 3 4 Prostat 67 75 99 *5-year relative survival rates based on follow up of patients through 2001. Recent changes in classification of ovarian cancer have affected 1995-2000 survival rates Source: Surveillance, Epidemiology, and End Results Program, 1975-2001, Division of Cancer Control and Population Sciences, National Cancer Institute, 2004.
YENİ BELİRTEÇLER GEREKLİDİR Tanı belirteçleri İzlem belirteçleri Sağaltım ve sağkalım öngörü belirteçleri
Geleneksel Biyoloji bir anda bir ağaç
Omic Yaklaşımı orman
Genden, Proteine...
Aynı genom, farklı proteom...
Proteomik nedir? Hücre Doku Organ Organizma
Proteomik nedir? Protein değişimleri Protein yerleşimi Protein-protein etkileşimleri A B A Protein İşlevleri Protein aktiviteleri A
Proteomik neden önemli? Normal Durum Hastalıklı durum Proteomdaki değişimler Yeni tanı ve Sağaltım olanakları
Translasyonel kanser araştırmalarında proteomik Celis, J. E. (2003) Cancer Cell. 3: 9-15
Kanser araştırmalarında sıklıkla kullanılan Proteomik teknikler Doku protein mikroarrayleri Jel temelindeki yöntemler Kütle spektrometresi temelindeki yöntemler
DOKU MİKROARRAY ÇALIŞMALARI Identification of a prognostic multiprotein signature in breast cancer samples using IHC and TMA. Bertucci F. (2006) Mol. Cell. Proteomics 5.10: 1772-1786
Sıvı faz Mikroarray Azad, N. S. (2006) Mol. Cell. Proteomics 5: 1819-1829
High-resolution 2-D Electrophoresis First Dimension: Denaturing isoelectric focusing in presence of urea, Nonidet NP-40 in vertical gel rod sample gel rod rebuffered in SDS buffer ph 3 Second Dimension: SDS polyacrylamide gel electrophoresis in discontinuous gradient gel ph 10 ph 10 ph 3 Separation acc. to Isoelectric Points (charge) Separation acc. to Molecular Weight (mass) O Farrell PH. High-resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J Biol Chem. 250 (1975) 4007-4021.
TIF proteins from tumor 41 separated by IEF 2D PAGE and stained with silver nitrate Celis, J. E. (2004) Mol. Cell. Proteomics 3: 327-344
TIF proteins from tumor 41 resolved by NEPHGE 2D PAGE and stained with silver nitrate Celis, J. E. (2004) Mol. Cell. Proteomics 3: 327-344
Immobilized ph Gradients (IPG) Acrylamide derivatives: Immobiline CH 2 =CH-CO-NH-R, R contains a carboxylic or a tertiary amino group Immobiline Gels: (0.5 mm gel layers on film supports) Bjellqvist B, Ek K, Righetti PG, Gianazza E, Görg A, Westermeier R, Postel W. Isoelectric focusing in immobilized ph gradients: principle, methodology and some applications. J Biochem Biophys Methods. 6 (1982) 317-339.
DIGE sistemi Pooled internal standard label with Cy 2 Cy2 Protein extract 1 label with Cy3 Cy3 Protein extract 2 label with Cy5 Cy5 Mix labelled extracts 2-DE separation Typhoon Variable Mode Imager DeCyder Differential Analysis Software
MALDI TOF-MS Wei-Jun Qian, (2006) Molecular & Cellular Proteomics 5.10:1727-1744
Schematic diagram of a prototype ESI-IMS-Q-TOF instrumentation platform that uses electrodynamic ion funnel interfaces at both ends of the IMS drift tube and, as a result, provides very high sensitivity from high speed analyses. Reproduced with permission from Ref. 68, copyright 2005 Am. Chem. Soc. Wei-Jun Qian, (2006) Molecular & Cellular Proteomics 5.10:1727-1744
A component diagram of an LC-MS protein profiling platform. FFE, free flow electrophoresis; 1D, one-dimensional; itraq, isobaric tags for relative and absolute quantitation. Wei-Jun Qian, (2006) Molecular & Cellular Proteomics 5.10:1727-1744
SELDI İşlemi & ProteinChip Array 1. Örnek ProteinChip Array yüzeyleri ile etkileşir 2. Proteinler yakalanır, tutulur ve çip yüzeyinde saflaştırılır (affinite ) 3. Yüzey, SELDI (Surface-Enhanced Laser Desorption/Ionization) yöntemi okunur Lazer Moleküler Ağırlık Örnek 100 µm 2 ila 1 mm 2 ProteinChip Array Kimyasal, Biyokimyasal veya Biyolojik Tutunma Yüzey
SELDI-TOF MS Azad, N. S. (2006) Mol. Cell. Proteomics 5: 1819-1829
ProteinChip Array Teknolojisi Kimyasal Yüzeyler Protein Ekspresyon Profili: Hidrofobik Anyonik Katyonik Metal İyon Normal Faz Biyolojik Yüzeyler Protein etkileşim yöntemleri: PS-1 veya PS-2 Antikor - Antijen Reseptör - Ligand DNA - Protein
ProteinChip Okuyucu olarak TOF-MS Y + - (+) (+) --- Vakum --- Hızlandırma Potansiyeli Proteinler (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) Dedektör 7.5 5 Spektra Görüntüsü 2.5 0 2000 4000 6000 8000
SELDI TOF MS SELDI-TOF-MS analizleri analitik geçerlilik ve kalite kontrol süreçleri düşük kalitedeki spektraların veri analizi öncesinde ayıklanmasının sağlanması. gürültü(noise)/gerçek pik ayrımı,internal kontrol gerekliliği Tekrarlanabilirlik, laboratuvarlar arası doğrulama Geçerli belirteçlerle (örn. CA 15.3) eş zamanlı doğrulama tanısal geçerlilik DEĞİŞKENLİK (Hong H, et al 2005). büyük sayıda çıktıya / küçük örnek büyüklüğü Bol bulunan aday proteinler akut faz yanıtı Klinik örneğin çok kesin ölçütlerle ve olası en az değişkenlikle seçilmesi gereklidir. Saptanan hedef pikler, daha geniş bir olgu grubunda doğrulanmalıdır (Li J, et al 2002).
Doku protein mikroarray çalışmaları *önceden bilinen tanısal sınıfların tanımlanmasında Büyük örnek serilerinde tek belirteç aranması Herediter (BRCA1, BRCA2 mutasyonu) sporadik; 37 protein, BRCA2 mutasyonu (+):Cyclin D1-D3, CDK4 Medüller Meme Kanseri; 18 protein, P-cadherin MIB1/Ki67 ve ERBB2 (-), p53 (+) Lenf bezi (+) metastatik olgularda; 14-3-3α (+) Inflamatuvar meme kanseri; Protein imzası (%91), E- cadherin ER (-), MIB1 (+),MUC1 (sitoplazmik boyanma), ERBB2 (+) Bertucci (2006) Mol. Cell. Proteomics. 5:1772-1786. Kononen (1998) Nat. Med. 4,844-847. Meme kanserinde ilk doku protein mikroarray yayını
Doku protein mikroarray çalışmaları * yeni meme kanseri alt gruplarının moleküler düzeyde tanımlanması ER(+) tümörler Luminal A Luminal B Basal ERBB2-overexpressing Normal breastlike 1944 tümör serilik grupta; 25 protein Bertucci (2006) Mol. Cell. Proteomics. 5:1772-1786.
Doku protein mikroarray çalışmaları *Klinik izlem çalışmaları 21 öngürü proteini, 552 tümör serisi, 5 yıl-metastazsız süre Bertucci (2006) Mol. Cell. Proteomics. 5:1772-1786.
Doku protein mikroarray çalışmaları * Klinik izlem çalışmaları iyi/kötü prognoz ayrımı öngörü oranı %90
SELDI-TOF ÇALIŞMALARI *tanısal belirteçler 4,300 ve 8,900 m/z protein pikleri BRCA1 mutasyonu (+); kanser gelişmiş/ gelişmemiş olguların ayrımı Sensitivite %94; spesifite %100 Meme kanseri/normal olgu ayrımı Sensitivite %76-93; spesifite %90-93 Bertucci (2006) Mol. Cell. Proteomics. 5.10 :1772-1786.
SELDI-TOF ÇALIŞMALARI *tanısal belirteçler BRCA1 mutasyonu (+); kanser gelişmiş/ gelişmemiş olguların ayrımı 5,900m/z protein piki 23 belirteç adayı BC2-8.1, BC3-8.9kDa artan, BC1-4.3kDa azalan protein pikleri 17.3, 26.2, 5.7, 8.9 kda protein pikleri Meme kanseri/normal olgu ayrımı Sensitivite %76; spesifite % Azad NS ( 2006) Mol. Cell. Proteomics. 5.10, 1819-1829. Li J. (2002) Clin Chem. 48, 1296-1304.
SELDI-TOF ÇALIŞMALARI *klinik izlem belirteçleri Bertucci (2006) Mol. Cell. Proteomics. 5:1772-1786.
SELDI-TOF ÇALIŞMALARI *sağaltım yanıtı belirteçleri Paclitaxel; 3. gün, 2.7kDa tek protein piki, sağaltım yanıtı belirteci olarak saptanmış 7,700 ve 9,200 m/z ( kininogen, apolipoprotein A-II); akut, yaygın yan etki ile ilişkilendirilmiş Bertucci (2006) Mol. Cell. Proteomics. 5:1772-1786.
2D JEL TEMELLİ ÇALIŞMALAR * Hücre kültürleri/serum-plasma proteomu karşılaştırmalı çalışmalar Üç meme kanseri hücre dizisinde proteom veri tabanı oluşturulmuş 1 139 protein tanımlanmıştır. Elafin, (Kallikrein) KLK5,KLK6, KLK10 serum proteomlarında ve kanseri dokularında olası meme kanser belirteci olarak önerilmiştir. Kulasingam V (2007) Mol. Cell. Proteomics 6.11, 1997-2011
2D JEL TEMELLİ ÇALIŞMALAR * Hücre kültürleri/serum-plasma proteomu karşılaştırmalı çalışmalar Meme hücre dizilerinde (kanser/normal) saptanıp meme kanseri olgularda çalışılarak önerilen belirteçler (endorepellin LG3 parçası) Chang JW (2008) Proteomics Clin. Appl. 2, 23-32.
2D JEL TEMELLİ ÇALIŞMALAR * Hücre kültürleri/serum-plasma proteomu karşılaştırmalı çalışmalar Meme hücre dizileri (normal/kanser) Serum/plasma (Meme kanseri, memenin benin hastalıkları) Doku (kanser, normal, metastatik, lenf düğümü) Doku İntertisyel sıvıları İğne aspirasyon sıvıları Celis JE (2004) Mol. Cell. Proteomics 3.4, 327-344
2D JEL TEMELLİ ÇALIŞMALAR * Hücre kültürleri/serum-plasma proteomu karşılaştırmalı çalışmalar Tümör intertisyel sıvısında 267 protein Serum/plasma proteomunda 97 protein Meme kanseri proteom veri tabanı Celis JE (2004) Mol. Cell. Proteomics 3.4, 327-344
2D JEL TEMELLİ ÇALIŞMALAR * Hücre kültürleri/serum-plasma proteomu karşılaştırmalı çalışmalar İmmunohistokimyasal MALDI-TOF-MS Yerleşimsel Fonksiyonel proteomik Celis JE (2004) Mol. Cell. Proteomics 3.4, 327-344
NIH / CLINICAL TRIALS BREAST CA / PROTEOMICS 1. A Biological Sample Collection Protocol of Women With and Without Breast Cancer 2. Use of Dynamic Contrast- Enhanced Magnetic Resonance Imaging to Assess Tumor- Associated Vasculature in Patients With Metastatic Breast Cancer 3. Analysis of Brain Metastasis in Patients With Breast Cancer, With and Without Over- Expression of HER-2 4. Genetic and Protein Profiling in Normal and Cancerous Breast Tissue 5. Proteomic Analysis of HLA Complex in Solid Cancers: Breast, Ovary, Colon, Rectum, Stomach, and Pancreas
NIH / CLINICAL TRIALS BREAST CA / PROTEOMICS 1. Docetaxel Combined With Ketoconazole in Treatment of Breast Cancer (Drug: docetaxel Phase II) 2. Serum Proteomics to Predict Gemcitabine Sensitivity in Breast Cancer (Drug: gemcitabine, carboplatin Phase II) 3. Clinical Trial of SAHA in Patients With Breast Cancer (Drug: Vorinostat Phase I/Phase II) 4. Phase II Neoadjuvant ER+/PgR + Arimidex +/- Iressa Study(Drug: Anastrazole Drug: Gefitinib Phase II) 5. Chemotherapy and/or Hormone Therapy With or Without Zoledronate in Treating Women With Stage II or Stage III Breast Cancer 6. Phase II Neoadjuvant Trial of Trastuzumab in Combination With Dose-Dense ABI-007 (Abraxane ) (Drug: Trastuzumab, Abraxane, Vinorelbine Phase II) 7. Gene Expression Profiles in Predicting Chemotherapy Response in Breast Cancer (Drug: doxorubicin, docetaxel Phase II)
SONUÇ OLARAK... başlangıç aşamasındadır sonuçların işlenmesi, genişletilmesi, onaylanması süreci başlamıştır iyi bir kalite kontrolü ve disiplinler arası etkin bilgi akışını gerektirirler.
HUPO (The Human Proteome Organisation) STANDARDLAR EĞİTİM
HUPO etkinlikleri: proteomik veri tabanları Proteomics database - PRIDE (www.ebi.ac.uk/pride) Protein Atlas (www.proteinatlas.org)
SONUÇ OLARAK... 1996-2007 yılları arasında meme kanseri/proteomik adresli 200 yayın ASCO 2007 güncellenmiş raporuna göre Klinik kullanımda geçerli proteomik belirteç tanımlanmamıştır. Umut vadeden belirteçler olarak yer almıştır. ASCO 2007 Update of recommendations for use of tumor markers in breast cancer. J Clin. Oncol. (2007) 25; 1-26
KAYNAKÇA 1. Baskın Y. Çoklu yöntemlerin (genomics and proteomics) tıpta kullanımı. Izmir Institute of Technology, 2005 seminars, Izmir. 2. Baskın Y. Tıpta teknolojik gelişimin neden olduğu kavram değişimleri: kişiselleştirilmiş tıp. Türk Hijyen ve Deneysel Tıp Dergisi, 2007; 64(2). 3. Petterson SD, Aebersold RH. Proteomics: First decade and beyond. Nature Genetics Supplement 2003; 33: 311-32. 4. Baskın Y. Ekstrasellüler matriks proteinleri: Nidogen ve fibronektin. Moleküler yapılarının biyolojik fonksiyonlar üzerine etkileri. DEÜ Sağlık Bilimleri Enstitüsü Doktora Tezi (Prof Dr. Hüseyin T. Sessiz Danışmanlığında), 1995. 5. Celis JE and Gromov P. Proteomics in tranlational cancer research: Toward an integrated approach. Cancer Cell 2003; 3: 9-15. 6. Görg A, Obermaier C, Boguth G, Harder A, Scheibe B, Wildgruber R, WeissW. The current state of 2DE with Immobilized ph gradients. Electrophoresis 2000; 21: 1037-1053. 7.Aebersold R and Mann M Mass spectrometry-based proteomics. Nature 2003; 422: 198-207. 8. Haris L, Fritsche H, Mannel R, Norton L, Ravdin P, Taube S, Somerfield MR, Hayes DF, Bast RC Jr. ASCO 2007 update of recommendations for the use of tumor markers in breast cancer. J Clin Oncol 2007; 25 (33); 1-26. 9. Bertucci F, Birnbaum D, Goncalves A. Proteomics of Breast Cancer. Mol. Cell. Proteomics 2006; 5:1772-1786 10. Azad NS, Rasoll N, Annuziata CM, Minasian L, Whiteley G, kohn EC. Proteomics in clinical trials and practice. Mol. Cell. Proteomics 2006; 5:1819-1829. 11. Celis JE, Gromov P, Cabezon T, Moreira JMA, Ambartsumian N, sandalin K, Rank F, Gromova I. Proteomic characterisation of the ınterstitial fluid perfusion the breast tumor microenvironment. Mol. Cell. Proteomics 2006; 3:327-344. 12. Kulasingam V, Diamandis EP. Proteomics analysis conditioned media from tree breast cancer cell lines. Mol. Cell. Proteomics 2006; 6:1997-2011 13. Chang JW, Kang UB, Kim DH, Yi JK et al. Identification of circulating endorepellin LG3 fragment. Proteomics Clin 2008, 2: 23-32.
Teşekkür ve Anma Prof. Dr. Julio E. Celis Arianna Celis
TEŞEKKÜRLER... İZMİR DE GÜNBATIMI