HLA TAYİNİNDE KULLANILAN YÖNTEMLER,SORUNLAR ve ÇÖZÜM ÖNERİLERİ

Transkript

1 HLA TAYİNİNDE KULLANILAN YÖNTEMLER,SORUNLAR ve ÇÖZÜM ÖNERİLERİ Dr. Türkan Patıroğlu Erciyes Üniversitesi Tıp Fakültesi Pediatrik Hematoloji ve İmmünolojiBilim Dalları Kayseri

2

3 HLA-Klinik önemi Antropolojik çalışmalar Babalık tayini Hastalıklarla ilişki Transplantasyon: Renal: Graftömrünü etkiler, Renal ve pankreas:hla-dr daha önemli KİT: Tam uyum (GvHH)

4 HLA-klas I ve klas-ii için %97 Güvenirlik

5 HLA Tiplendirme Testleri Serolojik test Mikrolenfositotoksisite Moleküler testler (PCR a dayalı testler) SP,SSO,SSPC,SBT Hücresel testler (Miks lenfosit Reaksiyonu)

6 SerolojikTestler Makroaglütinasyon Mikrolenfositotoksisite

7 SerolojiPlakları Klas-I ve II Kuyucuk sayısı: 60,72,120,144

8 Kullanılan Hücrelerin Özellikleri Viabilite Saflık Temizlik Hücrelerin izolasyonu -48 st içinde kullanılmalı -Buffy coat eldesi -Magnetik boncuklar ile T-B hücre saflaştırılması

9 MikrolenfositotoksisiteYöntem Plak oda ısısında eritilir Kompleman hazırlanır(1viyal 2 ml distile su) 1 µl hücre süsp. kuyucuklara konur Oda ısısında(18-22 C) 30 dk beklenir 5 µl tavşan komplemanı eklenir 1 µl boya solüsyonu eklenir +4 C de 15 dk. karanlıkta saklanır Okuma (floresan ataçmanlı mikroskopta)

10 MikrolenfositotoksisiteSkorlama Ölü hücre % Skor Değerlendirme (-) Olası (-) Zayıf (+) (+) Kuvvetli (+)

11 Mikrolenfositotoksisite Sorunlar Yalancı pozitiflik: Lenfosit kalitesinin kötü olması Kontaminasyon Komplemanın kuvvetli olması İnkübasyon sürelerinin uzaması Isının yüksek olması Diğer hatalı teknik detaylar

12 Mikrolenfositotoksisite Sorunlar Yalancı negatiflik Trombosit ve granülosit kontaminasyonu Komplemanın unutulması İnkübasyon sürelerinin kısa olması Isının düşük olması Hastanın aldığı ilaçlar Diğer hatalı teknik detaylar Antiserumunbozuk olması, Uygunsuz taşınma Kuyucuklardaki hücre sayısının fazlalığı

13 Mikrolenfositotoksisite Avantajları Basit Hızlı Dezavantajları Hata payı yüksek (ölü hücrelerin değerlendirilmesi subjektif) Yetersiz B lenfosit izolasyonu (klas-ii için) CREG Tekrarı zor (Ag-Ab-C birleşmesine bağlı) Saptanamayan aleller veya tek alel saptanması Yanlış saptanan aleller

14 MikrolenfositotoksisiteSonuç net değilse? Zayıf (+)ise: Bw4,Bw6 değerlendirmesi B44 (+) ise Bw4(+) olmalı Eleme yöntemi A32:A32 ve A10 (+) ama A25,26,34- Broadveya splitagbelirlemesi: A25 (+) ise A10 da (+) olmalı CREG tablolarının kullanılması Linkeage disequilibriumreaksiyonlar Etnik farklılıklara göre Ag tanımlanabilir

15 Bw4, Bw6 Birliktelikleri Bw4 Bw6 B5 B53 B7 B41 B65(14) B5102 B57(17) B703 B42 B67 B5103 B58(17) B8 B45(12) B70 B13 B59 B14 B46 B71(70) B17 B63(15) B18 B48 B72(70) B27 B77(15) B22 B50(21) B73 B37 B2708 B54(22) B75(15) B38(16) A9 B35 B55(22) B76(15) B44(12) A23(9) B39(16) B56(22) B78 B47 A24(9) B 3901 B60(22) B81 B49(21) A2403 B3902 B61(40) B51(5) A25(10) B40 B62(40) B52(5) A32(19) B4005 B64(14) Marsh SGE, Parham P, Barber LD, 2000

17 CrossReaktif Antijen Grupları (CREG), Bw4 Bw6 Bulunduran Antijenler CREG A01C A10C Yer Alan Antijenler A1, A3, A11, A29, A30, A31, A36, A80 A10, A11, A19, A25, A26, A32, A33, A34, A43, A66, A74 A02C A2, A9, A23, A24, A28, A68, A69, A203, A210, A2403, B17, B57, B58 B05C B5, B18, B35, B51, B52, B53, B78, B5102, B5103 B07C B7, B8, B13, B22, B27, B40, B41, B42, B47, B48, B54, B55, B56, B59, B60, B61, B67, B81, B82, B703 B08C B8, B14, B16, B18, B38, B39, B59, B64, B65, B67, B3901, B3902 B12C B12, B13, B21, B37, B40, B41, B44, B45, B47, B49, B50, B60, B61, B4005 B21C B5, B15, B17, B21, B35, B46, B49, B50, B51, B52, B53, B57, B58, B62, B63, B70, B71, B72, B73, B75, B76, B77, B78, B4005, B5102, B5103

18 Çapraz Reaksiyonlar Aynı kuyuda 2 farklı Ag ile reaksiyona giren 2 farklı Ab olabilir Antiserum 2 farklı Ag üzerinde de bulunan ortak bir antijenik epitop ile reaksiyon verebilir (CREG) Isı, süre,komplemanın şiddeti çapraz reak oluşturabilir Homozigotluk durumunda beklenmeyen çapraz reaksiyon olabilir. A2 için homozigot ise, A28 ile çapraz reaksiyon

19 CREG Çin de yapılan bir çalışmada: A 19, B62,B40,B75 Tan et al.transplantation Proceedings 2000:32 Kadaverik renal transplantasyonda CREG ile graft ömrü ilişkili bulunmuş Laux G, Opelz G. Transplantation 2004

21 Aile çalışmaları Haplotip belirleme Antijenik birliktelikler Eksik Ag tanımlama Homozigotluğun tanımlanması Etnik özelliklerin gösterilmesi Moleküler çalışma

22 Moleküler Teknik Avantajları Güvenilir (seroloji=düşük çözünür ) Hızlı (SSP 4 st, kadavra için bile zaman uygun) Canlı hücre gerektirmez DNA, herhangi bir çekirdekli hücreden elde edilebilir Örnek volümü daha az Lenfosit kalitesi kötü olsa bile sonuç verir Homozigot ise tam gösterim Otomasyona daha uygun Serolojide tanımlanamayan aleller bulunabilir

23 Kalitesi kötü lenfosit Yetersiz sayıda lenfosit (Lösemi veya aplastik anemi,kemoterapi) Uzun süreli hemodiyaliz İzole edilen lenfositlerde ölü hücre oranının yüksek olması

24 Moleküler Teknik Avantajları Güvenilir (seroloji=düşük çözünür ) Hızlı (SSP 4 st, kadavra için bile zaman uygun) Canlı hücre gerektirmez DNA, herhangi bir çekirdekli hücreden elde edilebilir Örnek volümü daha az Lenfosit kalitesi kötü olsa bile sonuç verir Homozigot ise tam gösterim Otomasyona daha uygun Serolojide tanımlanamayan aleller bulunabilir

25 MikrolenfositotoksisiteMoleküler yöntem Karşılaştırmaları İki yöntem arasında hata %23; HLA-A:%8.8,HLA-B:%14.2 En sık hata: B15:%13.9, A32:%7.2, A31:%5.7 Klas-I de hata %8.5 Klas-II de hata %20 Mytilineos J et al.human Immunol 1998;59 KİT hastalarında %30.6 sonuç yok En sık hata:hla- A10, A19 ve B15 Seyhun Y ve ark.gaziantep Tıp Dergisi2008,41 Kord kanı HLA çalışması %13.8 Li D et al.zhonghuaxue YeXueZaZhi 2000;21

26 Mikrolenfositotoksisite-Moleküler yöntem Karşılaştırmaları Saptanamayan aleller B15;%24, A32;%7.9 A33;%4.5 Homozigot? B15 %15 B53 %8.1 A32 %6.9

27 Mikrolenfositotoksisite-Moleküler yöntem Karşılaştırmaları A(%) B(%) Tan(n:525) Mytilineous(n:421) Kulcsarova(n:50) 9 11 Seyhun(n:1567)

28 Mikrolenfositotoksisite-Moleküler yöntem Karşılaştırmaları HLA-C ekspresyonu A ve B ye göre daha zayıf 1 alel noksanlığı %78.2 Yanlış sonuç %13.7, Cw7 aleli Cw5 olarak değerlendirilmiş Torio a et al.transplantation Proceedings2004;34 Serolojik HLA-Cw n:1203 HLA-Cw noksanlığı n:26 Tek Cw noksanlığı n:13 2 Cw alel noksanlığı n:13 Mytilineous et al.tissue Antigen1997;50

29 Moleküler Yöntemler SSP: Sequence Specific Priming (bir alel veya alel grubuna yönelik primerler) SSO: SequenceSpecificOligonucleotid (tüm bölgeyi içeren primerler) SSCP:Sequence Specific Conformational Polymorphism SBT: Sequence Based Typing

30 SSP Primerhangi aleliçin hazırlanmış ise DNA nın o kısmına bağlanır. Primer e özgü segment varsa Amplifikasyon olur Yöntem: DNA izolasyonu DNA amplifikasyonu Elektroforez Görüntüleme Verilerin sisteme girilmesi Analiz

31 SSP: Tekrar Gereken Durumlar Kuyularda (+) bandın yokluğu ile birlikte internal kontrol bandın olmayışı Reaksiyon olmayan kuyu ile tezat bir sonuç varsa;örnek:drb1 için 23+(DR53),8+(DR4),9(DR7) çalışmamış ise İkiden fazla sonuç veriyorsa; (DR15 ve DR11, DR15 ve DR13 vb.dr11?dr13?) Seroloji ile uyumsuz bir sonuç varsa; Nonspesifik bandlar fazla ise; Bandlarçok soluk ise, Aile içinde klas-i tam uyumlu ama klas-ii de uyumsuzluk varsa

32 SSP: Sorunlar-I Reaksiyon yok Az veya kalitesiz DNA Reaksiyonun zayıf olması Az veya kalitesiz DNA Bir lokusta beklenenden çok alele özgü band var Yeni bir alel olabilir Kontaminasyon varsa, bantların koyu olması gerekir Tüm lokuslarda çok sayıda alel spesifik bandlar olması PCR kaynaklı olabilir; Program kesintileri etkiler (nonspesifik bağlanmalar nedeni ile) Örnek veya master mix kontaminedir

33 SSP: Sorunlar-II Bir lokustaaleleuygun bandyok? Bilinmeyen bir alel için homozigotluk Kitler doğru koşullarda saklanmamışsa Hatalı master mix Alele özgün band var ama kontrol bandı yok? Kontrole ait bandvar ama aleleözgün bandyok? Hatalı master mix Cihazın kullanımı ile ilgili sorunlar olabilir Çalışmanın bir kısmı sorunlu? Genellikle cihazın kullanımı ile ilgilidir

34 Hasta A*02 A*26 B*38 B*51 DRB1*10 DRB1*13 Kardeş A*02 B*38 DRB1*13 (Kord kanı) A*26 B*51 DRB1*13?? Anne DRB1*04 DRB1*13 Baba DRB1*10 DRB1*15

35 SSP: Sorunlar ve Öneriler DNA kalitesini artırmak için; Daha az DNA, 2 kat taqpolimerazkonmalı DNA zaman içinde bozulmuşsa,örnek yenilenmeli Bandlarsoluk ise; Daha fazla DNA Master mix yeniden hazırlanmalı Taq miktarı artırılmalı Beklenenden çok alel varsa; Yeni bir alel mi? Sekans yapılmalı Cihaz hatalarında çalışma tekrarlanmalı, cihaz kalibre edilmeli, Hata belli bir lot ile oluyorsa, değiştirilmeli Özellikle verici akraba dışı ise yüksek çözünürlükte çalışma yapılmalı

36 SSO Bir HLA bölgesine özgün primerler kullanılarak çoğalma sağlanır Specific oligonucleotidlerin boncuk gibi katı bir ortamda bağlanması Reaktif eklenmesi Hibridizasyon Yıkama işlemi Enzim işaretli avidin eklenmesi ile DNA nın enzimle işaretlenmesi Enzimin substratınınortama ilavesi ile hangi oligonükleotidprobunbağlandığı saptanır

37 SSO Dezavantaj Bölgeye özgün olanlardan başka gruba özgün çalışmaların yapılması

38 Moleküler Yöntem Dezavantajları Çok sayıda tüp,primer ve işlem gerektirir Doğru sonuç için tüm eksonlar değerlendirilmeli HLA alelleriarasında ortak dizilimlerden dolayı karışıklıklar olabilir. Bu nedenle duyarlılığı artırıcı yöntemler ( nestedpcr, multiplexpcr ) kullanılabilir

39 Neden Multiplex? Farklı allellereözgü olan farklı problarıtaşıyan farklı renklerdeki (~100 renk) boncukları kullanarak aynı anda pekçok allelin varlığının test edilebilmesi HLA allellerinindüşük/orta/ yüksek çözünürlükte belirlenebilmesi

40 Luminex Mikro boncukların kullanımına dayalı, çoklu analiz imkanı olan, floresan ölçümü yapabilen hibridizasyon ve floresantayin yöntemlerini birlikte kullanan multiplex bir sistem

41 Luminex:Yöntem DNA izolasyonu DNA amplifikasyonu Hibridizasyon Quicktype for LifeMatch kullanarak hasta girişleri Çalışmanın okutulması Analiz

42 Luminex:Sorunlar ve çözüm DNA nın bozulması veya az olmasıreaksiyonda yetmezliklere neden olur.dna kalitesine duyarlı olan lokuslarsırasıyla: C > A > B > DQ > DR dir. DNA kontaminasyonu karmaşık sonuçlar alınmasına yol açar. Sık DNA sorunu varsa hibridizasyonöncesi jel elektroforeziuygulanarak amplifikasyonun kontrol edilmesi gerekir Materyalin taşınması, ısı ve ışıktan ( probemixve SA-PE)koruması, süreye uyum önemlidir Çalışma için sadece rekombinant Taq polimerazkullanılmalıdır. İyi karışmayan boncuklar, düşük prob sayımlarına ve verilerin analiz edilemesine sebep olur.

43 Luminex:Sorunlar ve çözüm Plastik malzemelerin kalitesiz olması, boncukların bu malzemenin çeperine yapışmasına neden olur ve analiz sorunlarına yol açar Hibridizasyon sırasında olabilecek buharlaşmalar, bazan yetersiz sonuç alınmasına sebep olabilir. Hazırlanan SA-PE solusyonunun iyi karışmamasıçalışmada farklı tip sonuçlara neden olur Amplifiye olmus ürünleren kısa sürede işleme konmalıdır,yükleme cihaza hemen yapılamayacaksaürün 3 gün boyunca 2-8 C de saklanabilir. En çok 1 hf.-20 C de saklanabilir. Her koşulda bir negatif ve bir pozitif kontrol kullanılmasıgerekir.

44 SBT Aleller, nükleotid dizilerinin incelenmesi ile bulunur Klas-I için:ekson 2-3 Klas-II için:ekson 2 İlk adım: Lokusa veya alel sekansına özgü primerler Ampflikonların oluşması İkinci adım:reaksiyonun durdurulması

45 SBT:Avantajları Seroloji ile saptanamayan aleller Benzer alellerin ayırımı Mutasyonların saptanması

46 MiksLenfosit Reaksiyonu(MLR) Kültür ortamındaki lenfositlerin aynı ortamdaki ikinci bir seri hücrenin yüzey Ag lerine karşı çoğalmasıdır Bir hücre serisi ışınlama veya mitomisin-c ile immün cevapsız hale gelir Uyarılan hücrelerin çoğalması radyoaktif yöntemlerle ölçülür HLA-Klas II antijenlerinin uyum veya uyumsuzluğu gösterilir

47 Öneriler İyi bir değerlendirme için: Irk,haplotip bilgisi, popülasyondaki alel sıklığı dikkate alınmalı Alıcı-verici için: HLA-A,B,DR çalışılmalı Hasta KİT e hazırlanıyorsa moleküler yöntem tercih edilmeli Uygun donör taraması için seroloji yapılmalı Donör arama:hastanın 1 derece akrabaları taranmalı Hematolojik malignite varsa moleküler yöntem tercih edilmeli

48 SBT Ne zaman yapalım? Diğer yöntemlerle saptanamayan HLA tiplerinde KİT için akraba dışı donör aranmasında

49 Sorunlar? Eğitimin sürekliliği Uluslar arası kalite kontrolu EFI veya ASHI akreditasyonu

50