Moleküler Metodlar ve Myeloma. Dr. Güray Saydam Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Hematoloji Bilim Dalı

Transkript

1 Moleküler Metodlar ve Myeloma Dr. Güray Saydam Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Hematoloji Bilim Dalı

2 Çalışmalarımın katıksız hayal ürünü olduklarının söylendiğini duydum. Fransa da biri, bahsettiğim küçük yaratıkların aslında cansız olduğunu söylemiş. Oysa ben bunun aksini pek çok saygın bilim adamına kanıtladım. Böyle yorumlar yapan gözüpek kişilerin yargıda bulunacak deneyimleri olmadığını görüyorum. Antonie Van Leeuwenhoek ( )

3 Resolution of array Molecular methods bp CGH/SNP array array Mb-Kb Kb-Mb Conventional karyotyping Mb

4

5

6

7

8

9 MOLECULAR PATHOGENESIS OF MYELOMA Lancet 2004;363:875

10 Lancet 2004;363:875

11 Monitoring Disease CR Definition Does Matter With Regards to Depth of Remission Number of Myeloma Cells At diagnosis Partial response 50% reduction in M protein Near complete remission immunofixation positive only Complete remission immunofixation negative MRD Nonquantitative ASO-PCR Quantitative ASO-PCR flow cytometry Rate of molecular CR with HDT is 5%

12

13 İmmunolojideki ilerlemeler ve hematolojiye katkıları

14

15 FISH Fluoresan in situ hibridizasyon (FISH): Kromozomların belli bölümlerinin ya da tamamının fluoresan moleküllerle belirlenmesi Prensip: fluorokrom işaretli Timidin içeren oligonukleotidler (> 1Kb), Fluoresan mikroskop

16 Malign hematoloji AML-M2 AML-M4Eo AML-M3 AML AML/MDS AML/MDS AML/MDS AML/MDS CML t(8;21) inv(16)/t(16;16) t(15;17) t(11q23) -5/del(5q) -7/del(7q) del(20q) +8 *t(9;22) +8 i(17q) RUNX1/ETO CBFB PML/RARA MLL EGR1/5p D7S522/CEP7 D20S108 CEP8 BCR/ABL BCR/ABLES MBCR/ABL CEP8 HER2/CEP17

17

18 Resolution of array Molecular methods bp CGH/SNP array array Mb-Kb Kb-Mb Conventional karyotyping Mb

19 Polymerase Chain Reaction 1998

20 PCR

21 PCR ın keşfi sadece bizim için değil, tüm dünya için ilham kaynağı olmuştur

22 PCR Evolution The future is amplifying! 1985 First publication of PCR by Cetus Corporation in Science (R. Saiki, S. Scharf, F. Faloona, K. Mullis, G. Horn, H. Erlichand N. Arnheim) The thermostable DNA polymerase, Taq, (enabling automation of PCR) declared molecule of the year by Science. Hoffmann-La Roche Inc. and Cetus agree to begin development of diagnostic applications for PCR Cetus scientists, D. Gelfand and S. Stoffel, named Distinguished Inventors for purifying Taq DNA polymerase. First forensic PCR kit is introduced for HLA DQA. Cetus scientists, H. Erlich and K. Mullis, recieve the Biochemical Analysis Award from the German Society of Clinical Chemistry. * European Launch ** US Launch

23 PCR Evolution The future is amplifying! 1991 First publication of TaqMan method by Cetus. Hoffmann-La Roche Inc. acquires from Cetus worldwide rights and patents to PCR. Roche Molecular Systems, exclusively devoted to development of PCR, is founded. RT-PCR is developed using a single thermostable polymerase, rtth, facilitating diagnostic tests for RNA viruses. First publication on thermostable Reverse Transcriptase by Cetus Scientists. Cetus scientist, H. Erlich, recieves the Advanced Technology in Biotechnology (ATB 91) Milano Award from the International Federation of 1992 Clinical Chemistry AMPLICOR HCV* is introduced as the first standardised RNA PCR kit. Kary Mullis receives Japan Prize and shares Nobel Prize in Chemistry for conceiving the concept of PCR. AMPLICOR C. trachomatis** is launched. * European Launch ** US Launch

24 PCR Evolution The future is amplifying! 1995 COBAS AMPLICOR *, the first automated system for routine diagnostic PCR, is launched. First standardised quantitative PCR kits, AMPLICOR HIV-1 MONITOR * and AMPLICOR HCV MONITOR *, are launched AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis** and AMPLICOR Enterovirus* tests are launched. AMPLICOR HIV-1 MONITOR ** test is launched COBAS AMPLICOR ** Analyser is launched COBAS AMPLICOR MONITOR * System is launched. * European Launch ** US Launch

25 PCR Amplifies a Targeted Sequence Target Sequence Supercoiled DNA Strand DNA Strand Double Helix DNA Strand Chromosome

26 Cell Division Parent Cell Prophase Chromosomes align at the equatorial (metaphase) plate Metaphase (Centromeres divide) Sister chromatids separate during anaphase, becoming chromosomes Two Daughter Cells

27 DNA Structure Hydrogen Bonds Cytosine Adenine Thymine Guanine Deoxyribose (Sugar molecule) Phosphoric Acid (Phosphate molecule)

28 DNA Double Helix

29 Phosphate Molecule Deoxyribose Sugar Molecule Bonding of Bases Base, Sugar and Phosphate Groups Hydrogen Bonds Sugar-Phosphate Backbone

30 PCR Cycle - Step 1 - Denaturation by Heat Target Sequence Target Sequence

31 PCR Cycle - Step 2 - Biotinylated Primer Pair Anneals to Ends of Target Sequence Target Sequence Biotin Biotin 5 Primer 2 3 Primer Target Sequence

32 PCR Cycle - Step 3 - Taq DNA Polymerase Catalyses Primer Extension as Complementary Nucleotides are Incorporated Target Sequence Primer 1 5 Biotin Biotin 5 Primer 2 Taq DNA Polymerase Target Sequence

33 End of the 1st PCR Cycle - Results in Two Copies of Target Sequence Target Sequence Biotin Biotin Target Sequence

34 Target Amplification 1 cycle = 2 Amplicon 2 cycle = 4 Amplicon 3 cycle = 8 Amplicon 4 cycle = 16 Amplicon 5 cycle = 32 Amplicon 6 cycle = 64 Amplicon 7 cycle = 128 Amplicon No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target ,048, ,073,741,824

35 Reverse Transcription - Step 1 - Biotinylated Primer Anneals to Target RNA Sequence Target RNA Sequence Primer 5 Biotin

36 Reverse Transcription - Step 2 - rtth DNA Polymerase Catalysing Primer Extension by Incorporating Complementary Nucleotides Target RNA Sequence Primer 5 Biotin rtth DNA Polymerase

37 End of Reverse Transcription - Step 3 - Results in Synthesis of Complementary DNA (cdna) to the RNA Target Sequence Target RNA Sequence cdna Biotin

38 PCR Step 1 - Denaturation by Heat Target RNA Sequence cdna Biotin

39 PCR Step 2 - Annealing of Primer to cdna Biotin Primer Biotin cdna

40 PCR Step 3 - rtth DNA Polymerase Catalyses Primer Extension Biotin Primer rtth DNA Polymerase Biotin cdna

41 End of 1st PCR Cycle - Yields a Double-Stranded DNA Copy (Amplicon) of the Target Sequence Biotin Amplicon cdna Biotin

42 PCR End of Second Cycle - rtth DNA Polymerase Catalyses Primer Extension Biotin Amplicon Biotin Biotin cdna Biotin

43 PCR - Exponential Amplification: Each New Cycle Doubles the Amount of Target, Resulting in an Exponential Increase in Amplicon Single strand RNA 1 cycle = 1 (RNA/cDNA hybrid) 2 cycle = 2 3 cycle = 4 4 cycle = 8 5 cycle = 16 6 cycle = 32 7 cycle = 64

44

45 Myelomada moleküler yöntemler?

46 Recurrent genomic abnormalities in Multiple Myeloma (MM) Aberration Incidence Prognosis hyperdiploidy 50-60% favorable hypodiploid, and/or neartetraploid variants associated with translocations poor loss TP53 10% poor loss 13q14 50% unknown gain CKS1B 40% poor Loss 1p 30% poor rearrangements (FRFR3/MAF/CCND1, CCND3,MAFB) 5-25% (depending on the partner gene) Favorable to poor (depending on the partner gene) Conventional Karyotyping 30% abnormal (often complex) Interphase FISH on plasmacells (CD138+) Molecular karyotyping on plasmacells (CD138+) (20 ng DNA required)

47 array genomic profile of MM Whole chromosome gain partial loss 13q Hyperdiploidy 1q gain Whole chromosome gain Near-tetraploidy

48 Array CGH (OGT 180K) SNP array (Affymetrix Cytoscan HD) Price + _ Hands on work + _ Overal time ± ± Multiplexing + _ input DNA _ + Resolution _ + Size accuracy of LOH detection Sensitivity for mosaicism Matched sample in same hybridization Polyploidy detection using SNPs _ + + _ + _ ± +

49

50

51

52

53

54

55

56

57

58

59

60

61

62

63 Myeloma sınıflaması; A-Biolojik/genetik sınıflama B-Prognostik sınıflama Tanı esnasında t(4;14) varlığı agresif hastalıkla ilişkilidir ve Bortezomibe kadar, klasik tedaviler gidişatı çok değiştirememiştir. Bortezomib bu negatif etkiyi ortadan kaldırmıştır. C-Prediktif sınıflama Şimdilik geçerli bir sınıflama değildir. CCND1, FGFR3 konularında çalışmalar devam etmektedir.

64 Biyolojik/genetik sınıflama PRİMER GENETİK BOZUKLUK Hiperdiploidi (multiple trizomiler, minimal IgH translokasyonu) (erkek, yaşlı,daha iyi prognoz, kemik hastalığı daha fazla) Non-hiperdiploidi Tanı esnasında dökümante edilen genetik bozukluk, genelde, hastalık seyri boyunca değişmemektedir. Hiperdiploid olup kromozom 13 bozukluğu olanlarda yaşam süresi daha kısadır. Tüm myelomların %15 inde t(11;14) görülür. Cyclin D1 upregulasyonuyla karakterize bu durumda, genelde CD 20 ekspresyonu, lenfoplazmasitik morfoloji, hiposekretuvar hastalık ve lambda hafif zincir varlığı eşlik eder. İyi prognostik etkisi olduğu iddia edilmekle birlikte, bu konu net değildir. Genelde, t(4;14) varlığı kötü prognozla ilişkilidir. MMSET ve FGFR3 etkilenir.fgfr3 upregülasyonuna karşı TKI-258 adlı molekül geliştirilmiştir. MGUS aşamasında olmadığı, daha çok SMM evresinde rol aldığı saptanmıştır. MM vakalarının %5-7 sinde t(14;16) saptanmıştır. IgH bölgeyi ilgilendirir. Beraberinde del 13, IgA izotip birlikteliği sıktır.

65 Sekonder genetik bozukluklar Delesyon ya da monozomi 13 varlığının prognostik farkı tam bilinmiyor. Genelde 13. kromozom bozuklukları kötü prognostiktir. Genelde nonhiperdiploid MM ile birliktedir ve muhtemelen kötü prognostik özelliği buradan gelmektedir. MM hastalarında, en önemli prognostik gösterge del 17p olarak saptanmıştır. Ayrıca, beraberinde daha agresif hastalık, daha çok ekstra-medullar hastalık ve hiperkelsemi, SSS tutulumu ve HDTye kısa süreli yanıt gibi özellikleri de getirir. (Plazma hücreleri malign özellik kazandığında ekstra-medüller yaşamlarını sürdürebilmekte, ancak normal p53 varlığında apoptozise gitmektedir) MGUS vakalarında seyrek olarak saptanır. Kromozom 1 bozuklukları, MM hastalarında kısa OS ile ilintilidir. Bunu tam olarak nasıl yaptığı bilinmiyor. NF-kB aktivasyonu, en az %50 vakada vardır ve devamlıdır. Bu vakalardan TRAF3 ekspresyonu düşük olanlar Bortezomib tedavisine daha iyi yanıt verir.

66 Sekonder genetik bozukluklar K-ras mutasyonu olanlarda prognoz nispeten kötüdür. N-ras için bu gösterilememiştir CD27 yi barındıran 12p delesyonu vakaların %12 sinde saptanmıştır ve kötü prognostiktir. P16 metilasyonu patogenezde rol oynar ancak, muhtemelen, prognostik değeri yoktur. Deişik mirna ların rolü olduğunu gösteren çalışmalar da mevcuttur (mirna 21,miR-106b, mir-32, mir 17-92). Bunlar özellikle MGUS dan klinik MM ye geçişte önemlidir. MM vakalarının %20 sinde 16q delesyonu ya da farklı mutasyonlarını bildiren yayınlar mevcuttur (özellikle LOH).

67

68

69

70

71

72 Gene expression profiling Yüksek mitotik hastalıkta CG, düşük mitoz ve düşük tümör yükü varlığında FISH yardımcıdır. Micraarray yöntemi ile binlerce gen incelenebilir. MM için 2 açıdan GEP önemlidir. 1.MM heterojen bir hastalıktır. Kendi içinde zamanla değişim gösterebilmektedir. 2. MM etyopatogenezinde rol oynayan genetik bozukluklar kompleks ve çoklu ve değişkendir. Bu moleküler lezyonlarla klinik sonuçlar arasında korelasyon kurmak zordur. MM da dekzametazon direnci, ilk defa GEP yöntemiyle gösterilmiştir. 2ME2 (2- methoxyestradiol) tarafından module edilen gen grubu ile Dex direnci arasındaki bağlantı gösterilmiştir. MM da Ig ağır ve hafif zincirlerin tiplerine göre gen expresyon profilleri değişebilmektedir. Mip-1 alfa geni kappa myelomda fazla expresse edilmekte ve kemik hastalığıyla ilgili olduğu bilinmektedir. Özgül moleküler imzaların zaman içinde, özellikle MM mikroçevresinde değiştiği (N-Ras gibi) ve bunun IL-6 ile ilişkili olduğu da gösterilmiştir.

73 GEP Normal hücreler ile MM arasındaki fark, MGUS ile MM arasındakinden daha fazladır. GEP olarak, MGUS ile MM çok yakındır. CD138+ normal ve malign plazma hücreleri GEP yönetmiyle incelendiğinde, çoğu açıdan benzer bulunurken, RAD-51 ve Amphiregülin genlerinin, malin hücrelerde fazla sentezlendiği saptanmıştır. Cyclin D1 gen expresyon deregulasyonu, MM progresyonunda erken süreçlerden birisidir.

74 PROTEOMICS Çok sayıda tekniği ve teknolojiyi bir arada kullanmayı gerektirir. Klinikte kullanılan tekniklere üstünlüğü henüz gösterilememiştir. En üstün metodu kullansak bile, elimizdeki örneğin tüm protein içeriğini değerlendirmek mümkün değildir. Şu an sadece tamamlayıcı amaçlarla kullanmak mümkün SELDI-TOF metodu ile MM hücrelerinin aşırı miktarda 65 kda bir proteien sentez ettiği ve bunun SDS-PAGE ile chondhroitin 1 synthase olduğu saptanmıştır. Bu enzimin özellikle mikroçevredeki Notch sinyal sistemi ile yakın ilişkide olduğu bilinmektedir. Bir başka çalışmada, hem MM hem de WM hücre dizilerinde germinal center kinaz (GCK) sentezinin olmadığı, bunun da her iki hastalığın post-germinal merkez hastalıklar olduğunu doğruladığı gösterilmiştir. Bir başka çalışmada, Bortezomible muamele edilmiş MM hücre dizisinde PI- 3K/Akt yolak proteinlerinin sentezinin azaldığı gösterilmiştir. Protein-protein ilişkisini göstermek açısından faydalı yöntemlerdir.dexresistan hücre dizisinde HSP-27 ekspresyonu artmıştır. Hsp-27 antiapoptotik etkiye sahiptir ve bunu Aktinle etkileşerek yaptığı gösterilmiştir.

75

76

77 Once upon a time. Teşekkürler.