IGF-I ELISA REF AC-27F1 96

Transkript

1 IGF-I ELISA İnsan serum veya plazmasında Insulin benzeri büyüme faktörü I (IGF-I) ün kantitatif tespiti için immunoenzimometrik test (IEMA) REF AC-27F1 96

2 Kullanım Amacı 2 In Vitro Diagnostik Kullanım için İnsan serum veya plazmasında Insulin benzeri Büyüme faktörü I ün kantitatif tespiti kullanılan bir immunoenzimometrik testtir [IEMA]. Yöntem bağlayıcı proteinlerden gelen girişimleri engellemek için ön işlem içerir. Özet ve Açıklama Insulin benzeri büyüme faktörü I (IGF-I) 70 amino asit içeren (7650 daltons) tek zincirli bir polipeptidtir ve dolaşımda bulunan ilgili insulin benzeri büyüme faktörlerinden biridir. Molekül proinsülinlü yaklaşık% 50 homolog dizisini gösterir ve insüline benzer biyolojik aktiviteye sahiptir. Peptit, yüksek derecede bağımlı büyüme hormonuna (GH) bağlıdır ancak GH-bağımlı olmayan salgısının kanıtı büyümektedir. IGF-I in mitojenik etkileri ve kıkırdak sülfasyonunun yükselmesi dahil olmak üzere sayısız büyüme destekleyici etkileri vardır. Ayrıca iskelet ve diğer vücut sıvıları üzerinde büyüme hormonu büyüme faaliyetleri desteklemektedir. Serum IGF-1 in hemen hemen hepsi altı sınıf (IGF-BPs 1-6) olarak kabul edilen spesifik IGF bağlayıcı proteinlere bağlanarak dolaşır. B P 3, a s it - l ab i l a l t b ir i mi ve I G F - 1 s a hi p d a lt o n u n ü ç l ü k o m pl e k s i n de n ol u ş a n I G F i n m aj o r b a ğ l a yı c ı p r ot e i nl e ri ol a r a k d ü ş ü n ü l m e kt e d ir. Serum IGF-I in ölçümü büyüme bozukluğu olan çocuklarda ve akromegali tanısında ve takibinde kabule edilen bir değer taşımaktadır. IGF-I konsantrasyonları yaş, beslenme durumu, vücut kompozisyonu ve büyüme hormonu salgılanması ile değişir. Tek bazal IGF-I tespiti çocuklarda ve akut bakım hastalarının beslenme desteği çalışmalarda boy kısalığı değerlendirilmesinde yararlıdır. Akromegali teşhisi için, bir tek IGF-belirlenmesi rasgele bir GH belirlenmesinde daha güvenilir olarak kabul edilir. Yöntem Açıklaması Hasta örnekleri bağlayıcı protein inaktive etmek için bir reaktif ile kısa bir süre için inkübe edilir ve daha sonra deney için seyreltilir. IDS IGF-ELISA kiti içinde arıtılmış koyun poliklonal anti-igf polistiren mikrotitre kuyucuklarının (katı faz veya antikor kaplı) iç yüzeyi üzerine kaplanmıştır. Ön-işlem görmüş, seyreltilmiş numune daha sonra oda sıcaklığında 2 saat boyunca antikorla kaplı kuyucuklar içinde, yabanturpu peroksidaz işaretli monoklonal anti-igf-i ile birlikte inkübe edilir. Kuyular yıkanır ve bir tek bileşen kromojenik substrat (tetrametil-benzidinin formülasyonu) rengi geliştirmek için ilave edilir. Durdurulmuş reaksiyon karışımının absorbansı bir mikrotitre plaka okuyucu ile okunur, renk yoğunluğu numunede bulunan I-IGF miktarı ile orantılı olarak artar. Uyarılar ve Önlemler IDS IGF-1 ELISA kiti yalnızca in vitro diagnostik amaçlı kullanım içindir, insanlar ve hayvanlarda kullanılamaz. Bu ürünün kullanım talimatlarına uygun kullanılması zorunludur. Kullanım talimatlarına aykırı kullanımlara bağlı oluşan hata ve kayıplardan IDS limited sorumlu değildir. DİKKAT: Bu kit insan ve/veya hayvan kaynaklı materyal içerir. Kit reaktifleri infeksiyon ajanlarını içerebilir. Bu kit laboratuar uygulamalarına uygun şekilde saklanmalı, kullanılmalı ve imha edilmelidir. Reaktiflerin imhası yerel yönetmeliklere uygun olarak yapılmalıdır. Hasta Serumu: Bu ürünün hazırlanmasında kullanılan İnsan materyalli Kalibratör CAL ve Kontrol CTRL İnsan İmmün Yetmezlik Virüsü karşı antikor varlığı (HIV I ve II), Hepatit B yüzey antijeni, Hepatit C antikoru için FDA önerilen analizleri ile test edilmiş ve negatif bulunmuştur. Hiçbir test bulaşıcı ajanların bulunmadığına dair tam bir güvence veremediği için reaktifler Biyogüvenlik Seviyesi 2 göre ele alınmalıdır. Sodyum Azid Xn.Z a r a r l ı. K alibratörler CAL v e Kontroller CTRL >0.1% (w/w) (<1%) sodyum azid (NaN3) içerir. R22 Yutulması Zaralıdır. R52/53 Sudaki organizmalar için zararlı, su ortamında uzun süreli olumsuz etkilere neden olabilir. S46 Yutulması durumunda hemen doktora başvurun ve etiketi gösterin. S36/37 Uygun koruyucu giysi ve eldiven kullanın. S60 Bu malzeme ve/veya kabı tehlikeli madde olarak atılmalıdır. Bu kitte bazı reaktifler Yüksek patlayıcı metal azitleri oluşturmak üzere kurşun, bakır tesisat ile reaksiyona girebildiği için koruyucu olarak sodyum azit içerir. Attıkta birikmesini önlemek için büyük miktarda suyla yıkayın. Tetrametilbenzidin TMB Substrat SUBS 3,3,5,5 -tetramethylbenzidine içerir. R21/22 Solunduğunda ve deri ile temasında zaralıdır. S36/37 Uygun koruyucu giysi ve eldiven kullanın.

3 1M sülfürik asit Stop Solüsyon H 2 SO 4 1M Sülfürik asit içerir. R36/38 Gözü ve deriyi tahriş eder. S26 Göz ile teması sonucunda bol su ile yıkayın ve medikal destek alın. S36/37 Uygun koruyucu giysi ve eldiven kullanın. Reaktiflerin hazırlanması Kalibratör CAL ve Kontroller CTRL : K alibratörler CAL ve Kontroller CTRL liyofilize dir. 0.5 ml distile su ile çözündürülmelidir ve dakika oda sıcaklığında bekletilmelidir. Tama men çözündüğünden emin olduktan sonra birkaç kez alt üst edilmelidir. Eğer Kalibratörler CAL veya Kontroller CTRL birden daha fazla kullanılacaksa, (-20 C) de dondurulmalıdır (<30 dakika çözünme sonrası). Donmuş halde bulunan tekrar kullanılacak Kalibratör ve Kontroller çözünene kadar oda sıcaklığında bekletilmeli ve sonra karıştırılmalıdır. Yıkama Solüsyonu: 20x 950 ml distile veya deiyonize suya Wash Concentrate WASHBUF şişe içeriğini ekleyin ve karıştırın. Oda sıcaklığında saklayın.tüm reaktifler kullanıma hazırdır. Tüm reaktifler kullanılmadan önce oda sıcaklığına gelmesini bekleyin. Reaktifler deneyde kullanmadan önce alt üst edilerek karıştırılmalıdır. Raf ömrü ve Reaktiflerin saklanması Bu kit etiketi üzerinde bulunan kullanım tarihine kadar stabildir. Tüm reaktifleri 2-8 C de saklayın. Çözünmüş Kalibratör CAL ve Kontroller CTRL 8 haftaya kadar -20 C de saklanmalıdır. Kit reaktiflerinin olası bozulma Endikasyonları 1.Reaktiflerin herhangi bir anormal partikül madde varlığında. 2.Maksimum absorbans da bir azalmada. 3. Normal konumundan eğrisinin eğiminde bir kayma olduğunda görülür. Örnek Toplama ve Saklama Test serum veya plazma örnekleri kullanılarak yapılmalıdır. Örnekler toplandıktan sonra en kısa sürede ayrılmalıdır. -20 C'de uzun süreli saklanır. Örnekleri tekrar dondurma / çözündürmeden kaçının. Not: Numunelerin yanlış kullanım ve saklanması IGF-I kaybına neden olabilir. 3

4 Prosedür Gerekli Materyaller 1. CAL Kalibratörler ( REF AC-2701A - AC-2701F): IGF-I liyoflize insan serumu içerir ve <1% sodyum azide (0.09% çöünmüş). Her Kalibratör değeri tam QC Raporu, şişe başına 0.5 ml, kit başına 6 şişe yazdırılır. 2. MICROPLAT - Antikor kaplı pleyt ( REF AC-2702W): Kurutuculu folyo kese içinde 12 x 8 kuyulu stripler olan polistiren kuyuların iç yüzeyi ile bağlantılı koyun anti-igf-poliklonal antikor ile kaplı mikropleytler. 3. ENZYMCONJ - Enzime Konjugat ( REF AC-2703): Yaban turpu peroksidaz, protein, enzim stabilizatörleri ve koruyucu maddeye bağlı fare anti-igf monoklonal antikor içeren fosfat buffer tuz. Şişe içeriği 22 ml. Gerekli fakat sağlanmayan materyaller 1. T ek kull anı mlı k 12 x 75 mm plastik tüp µl ve 50 µl çekebilen ayarlanabilir hassas pipet µl ve 1 ml ayarlanabilir hassas pipet, Eppendorf Multipipet 4780, veya benzeri µl ve 200 µl ayarlanabilir hassas çok kanallı pipet. 5. V or t e k s. 6. Otomatik mikropleyt yıkayıcı (opsinoyel). 7. F ot ometri k mi kr opl eyt okuyucu ve dat a anali z yazılı m ı. 4. CTRL 1-2 Kontroller ( REF AC-2705A - AC-2705B): IGF-I liyoflize insan serumu içerir ve <1% sodyum azide (0.09% çöünmüş). Şişe içeriği 0.5 ml, kit içeriği 2 şişedir. 5. H 2SO 4 - Stop Solüsyonu ( REF A C-2706): 1M sülfürik asit, şişe içeriği 12 ml. 6. RELEASREAG - Releasing Reagent ( REF AC-2707): Bağlayıcı proteinlerden gelen IGF-I ayrıştırmak için kullanılan özel reaktif. Şişe içeriği 21 ml. 7. SUBS - TMB Substrat ( REF AC-SUBS): Tetrametilbenzidin (TMB) ve hidrojen peroksit bileşimli suyu bir çözelti. Şişe başına 30 ml. 8. SAMPDIL - Numune Diluenti ( REF AC-270B): Koruyucu içeren fosfat tamponlu tuz. Şişe başına 50 ml. 9. WASHBUF 20x - Yıkama Concentrate ( REF AC-WASHL): Tween içeren fosfat tamponlu tuz. Şişe içeriği 50 ml. 4

5 Test Prosedürü Reaktiflerin hazırlanması de açıklandığı gibi reaktiflerin hazırlanması veya çözünmesi. 1. Kalibrator CAL, Kontrol CTRL ve örneğin her biri için işaretli plastik tüp hazırlanır. 2. Kalibrator CAL, kontrol CTRL veya örneklerden işaretli tüplerine 25 µl e k l e y i n. 3. H er t ü p e 100 µl Releasing Reagent RELEASREAG e kl e yi n. T ü m t ü p l er i v o r t e k sl e yi n v e 1 0 d a ki k a C de inkübe edin. 4. H er b i r t ü p e 1.0 ml Sample Diluent SAMPDIL ekleyin. Tüpleri vorteksleyin. Şimdi örnekler kullanıma hazırdır. 5. Çift olarak Antibody Coated Plate MICROPLAT uygun kuyularına dilüe edilmiş Kalibratör,Kontrol veya örnekten 50 µl ekleyin. Not: 10 dakika içinde dağıtım yapılmalıdır. 6. Çok kanallı pipet kullanarak tüm kuyulara 200 µl Enzyme Conjugate ENZYMCONJ ekleyin. 2 saat ve 2 saat 15 dakika arasında C de inkübe edin. 7. Yıkama Solüsyonu ile üç kez bütün kuyuları yıkayın: a. Otomatik pleyt yıkayıcı: Kuyu başına en az 300 µl Yıkama Solüsyonu dağıtması için ayarlayın. 3 döngü aspite edin ve doldurun. b. M anuel yı kama: Alt eder ek kuy u içeri ği ni boşaltı n. B üt ün kuyul ar a 250 µl Wash Solution ekleyin. Birkaç kere tekrar edin ve atın.bir sonraki adıma geçmeden önce artan Yıkama Solüsyonunu emici bir mendil üzerine pleyti ters çevirerek uzaklaştırın. 7. Ç ok kanallı pipet kullanarak tüm kuyulara 200 µl TMB Substrate SUBS ekleyin C de 30 dakika inkübe edin. Not: TMB Substrate kolayca kontamine olur. Sadece şişe çalışması için gerekli miktarı çıkarın. Kullanılmayan TMB Substrate atın. Şişeye geri dökmeyin. 9. Ç ok kanallı pipet kullanarak tüm kuyulara 100 µl Stop Solution H 2 SO 4 ekleyin. 10. Stop solüsyonu eklendikten 30 dakika içinde bir mikroplaka okuyucu kullanılarak 450 nm de (referans 650 nm) absorbansı ölçün. Kalite Kontrol Kontrol örneklerinin düzenli kullanımı sonucu günlük validasyonun sağlanması tavsiye edilir. İki kit kontrolleri bulunur. Kontroller bilinmeyen olarak test edilmelidir. Kalite Kontrol çizelgeleri test performansının takipini sağlanmalıdır. Sonuçların hesaplanması Her Kalibratör, Kontrol ve bilinmeyen numune için ortalama absorbans hesaplayın. IGF-I konsantrasyonu karşı ordinat her Kalibratörü için ortalama absorbans çizerek log-log grafik kağıdı üzerine bir kalibrasyon eğrisi hazırlayın. Mikrogram / L olarak kalibrasyon eğrisi her kontrolü ve bilinmeyen numune değerlerini okur. Düşük değerlerin tahmini için lineer-lineer grafik kağıt üzerinde düşük kalibratör değerlerinin konsantrasyonuna karşı absorbansın çizilmesi önerilir. Bilinmeyen bir numune için sonuçlar eğrisinden direk olarak okunabilir. Alternatif veri azaltma teknikleri çalışılabilir ancak kullanıcılar seçilen eğriye uygun ve kabul edilebilir sonuçlar verdiğini kabul etmelidir. Düzleştirilmiş spline eğri tipleri tavsiye edilir. Birim dönüştürücü: X µg/l x x 7.63 Y nmol/l Kalibrasyon IDS IGF-ELISA kiti İnsülin-benzeri Büyüme için Uluslararası Referans Reaktifi Faktör-I, IGF-I, 87/518 kodlu kitlere karşı kalibre edilmiştir. 5

6 Numune Test Verisi Bu veri gösterim içindir ve herhangi bir numune sonuç hesaplaması için kullanılmamalıdır. Kuyu Açıklama Tekrarlı Absorbans Ortalama Absorbans Sonuç A1, A2 B1, B2 C1, C2 D1, D2 E1, E2 F1, F2 Kalibratör 0 (0 µg/l) Kalibratör 1 (16 µg/l) Kalibratör 2 (32 µg/l) Kalibratör 3 (107 µg/l) Kalibrator 4 (357 µg/l) Kalibratör 5 (1137 µg/l) G1, G2 H1, H2 Örnek Örnek Kalibrasyon Eğrisi Aşağıdaki sadece bu numune kalibrasyon eğrisi içindir Absorbance IGF-1 (μg/l) 6

7 Kullanım limitleri 1. En yüksek kalibratörü aşan analit konsantrasyonları içeren kuşkulanılan örnekler dilüsyonlanarak test edilmelidir. 2. Herhangi bir tanı için doktorun hastanın klinik geçmişi ve elindeki diğer bilgileri yorumlanması gerekir. 3. Aşağıdaki maddeler test edilmiştir ve IDS IGF-I testinde engeli bulunmuştur: Hemoglobin Bilirubin Yağ 500 mg/dl a kadar test edilir to 30 mg/dl a kadar test edilir 4000 mg/dl a kadar test edilir 4. Hook etkisi konsantrasyonu mg / L kadar IGF-I kullanılarak test edildi. Hook etkisi gözlenmemiştir. Beklenen değerler Aşağıdaki aralıklar the IDS IGF-I ELISA kit kullanılarak tespit edilmiştir ve manuelde verilir. Her laboratuar yerel popülasyonuna göre aralığını belirlemelidir. Yaş (yıl) n µg/l Normal ar al ı k < > > > > > > > > > > > Akromegalics Not:Her numune tipi için bulunan beklenen değerlerin mutlak aralıkları vardır - her aralık ilgili numune tipi için minimum değerden maksimum değere sahiptir. Performans verileri Doğruluk IDS IGF-ELISA kiti IGF-I kantitatif tespitinde iki sandviç yönlü immunoradyometrik ölçüm ile karşılaştırıldı. Popülasyonda 67 numune IGF-I [ µg/l] aralığındadır. En küçük kareler regresyon analizi karşılaştırmalı veriler ile gerçekleştirildi: y = 0.45 [x] ; Korelasyon katsayısı (r) = Özgünlük IGF-II, insülin ve proinsülin potansiyel çapraz reaksiyon ve müdahale "0" ve "150" mikrogram / L Hassasiyeti Intra-Assay Variation (n=20) Inter-Assay Variation (n=38) Ort. Değer %CV Ort.Değer %CV Duyarlılığı Zero Kalibratör 20 tekrarlı çalışmanın ortalaması artı 2 standart sapma karşılık gelen konsantrasyon olarak tanımlanır hassasiyeti, 3.1 mikrogram / L'dir Doğrusallık Doğrusallık düşük bir hasta örneği ile yüksek hasta seyreltilerek değerlendirildi. Örnek Ölçülen Beklenen % M/E A A+0.125B A+0.250B A+0.375B A+0.500B A+0.625B A+0.750B A+0.875B B Ortalama 99 IGF-I Bağlayıcı Proteinler inaktivasyonu mikrogram / L olan IGF-I konsantrasyonları ile otuz beş numune asit-etanol ekstraksiyonu ve IDS Releasing Reaktif karşılaştırılarak test edildi. Asit etanol sonuçları 92.9% Releasing Reaktif sonuçlarıdır(cv 20.5%). Geri getirme Geri getirme test öncesi numuneler için IGF-I ekleyerek değerlendirildi. Numun Konc. IGF-I added Ölçülen Recovery Recovery (%) Mean 95 Kalibratörleri için 1000 mg / L proinsülin ve 4,444 ug / L, IGF-II, 25 IU / L insülin eklenerek test edildi. Hiçbir girişim gözlenmedi. 7

8 Kaynakça 1. Daughaday WH, Mariz IK, Blethen SL. Inhibition of access of bound somatomedin to membrane receptor and immunobinding sites: a comparison of radioreceptor and radioimmunoassay of somatomedin in native and acid-ethanol extracted serum. J Clin Endocrinol Metab 1980: 51: Oppizi G, Petroncini M, Dallabonzana, et al. Relationship between somatomedin C and growth hormone levels in acromegaly: Basal and dynamic evaluation. J Clin Endocrinol Metab 1986: 67: 1348-I Barkan AL, Beitins IZ, Kelch RP. Plasma immunoreactive insulin-like growth factor 1 in acromegaly: Correlation with the degree of growth hormone hypersection. J Clin Endocrinol Metab 1988: 67: Baxter RC. Characterisation of the acid-labile subunit of the growth hormone dependent insulinlike growth factor binding protein complex. J Clin Endocrinol Metab 1988: 67: Rudd BT. Growth, growth hormone, and the somatomedins: A historical perspective and current concepts. Ann Clin Biochem 1991: 28: Bristow, AF., Gooding,.R.P. and Gaines - Das, R.E. [1990]. The International Reference Reagent for Insulin-Like Growth Factor-I. Journal of Endocrinology, 125, 191-I97. Döküman: AC-27PL-A Yayın: 17 Tarih: 7 Eylül

9 EXP TR Raf Ömrü LOT TR Lot numarası TR Katalog Numarası TR Üretici TR Test <n> sayısı TR In Vitro Diagnostik Medikal Kullanım TR Sıcaklık Limitleri TR Kullanım talimatı 9

10 Prosedür Özeti TEST 25 µl CAL, CTRL or SPE µl RELEASREAG C + 1mL SAMPDIL 50 µl MICROPLAT µl ENZYMCONJ C µl WASHBUF SOLN X µl SUBS C µl H2SO4 Immunodiagnostic Systems Ltd (IDS Ltd). 450nm UK Immunodiagnostic Systems Ltd (IDS Ltd), 10 Didcot Way, Boldon Business Park, Boldon, Tyne & Wear, NE35 9PD Tel: +44 (0) Fax: +44 (0) info.uk@idsplc.com USA Immunodiagnostic Systems Inc (IDS Inc.), 8425 N. 90th Street, Suite 8, Scottsdale, AZ Tel: Fax: info.us@idsplc.com Germany Immunodiagnostic Systems GmbH (IDS GmbH), Mainzer Landstrasse 49, Frankfurt am Main Tel: +49 (0) Fax: +49 (0) info.de@idsplc.com France Immunodiagnostic Systems France SA (IDS France SA) 153 Avenue D Italie, PARIS Tel: +33 (0) Fax: +33 (0) info.fr@idsplc.com Scandinavia Immunodiagnostic Systems Nordic a/s (IDS Nordic a/s), Marielundvej 30, 2. Sal, 2730 Herlev, Denmark Tel: Fax: info.nordic@idsplc.com