T.C. GAZİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ORAL PATOLOJİ BİLİM DALI

Transkript

1 T.C. GAZİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ORAL PATOLOJİ BİLİM DALI ODONTOJENİK KERATOKİST VE AMELOBLASTOMALARDA İNTERLÖKİN 1 ALFA VE İNTERLÖKİN 6 EKSPRESYONUNUN VE GEN POLİMORFİZMİNİN İNCELENMESİ DOKTORA TEZİ Dt. Burcu SENGÜVEN Tez Danışmanı Prof.Dr. Tülin OYGÜR ANKARA Aralık 2008

2 T.C. GAZİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ORAL PATOLOJİ BİLİM DALI ODONTOJENİK KERATOKİST VE AMELOBLASTOMALARDA İNTERLÖKİN 1 ALFA VE İNTERLÖKİN 6 EKSPRESYONUNUN VE GEN POLİMORFİZMİNİN İNCELENMESİ DOKTORA TEZİ Dt. Burcu SENGÜVEN Tez Danışmanı Prof.Dr. Tülin OYGÜR Bu tez Gazi Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından 03/ proje numarası ile desteklenmiştir. ANKARA Aralık 2008

3 i

4 İÇİNDEKİLER Kabul ve Onay İçindekiler Tablolar Şekiller Resimler Semboller, Kısaltmalar i ii iv v vi vii 1. GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER: Odontojenik Kistler ve Tümörler Ameloblastoma Odontojenik Keratokist (Keratokistik Odontojenik Tümör ve Ortokeratinize Odontojenik Keratokist) Keratokistik Odontojenik Tümör (KOT) Ortokeratinize Odontojenik Keratokist (OK) İnterlökinler İnterkölin İnterlökin Tek nükleotid polimorfizmi GEREÇ VE YÖNTEM İmmünohistokimyasal Yöntem: İmmünohistokimyasal Boyanmaların Değerlendirilmesi: Gen polimorfizmi analizi: DNA eldesi ve saflaştırılması: Polimeraz Zincir Tepkimesi (PCR ) 42 ii

5 PCR Ürünlerinin Uygun Kesim Enzimi ile Kesilmesi ve Restriksiyon Fragman Uzunluk Polimorfizmi (RFLP) Analizi: İstatistiksel Analizler: BULGULAR Klinik ve Histopatolojik Bulgular İmmünohistokimyasal Bulgular IL-1A (-889 C/T) Genotipi ve Alel Dağılımı TARTIŞMA SONUÇLAR ÖZET SUMMARY KAYNAKLAR TEŞEKKÜR ÖZGEÇMİŞ 113 iii

6 Tablolar Tablo 1: DSÖ nün 2005 Odontojenik Tümörler Sınıflaması Tablo 2: İnterlökin ailesi Tablo 3: ABL vakalarının yaşa göre dağılımı Tablo 4: ABL vakalarının boyutlarına göre dağılımı Tablo 5: KOT vakalarının yaşa göre dağılımı Tablo 6: KOT vakalarının boyutlarına göre dağılımı Tablo 7: OK vakalarının yaşa göre dağılımı Tablo 8: OK vakalarının boyutlarına göre dağılımı Tablo 9: IL-1α (-889 C/T) genotipi ve alel dağılımı Tablo 10: IL-1α (-889 C/T) genotipi ve alel dağılımının ABL ve KOT ile ilişkisi iv

7 Şekiller Şekil 1: IL-1 gen bölgesi Şekil 2: IL-6 gen bölgesi Şekil 3: PCR aşamaları Şekil 4: Restriksiyon enzimi ile kesim sonrası oluşan bantlar Şekil 5: Çalışma akış şeması Şekil 6: ABL vakalarının inflamasyon yoğunlukları Şekil 7: KOT vakalarının kist duvar kalınlıkları Şekil 8: KOT vakalarının inflamasyon yoğunluklarına göre dağılımı Şekil 9 OK vakalarının kist duvar kalınlıkları Şekil 10: ABL vakalarının IL-1α ve IL-6 ekspresyon derecelerine göre dağılımı Şekil 11: KOT vakalarının IL-1α ve IL-6 ekspresyon derecelerine göre dağılımı Şekil 12: OK vakalarının IL-1α ve IL-6 ekspresyon derecelerine göre dağılımı Şekil 13: IL-1A -889 bölgesine ait PCR ürünü örnekleri Şekil 14: IL-1A -889 bölgesinin NcoI restriksiyon endonükleaz enzimi ile analizi v

8 Resimler Resim 1: ABL de (a) stellat retikulum benzeri hücrelerde stoplazmik olarak izlenen ve (b) skuamöz metaplazi alanlarında yoğunluğu artan (ok) IL- 1α pozitifliği (DAB, a:x100, b:x200) Resim 2: ABL de (a ve b) stellat retikulum benzeri hücrelerde izlenen IL-6 ekspresyonu (ok) (DAB, a:x100, b:x400) Resim 3: KOT de (a) döşeyici kist epitelinde ve (b) kist bağ dokusundaki mononükleer inflamatuar hücrelerde (ok) saptanan IL-1α pozitifliği (DAB, a:x100, b:x200) Resim 4: Kist epitelinde ve bağ dokusundaki inflamatuar hücrelerde (ok) izlenen IL-6 pozitifliği (DAB, x100) Resim 5: Ortokeratinize (ok) odontojenik keratokistte döşeyici epitelde saptanan (a) IL-1 α ve (b) IL-6 pozitifliği (DAB, a:x100, b:x200) vi

9 Kısaltmalar ABL Ameloblastoma ACTH Adeno Kortikotropik Hormon bç Baz Çifti DAB Diaminobenzidin Tetraklorit DF Dental Folikül DK Dentigeröz Kist DNA Deoksiribo Nükleik Asit DSÖ Dünya Sağlık Örgütü ECM Ekstraselüler Matriks EGF Epitelyal Büyüme Faktörü ICAM İnterselüler Adezyon Molekülü IL İnterlökin IL-1α İnterlökin 1 Alfa IL-6 İnterlökin 6 KOT Keratokistik Odontojenik Tümör MFH Mononükleer Fagositik Hücre MMP Matriks Metalloproteinaz NBHK Nevoid Bazal Hücreli Karsinom OK Odontojenik Keratokist PBS Fosfatla Tamponlanmış Serum PCNA Proliferating Cell Nuclear Antigen PCR Polimeraz Zincir Reaksiyonu PGE 2 Prostaglandin E 2 RANKL NF k B Ligant Reseptör Aktivatörü RNA Ribonükleik Asit TNF Tümör Nekroz Faktör TNP Tek Nükleotit Polimorfizmi VCAM Vasküler Hücre Adezyon Molekülü vii

10 1. GİRİŞ Odontojenik kistlerin ve tümörlerin biyolojik davranışlarının ve prognozlarının belirlenmesi amacıyla yapılan çalışmalar son yıllarda giderek artmakta ve buna bağlı olarak aynı ölçüde değer kazanmaktadır. Çünkü oral bölgeyi ilgilendiren kist ve tümörler sadece fizyolojik değil, aynı zamanda estetik ve fonksiyonel problemlere de neden olmaktadır 1,2. Diğer sistemleri ilgilendiren tümörler üzerinde yapılan immunohistokimyasal ve ileri tetkikleri içeren genetik çalışmalar oral bölge lezyonlarında da uygulanmaktadır. Odontojenik kist ve tümörlerin çok büyük bir kısmının etyolojisi ve gelişim mekanizmaları halen bilinmemektedir. Bu lezyonların patogenezleri ve biyolojik davranışları ne kadar iyi anlaşılırsa, tanı ve tedavi yöntemlerinde o kadar başarılı olunabilir 1,3. Pek çok çalışmada büyük bir oranda odontojenik lezyonların hücresel özellikleri araştırılmış ve histogenetik mekanizmalarla ilgili görüşler ileri sürülmüştür 4. Bu kist ve tümörlerin kemik yıkım mekanizmalarını açıklamaya yönelik çalışmalar ise belki de tedavi yöntemlerini etkileyebilecek sonuçlar ortaya koyacaktır. Oral patoloji için en önemli konulardan birini oluşturan odontojenik kist ve tümörler içinde yer alan odontojenik keratokist ve keratokistik odontojenik tümör ile ameloblastoma, agresif klinik özellikler, yüksek nüks potansiyeli, ender olmamaları ve radikal tedavi yaklaşımlarına gereksinim göstermeleri gibi birçok ortak nokta paylaşırlar 5. Günümüzde bu lezyonlar ile ilgili, özellikle tümör süpressör genler, doku onkogenleri ve inflamasyon mediyatörlerini inceleyen araştırmalara sıkça rastlanmaktadır. Odontojenik tümörler için uzun yıllar kullanılan, Dünya Sağlık Örgütü nün 1992 yılında yayımladığı ve 2002 yılında tekrar gözden geçirilen sınıflama, 2005 yılında yeniden yapılmıştır 6,7. Yeni sınıflamaya 1

11 göre benign odontojenik tümörlerin alt gruplarında birkaç önemli değişiklik yapılmıştır. Odontojenik keratokist, gelişimsel odontojenik kistler içindeki sınıflandırılmasından çıkartılıp, benign odontojenik tümörler içinde keratokistik odontojenik tümör adıyla kendine yer bulmuştur. Terminolojideki bu değişikliğin sebebi odontojenik keratokistin gelişimsel kistik bir lezyondan ziyade, nüks etme potansiyeli ve büyük boyutlara ulaşabilmesi gibi özellikleri ile benign bir neoplazi gibi biyolojik davranış gösterdiği kanısının yaygınlaşmış olmasıdır. Ancak parakeratotik odontojenik keratokiste göre daha az nüks ettiği bilinen, daha masum bir lezyon olan ortokeratinize odontojenik keratokist bu sınıflamaya dahil edilmemiş, gelişimsel odontojenik kistler içindeki yerini korumuştur 6,8.Terminolojideki bu değişiklik yoğun tartışmalara sebep olmaktadır. Cerrahi patoloji pratiğinde halen odontojenik keratokist tanısı verilmektedir, çünkü bu antitenin sadece adının değişmesi, klinisyenler tarafından ele alınışında bir farklılık yaratmamıştır. Fakat bu durum, özellikle akademik yayınlarda, Dünya Sağlık Örgütü nün önerdiği ve kabul görüp tam anlamıyla yerleşmesi için zamana ihtiyaç duyan yeni isimlendirmeyi görmezden gelmemizi gerektirmemelidir. Yeni sınıflamaya dayanarak bu çalışmada keratokistik odontojenik tümör ve odontojenik keratokist (ortokeratinize tip) ayrı ayrı ele alınmış ancak, genel ve oral patoloji pratiğinde odontojenik keratokist isminin halen kullanıldığı düşünülerek çalışmanın başlığı değiştirilmemiştir. Sitokinler, genel olarak pro-inflamatuar ve inflamatuar olaylarda hücreler arası iletişimi sağlamanın yanında büyüme faktörü olarak birçok hücre üzerinde, kemik metabolizması üzerinde ve hatta tümör gelişiminde görevler üstlenirler 9. IL-1α ve IL-6, kemik dokunun yeniden şekillenmesinde görev alan en etkili sitokinlerdendir. Kemik üzerine etkili ve çok fonksiyonlu bu inflamatuar sitokinler kemik yıkımına, osteoklast diferansiyasyonunu ve/veya aktivasyonunu etkileyerek, aynı zamanda yıkım enzimlerinin 2

12 üretimine sebep olarak katkıda bulunurlar 10. Birçok hastalıkta görülen kemik kaybını ve doku yıkımını başlatma potansiyeline sahiptirler. Kemik yapım ve yıkım olayları bir arada ve bir denge içinde yürür. Ancak kemik yıkımını teşvik eden pro-inflamatuar ve/veya inflamatuar sitokinlerin göreli artışı bu dengeyi kemik yıkımı lehine kaydırır 11,12. Sitokinlerin ekpresyonunu düzenleyen genetik faktörlerin hastalığın klinik şiddetini, hastalığın ilerlemesini ve hastalığa yatkınlığı etkileyebileceği düşünülmektedir. Hatta sitokinlerle ilgili spesifik genlerin hastalık etyolojisindeki yerinin belirlenmesiyle, bu genin neden olduğu biyokimyasal değişikliğin düzeltilmesine yönelik tedavilerin geliştirilmesinin gündeme gelebileceği düşünülmektedir Tek nükleotid polimorfizmi, DNA dizisindeki tek bir nükleotid (A, T, C veya G) çiftinde değişikliğin olmasıdır. Polimorfizmler sıklıkla, popülasyonda % 1 den daha az yaygın bir varyantın olduğu bölge olarak da tanımlanırlar. Bu varyantlar düşük sıklıkta olmalarına rağmen bazı durumlarda çok önemlidirler. Farklı tipteki tek nükleotid polimorfizmleri, bir proteinin fonksiyonunu veya regülasyonunu ve ekspresyonunu değiştirebilir. Polimorfizmler hastalığa yol açmayan, fakat hastalık için yatkınlık yaratabilen DNA değişikliği olarak bilinir. Aynı zamanda polimorfizmler, hastalıkların prognozu veya her bireyin tedaviye verdiği yanıt gibi farklılıkları da açıklayabilir 18. Sitokinlerin sentezini etkileyen genetik polimorfizmlerin konak cevabını da değiştireceği ve hastalığın şiddetinde görülen farklılığı açıklamada yardımcı olacağı düşünülmektedir 14. Çünkü hastalıklar her bireyde farklı seyir izler ve bilindiği gibi her birey, muhtemelen genetik olarak belirlenmiş, farklı düzeyde sitokin salınımları sergiler. Bu çalışmada, nispeten sık görülen ve en agresif odontojenik lezyonlar olan keratokistik odontojenik tümör, odontojenik keratokist ve ameloblastomalarda, IL-1α ve IL-6 ekspresyonunu ve gen polimorfizmi 3

13 araştırılacaktır. Böylece bu tümörlerin kemik içinde geniş yıkımlar yaparak büyük boyutlara ulaşabilmelerinde bu sitokinlerin rol alıp almadığı anlaşılmaya çalışılacaktır. 4

14 2. GENEL BİLGİLER: 2.1. Odontojenik Kistler ve Tümörler Kist, içi sıvı, yarı katı veya katı materyalle dolu ve çevreşi epitelle çevrili patolojik boşluk olarak tanımlanır. Maksilla, mandibula ve perioral bölgenin kistleri insidansları, histogenezleri, davranışları ve tedavileri açısından birbirlerinden farklılıklar gösterir. Oral patolojide kistler odontojenik kistler, non-odontojenik kistler, psödokistler ve boyundaki yumuşak doku kistleri olarak ayrılabilir 19. Odontojenik kistler ise kendi içinde inflamatuar ve gelişimsel odontojenik kistler olarak ikiye ayrılır 1. Günümüze kadar birçok araştırmacı çeşitli sınıflamalar tarif etmiştir. Çene kistleri sınıflanırken, kistin anatomik lokalizasyonu, dişlerle olan topoğrafik ilişkisi, döşeyici epitelin histogenetik kökeni ve kistin kendine ait yapısal karakteri gibi özellikler göz önünde bulundurulmaktadır 1,19. Odontogenezde rol oynayan ve fonksiyonlarını tamamladıktan sonra indirgenen veya eriyen odontojenik epitel dokular aslında dişeti ve çene kemikleri içinde varlıklarını sürdürmektedir. Bu fenomen, yaşamın çeşitli evrelerinde, gömülü dişle ilişkili veya ilişkisiz, çene kemiği içinde veya dişeti mukozasında ortaya çıkan çok çeşitli odontojenik kist ve tümörün nereden kaynaklandığını (histogenezini) açıklamaktadır. Bu dokulardan neden ve nasıl odontojenik tümörlerin ortaya çıktığı bilinmemektedir. Epitelyal orijinli kistlerin oluşumuna sebep olan odontojenik epitelyal dokular, Hertwig kök kılıfı kökenli Malessez epitel artıkları, enamel organ kökenli ingirgenmiş enamel epiteli ve mukoza ve enamel organ arasındaki epitelyal bağlantı olan dental laminanın artıklarıdır (Serre artıkları) 1. Odontojenik tümörler, diş gelişiminde rol oynayan, dişleri şekillendiren epitelyal veya mezenşimal dokuların neoplastik ya da 5

15 hamartomatöz gelişimi ile meydana gelen oldukça geniş bir spektrumdaki tümörleri ifade ederler 3. Odontojenik tümörlerin klinik davranışları ve histopatolojik tipleri hakkında kabul görmüş bilgiler bulunmasına rağmen, etyolojisi ve patogenezi halen netlik kazanmamıştır. Odontojenik tümörler, dişleri şekillendiren dokuların epitelyal ve/veya ektomezenkimal artıklarından köken alırlar. Odontogenezde rol oynayan ve fonksiyonlarını tamamladıktan sonra indirgenen veya eriyen odontojenik epitel dokuları çene kemikleri ve nadiren de dişeti içinde varlıklarını sürdürmektedir. Tıpkı odontojenik kistlerde olduğu gibi indirgenmiş mine epiteli, Malassez epitel artıkları ve Serre artıkları gibi odontojenik epitel dokuları, çene kemikleri içinde ya da dişetinde gelişen tümörlerin kökenini açıklamaktadır. Ancak odontojenik epitel artıklarını tümöral bir yapı oluşturmak üzere hangi mekanizmanın tetiklediği hala bilinmemektedir 1,2. Odontojenik tümörler de diğer tüm neoplaziler gibi köken aldıkları dokulara benzeme eğilimindedirler. Histolojik olarak diş minesi, dentin veya pulpa dokularına benzerler, hatta sert dokular içerebilirler. Odontojenik tümörler, hamartomatöz gelişimden metastaz yeteneği olan malign neoplazilere kadar değişen geniş bir grup lezyonu içerir. Bu karmaşık grubu kendi içinde sınıflamak için birçok histolojik sınıflama yapılmıştır. En fazla kabul gören ve günümüzde de halen kullanılan sınıflamanın temelini, odontojenik tümörlerin epitelyal ve/veya mezenkimal kökeni oluşturur 1. Odontojenik tümörler için kullanılmakta olan sınıflama temelde Dünya Sağlık Örgütü nün (DSÖ) 1992 yılında yayımladığı sınıflamayı 20 esas alır sınıflaması 2002 yılında Philipsen ve Reichart 7 tarafından yeniden yapılmış ve DSÖ tarafından 2005 yılında odontojenik tümörler için yeni bir sınıflama yayınlanmıştır 21 (Tablo I). 6

16 Tablo 1: DSÖ nün 2005 Odontojenik Tümörler Sınıflaması 21 BENİGN TÜMÖRLER Odontojenik Epitel Kökenli, Matür Fibröz Stroma İçeren, Odontojenik Ektomezensim Bulundurmayanlar MALİGN TÜMÖRLER Odontojenik Karsinomlar Ameloblastoma, Solid / Multikistik Tip Metastaz Yapabilen (Malign) Ameloblastoma Ameloblastoma, Ekstraosseöz / Periferal Tip Ameloblastik Karsinoma-Primer Tip Ameloblastoma, Desmoplastik Tip Ameloblastik Karsinoma-Sekonder Tip (Dediferansiye), İntraosseöz Ameloblastoma, Unikistik Tip Ameloblastik Karsinoma-Sekonder Tip (Dediferansiye), Periferal Skuamöz Odontojenik Tümör Kalsifiye Olan Epitelyal Odontojenik Tümör Primer İntraosseöz Skuamöz Hücreli Karsinoma-Solid Tip Primer İntraosseöz Skuamöz Hücreli Karsinoma-Keratokistik Odontojenik Tümör'den Gelisen Adenomatoid Odontojenik Tümör Primer İntraosseöz Skuamöz Hücreli Karsinoma-Odontojenik Kistlerden Gelisen Keratokistik Odontojenik Tümör Şeffaf Hücreli Odontojenik Karsinoma Hayal Hücreli (Ghost Cell) Odontojenik Karsinoma Odontojenik Epitel Kökenli, Odontojenik Ektomezensim İçeren, Sert Doku Oluşumu Bulunduran ve/veya Bulundurmayanlar Odontojenik Sarkomlar Ameloblastik Fibroma Ameloblastik Fibrosarkoma Ameloblastik Fibro-dentinoma Ameloblastik Fibrodentino- ve Fibro-odontosarkoma Ameloblastik Fibro-odontoma Odontoma Odontoma, Komplex Tip Odontoma, Kompound Tip Odontoameloblastoma Kalsifiye Olan Kistik Odontojenik Tümör Dentinojenik Hayal Hücreli Tümör Mezenşim ve/veya Odontojenik Ektomezensimden Kökenli, Odontojenik Epitel Bulunduran ve/veya Bulundurmayanlar Odontojenik Fibroma Odontojenik Miksoma / Fibromiksoma Sementoblastoma 7

17 Yeni sınıflamanın en göze çarpan özelliği, odontojenik tümörleri yalnızca histolojik özelliklerine göre değil aynı zamanda lezyonların epidemiyoloji, etyoloji, lokalizasyon, klinik ve radyolojik özellikleri, makroskopik ve histopatolojik özellikleri, tümör genetiği ve prognoz gibi özellikleri de göz önünde bulundurularak tasniflemesidir 8. DSÖ nün 2005 yılındaki sınıflamasına bakıldığında esasen terminolojide, özellikle de benign odontojenik tümörlerin alt gruplarında birkaç önemli değişiklik yapıldığı görülmektedir. Belki de en önemli değişiklikler odontojenik keratokist ve ameloblastoma (ABL) ile ilgili olanlardır. DSÖ nün 1992 sınıflamasında 22 tüm histolojik varyantları tarif eden ameloblastomalar adıyla çoğul bir terim kullanılırken son sınıflamaya göre, ameloblastomanın her bir varyantı ayrı bir antite gibi sınıflandırılmıştır yılındaki sınıflamada odontojenik kistler başlığı altında yer alan odontojenik keratokistin parakeratotik tipi, DSÖ nün 2005 sınıflamasında 6 benign odontojenik tümörler arasında keratokistik odontojenik tümör adıyla (KOT) yer almaktadır. Terminolojideki bu değişikliğin sebebi parakeratinize odontojenik keratokist in benign kistik bir lezyondan ziyade gerçek bir neoplazi gibi biyolojik davranış gösterdiğinin gözlenmiş olmasıdır 8. Ancak, ortokeratinize odontojenik keratokist (OK) bu sınıflamanın dışında tutulmuştur. Halen odontojenik kistler içinde sınıflandırılan ortokeratinize odontojenik keratokist, parakeratinize tipe göre daha nadirdir, daha az nüks etme eğilimindedir ve nevoid bazal hücreli karsinoma (NBHK) sendromu (Gorlin sendromu) ile ilişkili değildir 1. Gelişimsel odontojenik kistler içindeki sınıflandırılmasından çıkan KOT ve çene kemiklerinin en sık izlenen odontojenik epitel kökenli tümörü olan ABL, sergiledikleri farklı klinikopatolojik özellikler açısından diğer odontojenik kist ve tümörlerden ayrılırlar 5,23. KOT ve ABL, agresif klinik özellikler, yüksek nüks potansiyeli, radikal tedavi yaklaşımları gibi birçok ortak nokta paylaşırlar. Çoğu zaman 8

18 klinik semptomlar ve radyolojik görüntülerle bu iki lezyonu birbirinden ayırt etmek oldukça güç olabilir Ameloblastoma Tarihsel olarak çok uzun yıllardan beri bilinen bir lezyon olmasına rağmen, ameloblastoma ile ilgili ilk bilimsel olgu raporları 19. yüzyılın başlarına rastlamaktadır. İlk tanımlandığı yıllarda bu tümör adamantinoma olarak adlandırılmaktaydı 25. ABL, Malassez epitel artıkları, Serre epitel artıkları, indirgenmiş mine epiteli ve odontojenik kistlerin (özellikle dentigeröz kist) döşeyici epitelinden köken alabilen ektoderm orijinli, en sık izlenen odontojenik tümördür 1,3. Ancak bu epitel artıklarını neyin tetiklediği, neoplastik değişim sürecini neyin başlattığı halen bilinmemektedir 2. Bu tip hücreler ve embriyolojik artıklarının transformasyona uğramasında; diş çekimi, çürükler, travma, enfeksiyon, inflamasyon, diş sürmesi gibi nonspesifik irritasyona neden olan etkenlerin, viral patojenlerin ve beslenme bozukluğu gibi nedenlerin rol oynayabileceği düşünülmektedir 26. ABL, tüm oral neoplazilerin % 2 sini oluşturan, lokal agresiv bir tümördür. Odontomalardan sonra klinik olarak en sık karşılaşılan odontojenik tümördür. En çok mandibula angulus bölgesinde ve yaşlar arasında (ortalama 40 yaş civarı) ortaya çıkan bu tümör, yavaş büyür ve çenede ağrısız ekspansiyona neden olur. İlerlemiş vakalarda komşu dişlerde yer değiştirme ve diş köklerinde rezorbsiyona neden olabilir 1. Literatürde şimdiye kadar bildirilen en büyük ameloblastoma 15.2 x 11.4 x 12.0 cm boyutlarındadır 27. Radyolojik olarak radyolüsent, genelde multiloküler bir görüntüye sahiptir. Tümör kemiği tümüyle yıkarak ilerler. Mine benzeri sert doku üretimi yoktur. Bazen gömülü diş ile birlikte uniloküler radyolüsensi 9

19 şeklinde izlenebilir. Yavaş büyüdükleri için genelde iyi ve sklerotik sınırlı olabilirler 1. ABL, DSÖ nün 2005 sınıflamasında sınıflamasının 22 aksine tek bir başlık altında toplanmamış, tüm varyantlar ayrı bir antite olarak sınıflandırılmıştır: Solid/multikistik ABL, ekstraosseöz/periferal ABL, dezmoplastik ABL, unikistik ABL. Bu sınıflamada ABL varyantları yaş, yerleşim bölgesi, radyolojik bulgu ve özellikle de prognoz açısından farklılıklar gösterdikleri için ayrı ayrı kategorize edilmişlerdir. ABL alt grupları için daha özelleşmiş ve geliştirilmiş tedavi seçenekleri şiddetle önerilmektedir 8. ABL nin farklı biyolojik davranışlar sergileyen alt gruplarından solid ABL (kemik içi ABL, konvansiyonel ABL), çene kemikleri içinde yavaş ilerleyen ve benign-malign tümörler arasında sınırda kalmış (borderline) bir tümör olarak kabul edilir 3. DSÖ, solid ABL yi lokal invaziv polimorfik bir neoplazi olarak tanımlamaktadır 29. Konvansiyonel ameloblastoma çok geniş bir yaş aralığında görülür. Tümörün 30 lu yaşlardaki görülme sıklığı ile 70 li yaşlardaki görülme sıklığı çok yakındır. Klinik olarak çenede ağrısız şişlik ya da ekspansiyon şeklinde görülebilir ve çok büyük boyutlara ulaşabilir. Ağrı ve parestezi, büyük tümörlerde bile çok sık görülmez. Konvansiyonel ameloblastomaların % 85 i mandibulada görülür. Mandibuladaki lezyonların % 70 i posterior ve yükselen ramusta, % 20 si premolar bölgede, % 10 oranında da anterior bölgede izlenir 30,31. En tipik radyolojik bulgu, multiloküler radyolusent alanlardır. Lezyon büyük boyuta ulaştığında sabun köpüğü, küçük boyutta olduğunda bal peteği görüntüsü verir. Bukkal ve lingual kortikal ekspansiyon sık görülür. Tümöre komşu olan dişlerin köklerinde sıklıkla rezorpsiyon mevcuttur. Çoğu vakada sürmemiş diş veya diş benzeri yapılar; özellikle üçüncü mandibular molar diş, radyolusent görüntü veren lezyon ile ilişkili olabilir. Solid ameloblastoma diğer tiplere oranla daha agresif bir seyir izler ve bu tipin rekürrens olasılığı daha fazladır 29,32. 10

20 Solid ameloblastoma çeşitli yollarla tedavi edilmektedir. Bu tedavi seçenekleri basit enükleasyon ve küretajdan, en-blok rezeksiyona kadar değişebilir. En doğru tedavi seçeneği yıllardır tartışılmaktadır. Konvansiyonel ameloblastoma, tümörü çevreleyen kemiğin trabekülleri arasındaki gevşek bağ doku içine, küçük gruplar veya diziler halinde infiltre olma eğilimindedir. Kemik rezorpsiyonu bu olaydan sonra ortaya çıktığı için, tümörün gerçek sınırı genelde radyolojik olarak görülenden daha yaygındır. Tümörü küretajla çıkarmak, kemik içinde küçük tümör adacıklarının kalmasına neden olur ve daha sonra rekürrens gelişimine yol açar. Rezeksiyon sınırının, normal sağlıklı kemik sınırını 1 cm geçecek şekilde bir cerrahi planlanma gerektirdiği savunulmaktadır 33,34. Periferal / kemik dışı ABL, çene kemikleri dışında dişetinde ve çok nadiren de yanak mukkozası ve ağız tabanında gelişir. Sıklıkla mandibula posterior bölgede yer alır. Serre epitel artıklarından ya da döşeyici oral epitelden köken aldığı düşünülmektedir ve tüm ameloblastomaların % 2-10 nunu oluşturur. Görülme yaşı konvansiyonel ABL ye göre daha geçtir (ortalama 50 yaş); agresiv davranış sergilemez; kemiğe invaze olmazlar. Total eksizyon ile tedavi oldukça başarılıdır, nüks çok enderdir 1,35. Ağrısız, dışa doğru kabarık, geniş tabanlı, saplı ya da sapsız, gingival ya da alveolar mukoza yerleşimli nodüler lezyonlardır. Bu klinik görünüm ile fibröz hiperplaziler, dev hücreli granülom ve piyojenik granüloma benzerler 36. Dezmoplastik ABL, daha çok çene kemiklerinin anterior kısımlarında yerleşim gösterir ve tümör adalarını çevreleyen dens kollajenize alanlar ile karakterizedir. Radyolojik olarak da fibroosseöz bir lezyonu andırırlar. Biyolojik davranışları belirsizdir 1. Unikistik ABL olarak adlandırılan kistik ameloblastoma ilk olarak 1977 yılında Robinson ve Martinez tarafından tarif edilmiştir. Konvansiyonel ameloblastomaya oranla daha az agresif ve daha düşük 11

21 rekürrens gösterdiği bildirilmiştir. Solid ABL ye göre daha genç yaşlarda, genelde 2. ve 3. dekatlarda ve sıklıkla maksillada ortaya çıkan bir ABL varyantıdır. Olguların % 80 inden fazlasında lezyon sürmemiş mandibuler üçüncü molar dişin kronunun çevresinde dairesel bir radyolusensi olarak tarif edilir ve bu sekliyle dentigeröz kist görünümünü taklit eder. Özellikle mural invazyonlar yok ise daha az nüks etme eğilimdedir ve bu yüzden daha sınırlı bir cerrahi ile tedavi edilebilir 1,2. Unikistik ameloblastomanın 3 histopatolojik varyantı vardır: luminal, intraluminal ve mural tip unikistik ABL. ABL nin malign varyantları DSÖ nün 2005 sınıflamasında şöyle yer bulmuştur: metastaz yapabilen (malign) ameloblastoma, ameloblastik karsinom- primer tip, ameloblastik karsinom- sekonder tip (kemiç içi), ameloblastik karsinom- sekonder tip (periferal). ABL nin malign varyantları tüm ameloblastomaların % 2 sini oluştururlar 37. Malign ABL de hem primer hem de metastazik tümörler histolojik olarak tipik ABL özellikleri sergilerler ve iyi diferansiye tümörlerdir (ancak metastaz yapmışlardır). Metastazlar karakteristik olarak akciğer veya bölgesel lenf nodlarında görülür. Ameloblastik karsinom ise de novo gelişebileceği gibi (primer), konvansiyonel ABL üzerinde de gelişebilir (sekonder-karsinom ex ameloblastoma). Her şekilde de diferansiyasyon kaybı, hücresel atipi ve atipik mitoz vardır. ABL nin malign varyantları lokal olarak kontrol edilmesi zor, prognozları çok iyi olmayan lezyonlardır 1, ABL, histolojik olarak da farklı tiplere ayrılır. En sık izlenen histolojik görünüm foliküler ABL dir. Tümör parankimi, ortada gevşek, yıldızsı yapıda stellat retikulum ve bunu çit tarzında çevreleyen prizmatik ameloblastların oluşturduğu enamel organına çok benzeyen, irili ufaklı epitel adalarından oluşur. Tümörü oluşturan bu epitel adaları, hücresel zenginliği değişiklik gösterebilen fibröz stroma ile birbirinden ayırır. Gevşek, yıldızsı yapıdaki epitel adalarının ortasında odontojenik epitelin skuamöz metaplazi yaptığı gözlenir ise ve bu görünüm baskın ise tümöre 12

22 akantotik ABL ismi verilebilir. Daha seyrek olarak, epitel adalarının ortasındaki yıldızsı hücrelerin büyük ve granüler stoplazmalı epitel hücrelere değiştikleri görülebilir. Bu histolojik görünüm ise granüler hücreli ABL olarak adlandırılır. Gerek tümör adaları içinde gerekse tümörün bağ doku stromasında kistik dejenerasyon izlenebilir. Bazen kistik değişim lezyona kistik tümör özelliği kazandıracak kadar büyüyebilir. Pleksiform tip ABL da tümör parankimi bağ doku içinde çeşitli kalınlıklarda ve birbirleriyle birleşen kordonlar oluşturmuştur. Bu kordonları oluşturan epitel hücreleri ortada gevşek, yıldızsı yapıda iken periferde prizmatik değil kübik, hatta basıklaşmış hücrelerdir. Bir başka deyişle bazal tabaka hücreleri folliküler tipteki gibi belirgin değildir. Panoramik histolojik görünüm, uzamış rete pegleri birbiri ile anastomazlar yapan hiperplastik skuamöz epiteli andırabilir. Akantotik veya granüler hücreli alanlar fazla izlenmez. Kistik boşluklar yine yaygın olabilir. Bazal hücreli tip ABL da ise tümör parankimi bağ doku stroma içinde geniş epitel tabakaları halindedir. Tabakaları oluşturan hücreler skuamöz epiteldeki bazal ve suprabazal konumlu ince dar stoplazmalı küçük epitel hücreleridir, periferdeki hücreler ise prizmatik yapıdadır. Epitel tabakalarında stellat retikulum benzeri alanlar belli belirsizdir veya hiç yoktur. Kistik ABL histopatolojik olarak ameloblastomatöz epitelin lezyon içindeki dağılımına (yerleşimine) göre üç alt gruba ayrılmıştır: (1) Luminal tip; ameloblastomatöz kist epiteli non-neoplastik kistlerdeki gibi uniformdur, basit şekilde kist boşluğunu döşer. (2) İntraluminal tip; ameloblastomatöz epitel lümen içerisine doğru nodüler tarzda çıkıntı yapar. Bu nodül pleksiform paternde ameloblastomatöz epitelden oluşur. Kistik yapının bağ doku duvarında epitel bulunmaz. (3) Mural tip; döşeyici neoplastik epitelin yanı sıra bağ doku içinde yaygın ameloblastoma adaları bulunur; bu nedenle bazen solid ABL nın genişlemiş tek bir kistten oluşan 13

23 şekli olarak da düşünülmektedir. Kistik yapının fibröz bağ doku duvarı pleksiform veya folliküler paterndeki ameloblastomatöz epitel tarafından invaze edilmiştir. Kistik ABL lar içinde nüksü en fazla görülen alt tiptir. Periferal ABL, histolojik olarak intraosseöz ameloblastomaya benzer şekilde, pleksiform, folliküler veya bazaloid paternde epitelyal komponent içerir. Epitelyal hücreler fibröz bağ doku tarafından çevrelenmiştir, ancak lezyon kapsülsüzdür. Genellikle alttaki alveol kemiğini erode etmez 1,2. ABL, embriyonik, morfolojik hatta biyolojik davranışı açısından bazal hücreli karsinoma benzetilmektedir. Agresif biyolojik davranışı nedeniyle de bazı yazarlar tarafından borderline tümörler sınıfına sokulmuştur 41. Her ne kadar benign odontojenik bir tümör olarak nitelendirilse de ABL ların lokal agresifliğini, kemik yıkım mekanizmalarını ve nüks potansiyelini açıklayabilmek için birçok çalışma yapılmıştır. Hücre proliferasyonundaki veya protein sentezindeki ve anti-apoptotik proteinlerdeki (Bcl 2, Bcl-x 1 ) artışın bu fenomene sebep olabileceği ileri sürülmüştür 1,42. ABL gelişiminde veya büyümesinde p53 mutasyonunun rol oynamadığı görülmüştür 1. Tümörün lokal agresifliği sadece tümör hücrelerinin yüksek proliferasyon yeteneği ile açıklanamaz. Aynı zamanda hücrelerin hem bazal membranı hem de çevre bağ dokusunu yıkma potansiyelinin de olması gerekmektedir. Bunun için ise tümör hücrelerinin biyolojik aktif moleküller salıyor olmaları beklenir 43. ABL larda, bazal membran yapısal proteini olan laminin 5 alterasyonları, fibroblast büyüme faktörü, epidermal büyüme faktörü (EGF) gibi büyüme faktörlerinde, interlökinler (IL) ve tümör nekroz faktör (TNF) gibi sitokinlerde ve matriks metalloproteinazlar (MMP), enamel matriks serin proteaz ve heparanaz gibi proteinazlarda artmış ekspresyon gösterilmiştir 43,1,42,44. ABL ların 14

24 osteolitik aktivitelerinden sitokinler halen en fazla sorumlu tutulan moleküllerdir Odontojenik Keratokist (Keratokistik Odontojenik Tümör ve Ortokeratinize Odontojenik Keratokist) Odontojenik keratokist (OK) terimi ilk olarak Philipsen tarafından 1956 yılında kullanılmıştır yılında ise Pinborg, Philipsen ve Henriksen tarafından kullanılan keratokist terimi keratinizasyon gösteren tüm odontojenik kistleri ifade ediyordu 32. Nadiren de olsa dentigeröz kist ve radiküler kist epiteli keratinizasyon gösterebilir ancak OK in döşeyici epitelindeki farklılıklar ve biyolojik davranışı diğer odontojenik kistlerden ayrı olduğunu ortaya koymaktadır. Yıllar içinde odontojenik keratokistin diğer kistlerden farklılığının sadece keratinizasyon veya kist epitelinin özellikleri ile sınırlı olmadığı anlaşılmıştır Odontojenik keratokist, gelişimsel kistler içinde spesifik histopatolojik bulgular ve klinik seyir açısından özel ilgi gerektiren farklı bir kisttir yılında odontojenik kistler başlığı altındaki sınıflamada yer alan OK, DSÖ nün 2005 sınıflamasında 28 benign odontojenik tümörler arasında keratokistik odontojenik tümör (KOT) adıyla yer almaktadır. Terminolojideki bu değişikliğin sebebi odontojenik keratokistin kistik bir lezyondan ziyade, bir neoplazi gibi biyolojik davranış gösterdiği kanısının yaygınlaşmış olmasıdır. Terminolojideki bu değişiklik yoğun tartışmalara sebep olmuş fakat neticede, bugün için OK lerin tedavisinde bir değişiklik yaratmamıştır 8. DSÖ, ortokeratinize odontojenik keratokisti ise yeni sınıflamanın dışında tutmuş, odontojenik kistler içindeki yerini korumuştur. Yani keratokistik odontojenik tümör terimi parakeratinize odontojenik keratokisti, odontojenik keratokist terimi ise ortokeratinize odontojenik keratokisti vurgulamaktadır. İngilizce literatürde yayımlanmış odontojenik keratokist hakkındaki araştırmaların büyük oranda, 2005 sınıflamasında keratokistik

25 odontojenik tümör (KOT) adı verilerek odontojenik tümörler grubuna alınan parakeratotik odontojenik keratokistlere dayandığı açıktır. Bu nedenle tezin bundan sonraki bölümlerinde söz konusu lezyon grubu için yalnızca yeni sınıflamadaki KOT ismi kullanılacaktır Keratokistik Odontojenik Tümör (KOT) KOT göreli olarak sık rastlanan bir antitedir. Tüm odontojenik kistler içinde üçüncü en sık görülen kist olarak, tüm odontojenik kistlerin %5-10 unu oluşturduğu bildirilmiştir 2,19. Tüm yaş gruplarında görülse de en sık ikinci ve üçüncü dekatta ortaya çıkar. Mandibulada maksillaya göre daha sık izlenir (2:1). Her iki çenede de posterior bölgeler daha fazla etkilenir. Mandibula posterior, angulus bölgesi en sık izlendiği alandır. Erkeklerde kadınlara oranla biraz daha fazla görülür 1,19. KOT, klinik olarak ağrı veya şişlik gibi belirtiler gösterebilir, paresteziye neden olabilir. Buna karşılık tamamen asemptomatik ilerleyip, radyografik olarak tesadüfen de tespit edilebilir. KOT, kemik içinde, medullar bağ dokudan zengin süngerimsi alanlarda ilerleyerek büyür ve ancak büyük boyutlara ulaşıp kemikte ekspansiyona neden olduğunda klinik bulgu verebilir. KOT ler genelde uzun süre kemik ekspansiyonuna neden olmadan, kemiğin medullar kavitesinin içinde anteroposterior yönde sessizce büyümeye eğilimlidirler. Bu esnada dişlerde yer değiştirmelere sebep olabilir. KOT ler zamanla kortikal kemiği penetre edebilir, çevre yumuşak dokulara yayılabilir, infratemporal fossa, maksiller sinüsler, orbita, hatta kafa tabanı gibi komşu anatomik yapılara kadar büyüyebilirler 46,47. Bazı vakalarda gömülü diş ile ilişkilidir. Hastaların yaklaşık % 5 inde birden çok sayıda KOT izlenir. Birden çok sayıda KOT ü bulunan bireylerde nüks riski daha yüksektir 1,19. 16

26 Radyografide, KOT karakteristik olarak iyi sınırlı, sınırları sklerotik, büyük lezyonlarda multiloküler radyolüsent kistik lezyon olarak görünür. Ancak çoğunlukla unilokülerdir. Gömülü dişle birlikte ise dentigeröz kist gibi gözükür. Tanı konduğunda çoğu lezyonda kemikte ekspansiyon vardır 1. Vakaların % 5 i NBHK sendromlu (Gorlin sendromu) bireylerdir. Gorlin ve Goltz un 1960 yılında tanımladığı bu sendromda, hastalarda çok sayıda parakeratinize odontojenik keratokist, çok sayıda bazal hücreli karsinom, medulloblastom gibi diğer neoplaziler, ektopik kalsifikasyonlar ve tipik olarak konjenital iskeletsel anomaliler mevcuttur. Otozomal dominant geçişli bu hastalık oldukça nadir görülür ( de bir) 48 ve sorumlu gen 9q22.3-q31 de bulunur (PTCH geni). PTCH geni bir tümör süpresör gendir ve normal şartlarda embriyogenez ve hücre sinyal iletiminde rol oynar. NBHK sendromlu bireylerin % 40 ında bu gende mutasyon belirlenmiştir. PTCH geni fonksiyon görmediğinde, sonic hegdehog proteininde overekspresyon ve neticede hücre proliferasyonunda artış izlenir. PTCH mutasyonu ve heterozigosite kaybı sendromlu, hatta sporadik KOT lu bireylerde de saptanmıştır. Sendromlu bireylerin % inde çok sayıda KOT izlenir 48. Bu lezyonların nüks potansiyeli, sendrom göstermeyen fakat birden fazla KOT ü olan bireylerden de yüksektir 1,2,49. Sendromlu hastaların odontojenik keratokistleri histopatolojik olarak farklılık göstermez ancak sporadik olanlara göre uydu kistlere, fibröz kapsül içindeki odontojenik epitel artıklarına ve solid adacıkların epiteliyal proliferasyonuna daha çok rastlanır. Histolojik olarak KOT un kendine has oldukça tipik, ayırt edici bir görünümü vardır. Sekonder olarak enfekte olmadığı sürece kist duvarı incedir. Bu ince, narin yapıdaki kist duvarı lezyonun kemik içinden tek parça halinde çıkarılmasını genelde zorlaştırmaktadır. Döşeyici epitel tipik olarak ince, genelde 8 10 sıralı, rete içermeyen, keratinize skuamöz 17

27 epiteldir. Parakeratotik epitelin yüzeyi, tipik şekilde dalgalı yapıdadır ve bu özellik keratin tabakası çok ince olsa bile dikkat çekicidir. Kist lümeninde genelde keratin materyali izlenir. Epitelin bazal tabaka hücreleri kübik ya da alçak prizmatik şekilli olup, çit tarzında dizelenme gösterir. Bazal tabaka hücrelerinin nükleusları hiperkromatiktir ve hücrenin bazal membrandan uzak kısmında yerleşmiştir (ters polarizasyon). Bu görünüm KOT için oldukça tipiktir ve nadiren de olsa keratinizasyon gösterebilen diğer odontojenik kistlerden ayırt etmede kullanılır. Epitelin hem bazal hem parabazal tabakalarında mitotik figürler sıklıkla izlenebilir. Kist bağ dokusu duvarı ince fibröz yapıda olup, genelde hücreden fakirdir. KOT vakalarının yaklaşık % 10 nunda kist bağ doku duvarında uydu kistler (satellit / daughter cyst) izlenir. Uydu kistler hemen daima keratin ile doludur. Döşeyici epitel bazen bağ dokusuna doğru tomurcuklanmalar yapar. Uydu kist veya tomurcuklanma sendromlu vakalarda daha sık izlenir ve bu vakalarda nüks potansiyelinin daha yüksek olduğu vurgulanmaktadır 1,3,19,47. Çok ender olarak bu kistlerden skuamöz hücreli karsinom geliştiği bildirilmistir 50. KOT, kemik içi yerleşimli bir lezyon olmasına rağmen çok ender olarak dişetinde gelişebilir. Literatürde sadece 12 periferal odontojenik keratokist vakası rapor edilmiştir. Klinik olarak erişkinin gingival kistine benzer, hatta bazı yazarlar bu antitenin erişkinin gingival kistinin bir varyantı olduğunu düşünmektedir. Literatürde erişkinin gingival kisti, keratokistik tip olarak rapor edilmiş vakalar da mevcuttur. Ancak histolojik olarak tüm döşeyici epitel özellikleri, bağ dokusu görünümü ve hatta uydu kistlerin varlığı ile parakeratinize odontojenik keratokist özellikleri sergileyen bu lezyonlar, tıpkı kemik içi KOT gibi NBHK sendromlu bireylerde görülebilir ve nüks edebilir

28 Literatürde solid odontojenik keratokist olarak adlandırılan antite, her biri histopatolojik olarak keratokist özellikleri taşıyan çok sayıda mikrokist içeren solid bir lezyonu tarif eder. Mikrokistleri çevreleyen bağ dokusu, genelde vasküler yapılardan zengin, selüler, hyalini yapıdadır. Bu lezyonların, odontojenik keratokistin solid neoplastik bir varyantı olduğu ve ameloblastoma gibi biyolojik davranış göstereceği söylenmektedir 52. Genel kanı KOT lerin çene kemikleri içindeki dental lamina artıklarından geliştiği yönündedir. Ancak yüzey oral epitelinin bazal tabaka hücrelerinden de gelişebilecekleri düşünülmektedir. Halen KOT patogenezindeki tetikleyici mekanizma aydınlatılamamıştır 1,19. KOT lerde % 3 60 arasında değişen nüks oranı bildirilmiştir. KOT lerin iyi bilinen nüks eğilimi, daha çok kistin morfolojik yapısına bağlanmaktadır. İnce duvarlı olmaları, döşeyici epitel ile kist bağ dokusu arasındaki bağın zayıf olması ve büyük boyutlara ulaşabilen lezyonun bir bütün halinde çıkartılamaması, cerrahi eksizyon sırasında geride doku parçalarının kalmasına sebep olabilir. Birden fazla lezyon bulunması veya uydu kistlerin varlığı da yine cerrahi tedavi sonrası nükse neden olabilir. Cerrahi tedavi sonrası arta kalan doku parçalarından yeniden lezyon oluşması, epitelin yüksek mitotik aktivitesi nedeniyle olasıdır. Ancak nüks eden lezyonların çoğunun gerçekte yeni bir tümör gelişmesi olduğu yönünde kanaat bildiren araştırmacılar da vardır. Belirtilen nüks oranları arasında bu kadar büyük farklılıklar olması değişik tedavi şekilleri ve takip süreleri ile açıklanabilir. En az nüks, en radikal tedavi modelleri ile sağlanmış, rekürens oranı % 10 un altına düşmüştür 1,19,53. KOT leri, yüksek nüks potansiyelinin yanı sıra diğer odontojenik kist ve tümörlerden ayıran bir diğer özelliği de çok büyük boyutlara ulaşabilmesidir. Bu özellikleri nedeniyle parakeratinize odontojenik keratokistin basit bir kist gibi değil benign bir neoplazi olarak değerlendirilmesi gerektiği bildirilmiştir 8,46,47. 19

29 KOT epitelinin mitotik indeks değerleri diğer odontojenik kistlerden yüksektir ve klinik olarak agresif seyreden ABL ye yakındır. KOT un büyüyebilme yeteneğinin kist içi ozmotik basınçtan ziyade yüksek epitelyal proliferasyon özelliğine bağlı olduğu düşünülmektedir. KOT un multisentrik paterni ve semi-solid alanlar oluşturması bu görüşü desteklemektedir 46,53,54. KOT un agresif büyüme gösterebilmesinde epitelyal proliferasyona eşlik eden osteolitik bir yeteneğin de gerekli olduğu bilinmektedir. KOT un bu özelliği, kollajenolitik akitivitesinden gelmektedir. Doku yıkımına sebep olan etkenler, hem kist sıvısında hem de döşeyici epitelde artmış ekspresyonları gösterilmiş olan, başta IL-1α ve IL 6 olmak üzere birçok sitokin, MMP 1 ve MMP 9 gibi matriks metalloproteinazlar, paratiroid hormon ilişkili protein, EGF, transforming büyüme faktörü gibi biyolojik aktif moleküllerdir 46,53,55. Yanı sıra keratinositlerde anti-apoptotik bir protein olan Bcl-2 nin de artmış ekpresyonu bildirilmiştir 1, Ortokeratinize Odontojenik Keratokist (OK) Odontojenik keratokist vakalarının % 10 kadarı ortokeratinizedir. Parakeratinize ve ortokeratinize odontojenik keratokist ayırıcı tanısını yapmak önemlidir çünkü ortokeratinize odontojenik keratokist çok daha nadirdir, NBHK sendromu ile ilişkili değildir ve en önemlisi daha az agresif olup nüks potansiyeli daha azdır. Tüm özellikleri nedeniyle de DSÖ nün son sınıflamasında tümör isimlendirilmesinden muaf tutulmuştur 6. Yeni sınıflama gündeme gelmeden önce de, ortokeratinize odontojenik keratokistin, parakeratinize tipten farklı, ayrı bir antite olarak değerlendirilmesi gerektiğini söyleyen birçok yazar olmuştur. Klinik ve histopatolojik farklılıkları histokimyasal, immunohistokimyasal ve genetik çalışmalarla desteklenmiştir 57,58. 20

30 OK, 2 ila 5. dekatlarda ve sıklıkla erkeklerde izlenir. Mandibula posterior bölge en fazla izlendiği bölgedir 58. Histolojik olarak KOT ile benzerlik gösterebilir ancak, dalgalanma göstermeyen ortokeratinizasyon ve belirgin granüler tabakanın yanısıra KOT e göre oldukça silik bir bazal tabaka dizelenmesi ile karakterlidir 1. OK, KOT e göre çok daha az nüks eder, rekürrens oranları oldukça düşüktür (% 2.2). Bu yüzden basit enükleasyon ile tedavi edilmeleri önerilir. Proliferasyon indeksleri de KOT ten düşüktür. Hastalarda tek bir lezyon olarak ortaya çıkar. NBHK sendromu ile ilişkili değildir ve KOT lerde izlenebilen PTCH gen mutasyonları ve tümör süpresör genlerde izlenen heterozigosite kaybı yoktur 58, İnterlökinler İnterlökinler (IL), ilk kez lökositler tarafından salındığı fark edilen bir grup sitokin ailesidir. Şimdiye kadar tanımlanmış yaklaşık 35 alt tipi bulunan (Tablo II) polipeptit yapısındaki bu sitokinler, hem doğal hem spesifik immünitenin baş rol oyuncularındandır. İsimlendirmelerinin aksine, lökositler dışında makrofaj, endotel ve epitel hücreleri gibi birçok farklı hücre tarafından da üretilirler. İnterlökinlerin salındıkları hücrelere etki etmesine otokrin, çok yakınındaki hücrelere etki etmesine parakrin, kan dolaşımı yoluyla uzaktaki hücrelere etki etmesine ise endokrin etki denilmektedir. Değişik hücreler aynı interlökinleri salgılayabilir ya da bir tür interlökin farklı birçok hücreye etki edebilir. Bir tür interlökinin birden fazla hücreye etki etmesine pleiotropik etki denmektedir. İnterlökinler aynı zamanda birlikte sinerjik etki ya da antagonist etki gösterebilirler. Kısa yaşam süreleri, plazma konsantrasyonlarının düşük olması ve birçok interlökinin birçok hücreden salınıyor olması izolasyonlarını ve karakterlerinin anlaşılmasını 21

31 zorlaştırmaktadır. İnterlökinler bir immün stimulasyona cevap amacıyla her defasında yeniden üretilmek zorundadırlar. Genellikle çok düşük konsantrasyonlarda, çok kısa zamanda, çok kısa uzaklıklara etki ederler 9. 22

32 Tablo 2: İnterlökin ailesi 28 İsim Kaynak Hedef reseptörler Hedef hücreler Fonksiyon yardımcı T hücreleri ko-uyarım B hücreleri maturasyon & proliferasyon IL-1 makrofajlar,b hücreleri, monositler, Dendritik hücreler CD121a, CD121b NK hücreler makrofajlar, endotel, diğer etkinleştirme inflamasyon, küçük miktarlar akut faz reaksiyonuna, büyük miktarlar ateşe sebep olur. IL-2 TH1-hücreleri CD122/CD25, CD132 etkinleştirme T hücreleri ve B hücreleri, NKhücreler, makrofajlar, oligodendrositler T hücre yanıtında gelişmeyi ve farkılıaşmayı uyarır. İmmünoterapide kanser ya da doku nakli hastaları için kullanılabilir. IL-3 etkinleştirilmiş yardımcı T hücreleri, mast hücreleri, NK hücreler, endotel, eozinofiller CD123, CDw131 hematopoietik kök hücreler mast hücreleri eritrositlere, granülositlere gelişme ve farklılaşma gelişme ve histamin salınımı IL-4 TH2-hücreleri, yeni etkinleştirilmiş tecrübesiz CD4+ hücresi, bellek CD4+ hücreleri, mast hücreleri, makrofajlar CD124, CD132 etkin B hücreleri T hücreleri proliferasyon ve farkılıaşma, IgG1 ve IgE sentezi. Alerjik yanıtda (IgE) önemli rol. proliferasyon endotel IL-5 TH2-cells, mast hücreleri, eozinfiller CD125, CDw131 eozinofiller B hücreleri üretim farkılaşma, IgA üretimi etkin B hücreleri plazma hücrelerine farkılaşma IL-6 makrofajlar, TH2-hücreleri, B hücreleri, astrositler, endotel CD126, CD130 plazma hücreleri hematopoietik kök hücreler antikor salgısı farkılıaşma T hücreleri, diğerleri akut faz reaksiyonu, hematopoiezis, farkılılaşma, inflamasyona sebep IL-7 kemik iliği stromal hücreler ve timus stromal hücreler CD127, CD132 pre/pro-b hücresi, pre/pro-t hücresi, NK hücreler B, T, ve NK hücre yaşamıyla ilgili, gelişim ve homeostaz, proenflamatör sitokinler IL-8 makrofajlar, lenfositler, epiteliyal hücreler, endoteliyal hücreler CD128 nötrofiller, bazofiller, lenfositler nötrofil kemotaksi IL-9 Th2-hücreleri, özellikle CD132 T hücreleri, B IgM, IgG, IgE'yi etkili hale 23

33 İsim Kaynak Hedef reseptörler Hedef hücreler Fonksiyon CD4+ yardımcı hücreleri hücreleri getirir, mast hücrelerini uyarır. makrofajlar sitokin üretimi IL-10 monositler, TH2-hücreleri, CD8+ T hücreleri, mast hücreleri, makrofajlar, B hücresi altkümeleri CD210 B hücreleri mast hücreleri etkinleştirme Th1 hücreleri Th1 sitokin üretimini baskılar (IFN-γ, TNF-β, IL-2) IL-11 kemik iliği stroma kemik iliği stroma akuz faz proteini üretimi, osteoklast formasyonu IL-12 dendritik hücreler, B hücreleri, T hücreleri, makrofajlar CD212 etkin T hücreleri, NK hücreleri sitotoksik T hücrelerine IL-2, IFN-γ, TNF-α, IL-10 ile farklılaşma IFN-γ, TNF-α IL-13 etkin TH2-hücreleri, mast hücreleri, NK hücreler TH2-hücreleri,B hücreleri, makrofajar B-hücreleri (IgE)'nin gelişme ve farkılaşmasını uyarır, TH1-hücrelerini ve makrofaj inflamasyon sitokinleri (örn. IL-1, IL-6), IL-8, IL-10, IL- 12 baskılar. IL-14 T hücreleri ve kesin kanserleşmiş B hücreleri etkin B hücreleri B hücreleri'nin büyüme ve farkılaşmasını kontrol eder, Ig salgısını baskılar. IL-15 mononüklear fagositler (ve bazı diğer hücreler), özellikle virüslerce enfeksiyonu izleyen makrofajlar CD132 T hücreleri, etkin B hücreleri doğal öldürücü hücrelerin üretimine neden olur. IL-16 lenfositler, epitelyal hücreler, eozinofiller, CD8+ T hücreleri CD4+ T hücreleri CD4+ kemoçekiciler IL-17 T hücrelerinin alt kümeleri epitel, endotel, diğer osteoklastogenez, angiogenez, enlamasyon sitokiler 24

34 İnterlökinler, Doğal ve spesifik immünitenin hem aktivasyon hem de etkin fazında üretilip immün ve inflamatuar cevabı düzenlerler. Salınımları kısa süreli ve kendi kendini sınırlandıran bir olaydır, depolanmazlar. Tek bir IL pek çok farklı hücre tipi tarafından salınabilir. Pleiotropizm gösterirler, yani pek çok farklı hücre tipi üzerine etki gösterebilirler. Genelde aynı hedef hücre üzerinde birden fazla farklı etki gösterirler. Başka sitokinlerin sentezlenmesini sağlayabilirler ve diğer sitokinlerin işlevlerini etkilerler. Diğer tüm polipeptit hormonlar gibi hedef hücre yüzeyindeki spesifik reseptörlere bağlanarak etki gösterirler. Otokrin, parakrin ve endokrin etki gösterebilirler. Birçok hedef hücre için büyüme faktörü olarak görev yaparlar İnterkölin-1 İnterlökin-1 (IL-1) ilk olarak, mononükleer fagositik hücreler (MFH) tarafından salınan ve T hücre aktivasyonunda görev alan polipeptit yapısında bir sitokin olarak tanımlanmıştır. Ancak bugün bilinmektedir ki, IL-1 asıl olarak doğal immunitede konak inflamatuar cevabında mediatör olarak görev alır. IL-1 in ana hücresel kaynağı aktive olmuş mononükleer fagositlerdir ve üç ana alt tipi vardır. Bunlar; IL-1 alfa (IL-1α), IL-1 beta (IL- 1β) ve IL-1 reseptör antagonistidir (IL-1Ra). IL-1 sitokin ailesi üyelerinden 25

35 IL-1α ve IL-1β agonist aktiviteye sahiptir. IL-1Ra ise, diger iki IL-1 molekülüyle fizyolojik olarak antagonist etki gösterir. 60,61. Her bir proteinin kodlandığı gen bölgesi 2. kromozomun uzun kolunda, birbirlerine oldukça yakın konumlardır. Aminoasit düzeyinde sadece % 27 oranında benzerlik göstermelerine rağmen yapısal ve fonksiyonel olarak birbirleri ile oldukça yakın ilişkilidirler. IL-1α büyük oranda hücre membranı ile ilişkili olarak bulunurken IL-1β nın hücreden salındığı gösterilmiştir. Hücre yüzeyinde IL- 1α, IL-1β ve IL-1Ra yı tanıyan iki reseptör protein tanımlanmıştır. Tip I reseptörler sinyal iletimi ve hücre aktivasyonundan sorumluyken tip II reseptörler membrana bağlı, çözünebilir ve işlev görmeyen reseptörlerdir (decoy receptor). IL- 1 reseptör aktivitesinin, hem nötralize edici reseptör olarak davranan tip II reseptörler, hem de IL-1Ra tarafından azaltılarak bloke edildigi belirtilmistir 62. IL-1, MFH ler dışında, endotel hücreleri, keratinositler, synovial hücreler, astrositler, osteoblastlar, düz kas hücreleri, fibroblastlar, nötrofiller ve glial hücreler gibi pek çok farklı hücre tarafından da üretilirler. Üretimi, endotoksinler, diğer sitokinler, mikroorganizmalar ve diğer ajanlar tarafından tetiklenebilir. Salınım mekanizması halen tam olarak bilinmemekle birlikte büyük olasılıkla spesifik bir enzimin IL-1 i öncü formundan aktif formuna çevirmesi ile olmaktadır. IL-1 in en önemli fonksiyonu lenfosit (T hücre) aktivasyonudur ancak biyolojik etkisi salınım miktarına bağlıdır 61. Salınan miktar ise hücre tipine ve uyarana göre değişir. Düşük konsantrasyonlarda lokal inflamasyon mediatörü olarak görev alır. Örneğin endotel hücreleri üzerinde etki göstererek, lökosit adezyonunu kolaylaştırır. IL-1, direkt olarak nötrofiller gibi inflamatuar lökositler üzerine etki etmez. Ancak lökosit aktivasyonunu sağlayacak kemokinleri salması için makrofaj ve endotel hücrelerine etki eder. Daha yüksek konsantrasyonlarda ise endokrin etki gösterir. Bu etkileri komplemanların, adezyon moleküllerinin ve akut faz plazma proteinlerinin 26

36 sentezlenmesi, ateş, iştahsızlık, uyku hali ve hipotansiyondur 28. Diğer sitokinler ve kendi alt tipleri ile sinerjik fonksiyon gösterebilir 61. IL-1α, endoplazmik retikulumda, öncelikle prekürsor olarak sentezlenir (proil-1α). proil-1α, 31 kda dur, intrastoplazmiktir ve biyolojik olarak aktiftir. Hücre öldüğünde, IL-1α prekürsörü serbest kalır ve bir ekstraselüler proteaz olan calpains tarafından matür IL-1α ya dönüştürülür. Calpainsin kalsiyum ile stimülasyonu ile de proil-1α, hücre ölmeksizin 17 kda luk matür IL-1α ya dönüştürülebilir 60,61. IL-1α, kendi sinyalini güçlendirmek için bir çok başka hücreden de IL-1 salınımını tetikler. IL-1 aktivitesi, özgün inhibitörü IL-1Ra tarafından kontrol edilir ve IL-1Ra, steroidler, IL-4, IL-10 gibi antiinflamatuar sitokinler tarafından baskılanır. Bununla beraber IL-1 in diğer sitokinlerin sentezini artırması da önemli özelliklerindendir. IL-1 esasen, siklooksijenaz ve lipooksijenaz gen ekspresyonu ile de ilişkilidir. MMP ve kollajenazları sentezleyerek osteoklast ve osteoblast aktvasyonunda görev alır. IL-1α ve IL-1β, monosit ve fibroblastlardan büyük miktarlarda prostoglandin E 2 (PGE 2 ) ve MMP salınmasını indükleyerek bağ dokusu katabolizması ve kemik rezorpsiyonunun güçlü aktivatörleri olarak görev yaparlar 63. IL-1α, kemiğin yeniden şekillenmesinde hem osteoblast hem de osteoklastlar üzerinde etki gösteren en önemli sitokinlerdendir. Ekstraselüler matrikste bulunan lenfoid hücreler üzerindeki reseptörleri indükleyerek osteoklast oluşumunu ve kemik resorpsiyonunu indükler. Başka bir deyişle kemik yıkımını stimüle eden osteoklast progenitörü olarak rol oynar. Makrofaj ve T hücrelerden salınıp osteoklast diferansiyasyonunda görev alır. Normal koşullarda anti-inflamatuar ve immün düzenleyici faktörlerle osteoklast diferansiyasyonu ve aktivasyonu dengededir. Ancak bu denge IL-1α lehine değiştiği zaman, artmış IL-1α 27

37 ekspresyonu osteoklast diferansiyasyonunu ve aktivasyonunu artırarak, kemik rezorbsiyonuna ve neticesinde de kemik kaybına sebep olur 10. IL-1 ve TNF-α, kronik inflamatuar hastalıklardaki anahtar aracı moleküller olup, birçok hastalıkta görülen kemik kaybı ve doku yıkımını başlatma potansiyeline sahiptirler. Hücre kültüründe IL-1 in fibroblastlarda kollajenaz sentezini artırdığı gösterilmiştir. Kemik demineralizasyonuna neden olduğu bilinen en güçlü molekül yine IL-1 dir. TNF-α ile sinerjistik etki göstererek kemik yıkımını stimule eder ve bağ dokusu değişikliklerine yol açarlar 64,65. IL-1, NF к B ligand reseptör aktivatörünün (RANKL) üretimini arttırır. RANKL, osteoblastların, kemik iliği kök hücrelerinin, fibroblastların ve endotel hücrelerin yüzeyinde bulunur ve osteoklast oluşumunu düzenler. RANKL, osteoklast prekürsörü hücrelerin yüzeyindeki reseptörüne bağlandığında osteoklast diferansiyasyonunu ve fonksiyonunu stimüle eder. IL-1 aynı zamanda RANKL ın doğal bir inhibitörü olan osteoprotegrini inhibe eder 10. IL-1 doku fibroblastlarının, kondrositlerin ve osteoklastların MMP, katepsin ve mast hücresi proteazı gibi yıkıcı enzimleri salmalarını stimüle eder. MMP ler çinko bağımlı doğal proteazlardır ve beş gruba ayrılırlar. Bunlar kolajenazlar, jelatinazlar, stromalizinler, membran tip MMP ler ve diğerleridir. IL-1 diğer sitokinlerle sinerjik olarak MMP ekspresyonunu artırır 10. IL-1 in hem endokrin hem parakrin yol ile MMP-2 ve MMP-9 ekspresyonunda artışa yol açtığı gösterilmiştir 5. Menapoz sonrası osteoporozun artmış IL-1 seviyeleri ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. In vitro çalışmalarda IL-1 reseptör yokluğunun kemik yıkımını engellediği saptanmıştır. Yine in vitro çalışmalarda IL-1Ra seviyesindeki artış ile kemik kaybının azaldığı gösterilmiştir

38 Tüm bu bulgular IL-1 in kemik metabolizmasında, özellikle kemik yıkımında üstlendiği önemli rolü göstermektedir 24,66. Lösemi, kanser, osteoporöz, diyabet, santral sinir sitemi hastalıkları, enfeksiyöz hastalıklar ve arteriyel hastalıklar gibi birçok patolojide IL-1 in bölgesel olarak aşırı sentezi veya IL-1Ra nın yetersiz sentezi hastalık gelişimine öncülük etmektedir 67. ABL larda ve KOT larda da artmış IL-1 seviyesi, bu iki lezyonun kemik içindeki ekspansiyonları ile ilişkilendirilmiştir 5,24, İnterlökin-6 İnterlökin-6 (IL-6) ilk kez 1986 yılında T hücrelerden salınan ve B hücre diferansiyasyonunu indükleyen bir medyatör olarak tanımlanmıştır. Tanımlandığı yıllarda gösterdiği farklı aktivitelerinden dolayı değişik şekillerde isimlendirilmiş [B hücre stimüle eden faktör (BSF- 2), hibridoma plazmositom büyüme faktörü, hepatosit stimüle eden faktör] ve interferon ailesinin yeni bir üyesi olduğu düşünülmüştür 68,69. IL-11, lösemi inhibe eden faktör, oncostatin M, silier nötrofilik faktör ve kardiotrofin-1 en önemli IL-6 ailesi üyelerindendir 70. Moleküler konfigürasyonu tamamen bilinmemekle birlikte IL- 6, dört alfa heliks uzun zincir ailesine ait olan bir sitokindir ve yaklaşık 26 kd ağırlığındadır. IL-6, MFH ler, endotel hücreleri, fibroblastlar, monositler, keratinositler, mezengial hücreler ve kemik iliği stromal hücreleri tarafından IL-1 stimülasyonu ile sentezlenen bir interlökin üyesidir. Aynı zamanda bazı aktive T hücreler tarafından da üretilir 28,68. IL-6 endotel hücrelerinde IL-1 ve TNFα nın sekresyonunu artırır. IL-1 ve TNFα da IL-6 sekresyonunu artırmaktadır. IL-10 posttranskripsiyonel mekanizma ile IL- 6 nın sentez ve sekresyonunu baskılamaktadır 71. 7p21-14 kromozomu üzerindeki IL-6 geninin ürünü olan IL-6 homodimer bir yapıya sahiptir. Birden çok fonksiyonu olan IL-6 asıl olarak 29

39 immün ve inflamatuar yanıtın düzenlenmesinde, hematopoetik sistem ve santral sinir sisteminde görev alır ve inflamatuar ve hematolojik birçok hastalıkta üretimi artar. Pleiotropik bir sitokin olan IL-6, T ve B hücre diferansiyasyonunu ve proliferasyonunu indükler. B hücrelerin immünglobülin salgılayan plazma hücrelerine diferansiyasyonunu ve megakaryositlerin trombositlere diferansiyasyonunu indükler. Karaciğerden hapsidin ve demir düzenleyici peptid hormonunun salınımında görev alır. Hepatositlerin akut faz proteinleri, fibrinojen ve serum amiloid üretimini stimüle eder. IL-6 aynı zamanda vasküler endotelyal büyüme faktörü üretimini de indükler 68. IL-6 endotel hücrelerde interselüler adezyon molekülü 1 (ICAM-1) ve vasküler hücre adezyon molekülü 1 (VCAM-1) ile E-selektin moleküllerinin ekspresyonunu artırarak endotel hücrelerinin lenfositlere yapışmasını kolaylaştırır. IL-6 hipofize etki ederek adenokortikotropik hormon (ACTH) salınımını indükler ve direkt olarak adrenal bezlere etki ederek glikokortikoid üretimine neden olur 71. IL-6 aynı zamanda osteotropik bir sitokindir ve kemik metabolizması üzerine de etkileri vardır 11,71. In vitro çalışmalarda IL-6 nın osteoklast diferansiyasyonunu ve aktivasyonunu indüklediği gösterilmiştir. Synovial inflamasyona katıldığı ve kıkırdak çevresi dokularda ve kemikte yıkıma sebep olduğu bilinmektedir. Serum IL-6 seviyeleri ile radyografik olarak kemik yıkım seviyesi arasında bağıntı bulunmuştur. Kondrositlerin tip 2 kolajen ve agrekan üretimini azaltır 71. IL-6 IL-1 ile birlikte MMP lerin üretimini artırır 70. IL-6 IL-1, TNF-α, lipopolisakkaridler ve bazı dış etkenlere cevap olarak osteoblastlardan da salınır ve osteoklast oluşumunu stimüle eder. Yüksek konsantrasyondaki IL-6 seviyelerinin hiperkalsemiye neden olduğu gösterilmiştir. Aynı zamanda östrojen yokluğunda görülen kemik kaybına da IL-6 nın katkıda bulunduğu bilinmektedir 11. IL-6, periferal kandaki mononükleer hücrelerden osteoklast formasyonunu indükler

40 2.5. Tek nükleotid polimorfizmi Tek nükleotid polimorfizmi (TNP), deoksiribonükleik asit (DNA) dizisindeki bir nükleotid (A, T, C veya G) çiftinde değişikliğin olmasıdır. TNP leri, transisyonlar [bir pürin bazın (A,G) diğer bir pürin bazına veya bir pirimidin bazın (C,T) diğer pirimidin bazına değişmesi] ve transversiyonlar (bir pürin bazının bir pirimidin bazına değişimi veya tersi) gibi baz değişimlerini içermektedir. G>A ve C>T transisyonları insan genomundaki TNP lerin % 25 ini oluşturmaktadır. Tek nükleotid pozisyondaki varyasyon terminolojisi alel frekansı ile açıklanmaktadır. Bir populasyondaki tek baz değişiminin frekansı % 1 den büyükse bu değişim TNP, % 1 den küçük ise mutasyon olarak adlandırılır. Bu varyantlar düşük sıklıkta olmasına karşın bazı durumlarda çok önemlidirler. Farklı tipteki TNP leri, bir proteinin fonksiyonunu veya regülasyonunu ve ekspresyonunu değiştirebilir. TNP insanda en sık görülen sekans farklılığıdır ve popülasyonda % 1 in üzerinde bulunur. Şimdiye kadar insan genomunda kadar tek nükleotid polimorfizmi açığa çıkarılmıştır. İnsan genomu 3x109 baz çifti (3 milyon kilo baz) içermektedir ancak insan DNA sının sadece % 3-5 i protein kodlamaktadır. Bu yüzden TNP lerin çoğu protein kodlayan sekansların dışında olmaktadır. Bazı genler için toplumda tek tip nükleotid sekansı mevcuttur ve her kromozom çiftinde aynı dizilim söz konusudur. Bu genler non-polimorfik genlerdir. Bazı genlerin ise toplumda sabit sıklıkta görülen değişik formları mevcuttur. Bir türün popülasyonu içinde aynı fenotipik özelliği etkileyen ancak aralarında farklar bulunan bu genlere alel denmektedir. Aleller, bir kromozomun belirli bir lokusundaki genlerin farklı varyasyonlarıdır. Kişiden kişiye değişirler ve farklı aleller kalıtımda varyasyonlar oluştururlar. Her bir lokalizasyon için bir tek alel anneden veya babadan alınır. Her bir birey için alelin bir tek formu, dominant olarak diğer formdan daha fazla eksprese edilir. Göz rengi, kan grubu gibi... Polimorfik genlerde bireyin kromozom çiftinde aynı 31

41 alel (homozigot) veya 2 farklı alel (heterozigot) bulunur. Polimorfizmler hastalığa yol açmayan, fakat hastalık için yatkınlık yaratabilen DNA değişikliği olarak tanımlanır. Aynı zamanda polimorfizmler, hastalıkların prognozu, her bir bireyin tedaviye verdiği yanıt gibi farklılıkları da açıklayabilir. Bir sonraki jenerasyona basit Mendel kuralları ile aktarılır 18. Hem hastalıkta hem sağlıkta IL-1 dengesi ve bu dengenin korunması immün cevapta kritik bir öneme sahiptir. Düşük doz IL-1 in enfeksiyona karşı konak cevabında koruyucu, yüksek dozlarda ise yıkıcı etkisinin olduğu belirtilmiş, dahası bu sitokinlerin yararlı ve patolojik etkileri arasındaki sınırın oldukça dar olduğu, kontrol edilemeyen inflamatuar hastalıklarda hastalık şiddeti ve IL-1 düzeyleri arasında ilişki kuran çalışmalar sayesinde anlaşılmıştır. IL-1 in sentezini düzenleyen ve kontrol eden moleküler genetik elemanlara ait bilgilerin henüz yetersiz olmasına rağmen genetik polimorfizmlerin sitokinler üzerine etkilerinin değerlendirilmesi gerekmektedir. Nitekim, IL-1 gen polimorfizminin Alzhemier, juvenil kronik artirit, juvenil romatoid artirit, multiple myelom ve periodontal hastalıklarla ilişkili olduğu bulunmuştur 72,73. IL-1 gen ailesi, 2. kromozomun aynı bölgesinde bulunan ayrı genler tarafından kodlanmaktadır. 2q13 bölgesinde 415 baz çifti (bç) uzunluğundaki bölgede yerleşen IL-1A, IL-1B ve IL-1RN genleri sırasıyla IL-1α, IL-1β ve ILRa yı sentezler (Şekil 1). IL-1A geni promotor bölgesi pozisyonda tek nükleotid polimorfizmi mevcuttur pozisyonundaki polimorfizm, bir tek nükleotid polimorfizmidir (TNP) ve sitozin-timin (C/T) değişikliği söz konusudur (IL-1A -889 C/T). Sitokin salınımının düzenlenmesi, genetik olarak bu sitokinin kodlandığı ve promotor bölgesindeki gen dizisi ile kontrol altındadır. Ancak her TNP, gen ürünü ekspresyonunda değişikliğe neden olmazken, IL-1α -889 polimorfizmi IL- 1α protein üretimini etkiler. Bu polimorfizm ile artmış IL-1α seviyeleri arasında bağıntı gösterilmiştir

42 Şekil 1: IL-1 gen bölgesi IL-6 geni 7p21-p15 lokalizasyonunda bulunur (Şekil 2). IL-6 geninin promotor bölgesindeki polimorfik varyantlar, IL-6 nın transkripsiyon varyantlarından ve dolayısıyla bu sitokinin seviyesinden sorumlu olabilir. Bu tek nükteotid polimorfizmlerinden en iyi tanımlanmış olanı -174 pozisyonunda olandır. IL-6 ( 174), IL-6 geninin transkripsiyon bölgesinin 5 kısmında lokalizedir pozisyonundaki bu tek nükteotid polimorfizminde guanin-sitozin (G/C) değişimi söz konusudur (IL G/C) 75,76. IL-6 polimorfizmi birçok hastalık ile ilişkilendirilmiştir. Koroner kalp hastalığı, greft versus host hastalığı, Sjögren sendromu ve sistemik lupus eritomatozusta zayıf prognoz ile; ayrıca jüvenil romatoid artirit gelişme riski ile IL G/C polimorfizmi arasında bağıntı bildirilmiştir. Yanı sıra birçok kanser türünde prognoz ve bu TNP arasındaki ilişki halen araştırılmaktadır

43 Şekil 2: IL-6 gen bölgesi Diğer birçok hastalıkta olduğu gibi odontojenik tümörlerin gelişiminde de çok sayıda polimorfizmin rol oynayacağı tahmin edilmektedir. Tek nükleotid polimorfizmleri günümüzde sıklıkla kullanılan polimeraz zincir tepkimesi (Polymerase Chain Reaction; PCR) ve diğer yüksek teknolojiler sayesinde saptanmaktadır. PCR, DNA üzerinde incelenmek istenen bölgenin, o bölgeye özgül primerler kullanılarak çoğaltılması esasına dayanır. Isı ile denatüre edilerek tek zincir haline getirilen DNA molekülüne primerlerin bağlanması ve bu primerlerden yeni DNA zincirinin sentezlenmesi olarak üç aşamadan oluşur. Bu aşamalar döngü halinde tekrarlanarak istenilen bölge çoğaltılmış olur 77 (Şekil 3). 34

44 30-40 döngülük PCR basamakları: 1. Basamak: Denatürasyon ~ 1 dak. 95 o C 2. Basamak: Annealing ~45 sn. 54 o C Forward ve reverse primerler Şekil 3: PCR aşamaları Genin ekzon bölgesinde bulunan TNP leri gen transkripsiyonunda değişikliğe yol açarken, genin promotor bölgesinde yerleşim gösterenler protein dizisinde değişikliğe neden olup, proteinin biyolojik fonksiyonunda farklılığa neden olabilirler. Sonuç olarak TNP leri, kompleks poligenik hastalıklara yatkınlığı aydınlatmada önemlidirler 78. Genetik polimorfizmlerin açığa çıkarılması, bireyin tümör geliştirme yatkınlığını, tümörün nüks etme potansiyelini veya hastalığın prognozunu da tahmin etmeye izin verecektir. Genetik faktörlerin belirlenmesinde anahtar olan nokta, hastalığın klinik sonucunu etkileyecek ölçüde anlamlı rol oynayan genetik faktörlerin tanımlanabilmesidir. Hastalıklarda bir genin hastalığı yönlendirici etkisiyle aday gen olabilmesi için bu gen tarafından belirlenen fizyolojik olayların hastalığın varlığı veya şiddeti ile ilişkili olması gerekmektedir. 35

45 IL-1α ve IL-6 yı ilgilendiren genlerdeki polimorfizim bazı vakalarda daha fazla nüks veya daha büyük boyut gibi daha agresif özelliklerle sonuçlanan, vakalar arasındaki farklılıkları açıklayabilecek bir mekanizma olabilir. Birçok farklı kanser türünde sitokin polimorfizmi; prognozu belirlemede, tümöre karşı gelişen immün yanıtı ve tedaviye cevabı değerlendirmede kullanılmaktadır 79. Spesifik genlerin hastalık etyolojisindeki yerinin bilinmesiyle birlikte, bu genin neden olduğu biyokimyasal değişikliğin düzeltilmesine yönelik tedavilerin geliştirilmesi gündeme gelebilir. Ayrıca sitokin polimorfizminin farklı klinikopatolojik özelliklere sebep olan faktörleri açıklayabilecek bir neden olduğu düşünülmektedir. En agresiv iki odontojenik tümör ile ilgili gen polimorfizmi çalışılmasının olası faydaları ve bu konuyla ilgili olarak yapılan genetik çalışmaların ışığında; çalışmamızda KOT, OK ve ABL li bireylerde IL-1A (-889) ve IL-6 (-174) polimorfizmlerinin araştırılması ve bu sitokinlerin ekspresyon derecelerinin immünohistokimyasal olarak saptanması planlanmıştır. Bu çalışmanın amacı, çok ender görülmeyen KOT ve ABL ların kemik içinde geniş yıkımlar yaparak büyük boyutlara ulaşabilmelerinin nedenleri arasında IL- 1α ve IL-6 protein varlığının ve ilgili gen polimorfizmlerinin etken olup olmadığını araştırmaktır. 36

46 3. GEREÇ VE YÖNTEM Bu çalışma yılları arasında Gazi Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesi Oral Patoloji Bilim Dalı nda tanıları konmuş ve Bilim Dalı arşivinde yer alan odontojenik keratokist ve ameloblastoma vakaları üzerinde yürütüldü. Bu vakalardan 25 adedi ABL, 41 adedi KOT ve 8 adedi OK idi. Kontrol dokusu olarak KOT ve OK için 15 adet dentigeröz kist (DK) ve ABL için de 15 adet dental folikül (DF) kullanıldı. Vakalara ait tüm hematoksilen-eozin boyalı kesitler yeniden gözden geçirilerek, vakalar histolojik alt tiplerine göre kendi içlerinde gruplandırıldı. Tüm histopatolojik değerlendirmeler Leica DM 4000 B (Leica Microsystems GmbH. Wetzlar, Germany) ışık mikroskopunda yapıldı. İmmünohistokimyasal yöntem ve DNA eldesi için uygun parafin bloklar tespit edildi. Tüm vakalara ait cinsiyet veya yaş gibi klinik bilgiler ve lezyon boyutları kaydedildi. Makroskopik örnekleme sırasında not edilmiş olan lezyon boyutlarından yararlanılarak her vaka, boyutlarına göre şu şekilde derecelendirildi: En uzun çapı cm arası: 1 En uzun çapı cm arası: 2 En uzun çapı 3-3.9cm arası: 3 En uzun çapı 4 cm ve daha büyük: 4 Vakaların histopatolojik kesitleri mikroskopik olarak yeniden incelendi. Tüm vakalarda inflamasyon derecesi değerlendirildi. ABL vakalarında buna ek olarak tümör alt tipleri de değerlendirildi. İnflamasyon yoğunluğunun değerlendirilmesi x400 (büyük büyütme alanı) büyütmede tümör dokusu içinde ve kist bağ dokusunda yer 37

47 alan inflamatuar hücrelerin sayılması ile gerçekleştirildi. Hematoksileneozin kesitlerde rastgele seçilen beş ayrı büyük büyütme alanındaki inflamatuar hücreler Leica QWin Plus v3.3.1 görüntü analizi programı (Leica Microsystems GmbH. Wetzlar, Germany) kullanılarak sayılan inflamasyon yoğunluğu dört dereceli bir sistem ile skorlandı 80 : 0: İnflamasyon yok 1: Alan başına 15 inflamatuar hücreden az 2: Alan başına inflamatuar hücre 3: Alan başına 50 veya daha fazla inflamatuar hücre. Ayrıca KOT ve OK vakalarında kist duvar kalınlığı Leica QWin Plus v3.3.1 görüntü analizi programı (Leica Microsystems GmbH. Wetzlar, Germany) kullanılarak ölçüldü. Rastgele seçilen üç alandan yapılan ölçümlerin ortalaması ile elde edilen µm cinsinden değer, her bir vaka için kist duvar kalınlığı olarak kaydedildi İmmünohistokimyasal Yöntem: IL-1α ve IL6 antikorları için Avidin-Biyotin Kompleks (ABC) metodu ile immünohistokimyasal boyama yapıldı. % 10 luk tamponlanmış formalin solüsyonunda saat fikse edildikten sonra rutin doku takip işlemlerinden geçirilen ve parafin bloklara gömülen dokulardan adheziv lamlara (Surgipath, X-tra Adhesive Microslides, Illinois, USA) 4 m kalınlığında kesitler alındı. Kesitler etüv içinde 56 o C de 12 saat bekletildikten sonra 30 dakika süreyle ksilol ile deparafinize edildi ve on beşer dakika süreyle sırasıyla % 100 (absolut), % 96, % 90 ve % 80 lik etil alkolde bekletilerek dehidratasyon işlemleri 38

48 gerçekleştirildi. En son bir dakika çeşme suyunda yıkandı ve distile sudan geçirildi. Endojen peroksidaz aktivitesini bloke etmek için metanol içinde hazırlanmış % 3 lük hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) 10 dakika süreyle uygulandı. Kesitler fosfatla tamponlanmış serum (PBS, Fosfat Buffer Solüsyonu, ph:7,60) ile püskürtme yöntemi kullanılarak iyice yıkandı. Formalin fiksasyonu ve parafin bloklama nedeniyle dokuda maskelenmiş olan antijenik yapıları açığa çıkarmak amacıyla her iki antikorun da uygulanacağı kesitler, antijen retreival solüsyonu (0,01M sodyum sitrat buffer, ph:6,00) içinde ilk on dakika orta, son beş dakika yüksek derecede olmak üzere 15 dakika mikrodalga fırında işlemden geçirildi. Takiben kesitler oda ısısında 30 dakika bekletildi ve distile su ve arkasından PBS ile üç kez yıkandı. IL-1α boyaması için Zymed Histostain Plus Broad Spectrum (Lot , Zymed laboratories Inc., Carlsbad, CA, USA) ve IL-6 boyaması için Santa Cruz goat ABC staining System (ABC kit, Lot: sc- 2023, Santa Cruz Biotechnology,Inc. CA, U.S.A) kullanıldı. Kesitler 5-10 dakika süreyle non immün bloklama serumunda bekletildi. Daha sonra IL-1α (IL-1α rabbit polyclonal antibody, cat # ab7632, Abcam, Cambridge, UK ) ve IL-6 (IL-6 goat polyclonal antibody, Lot: sc-1265, Santa Cruz Biotechnology, Inc. CA, U.S.A) primer antikorlarıyla +4 o C de saat süreyle muamele edildi. IL-1α ve IL-6 antikorları için kullanılan dilüsyon oranları sırasıyla 1:25 ve 1:50 idi. Oda ısısına erişen kesitler PBS ile 5 dakika püskürtme yöntemi ile yıkanıp kurulandıktan sonra biyotine bağlanmış bağlayıcı (sekonder) antikor dakika uygulandı. Kesitler yeniden PBS ile yıkanıp kurulandıktan sonra streptavidin ile konjüge alkalen fosfataz uygulanarak dakika bekletildi. Takiben kesitler PBS ile yıkandı ve kurulandı. Renk vererek görüntülemeyi sağlamak amacıyla yaklaşık 5-8 dakika süre ile

49 diaminobenzidine tetrachloride solüsyonunda (DAB, substarate kit, Lot: , Zymed S.San Francisco, California, USA) inkübe edildi. Kesitler üç kez distile sudan geçirildi. Zemin boyaması için Harris hematoksilende 5 saniye bekletildi. Kesitler önce çeşme suyunda ardından distile suda yıkandıktan sonra 5 dakika % 96 alkolde fiksasyonları sağlandı. Ksilol içinde 5 dakika bekletilen kesitler entellan (Clearmount, Lot: , Zymed S.San Francisco, California, USA) kullanılarak lamelle kapatıldı. Pozitif kontrol olarak her iki antikor için de insan lenf nodu dokusu kullanıldı. Primer antikor uygulanması aşamasında PBS içinde bekletilen lenf nodu dokuları negatif kontrol olarak kabul edildi İmmünohistokimyasal Boyanmaların Değerlendirilmesi: IL-1α ve IL-6 antikoru ile boyanan kesitlerde kahverengi renkteki stoplazmik boyanma pozitif olarak kabul edildi. Her iki antikor için de KOT ve OK vakalarında döşeyici epitel ve kist bağ dokusundaki inflamatuar hücrelerdeki; ABL vakalarında tümör hücrelerindeki boyanma alanları ve yoğunluğu Kubota ve arkadaşlarının 5 kullandıkları dört aşamalı skalaya göre değerlendirildi. 0: Boyanma yok 1: Zayıf boyanma (tek pozitif) 2: Orta derecede boyanma (iki pozitif) 3: Kuvvetli boyanma (üç pozitif) 40

50 3.2. Gen polimorfizmi analizi: DNA eldesi ve saflaştırılması: Arşiv bloklarından her örnek için lamlara 8 m kalınlığında adet kesit alındı. Kesitler etüv içinde 37 o C de 12 saat bekletildikten sonra 30 ar dakikalık sürelerle iki kez ksilol ile muamele edilerek deparafinizasyon, beşer dakika süreyle sırasıyla % 96, % 90, % 80 ve % 50 lik etil alkolde bekletilerek dehidratasyon işlemleri gerçekleştirildi. Kesitler distile su ile yıkandıktan ve oda ısısında kurutulduktan sonra steril bistüriler ile lam üzerindeki dokular 1,5 ml lik DNA veya ribonükleik asit (RNA) içermeyen ependorf tüplere aktarıldı ve DNA izolasyonuna kadar - 20 o C de saklandı. Deparafinize dokuların parçalanması için her örneğe 100 μl parçalama tamponu (150 mm NaCl, 10 mm TRIS-HCL [ph:8], 25 mm EDTA, %0.5 SDS) ve 40 μl / ml proteinaz K eklendi (20 μg/ml, Proteinase K, recombinant, PCR grade, Roche Diagnostics, Almanya); 55 C de bir gece inkübe edildi. Ertesi gün örnekler DNA saflaştırma işlemine alındı. DNA izolasyonunda ticari ekstraksiyon kiti olan High Pure Viral Nucleic Acid Kit (Roche Diagnostics, Almanya) kullanıldı. Doku parçalanması işlemi tamamlanan örneklerin kalan 140 μl'sine nükleik asit ekstraksiyon kiti üreticinin önerileri doğrultusunda uygulandı. Buna göre: Örneklere poli(a) taşıyıcı RNA solüsyonu ve proteinaz K içeren 200 μl Binding Buffer (6 M guanidin-hcl, 10 mm üre, 10 mm Tris-HCL, 20 % Triton X-100, ph:4.4 [25 C]) eklenerek karıştırıldı, 72 C de 10 dakikalık inkübasyonu takiben, 41

51 100 µl Binding Buffer daha eklendi, Tüm örnekler filtreli tüplere aktarıldı ve, 1 dakika rpm de santrifüj uygulandı. 500 µl Inhibitor Removal Buffer [saf alkolde 5 M guanidin-hcl, 20 mm Tris-HCL, ph:6.6 (25 C)] eklendi ve aynı şekilde santrifüj edildi. Daha sonra 450 μl Wash Buffer [saf alkolde 20 mm NaCl, 2 mm Tris-HCL, ph:7.5 (25 C)]ile iki kez yıkandı. Son olarak önceden ısıtılmış Elution Buffer (10 mm Tris-HCL, ph:8.5) eklenerek 1 dakika rpm de ve son olarak rpm de santrifüj edildi ve nükleik asitler elde edildi. Saflaştırması tamamlanan DNA örnekleri PCR ve enzim kesim işlemine kadar + 4 C de saklandı Polimeraz Zincir Tepkimesi (PCR ) İnterlökin-1A (IL-1A) geni promotor bölgesini çoğaltmak için kullanılan primer (TIB Molbiol, ref no: , Berlin, Almanya) dizisi: F 5 AAG CTT GTT CTA CCA CCT GAA CTA GGC 3 R 3 TTA CAT ATG AGC CTT CCA TG 3 Bu primerler 99 bç lik PCR ürününün oluşmasını sağlamaktadır. 50 µl lik toplam PCR reaksiyon karışımı için MgCl 2 içeren 10X PCR buffer dan 5 µl, 2mM lık dntp karışımından (PCR Nucleotide Mix, 42

52 cat no: , Roche Diagnostics, Almanya) 5 µl, 100pmol/ µl lik forward ve reverse primerlerden 1 er µl, taq DNA polimeraz (taq DNA Polymerase, cat no: , Roche Diagnostics, Almanya) enziminden karışım içinde 1U olacak şekilde 0,2 µl, 5 µl DNA ve 50 µl ye tamamlayacak kadar steril distile su kullanıldı. IL-1A gen bölgesi için PCR (PCR sprint cycling system, Thermo Hybaid, Franklin, MA, A.B.D.) amplifikasyon koşulları aşağıdaki gibidir: 95 0 C 7dk C 1dk C 1dk. 35 döngü 72 0 C 1dk. 72 o C 5dk. PCR ürünleri (10ml) yaklaşık 5 µl agaroz jel yükleme tamponu ile karıştırılarak X1 lik TAE (Tris-asetik asit- EDTA) tamponu ile hazırlanmış %3 lük agaroz jeldeki kuyucuklara yüklendi. 100 voltta (200mA) 1 saat yürütüldü (Power Station, Labnet İnt. Inc.). Elektroforez işlemi tamamlandıktan sonra jel UV ışık altında gözlendi ve fotoğraflandı (Kodak EDAS 290 Herolab UVT-20M, 1D Image Analysis Software, ver. 3,6) PCR Ürünlerinin Uygun Kesim Enzimi ile Kesilmesi ve Restriksiyon Fragman Uzunluk Polimorfizmi (RFLP) Analizi: Restriksiyon endonükleaz enzimleri, bakterilerin kendi genomunu korumak için sentezlediği enzimlerdir. Bakterilerden elde edilen restriksiyon endonükleaz enzimlerini kullanarak DNA zincirinde meydana gelen baz değişimlerini saptamak mümkündür. Bu tür değişimler bir 43

53 restriksiyon endonükleaz enzimi için tanıma bölgesi oluşmasına neden olabilir. Restriksiyon enzimleri kısa DNA dizilimlerini özgül olarak tanıyan ve bu dizilimlere yakın bölgelerden veya bu dizilimler içindeki spesifik DNA yı kesen yapılardır. Bugün, 230 un üzerinde farklı DNA dizilimini tanıyan yaklaşık 3000 kadar restriksiyon enziminden söz edilmektedir. Bakteriler dışında çok az bir kısmı virüslerde ve ökaryotlarda bulunmaktadır. Çalışmamızda IL-1A -889 gen bölgesindeki polimorfizmi saptamak için Nco I (Restriction Endonuclease NcoI, Cat no ,10U/ µl, Roche Diagnostics, Almanya) enzimi kullanıldı. Spesifik kesim bölgesi: C CATGC GGTAC C şeklindedir. Nco I restriksiyon endonükleaz enzimi ile kesim protokolü: PCR ürünü: 10X Nco I H Tamponu: Restriksiyon enzimi: Steril distile su: Toplam: 10 μl 2,5 μl 0,2 μl (1U) 12,3 μl 25 μl Enzim kesim reaksiyonu 37 0 C de 16 saat inkübe edilerek gerçekleştirildi ve enzim kesim sonuçları 100 voltta 1 saat yürütülen % 4 lük agaroz jelde analiz edildi. Restriksiyon enziminin DNA molekülünü kesmesine veya kesmemesine bağlı olarak, sonuçta kişiden kişiye değişiklik gösteren farklı uzunlukta DNA parçaları ortaya çıkar. İşte, DNA nın restriksiyon 44

54 enzimleriyle kesimi sonrasında oluşan fragmanların boyutlarındaki farklılıklar restriction fragment length polymorphism (RFLP) olarak tanımlanır. IL-1A -889 gen bölgesinde enzim, normal alel (CC) varlığında her iki aleli de keser; mutant alel heterozigot ise (CT) tek bir aleli keser, mutant alel homozigot ise (TT) iki aleli de kesmez 17. Bu bilgiler ışığında çalışmamızda da 83 ve 16 bç lik iki bant veren vakalar normal homozigot (1/1), 99, 83, 16 bç lik üç bant veren vakalar heterozigot (1/2), 99 bç lik tek bir bant veren vakalar mutant homozigot (2/2) olarak kabul edildi (Şekil 4). Fragman Normal Heterozigot Mutant Uzunluğu (bç) Homozigot (1/1) (1/2) Homozigot (2/2) 99 bç 83 bç 16 bç Şekil 4: Restriksiyon enzimi ile kesim sonrası oluşan bantlar. 45

55 Şekil 5: Çalışma akış şeması İstatistiksel Analizler: Tanımlayıcı istatistikler başlangıçtaki hasta verilerini gruba ve tanıya göre özetlemek için kullanıldı. Devamlı değişkenler, ortalama, standart sapma, ortanca, minimum, maksimum değerleri kullanılarak; kategorik değişkenler için ise oran ve yüzde değerleri kullanılarak özetlendi. İkiden çok grup arasındaki karşılaştırmalarda normal dağılan değişkenler için tek yönlü varyans analizi, normal olmayan dağılım 46

56 gösteren değişkenler için Kruskal Wallis varyans analizi kullanıldı. Genel olarak fark bulunan çoklu grup karşılaştırmalarının ikili grup alt analizleri normal dağılan değişkenler için parametrik testlerle (Student T testi), normal olmayan dağılım gösteren değişkenler için non parametrik (Mann Whitney U testi) testler kullanılarak yapıldı. Kategorik değişkenlerin karşılaştırılması çapraz tablo istatistikleri (ki kare testi, Fisher testi veya Mantel Haenszel testi) ile yapıldı. Normal dağılım gösteren değişkenler arasındaki doğrusal bağıntı analizi Pearson korelasyon analizi ile, normal dağılım göstermeyen değişkenlerde ise Spearman korelasyon analizi ile değerlendirildi. Saptanan alel dağılımlarının Hardy-Weinberg e uyup uymadığı kontrol edildi. Lojistik regresyon analizi kullanılarak odds oranı ve % 95 güven aralığı hesaplandı. İstatistiksel anlamlılık sınırı (P) 0.05 olarak seçildi. İstatistiksel analizler; SPSS ver 12.0 (SPSS Inc Boston USA) ve Medcalc ver (MedCalc Software, Mariakerke Belgium) programlarıyla, güç analizleri ise PASS 2005 (PASS, Kaysville USA) ile yapıldı. 47

57 4. BULGULAR 4.1. Klinik ve Histopatolojik Bulgular Bu çalışmada; 25 ABL, 41 KOT ve 8 OK tanısı almış toplam 74 vaka ile ABL için kontrol grubu olan 15 DF ve KOT ve OK için kontrol grubu olan 15 DK olmak üzere toplam 30 kontrol vakasının Bilim Dalı arşivinde parafin bloğu kullanılmıştır. ABL grubunda en sık gözlenen alt tip 16 (% 64.0) vaka ile solid (konvansiyonel) ABL idi, bunu 7 (% 28.0) vaka ile ünikistik ABL, 2 (% 8.0) vaka ile periferal tip ABL takip etmekteydi. Histopatolojik olarak ise solid ABL vakalarının 13 (% 81.25) tanesi foliküler tip, 2 (% 12.5) tanesi pleksiform tip ve 1 (% 6.25) tanesi bazal hücreli ABL idi. Tüm ABL vakalarından üç tanesinin nüks ettiği bilinmektedir. ABL vakalarının yaşa göre dağılımları Tablo 3 te gösterilmektedir. ABL tanısı alan hastaların yaş ortalaması 42±22 (10 82) idi; iki hastanın yaş bilgisine ulaşılamadı. ABL vakalarının 13 (% 52) tanesi erkek, 12 (% 48) tanesi kadındı. Lezyonların 8 tanesi (% 32) maksilla, 17 tanesi (% 68) mandibulada tespit edildi. Tablo 3: ABL vakalarının yaşa göre dağılımı Yaş Grubu N Yüzde (%) Toplam

58 En uzun çapı 3 4 cm arası olan vakalar % 32 ile en sık izlenen grubu oluşturdu. Yani ABL grubunda en sık gözlenen hacimsel büyüklük grade 3 idi. ABL vakalarının boyutlarına göre dağılımı Tablo 4 de gösterilmektedir. Tablo 4: ABL vakalarının boyutlarına göre dağılımı Boyut N Yüzde (%) Toplam ABL grubunda hastaların 16 (% 64.0) sında inflamasyon görüldü. Vakaların inflamasyon yoğunluklarına göre dağılımı Şekil 6 da gösterilmektedir. Şekil 6: ABL vakalarının inflamasyon yoğunlukları 49

59 Çalışmaya dahil edilen toplam 41 KOT vakasının 5 tanesinde uydu kist varlığı ve epitelde bağ dokusuna doğru tomurcuklanmalar gözlendi. KOT vakalarının yaşa göre dağılımları Tablo 5 te gösterilmektedir. KOT tanısı alan hastaların yaş ortalaması 39±16 (13 63) olarak saptandı. KOT vakalarının 24 (% 58.53) tanesi erkek, 17 (% 41.46) tanesi kadındı. Vakalardan 5 tanesinin nüks ettiği, 2 tanesinin birden çok sayıda lezyona sahip olduğu bilinmektedir. Tablo 5: KOT vakalarının yaşa göre dağılımı Yaş N Yüzde (%) Toplam KOT grubunda en sık gözlenen hacimsel büyüklüğü grade 2 ve 4 oluşturdu. KOT vakalarının boyutlarına göre dağılımı Tablo 6 da verilmiştir. En büyük KOT 9 x 4 x 0.5 cm, en küçük KOT 0.6 x 0.4 x 0.4 cm boyutlarında ölçüldü. 50

60 Tablo 6: KOT vakalarının boyutlarına göre dağılımı Boyut N Yüzde (%) Toplam KOT kist duvar kalınlıklarına ait veriler Şekil 7 de gösterilmektedir. Kist duvar kalınlığı ortalaması 809±437 ( ) µm olarak hesaplandı. Lezyonların % 42.9 unun kist duvarı kalınlığı µm arasında ölçüldü. Şekil 7: KOT vakalarının kist duvar kalınlıkları KOT vakalarının inflamasyon yoğunluklarına göre dağılımı Şekil 8 de gösterilmektedir. Vakaların % 49 unda hafif derecede inflamasyon izlendi. 51

61 Şekil 8: KOT vakalarının inflamasyon yoğunluklarına göre dağılımı Çalışmaya dahil edilen toplam 8 OK vakasının hiçbirisinde uydu kist varlığı ve epitelde bağ dokusuna doğru tomurcuklanmalar gözlenmedi. Ayrıca hiçbir vakanın nüks etmediği ve hepsinin tek lezyonlar olduğu belirlendi. OK vakalarının yaşa göre dağılımları Tablo 7 de gösterilmektedir. OK tanısı alan hastaların yaş ortalaması 31±164 (10 56) olarak saptandı. OK vakalarının 6 (% 75) tanesi erkek, 2 (% 25) tanesi kadındı. Tablo 7: OK vakalarının yaşa göre dağılımı Yaş N Yüzde (%) Toplam

62 OK grubunda en sık gözlenen hacimsel büyüklüğü grade 2 (% 62.5) oluşturdu. En büyük OK 6.5 x 2.5 x 1.3 cm, en küçük OK 1.8 x 1.0 x 0.8 cm boyutlarında ölçüldü. Tablo 8: OK vakalarının boyutlarına göre dağılımı Boyut N Yüzde (%) Toplam OK kist duvar kalınlıklarına ait veriler Şekil 9 da gösterilmektedir. Kist duvar kalınlığı ortalaması 588±237 ( ) µm olarak hesaplandı. Şekil 9 OK vakalarının kist duvar kalınlıkları 53

63 OK vakalarının tümünde hafif derecede inflamasyon yoğunluğu gözlendi. ABL ile KOT ve OK hasta grupları karşılaştırıldığında yaş ve cinsiyet açısından fark bulunmadı. Aynı şekilde KOT ve OK grupları arasında da yaş, cinsiyet, inflamasyon yoğunluğu, kist duvar kalınlığı ve hacim açısından fark bulunmadı. ABL ile KOT ve OK hasta grupları karşılaştırıldığında inflamasyon dereceleri arasında fark vardı (P=0.042). Yapılan alt analizde ABL grubunda inflamasyon gözlenmeyen hasta oranının, KOT ve OK grubunda inflamasyon gözlenmeyen hasta oranından anlamlı olarak daha yüksek olduğu saptandı (P=0.001) İmmünohistokimyasal Bulgular Yapılan mikroskobik incelemelerde IL-1α ve IL-6 reaktivitesi, hücrelerin stoplazmalarının değişen yoğunlukta koyu kahverengi olarak boyanması ile ayırt edilmiştir. İmmünohistokimyasal olarak yapılan boyamalarda yoğunlukları değişmekle birlikte ABL vakalarının tümünde IL-1α antikoru ile pozitiflik saptandı. Solid ABL vakalarında IL-1α ekspresyonu tümör adaları ortasındaki gevşek, yıldızsı yapıdaki stellat retikulum benzeri hücrelerde stoplazmik olarak gözlendi; bazal tabaka hücrelerinde ise pozitiflik saptanmadı. Odontojenik epitelin skuamöz metaplazi gösterdiği akantotik ABL lerde skuamöz epitelde kuvvetli boyanma izlendi (Resim 1a, 1b). Unikistik ABL vakalarında döşeyici ameloblastik epitelde stoplazmik IL-1α pozitifliği dikkati çekti. 54

64 a b Resim 1: ABL de (a) stellat retikulum benzeri hücrelerde stoplazmik olarak izlenen ve (b) skuamöz metaplazi alanlarında yoğunluğu artan (ok) IL-1α pozitifliği (DAB, a:x100, b:x200). 10 (% 40) ABL vakasında IL-6 ekspresyonu gözlenmezken, geri kalan vakaların tümünde stellat retikulum benzeri hücrelerde ve ayrıca unikistik ABL lerde döşeyici ameloblastik epitelde stoplazmik boyanma izlendi (Resim 2a, 2b). a b Resim 2: ABL de (a ve b) stellat retikulum benzeri hücrelerde izlenen IL-6 ekspresyonu (ok) (DAB, a:x100, b:x400) ABL vakalarının IL-1α ve IL-6 ekspresyon derecelerine göre dağılımı Şekil 10 da verilmiştir. 55

65 Şekil 10: ABL vakalarının IL-1α ve IL-6 ekspresyon derecelerine göre dağılımı ABL vakalarına kontrol olarak seçilmiş olan DF vakalarında; IL-1α ve IL-6 ekspresyonu folikül bağ dokusundaki dental epitel artıklarında izlendi. DF grubundan 7 (% 63.6) tanesinde IL-1α antikoru negatif bulundu. ABL ve ABL kontrol grupları IL-1α antikoru pozitifliği açısından değerlendirildiğinde, ABL grubunda IL-1α antikoru pozitif vaka oranı anlamlı olarak fazla bulundu (P<0.001). DF vakalarında IL-6 ekspresyonu gözlenmeyen vaka sayısı 4 (% 36.4) olarak bulundu. ABL ve ABL kontrol grupları arasında IL-6 antikoru varlığı açısından fark bulunmadı (P=0.365). ABL vakalarında IL-1α ve IL-6 ekspresyonu için yaş ve cinsiyet açısından fark görülmedi. Aynı şekilde ABL alt tipleri ve inflamasyon yoğunluğu açısından da IL-1α ve IL-6 ekpresyonunda farklılık izlenmedi. ABL vakalarında, IL-6 ekspresyonu ile boyut arasında zayıf / orta düzeyde ilişki görüldü (Rho=0.318) ancak bu ilişki anlamlı değildi (P=0.131). IL-1α ekspresyonu ile boyut arasında da çok zayıf ve 56

66 istatistiksel olarak anlamlı olmayan düzeyde ilişki gözlendi (Rho=0.157; P=0.465). KOT ların IL-1α boyanmaları değerlendirildiğinde 8 vaka haricindeki tüm vakalarda döşeyici kist epitelinde değişen yoğunluklarda stoplazmik pozitiflik saptandı. Ayrıca kist bağ dokusundaki inflamatuar hücrelerde (% 75.5 vakada) ve endotel hücrelerin bir kısmında da IL-1α ekspresyonu gözlendi (Resim 3a, 3b). a b Resim 3: KOT de (a) döşeyici kist epitelinde ve (b) kist bağ dokusundaki mononükleer inflamatuar hücrelerde (ok) saptanan IL-1α pozitifliği (DAB, a:x100, b:x200) IL-6 boyanmalarında KOT vakalarının sadece 6 sında boyanma görülmedi, kalan vakaların tümünde kist epitelinde (Resim 4) ve bağ dokudaki mononükleer inflamatur hücrelerde stoplazmik boyanma izlendi. 57

67 Resim 4: Kist epitelinde ve bağ dokusundaki inflamatuar hücrelerde (ok) izlenen IL- 6 pozitifliği (DAB, x100). KOT vakalarının IL-1α ve IL-6 ekspresyon derecelerine göre dağılımı Şekil 11 de verilmiştir. Şekil 11: KOT vakalarının IL-1α ve IL-6 ekspresyon derecelerine göre dağılımı KOT vakaları için kontrol olarak DK vakaları seçilmiştir. DK vakalarında IL-1α ve IL-6 ekspresyonu kistin döşeyici epitelinde stoplazmik olarak izlendi. Bu vakalardan 3 (% 27.3) tanesinde IL-1α antikoru saptanmadı. KOT vakalarındaki IL-1α boyanma yoğunluğunun, kontrol 58

68 grubu olan DK ler ile kıyaslandığında daha fazla olduğu dikkati çekti (P<0.032). KOT kontrol grubunda IL-6 ekspresyonu gözlenmeyen vaka sayısı da 3 (%27.3) olarak bulundu ve KOT ve DK vakaları arasında IL-6 antikoru varlığı açısından fark saptanmadı (P=0.259). KOT vakalarında IL-1α ve IL-6 ekspresyonu için yaş ve cinsiyet açısından fark izlenmedi. Döşeyici epiteldeki IL-6 ekspresyonu ile kist duvar kalınlığı arasında ise zayıf / orta düzeyde anlamlı ilişki bulundu (R=0.322; P=0.020). Aynı şekilde kist bağ dokusundaki inflamatuar hücrelerde ortaya çıkan IL-6 ekspresyonu ile kist duvar kalınlığı arasında da orta düzeyde anlamlı ilişki saptandı (R=0.544; P<0.001). OK vakaları IL-1α varlığı açısından değerlendirildiğinde, 2 vaka haricindeki tüm vakalarda döşeyici kist epitelinde değişen yoğunluklarda stoplazmik boyanma izlendi. Kist bağ dokusundaki mononükleer inflamatuar hücrelerde (vakaların % 62.5 inde) ve endotel hücrelerinin bir kısmında pozitifilk saptandı (Resim 5a). IL-6 pozitifliği değerlendirildiğinde vakaların % 62.5 inde kist epitelinde, % 37.5 inde bağ dokusundaki inflamatuar hücrelerde boyanma görüldü (Resim 5b). a b Resim 5: Ortokeratinize (ok) odontojenik keratokistte döşeyici epitelde saptanan (a) IL-1 α ve (b) IL-6 pozitifliği (DAB, a:x100, b:x200) 59

69 Şekil 12: OK vakalarının IL-1α ve IL-6 ekspresyon derecelerine göre dağılımı OK vakaları için de KOT vakaları için kullanılan kontrol grubu kullanıldı ve OK vakalarında IL-1α ve IL-6 antikoru ekspresyon derecesi açısından DK grubuna göre artış saptandı (P=0.039, P=0.021). OK vakalarında IL-1α ve IL-6 ekspresyonu için yaş, cinsiyet, inflamasyon dercesi ve kist boyutu açısından bir fark izlenmedi. Fakat tıpkı KOT vakalarında olduğu gibi, hem döşeyici epiteldeki hem de inflamatuar hücrelerdeki IL-6 ekspresyonu ile kist duvar kalınlığı arasında anlamlı ilişki bulundu (P= 0.004, P=0,019). IL-1α boyanma yoğunluğu göz önüne alındığında ABL vakalarındaki boyanma miktarında KOT ve OK vakalarına göre istatistiksel olarak anlamlı düzeyde fazlalık gözlendi (P=0.06). IL-6 boyanma miktarı ise tersine, KOT vakalarında ABL vakalarına göre istatistiksel olarak anlamlı derecede fazlaydı (P=0.037). Hem IL-1α hem de IL-6 nın kist epitelindeki boyanma miktarları KOT vakalarında OK vakalarına göre istatistiksel olarak anlamlı düzeyde fazla bulundu (P= 0.026, P= 0.001). 60

70 4.3. IL-1A (-889 C/T) Genotipi ve Alel Dağılımı IL-1A geni, 2q13 kromozom bandında yer alan IL-1 gen ailesinin bir üyesidir. IL-1A geni promotor bölgesi 889 pozisyonunda bir TNP bulunmaktadır. Bu bölgenin analizi için çalışmaya dahil edilen vakaların ilgili polimorfizm bölgesini içeren 99 bç lik DNA parçasına ait amplifikasyonu yapıldı (Şekil 12). PCR reaksiyonu ile amplifiye edilen bölge NcoI restriksiyon endonükleaz enzimi ile yukarıda anlatıldığı gibi analiz edildi. Enzim kesimi sonrasında 83bç+16bç (alel 1), 99bç+83bç+16bç (alel1 ve 2) ve 99bç (alel 2) ürünler elde edildi (Şekil 13) bç 100 bç 99 bç 1 : Moleküler ağırlık belirleyicisi: 100 bç DNA Ladder 2-10 : PCR amplifikasyon ürünleri (99 bç) 11 : DNA içermeyen negatif kontrol % 3 lük agaroz jel, 100 volt, 45 dk. Şekil 13: IL-1A -889 bölgesine ait PCR ürünü örnekleri 61

71 bç 100 bç 99 bç 83bç 16 bç 1: Moleküler ağırlık belirleyicisi: 100 bç DNA Ladder 2, 3, 5: Alel 1 ve alel 2 için heterozigot bireyler (99bç, 83 bç+16 bç) 6, 7: Alel 1 için homozigot bireyler (83 bç + 16 bç) 4: Alel 2 için homozigot bireyler (99 bç) % 3 lük agaroz jel, 100 volt, 60 dk. Şekil 14: IL-1A -889 bölgesinin NcoI restriksiyon endonükleaz enzimi ile analizi ABL vakalarının % 48 inin CC, % 36 sının CT ve % 16 sinin TT genotipinde olduğu saptandı. Bu vakalarda C ve T alellerinin dağılımı sırasıyla % 66 ve % 34 olarak hesaplandı. KOT vakalarının % 65.8 inin CC, % 19.5 inin CT ve % 14.6 sının TT genotipinde olduğu saptandı. Bu vakalarda C ve T alellerinin dağılımı sırasıyla % 75.6 ve % 24.4 olarak hesaplandı. OK vakalarının % 62.5 i CC ve %37.5 i CT genotipindeydi. Bu grupta TT genotipi saptanmadı. OK vakalarında C ve T alellerinin dağılımı sırasıyla % ve % olarak hesaplandı. Kontrol grubunda ise % 53.3 ünün CC, % 33.3 ünün CT ve % 13.3 ünün TT genotipinde olduğu olduğu bulundu (Tablo 9). 62