İmmünohematolojik Testler. Dr. İshak Özel TEKİN ZKÜ Tıp Fakültesi İmmünoloji A.D.

Transkript

1 İmmünohematolojik Testler Dr. İshak Özel TEKİN ZKÜ Tıp Fakültesi İmmünoloji A.D.

2 Clin Chem Lab Med 2010;48(8): Pasqualepaolo Pagliaro

3 İmmünolog lamba cini

4 Đmmünohematolojik Testler Kan gruplama Çapraz Karşılaştırma Antikor tarama Antikor tanımlama

5 Serolojik testler: Ag-Ab birleşmesi tepkimelerinin görülebilir, gözlemlenebilir, ölçülebilir hale getirilmesi temelli tanısal yöntemlerdir.

6 Aglutinasyon

7 Hemaglutinasyon

8 Eritrosit Serolojisi Hemaglutinasyon - Lam (slide) - Tüp - Jel Santrifügasyon - Mikroplak yöntemleri

9 Eritrosit Serolojisi RIA EIA PCR Moleküler baskılama Çoklu analit ölçümleri.

10 Karl Landsteiner 1900 yılında ABO kan gruplarını tanımlaması kan transfüzyonlarında dönüm noktasıdır

11 İmmünohematolojik testlerin geliştirilmesi Landsteiner ın ilk bulgularıyla doğrudan ilgilidir -Eritrositlerin farklı bireylerin serum/plazması ile aglutinasyonu -Bireylerin kanında diğer kan gruplarındaki eritrositleri kümelendiren doğal antikorların varlığı

12 Eritrosit Transfüzyonu

13 Plazma Transfüzyonu

14

15

16

17

18

19

20

21 Biyolojide Redüksiyonizm Karmaşık sistemlerin basit bileşenleri içinde analizi

22 Eritrositlere İmmün Yanıt Allojenik eritrositlerin yıkımı Otolog eritrositlerin yıkımı Fetal ve yenidoğan eritrositlerin yıkımı Transplant dokularının yıkımı

23 ABO Kan Grup Sistemi ABO sistemi iki özellik nedeniyle farklıdır. Serumda aglutinin varlığı ABH ag leri bir çok dokuda ve sekresyonlarda bulunur. Serumda antikor gösterilme prensibine dayanan karşıt gruplamanın yapıldığı tek kan grup sistemidir.

24 ABO-Rh Direkt Gruplama Numune Hazırlanması ( % 0,8 lik Eritrosit Süspansiyonu ) 0,5 ml. Diluent-I (1 basım) 50 µl Tam Kan veya 25 µl sediment İnkübasyon C de 5-10 Dakika Numune Dağıtılması Her mikrotüpe 25 µl % 0.8 lik Eritrosit Süspansiyonu Santrifüj 10 Dakika Değerlendirme

25

26 ABO Karşıt Gruplama Test Hücrelerinin Hazırlanması ( A1, A2, B, 0,I,II ) Hücreler resüspanse edilerek oda ısısına getirilir Hücrelerin Dağıtılması Her mikrotüpe 50 µl etiketine uyan test hücresi pipetlenir. Hasta Serumunun Dağıtılması Her mikrotüpe 50 µl hasta serumu veya plazması pipetlenir. İnkübasyon C de 5-10 Dakika Santrifüj 10 Dakika Değerlendirme

27 ABO Karşıt Gruplama Type A1 cells B cells O + + A 0 + B + 0 AB 0 0

28

29 ISBT Kan Gruplama Sistemleri Adı Kısaltma ABO ABO MNS MNS P P Rh RH Lutheran LU Kell KEL Lewis LE Duffy FY KiddJ K Diego DI Cartwright YT XG XG Scianna SC Dombrock DO Colton CO Landsteiner-Wiener LW Chido/Rodgers CH/RG Hh H Kx XK Gerbich GE Cromer CROM Knops KN Indian IN Ok OK Raph RAPH JMH JMH

30 Antikor Tarama - Tanımlama Antikor Tarama Testi Eritrosit antijenlerine karşı antikor olup olmadığını saptamak için yapılır Antikor Tanımlama Testi Varolan antikorun hangi kan grup sistemi ile ilişkili olduğunu ve hangi eritrosit antijenine karşı geliştiğini saptamak için yapılır

31 Antikor Tarama Klinik önemi olan antikorlar mutlaka araştırılmalı Klinik önem Antikorun 37 o C de reaktif olması Hemoliz yapması Eritrosit yaşam süresini azaltması

32 DAT Direkt Coombs Testi

33 DAT

34 Reaksiyon güçlendiriciler A H G (Anti Human Globülin)

35 Tüpte DAT

36

37 DAT Hasta Eritrosit Süspansiyonu Hazırlanması ( % 0,8 lik Eritrosit Süspansiyonu ) 1 ml. Diluent-II (2 basım) 10 µl Hasta Kanı Numune Dağıtılması Her mikrotüpe 50 µl % 0.8 lik Eritrosit Süspansiyonu Santrifüj 10 Dakika Değerlendirme 37

38 DAT POZİTİFLİK Eritrosit antijenlerine karşı oluşmuş otoantikorların komplemanla birlikte veya tek başına eritrosit yüzeyini kaplaması Transfüzyon sonrası alıcı antikorların donör eritrosit yüzeyini kaplaması Verici plazmasındaki antikorların alıcı eritrositlerin yüzeyini kaplaması

39 DAT 39

40 Antikor Tarama

41 Hücreler Fenotipik yapısı (tercihan homozigot) 2 veya 3 farklı donörden alınmış test hücreleri tarama, daha fazla sayıda test hücreleri ise tanımlama testlerinde kullanılmalıdır.

42 IAT damla hücre + 2 damla hasta serumu

43 ANTİKOR TARAMA (IAT-ET) I II III I II III Test Hücrelerinin Hazırlanması ( I, II, III ) Hücreler resüspanse edilerek oda ısısına getirilir I II III I II III Test Hücrelerinin Hazırlanması ( IP, IIP, IIIP ) Hücreler resüspanse edilerek oda ısısına getirilir Dağıtım 50 µl etiketine uyan test hücresi 25 µl hasta serumu veya plazma İnkübasyon 37 C de 15 Dakika Santrifüj 10 Dakika Değerlendirme Test hücreleri ekindeki tablo değerlendirmede kullanılır. Hücre ve tablonun Lot numarası aynı olmalıdır.

44 ANTİKOR TARAMA - CA I II III I II III * * I II III I II III Test Hücrelerinin Hazırlanması ( I, II, III ) Hücreler resüspanse edilerek oda ısısına getirilir Dağıtım 50 µl etiketine uyan test hücresi 25 µl hasta serumu veya plazma İnkübasyon 4 C de 15 Dakika Santrifüj 10 Dakika * Normal Hücre ve Nacl / Enzym / Cold Aglutinin Kartı Kullanılır Değerlendirme Test hücreleri ekindeki tablo değerlendirmede kullanılır. Hücre ve tablonun Lot numarası aynı olmalıdır.

45 IAT Etkileyen Faktörler İnkübasyon süresi ve sıcaklık ph İyonik konsantrasyon Antikorun afinite sabiti Antijen ve antikor oranı

46 İnkübasyon Süresi ve Sıcaklık Aglütinasyonun ilk safhasında veya sensitizasyon fazını etkiler Klinik olarak önemli antikorlar, genellikle C arasında reaksiyona girer Çoğu antikorlar, tuz ve albuminli test ortamları kullanıldığı takdirde ortalama 30 dakikalık bir inkübasyon süresi gerektirir Zayıf antikorlar için sürenin uzatılması gerekebilir

47 ph fizyolojik ph uygundur

48 İyonik Güç Serum fizyolojikli ortamda Na+ (negatif yük etrafında) Cl- (pozitif yük etrafında) iyonları antikor ve antijenin etrafında kümelenir Zıt yüklü moleküller arasındaki çekme gücü azalınca antikorun antijenle bir araya gelmesi engellenir Düşük iyon gücüne sahip solüsyonlar (LISS) kullanıldığında ortamdaki iyon sayısı azalır, pozitif ve negatif yükler ortaya çıkar LISS inkübasyon süresini kısaltır (37 C de dakika)

49 Antikorun Afinitesi Afinite, eritrositin herhangi bir antikora karşı özgül olarak sahip olduğu karakteristik bağlanma özelliğidir Genelde denge sabiti ne kadar yüksekse antijen antikor reaksiyonunun duyarlanma fazında antikorların birleşmesi o kadar yüksektir

50 Antijen-Antikor Oranı Reaksiyon hızı, ortamdaki antikor miktarı ve eritrosit antijenlerinin sayısına bağlıdır Antikor miktarını artırmak, test duyarlılığını artırabilir. Nadiren, önemli antikor fazlası prozon fenomeninin oluşmasına neden olur.

51 Test Hücreleri

52 Tüpte Antikor Tanımlama damla hücre + 2 damla hasta serumu

53 ANTİKOR TANIMLAMA - IAT Test Hücrelerinin Hazırlanması ( 11 li Normal Panel Hücresi ) Hücreler resüspanse edilerek oda ısısına getirilir Dağıtım 50 µl etiketine uyan test hücresi 25 µl hasta serumu veya plazma İnkübasyon 37 C de 15 Dakika Santrifüj 10 Dakika Değerlendirme Test hücreleri ekindeki tablo değerlendirmede kullanılır. Hücre ve tablonun Lot numarası aynı olmalıdır.

54 ANTİKOR TANIMLAMA ET Adı Soyadı Tarih Test Hücrelerinin Hazırlanması ( 11 li Enzimli Panel Hücresi ) Hücreler resüspanse edilerek oda ısısına getirilir Dağıtım 50 µl etiketine uyan test hücresi 25 µl hasta serumu veya plazma İnkübasyon 37 C de 15 Dakika Santrifüj 10 Dakika Değerlendirme Test hücreleri ekindeki tablo değerlendirmede kullanılır. Hücre ve tablonun Lot numarası aynı olmalıdır.

55 ANTİKOR TANIMLAMA CA Adı Soyadı Tarih * Test Hücrelerinin Hazırlanması ( 11 li Normal Panel Hücresi ) Hücreler resüspanse edilerek oda ısısına getirilir * Dağıtım 50 µl etiketine uyan test hücresi 25 µl hasta serumu veya plazma İnkübasyon 4 C de 15 Dakika Santrifüj 10 Dakika * Normal Hücre ve Nacl / Enzym / Cold Aglutinin Kartı Kullanılır Değerlendirme Test hücreleri ekindeki tablo değerlendirmede kullanılır. Hücre ve tablonun Lot numarası aynı olmalıdır.

56 Değerlendirme

57 Antikor Tanımlama Anti-E

58 Elüsyon Eritrosite bağlı antikorların ayrıştırılıp tanımlanmasına yönelik Isı ile Kimyasal yollar ile

59 Çapraz Karşılaştırma ABO ve Rh sistemleri dışında bulunan kan grupları nedeniyle önemli Kan transfüzyonu öncesi yapılması gerekir Lewis; Lea - Le - Leb MN; M - N - S - s - U P; P1 - P2 - p Luteren; Lua - Lub Kell; K - k Duffy; Fya - Fyb İi; İ - i

60 Çapraz Karşılaştırma Aglutinasyon yok ~ uyumlu Aglutinasyon ~ uyumsuz Verici Eritrositi Hasta Serumu

61

62 Çapraz Karşılaştırma Hasta Eritrosit Süspansiyonu Hazırlanması ( % 0,8 lik Eritrosit Süspansiyonu ) 1 ml. Diluent-II (2 basım) 10 µl Hasta Kanı Dağıtım A B D Enz. AHG AHG Donör E.S. 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl - İnkübasyon 37 C de 15 Dakika Santrifüj 10 Dakika Değerlendirme Donör Eritrosit Süspansiyonu Hazırlanması ( % 0,8 lik Eritrosit Süspansiyonu ) 1 ml. Diluent-II (2 basım) 10 µl Donör Kanı Hasta E.S. 50 µl 50 µl 50 µl µl Hasta Serumu µl 25 µl 25 µl Diluent-I 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl - -

63 Çapraz Karşılaştırma

64 Çapraz Karşılaştırma ABO Rh uygun kan % 98 uyum Antikor tarama -tanımlama Çapraz karşılaştırma % 2 ek uygunluk

65 Elektronik Çapraz Karşılaştırma

66 Ölçülebilir olanı ölç, ölçülemeyeni ölçülebilir hale getir. Galileo Galilei

67

68 Genomics Proteomics Glucomics

69 Genotip Belirleme Fetal kan gruplarının belirlenmesi (YDHH) Otoantikor varlığı (DAT+) Yakın dönemde çoklu kan transfüzyonu Nadir ve zayıf antijen eksprese edenler Hasta ya da vericide antijen gösterilemediğinde Antijen negatif kan tiplerinde, çıplak ve yeni allel tanımlamada Antikor tanımlama için verici tiplendirmede

70 PCR-SSP PCR-RFLP Taqman

71

72 "lab on a chip"

73 SNP Saptama Sistemleri

74 SNP Saptama Sistemleri

75

76

77

78 Technology Acceptance Model (TAM) Algılanan Kullanışlılık Dış Değişkenler Kullanıma Karşı Tutum Kullanım Niyeti Gerçek sistem kullanımı Algılanan Kullanım Kolaylığı Davis, F. D., Bagozzi, R. P., and Warshaw, P. R. "User Acceptance of Computer Technology: A Comparison of Two Theoretical Models," Management Science, 35, 1989,

79 Performans beklentisi Efor beklentisi Sosyal etki Unified Theory of Acceptance and Use of Technology (UTAUT) Kullanım niyeti Kullanım davranışı Kolaylaştırılmış Şartlar Cinsiyet Yaş Deneyim Gönüllü kullanım Venkatesh, V., Morris, M.G., Davis, F.D., and Davis, G.B. User Acceptance of Information Technology: Toward a Unified View, MIS Quarterly, 27, 2003,

80 Çoklu Analiz Sistemleri

81 Birçok biyobelirteç ve hücre içi sinyal sisteminin çoklu saptanması avantajı Antijen ya da antikorlar ELISA daki gibi bir zemine sabitlenirse planar array, mikrokürelere sabitlenirse Süspansiyon ya da bead array olarak adlandırılırlar. Planar Array Bead Array

82 Array Dizi Nesnelerin sistematik düzenlenmesi Genellikle satır ve sütünlar kullanılır

83 Planar Array Avantaj:Kompleks setler oluşturabilmek Problem: -Antijen üç boyutlu yapısının bozulabilmesi -Sterik engellenme

84 Bead Array Avantaj:Esneklik (Cihaz,taşıyıcı küre ) Sterik engellenme sorunu yok Problem:?

85 Antikor Temelli Protein Array 1.Plak ya da membrana sabitlenmiş antikor arrayde çözünür örneğin inkübasyonu Aynı antijen setine özgül işaretli çözünür antikor eklenmesi Veri seti 3. Kantitatif sinyal oluşumu

86 Multipleks Kitlerin Tek örnekte 20 den fazla analitin eş zamanlı ölçümü Aynı anda 20 den fazla analitin bireysel karşılaştırılması Sadece 25 µl örnek hacmiyle 20 den fazla analit ölçümü Geniş standart aralığı 96-çukurlu plak ya da tüplerde kolay uygulama Flow cytometry ve özel Luminex cihazlarda ortak kullanım Avantajları

87 Mikroküreler

88

89 1. Antikor kaplı küre 2. Antikor analiti tutar 3. Floresan işaretli raportör antikora bağlanan analite bağlanır Laser A 4. Küre ve raportör laser ışıkla sayılır Laser B

90 Kırmızı lazer küreyi okur Yeşil lazer hedef miktarını belirler

91 Yazılım analizi anında gerçekleştirir 1 saatten az sürede adet sonuç analizlenir.

92

93 Teknolojik Değişim im Serolojide teknolojiye paralel ilerlemeler: Multipleks ve paralel analizler Test tüpleri Mikrokuyucuklar Mikroaray Mikroküre temelli xmap

94 Akan Hücre Ölçer

95 Ön açı saçılımı PMT Işık kaynağı Floresan PMT Geniş açı saçılımı PMT Örnek girişi Floresan PMT Floresan PMT Emisyon Filtre blok Emisyon Filtre blok Oynar Ayna Mikroskop objektifi Mikroskop objektifi Uyarım filtre bloğu Oynar Ayna3 Oküler Oküler

96 Ön açı saçılımı PMT Işık kaynağı Floresan PMT Geniş açı saçılımı PMT Örnek girişi Floresan PMT Floresan PMT Emisyon Filtre blok Emisyon Filtre blok Oynar Ayna Mikroskop objektifi Mikroskop objektifi Uyarım filtre bloğu Oynar Ayna3 Oküler Oküler

97 Side Scatter (SSC) 90 sapma ~ Hücre yapıları Laser Y Forward Scatter (FSC) < 10 sapma ~ hücre büyüklüğü Floresan ve antijen yoğunluğu

98

99

100

101

102

103 Aynı anda kaç parametre çalışabilirsiniz?

104 60 parametreye ne dersiniz? Florokromlar ve ilişkili sorunlar da olmasa

105

106

107 Dr. Olga Ornatsky Dr. Scott D. Tanner CyTOF

108 Mass Cytometry

109 CyTOF Inductively Coupled Plasma Time-of-Flight Mass Spectrometer (ICP-TOF MS) -Kompleks matrikslerden stabil izotopların kantitatif ölçümü

110 CyTOF kütle sitometri şematik gösterimi Analytical Chemistry, Vol. 81, No. 16, August 15, 2009

111 Antikora metal içeren polimer takılması O. Ornatsky et al. / Journal of Immunological Methods 361 (2010) 1 20

112 KG1a (A) and Ramos (B) hücre serilerinin Mass Cytometry analizi (Flow-jo yazılımı ile) O. Ornatsky et al. / Journal of Immunological Methods 361 (2010) 1 20

113

114 Konjugat kullanmadan özgül antikor varlığını nasıl gösteririz?

115

116

117 AFM Atomik Kuvvet Mikroskopu

118 Moleküler Baskılama

119

120

121 Ağı nereye atacağınızı bilmeniz dileğiyle