T.C. TRAKYA ÜNĠVERSĠTESĠ TIP FAKÜLTESĠ TIBBĠ PATOLOJĠ ANABĠLĠM DALI Tez Yöneticisi Doç. Dr. Fulya ÖZ PUYAN NON-HODGKIN LENFOMALARDA GÜNCEL SINIFLAMA VE ĠMMÜNOHĠSTOKĠMYASAL DEĞERLENDĠRME (Uzmanlık Tezi) Dr. Enver DEMĠR EDİRNE 2013
TEġEKKÜR Mesleki görgü, bilgi ve becerilerimi kazanmamda büyük paya sahip olan Sayın hocam Doç. Dr. Fulya Öz Puyan a, eğitimim sırasında desteklerini esirgemeyen Sayın hocalarım Prof. Dr. Kemal Kutlu, Prof. Dr. Filiz Özyılmaz, Doç. Dr. Ömer Yalçın, Doç. Dr. Ufuk Usta, Doç. Dr. Tülin Deniz Yalta, Yrd. Doç. Dr. Ebru Taştekin, Yrd. Doç. Dr. Nuray Can, Uzm. Dr. Arzu Çalık a, istatistiksel değerlendirme aşamasında yardımcı olan Doç. Dr. Necdet Süt e, tezin immünohistokimyasal çalışmalarını yürüten Yük. Biyolog Muzaffer Tudan a, literatür taramalarım esnasında yardımlarını esirgemeyen Uzm. Dr. Gökhan Kazındır a ve tüm çalışma arkadaşlarıma teşekkür ederim.
ĠÇĠNDEKĠLER GĠRĠġ VE AMAÇ... 1 GENEL BĠLGĠLER... 4 LENF BEZĠ HĠSTOLOJĠSĠ... 4 B LENFOSĠT GELĠġĠMĠ... 6 LENFOMA SINIFLAMASI... 8 B HÜCRE ĠMMUNFENOTĠPLĠ HODGKĠN DIġI LENFOMALAR... 10 PREKÜRSÖR B HÜCRELĠ LENFOBLASTĠK LENFOMA/ LÖSEMĠ... 11 KRONĠK LENFOSĠTĠK LÖSEMĠ/KÜÇÜK LENFOSĠTĠK LENFOMA... 12 LENFOPLAZMOSĠTĠK LENFOMA... 12 MARJĠNAL ZON LENFOMA... 13 MANTLE HÜCRELĠ LENFOMA... 14 FOLĠKÜLER LENFOMA... 15 BURKĠTT LENFOMA... 15 DĠFFÜZ BÜYÜK B HÜCRELĠ LENFOMA... 16 GEN EKSPRESYON PROFĠLĠ VE ALT TĠPLER... 20 ALGORĠTMALAR... 21 ALT TĠPLEMEDE KULLANILAN ĠMMUNOHĠSTOKĠMYASAL BELĠRTEÇLER... 22 GEREÇ VE YÖNTEM... 25 BULGULAR... 31 TARTIġMA... 53
SONUÇLAR... 62 ÖZET... 64 SUMMARY... 66 KAYNAKLAR... 68 EKLER
SĠMGE VE KISALTMALAR AIDS : Acquired Immune Deficiency Syndrome, Edinilmiş İmmün Yetmezlik Sendromu ABK :Aktive B Hücre Kökenli ALK :Anaplastik Lenfoma Kinaz BCL6 : B-cell lymphoma 6 protein BL :Burkitt Lenfoma cdna : Complementary DNA,Tamamlayıcı DNA CD : Cluster of Differentiation CHOP :Cyclophosphamide, Doxorubicin, Vincristine, Prednisone DBBHL :Diffüz Büyük B Hücreli Lenfoma DSÖ :Dünya Sağlık Örgütü EBV : Ebstein Barr Virüs EMA :Epitelyal Membran Antijeni EMZL :Ekstranodal Marjinal Zon Lenfoma FL :Foliküler Lenfoma FOXP1 :Forkhead Box Protein P1 GCET1 : Germinal Center Expressed Transcript 1 GCET2 : Germinal Center Expressed Transcript 2 GEP :Gen Ekspresyon Profili GM :Germinal Merkez GMK :Germinal Merkez Kökenli 5
HDL :Hodgkin Dışı Lenfoma (Non-Hodgkin Lenfoma) HL :Hodgkin Lenfoma H&E :Hematoksilen ve Eosin MUM1 : Multiple Myeloma Oncogene 1 LMO2 : LIM Domain Only 2 Ig :İmmünglobulin INK4A-IRF : Inhibitor of Kinase 4 - Interferon Regulatory Factor LPL :Lenfoplazmositik Lenfoma MALT : Mucosa-associated lymphoid tissue, Mukoza İlişkili Lenfoid Doku MHL :Mantle Hücreli Lenfoma mrna :Messenger RNA MZL : Marjinal Zon Lenfoma NK : Natural killer, doğal öldürücü NF-kB : Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells NMZL :Nodal Marjinal Zon Lenfoma PTEN : Phosphatase and Tensin Homolog REAL : Revised European-American Lymphoma Classification, Yenilenmiş Avrupa-Amerika Lenfoma Sınıflaması SMZL :Splenik Marjinal Zon Lenfoma TdT :Terminal Deoksinükleotidil Transferaz TRAP : Tartrat Rezistan Asit Fosfataz VDJ : Variable, Diversity, Joining, İmmunoglobulin ağır zincir gen segmentleri VS38C :Plazma hücre antijeniklon kodu WM : WaldenströmMakroglobulinemisi 6
GĠRĠġ VE AMAÇ Lenfomalar T, B lenfosit ve nadir olarak doğal öldürücü (NK- Natural Killer ) hücrelerden veya öncüllerinden gelişen neoplazilerdir (1). Lenfomalar tarihsel olarak Hodgkin lenfoma (HL) ve Hodgkin dışı lenfoma (HDL) olarak iki ana gruba ayrılmıştır. Lenfomaların sıklığı son yıllardabilinmeyen nedenlerle artmaktadır (2). Dünya Sağlık Örgütü (DSÖ) verilerine göre 2008 yılında yeni tanı almış malign tümörler arasında sıklık yüzdesi olarak onuncu sırada yer almıştır (3). Lenfoma etyopatogenezinde çok çeşitli faktörler etkilidir. HL etiyolojisi kesin olarak saptanamamış olmakla birlikte Ebstein Barr Virüs (EBV) enfeksiyonu geçiren hastalarda HL gelişme riski artış göstermektedir. HL hastalarının tümör örneklerinde, vakaların yaklaşık yarısında EBV genomu saptanmıştır. HDL etyopatogenezinde genetik bozukluklar ve çevresel faktörlerin rol oynadığı düşünülmektedir. HDL hastalarının büyük bir çoğunluğunda kromozom anomalisi vardır. Bazı viral enfeksiyonlar, Helikobakter Pylori gibi kronik bakteriyel enfeksiyonlar, otoimmün hastalıklar, kimyasal karsinojen ajanlarla karşılaşma ve immünyetmezlik durumlarında HDL gelişim riskinin arttığı bilinmektedir (2). Lenfoma sınıflaması son olarak DSÖ tarafından 2008 yılında revize edilmiştir. Son yıllarda birçok merkezde prognostik belirteçlere yönelik genetik, moleküler ve immünohistokimyasal çalışmalar yapılmış ve yayınlanmıştır. Bu çalışmamızda Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı nda 1998-2011 yılları arasında tanı almış 172 adet B hücre immünfenotipli HDL vakası immünohistokimyasal çalışmalar yapılarak incelenmiştir. Dört vakaya ait dokular antijenik özelliklerini kaybettiğinden çalışma dışı bırakılmış, 168 olgu çalışmaya dahil edilmiştir. İlk aşamada 2008 yılı öncesi tanı almış olgular DSÖ 2008 sınıflamasına göre tekrar değerlendirilmiştir. 1
Çalışmamızda da en büyük grubu oluşturan Diffüz Büyük B Hücreli Lenfoma (DBBHL) erişkin yaş grubunda batı toplumlarında %30-40 lık bir oranla en sık görülen HDL tipidir. Son yıllarda DBBHL lerin birçok morfolojik ve fenotipik varyantı tanımlanmış olup bu durum prognoz tahmininde ve tedavi stratejilerinin belirlenmesinde zorluklara yol açmıştır. Gen ekspresyon profiline yönelik cdna ( complementary DNA, tamamlayıcı DNA) ve oligonükleotid microarray leri kullanılarak yapılan çalışmalarda DBBHL ler germinal merkez kökenli (GMK), aktive B hücre kökenli (ABK) ve klasifiye edilemeyen (tip 3) olarak 3 kategoriye ayrılmıştır (4,5). Ancak genetik profil çalışmaları için bazı tekniklerde taze donmuş örnekler gereklidir ve çalışmalar hem zaman alıcı hem de yüksek maliyetlidir. Bu alt tiplemenin tedavi protokollerinin belirlenmesinde önemli bir belirleyici olduğu gösterilmiştir. Yapılan gen ekspresyon profiline yönelik çalışmalarda CHOP (Cyclophosphamide, Doxorubicin, Vincristine, Prednisone) ya da benzeri tedavi alan GMK alt tip DBBHL hastalarının daha iyi yaşam süresine sahip olduğu belirlenmiştir (6-8). Bu nedenle immünohistokimyasal yöntemler kullanılarak alt tiplendirme amacıyla paneller önerilmiştir. Hans ve ark. CD10 (CD: Cluster of Differantiation,Cluster of Designation), MUM1 (Multiple myeloma oncogene 1) ve BCL6 (B-cell lymphoma 6 protein) ekspresyonuna göre immünohistokimyasal boyama yöntemlerini kullanarak algoritma geliştirmiş, DBBHL leri GMK ve GMK dışı (ABK ve klasifiye edilemeyenler) olarak sınıflamıştır (9). Choi ve ark. ek olarak anti-gcet1 (Germinal center expressed transcript 1) ve anti-foxp1 (Forkhead box protein P1) antikorlarını kullanarak yeni bir algoritma önermiştir (10). Son zamanlarda Visco ve ark. yayınladıkları bir çalışmada anti-cd10, anti- FOXP1 ve anti-bcl6 kullanarak oluşturdukları algoritmanın (Visco-Young algoritması) daha uyumlu sonuç verdiğini bildirilmişlerdir (11). Her üç algoritmanın sınıflama sonuçları gen ekspresyon profili ile büyük oranda uyumluluk göstermekle birlikte, az sayıda da olsa bazı olgularda uyumlu sonuç alınamamıştır. Biz çalışmamızda DBBHL olgularımıza bu üç paneli uyguladık ve ek olarak yeni germinal merkez işaretleyicileri olan anti-gcet2 (Germinal center expressed transcript 2), anti-lmo2 (LIM domain only 2) (12,13) antikorlarını immünohistokimyasal boyama yöntemi ile uygulayarak sonuçları karşılaştırdık. Bu panellerde kullanılan FOXP1, normal aktive B lenfositlerde üretilen ve ABK li DBBHL alt tipte pozitif saptanan bir transkripsiyon faktörü olup, bazı çalışmalar FOXP1 in artmış ekspresyonunun prognozu kötü yönde etkilediğini ortaya koymaktadır (14,15). Çalışmamızda aynı zamanda tüm olgularımıza anti-foxp1 antikoru ile immünohistokimyasal boyama yaparak,çalışmamıza dahil ettiğimiz lenfoma alt tipleri arasında anlamlı ekspresyon farkı olup olmadığını araştırdık. 2
Çalışmamızın amaçları özetle: 1- İlk aşamada tüm olgulara 2008 DSÖ Lenfoma Sınıflaması na göre tanı güncellemesi yapmak. 2- Çalışmaya dahil edilen tüm B hücre immünfenotipli HDL olgularına anti-foxp1 antikoru ile immünohistokimyasal boyama yaparak lenfoma alt tipleri arasında anlamlı ekspresyon farkı olup olmadığını araştırmak ve fark bulunduğu takdirde tanısal kullanım olanaklarını değerlendirmek. 3- TümDBBHL olgularına immünohistokimyasal çalışma yaparak, seçilen 3 algoritmaya göre ABK ve GMK olarak alt tipleme yapmak. Algoritmaların sonuçları arasındaki uyum ve farklılıklaryanı sıra,algoritmalarda kullanılan antikorların rutin kullanım açısından olumlu ve olumsuz yönlerini tespit ederek, kullanıma en uygun algoritmanın hangisi olduğu sorusuna cevap aramak. 4- Son olarakalgoritmaların hiçbirinde kullanılmayan anti-gcet2 ve anti-lmo2 antikorları ileimmünohistokimyasal çalışma yaparakdbbhl lerin ABK ve GMK olarak alt tiplemesinde alternatif veya ek olarak kullanılabilirliklerinisaptamak. 3
GENEL BĠLGĠLER Vücut sürekli antijenlerle karşılaştığından lenf bezleri çevreyle temas halindeki organların drenaj bölgelerinde yoğunlaşmıştır. Lenf bezleri aksiller, servikal, inguinal bölgelerde, mediastende ve mezenterik alanda yoğun olarak bulunurlar. Gastrointestinal sistem ve solunum yollarında lenfoid hücrelerin oluşturduğu küçük koleksiyonlar halinde mukoza ilişkili lenfoid dokular (MALT: Mucosa-associated lymphoid tissue, mukoza ile ilişkili lenfoid doku) bulunur (16). Lenfatik sistemin en önemli bileşeni olan lenf bezleri afferent ve efferent lenfatikler ile lenf dolaşımına bağlıdır. Oval, yuvarlak veya fasülye şeklinde olup birkaç milimetreden 20 milimetreye kadar değişik çapa sahiptir. Normalde belirgin olmayan lenf bezleri şiddetli immün reaksiyonlar, tümör metastazları veya neoplastik gelişimlerde belirgin boyuta ulaşırlar. Makroskopik olarak 3 cm veya daha büyük çap, kesit yüzünde beyaz renkli alanların bulunması gibi bulgular malign bir hastalığı düşündürür (2,16). Lenf bezlerinin ana fonksiyonu lenfopoezis, lenf filtrasyonu ve antijenleri işlemedir. İmmün yanıt oluşumunda lenf bezleri, MALT ve dalağın yer aldığı entegre bir sistemde rol oynar. Tüm lenfoid hücreler kemik iliği kökenli olup B lenfositler kemik iliğinde, T lenfositler ise timusa göç ederek burada olgunlaşırlar. Bu primer lenfoid organlardan sonra B ve T lenfositler sekonder lenfoid organlara (lenf bezleri, dalak ve MALT) kolonize olurlar (17). LENF BEZĠ HĠSTOLOJĠSĠ Lenf bezi bağ dokusundan oluşmuş ince bir kapsülle çevrilidir ve kapsül parankime doğru uzantılar vererek trabekül denilen yapıları oluşturur. Parankim korteks ve medulla 4
olarak ikiye ayrılır. Korteks; yüzeyel korteks ve parakorteks kısımlarından oluşur (18). Yüzeyel korteks kapsülün hemen altında yer alan, primer ve sekonder foliküller içeren kısımdır. Primer foliküller uyarı almamış küçük lenfositlerden oluşur. Bu foliküller antijenik uyarı aldıklarında sekonder foliküllere dönüşürler ve orta kısmında germinal merkez (GM) içerirler. GM de sentrositler, sentroblastlar, dentritik hücreler ve makrofajlar bulunur. GM ler antijenik uyarı almış B lenfositlerin çoğalma bölgesidir. Burada ayrıca plazma hücre prekürsörleri ve B bellek lenfositleri de bulunur. GM çevresinde küçük lenfositlerden oluşan mantle zon bulunur. Bunun çevresinde de hafifçe daha iri nükleuslu berrak sitoplazmalı hücrelerden oluşan marjinal zon izlenir. Parakorteks; foliküller ve medulla arasındaki alandır ve T lenfositten zengindir. Burada ayrıca az sayıda B lenfositler, immünoblastlar, dentritik hücreler ve postkapiller venüller bulunur. Medulla dallanmalar oluşturan hücre kordonları ve aradaki meduller sinüslerden oluşur. Foliküller dışında meduller kordlarda da B lenfositler ve plazma hücreleri ağırlıklı olarak bulunurlar. Lenf bezine kapsülü delerek giren afferent lenfatikler radial sinüsler (trabeküler sinüsler) aracılığıyla meduller sinüslere bağlanırlar. Sinüslerde fagositik sisteme ait monositik hücreler yer alır (18-20). Şekil 1 de normal lenf bezi yapısı şematik olarak gösterilmiştir (21). ġekil 1. Normal lenf bezi yapısı (21) 5
B LENFOSĠT GELĠġĠMĠ Lenfositler diğer tüm kan elemanları gibi kemik iliğinde yerleşmiş olan pluripotent kök hücrelerden gelişir. İlk aşamada bu kök hücrelerden miyeloid seri öncülü olan multipotent miyeloid kök hücre ve lenfositlerin öncülü olan lenfoid kök hücreler farklılaşır. Lenfoid kök hücrelerinin bir kısmı (T hücre prekürsörü veya protimosit) kan dolaşımına geçerek timusa gelir ve T lenfosit olarak farklılaşır. Kemik iliğinde kalan lenfoid kök hücreler B lenfosit yönünde diferansiyasyona uğrar (1,16). B lenfositlerin diferansiyasyonu prekürsör B lenfoblast olarak başlar. Bu aşamada Ig (immunoglobulin) VDJ (Variable, Diversity, Joining) geni yeniden düzenlenir ve yüzey Ig farklılaşması meydana gelir. Sonuçta naif B hücreleri oluşur. Naif B hücreleri kan dolaşımında bulunurlar ve lenf bezine veya diğer sekonder lenfoid organlara gelirler. Lenf bezinde primer lenfoid folikül merkezine yerleşen naif B lenfositler foliküler dentritik hücrelerin sunduğu antijenik uyarıma maruz kalırlarsa proliferasyon ve diferansiyasyona uğrarlar. Antijenik uyarım olmadığında apopitozis meydana gelir. Daha sonra antijenik uyarım almış bu hücrelerin primer folikülü çevreleyen mantle zona göç ettikleri düşünülmektedir. Mantle zondaki lenfositler antijen spesifik T lenfositlerle etkileşime geçerek prolifere olurlar ve folikül merkezi içine geçerler. Bu lenfositler sentroblast ismini alır ve olgunlaşarak sentrositlere dönüşür. Sentroblast, sentrosit ve dentritik hücrelerden oluşan germinal merkez içeren folikül artık sekonder folikül olarak adlandırılır. Sentrositler antijen sunan foliküler dentritik hücrelerle etkileşime geçerek seleksiyona uğrar. Daha sonra olgunlaşmasını tamamlamak üzere marjinal zona göç eden hücreler (marjinal zon veya monositoid B hücreler) farklılaşarak bellek B lenfositleri ve plazma hücrelerini oluştururlar (1). B hücre matürasyon aşamaları Şekil 2 de şematik olarak gösterilmiştir (1). Lenfositler gelişim aşamaları sırasında değişik antijenler eksprese ederler. Matür B hücre neoplazileri gelişim aşamalarının herhangi birini taklit eder ve isimlendirme, sınıflandırma temelde buna göre yapılır. B lenfosit matürasyonu aşamalarında bazı lenfomaların kökenleri Şekil 3 te, B hücre matürasyonunda izlenen sitoplazmik ve membranöz antijenler Şekil 4 te şematik olarak gösterilmiştir (1). 6
ġekil 2. B lenfosit geliģim aģamaları (1) KLL: Küçük lenfositik lenfoma, MHL: Mantle hücreli lenfoma, SMZL: Splenik marjinal zon lenfoma, DBBHL: Diffüz büyük B hücreli lenfoma, KHL: Klasik Hodgkin lenfoma, NLPHD: Nodüler lenfosit predominant Hodgkin lenfoma, MALT lenfoma: Mukoza ilişkili lenfoid doku lenfoma (MALTOMA), MZL: Marjinal zon lenfoma, PEL: Primer effüzyon lenfoma, FL: Foliküler lenfoma, BL: Burkitt lenfoma. ġekil 3. B lenfosit maturasyonu aģamalarında bazı lenfomaların kökenleri (1) 7
s: Sitoplazmik, m: Membranöz, Ig: İmmunoglobulin, HKH: Hemopoetik kök hücre, EBHP:Erken B hücre prekürsörü, BHP: B hücre prekürsörü, GBHP: Geç B hücre prekürsörü, NBH: Naif B hücre, GMBH: Germinal merkez B hücre, PGMBH: Post germinal merkez B hücre, PH: Plazma hücresi. ġekil 4. B hücre matürasyonunda sitoplazmik ve membranöz antijenler (1) LENFOMA SINIFLAMASI Klinik ve patolojik olarak oldukça heterojen bir hastalık olan lenfomalar için günümüze kadar çeşitli histopatolojik sınıflama önerileri yapılmıştır (Tablo 1). Dünya Sağlık Örgütü 2001 Lenfoma Sınıflaması, REAL (Yenilenmiş Avrupa-Amerika Lenfoma Sınıflaması) sınıflamasının yeniden gözden geçirilmesi ve bazı tanımların netleştirilmesiyle oluşturulmuş, 2008 yılında revize (yeniden düzenleme) edilmiştir (Tablo 2). Tablo 1. Lenfoma sınıflamasında kullanılan sistemler Rappaport (1956) Lukes Collins (1966) Kiel (1974) WHO (Dünya Sağlık Örgütü) Sınıflaması (1976) Working Formulation for Clinical Usage (1982) REAL (Yenilenmiş Avrupa-Amerika Lenfoma Sınıflaması) (1994) WHO (Dünya Sağlık Örgütü) Sınıflaması (2001) Revize WHO (Dünya Sağlık Örgütü) Sınıflaması (2008) 8
Tablo 2. Dünya Sağlık Örgütü 2008 lenfoma sınıflaması (22) Hodgkin lenfoma Nodüler lenfosit baskın Hodgkin Lenfoma Klasik Hodgkin Lenfoma Nodüler sklerozan klasik HL Mikst sellüler klasik HL Lenfositten zengin klasik HL Lenfositten fakir klasik HL Hodgkin dıģı lenfoma Prekürsör B hücreli neoplazi Prekürsör B lenfoblastik lösemi/lenfoma Matür B hücreli neoplaziler Kronik lenfositik lösemi/küçük lenfositik lenfoma B hücreli prolenfositik lösemi Lenfoplazmositik lenfoma Splenik marjinal zon B hücreli lenfoma Saçlı hücreli lösemi Plazma hücreli myelom/plazmositom Ekstranodal marjinal zon B lenfoma Nodal marjinal zon B lenfoma Foliküler lenfoma Mantle hücreli lenfoma Diffüz büyük B hücreli lenfoma (Mediastinal büyük B hücreli lenfoma ve Primer effüzyon lenfoma dahil) Burkitt lenfoma Prekürsör T hücreli neoplazi Prekürsör T lenfoblastik lösemi/lenfoma Matür T hücreli neoplaziler T hücreli prolenfositik lösemi T hücreli granüler lenfositik lösemi Agresif NK hücreli lösemi Erişkin T hücreli lösemi/lenfoma Ekstranodal NK/T hücreli lenfoma, nazal tip Enteropati tip T hücreli lenfoma Hepatosplenik tip T hücreli lenfoma Subkutan pannikülit benzeri T hücreli lenfoma Mikozis fungoides/sezary Sendromu Anaplastik büyük hücreli lenfoma, primer kutanöz tip Anaplastik büyük hücreli lenfoma, primer sistemik tip Periferal T hücreli lenfoma, başka türlü sınıflandırılamayan tip Anjioimmunoblastik T hücreli lenfoma 9
B HÜCRE ĠMMÜNFENOTĠPLĠ HODGKĠNDIġI LENFOMALAR Kök hücrelerden plazma hücrelerine kadar B hücre farklılaşması fetal karaciğer, kemik iliği ve lenf bezlerinde gerçekleşir (2). B hücrelerinin karakteristik işaretleyicisi hücre yüzey antijen reseptörü olarak hareket eden immünoglobulinlerdir. Antikorlar için genetik kodlar prekürsör B hücrelerinden itibaren yeniden düzenlenir (23). B hücre gelişim aşamalarının anlaşılması ve antijen bağımsız veya bağımlı antijenlerin eksprese edilme aşamalarının bilinmesi, lenfoma alt gruplarının tanımlanmasını ve tanı konulmasını kolaylaştırmıştır. Lenfomalar B hücre gelişim aşamalarının herhangi birinde takılan monoklonal hücrelerden gelişir. Bu nedenle immünohistokimyasal çalışmalarla bu antijenlerin tespiti tanı için oldukça yararlı bilgiler verir. B Hücre ĠĢaretleyicileri Matür B lenfositlerin yüzeylerinde antijen reseptörü olan ağır ve hafif zincirlerden oluşan immünoglobulin molekülleri bulunur. Ayrıca B lenfositler kendilerine spesifik CD19, CD20, CD22 ve CD79 molekülleri taşırlar. Matür plazma hücrelerinde yüzeyde CD19, CD20, CD22 ve immünoglobulin molekülleri kaybolur (sitoplazmada immünoglobulin molekülleri yapılmaya ve salgılanmaya devam edilir) ve yüzeyde CD38 ve CD138 belirir. Kemik iliğindeki kök hücreler pro-b lenfositlerine dönüştüklerinde yüzeylerinde CD19, CD79a, CD34, CD10 ve TdT (terminal deoksinükleotidil transferaz) içerirler. Bu sırada immünoglobülin genleri henüz yeniden düzenlenmemiştir. Daha sonra bu hücrelerde immünoglobülin ağır zincir geni yeniden düzenlenmesi olur ve hücrelerde sitoplazmik μ zinciri yapılmaya başlanır. Bu hücreler Pre-B lenfositleri olarak tanımlanır. Dolayısıyla bu aşamalardaki lenfositlerden kaynaklanan lenfoma veya lösemiler Prekürsör B hücreli lenfoblastik lenfoma/lösemi olarak adlandırılır. Bu aşamadan sonra immünoglobulin hafif zincir genlerinde yeniden düzenlenme olur ve hücreler membran yüzeylerinde IgM molekülü taşımaya başlayarak periferik lenfoid dokuya geçerler. İmmatür B hücreleri olarak tanımlanan bu hücreler CD20 ve CD22 de taşırlar. İmmatür B hücrelerinde TdT ve CD10 ekpresyonu kaybolmuştur. Bu sırada immünoglobulin ağır zincir mrna sında alternatif ayrışma gerçekleşir IgM ye ek olarak IgD molekülleri de üretilmeye ve eksprese edilmeye başlar. Yabancı antijenlere reaksiyon gösterebilme özelliği taşıyan bu hücreler matür B lenfositleri olarak adlandırılır. Bu lenfositlerin bir kısmında pan-b antijenlerinin yanısıra CD5 ekspresyonu da gözlenir. Bu hücreler kan dolaşımında bulunur ve lenfoid dokulardaki primer folikülleri oluşturur. MHL ve Küçük lenfositik lenfomaların (KLL) bir bölümünün bu aşamadaki hücrelerden geliştiği kabul edilmektedir. Bu lenfositler antijenik uyarı aldıktan 10
sonra lenfoid dokularda parakortekste blastik görünümlü büyük B hücrelerine dönüşerek aktive olurlar veya kısa ömürlü IgM üreten plazma hücrelerine dönüşürler ya da foliküllere yerleşerek aktivasyonlarını sürdürürler. Folikül merkezlerine yerleşenler; sentrosit veya daha büyük sentroblastlardan meydana gelen GM B hücrelerini oluştururlar. Daha sonra immünoglobulin genlerinde somatik mutasyonlar oluşmaya başlar ve hücrelerde pan-b antijenlerine ek olarak CD10 ve BCL6 ekspresyonu ve immün cevap sırasında görev almayacak lenfositlerin kolay ölümü için antiapoptotik özellik taşıyan BCL2 ekspresyonunda azalma izlenir. Bu aşamadaki hücrelerden Foliküler lenfoma (FL), Burkitt lenfoma (BL), Hodgkin lenfomalar ve DBBHL ler gelişmektedir. Antijenle karşılaşmış ve aktive olmuş B lenfositler daha sonra bellek B hücrelerine dönüşürek foliküllerin etrafındaki marjinal bölgeye göç eder. Bu aşamalardaki hücrelerden Marjinal zon lenfomalar (MZL) ve Küçük lenfositik lenfomaların bir kısmı gelişmektedir. Ardından B hücrelerin bir bölümü plazma hücrelerine dönüşür veya lenfoid dokuda medüller alana ya da kemik iliğine giderler. B hücre antijenlerini kaybetmiş olan plazma hücreleri yüzeylerinde CD138, CD38 ve sitoplazmik immünoglobulin ağır ve hafif zincirleri içerirler. Plazma hücrelerinden gelişen tümörler Plazmositom veya Myelom olarak adlandırılır (24). PREKÜRSÖR B HÜCRELĠ LENFOBLASTĠK LENFOMA/ LÖSEMĠ B hücre immünfenotipli matür olmayan lenfoid hücrelerin (lenfoblastlar) neoplazisidir (25). Klinik olarak en sık akut lösemi tablosuyla karşılaşılır. Çocuk ve genç erişkin erkeklerde daha sık izlenir. Anemi, granülositopeni veya trombositopeni, ya da her üçünün birlikte olduğu kemik iliği yetmezliği nedeniyle şüphelenilen hastalarda görülür. Lenfadenopati, hepatomegali ve splenomegali yaygındır. Kemik ağrısı ve artralji de görülebilir. Lenfadenopati hastaların %10 ile %20 sinde meydana gelir. Genellikle ekstranodal tutulum izlenir (deri, kemik, yumuşak doku vb). Histopatolojik olarak tümör diffüz patern oluşturan monoton görünümlü lenfoblastlardan oluşur. İri, ince tozsu kromatin içeren çekirdeğe sahip neoplastik hücrelerde nükleol belirginliği izlenmez. Çekirdekler bazen kıvrımlı yapıda izlenebilir. Sık mitoz görülür ve vakaların yaklaşık %10 unda belirgin yıldızlı gökyüzü manzarası mevcuttur. Tümör hücreleri immünohistokimyasal olarak anti-tdt, CD19, CD22 ve CD79a antikorları ile pozitivite gösterir. Tümör hücrelerinde anti-cd20, CD34, CD45, CD99 antikoru pozitif veya negatiftir. Sitoplazmik IgM ekspresyonu %10 hastada pozitif izlenirken yüzey Ig ekspresyonu görülmez (2). 11
KRONĠK LENFOSĠTĠK LÖSEMĠ / KÜÇÜK LENFOSĠTĠK LENFOMA Küçük lenfositik lenfoma, HDL'lerin %6,7'sini kapsar. Kronik lenfositik lösemi/küçük lenfositik lenfoma altıncı veya yedinci dekatta pik yapan bir tümördür. Erkek kadın oranı 2:1'dir (26,27). En sık görülen semptom ve bulgular; lenfadenopati %87, splenomegali %54, hepatomegali %14 oranında izlenir. Tutulan lenf bezleri mobildir ve çok iri değildir (28). Olguların %15-35'inde başlangıç lenf bezi tutulumu ile giden bir Küçük lenfositik lenfoma iken, zamanla klinik tablo Kronik lenfositik lösemi ye dönüşür. Deri, akciğer, mide, meme, oküler tutulum ve adneks tutulumu izlenebilir. Periferik kan, kemik iliği ve lenf bezlerindeki monomorfik CD5, CD23 pozitif küçük B lenfositler ile daha az oranda prolenfositler ve paraimmünoblastların infiltrasyonundan oluşan neoplazilerdir. Diffüz paternde bir infiltrasyon görülür, interfoliküler tutulum nadirdir. Lenf nodunda pseudodofoliküler paternde proliferasyon izlenebilir. Pseudofoliküler patern; proliferasyon merkezi yada büyüme merkezi olarak da adlandırılan pseudofoliküller, küçük lenfositlerden oluşan koyu zeminde, daha soluk boyanan büyük transforme hücrelerin, yani prolenfositler ve paraimmünoblastların gruplaşması tarzındadır (2). İnfiltrasyondaki hakim hücre normal lenfositten hafif irice, kromatini kümelenme gösteren, nükleer membranda hafif derecede bir kontür düzensizliği bulunabilen, mitotik aktivitesi düşük küçük lenfositlerdir ve benign transforme olmamış matür lenfositten morfolojik olarak ayırt edilemezler. Tanı sırasında kemik iliği tutulumu vardır ve tutulum hemen daima nodüler paterndedir. Splenomegali sıktır. DBBHL ye transformasyon Richter Sendromu olarak adlandırılır. Küçük lenfositik lenfoma tümör hücrelerinde CD5, HLA-DR, CD19, CD79a, CD23, CD43 pozitiftir, CD10 ve cyclind1 ekspresyonu görülmez (2). LENFOPLAZMOSĠTĠK LENFOMA Tüm HDL lerin % 1.7 sini oluşturan Lenfoplazmositik lenfoma (LPL) ileri yaşlarda izlenir. Erkeklerde 2 kat sıktır (2,26). LPL veya WaldenströmMakroglobulinemi (WM) hastalarının yaklaşık % 25'i tanı sırasında asemptomatik olabilir. Kemik iliği incelemesinde malign B lenfositlerin gelişimlerinin plazmositoid lenfosit evresinde durakladığı görüldüğünde ve serumda IgM yüksek düzeyde bulunduğunda WM tanısı konulur. Semptomatik hastalarda belirtiler neoplastik hücrelerin salgıladığı monoklonal IgM sekresyonu ve atipik lenfositlerin doku infiltrasyonu sonucu oluşur. Tümör tarafından yoğun kemik iliği infiltrasyonu sonucu sitopeniler görülür. Anemi, hepatomegali, splenomegali, lenfadenopati izlenebilir. Lenfadenopati genellikle hafiftir. Litik kemik lezyonları görülmez. Yüksek miktarda IgM proteini üretimi sonucunda WM adı verilen hiperviskozite 12
sendromu(baş ağrısı, baş dönmesi, sağırlık, görme bozukluğu, kanamalar, soğuk ürtikeri) izlenir. Kemik iliği, lenf bezleri, karaciğer tutulabilir. Lenf bezleri genellikle orta derecede büyümüştür. Lenf bezi diffüz olarak tamamen infiltre olabileceği gibi kısmen korunmuş da olabilir. Kapsül ve perinodal yağ dokusu infiltrasyonu yaygındır. Kısmen korunmuş lenf bezinde, subkortikal foliküller genellikle tutulmaz ve sinüsler açık olarak izlenir. Tümör küçük olgun lenfositler, plazmositoid lenfositler ve olgun plazma hücrelerinin değişken derecede karışımından oluşur. Amiloid birikimi oluşabilir. Mitoz nadirdir. Tümör hücrelerinde genellikle IgM, bazen IgG, nadiren IgA tipi monoklonal Ig ve çoğunlukla kappa hafif zinciri izlenir. IgD tipik olarak negatiftir. Anti-CD19, CD20, CD22, CD79a antikorları ile pozitif, anti-cd5 ve CD10 antikorları ile negatif (nadiren pozitif) reaksiyon saptanır (2,29). MARJĠNAL ZON LENFOMA Tüm HDL lerin %5-7 sini oluşturur. DSÖ sınflamasına göre Ekstranodal marjinal zon lenfoma (EN-MZL), Nodal marjinal zon lenfoma (N-MZL) ve Splenik marjinal zon lenfoma (S-MZL) olarak 3 alt gruba ayrılır. S-MZL germinal merkezleri sarıp ortadan kaldıran ve folikül mantle zonunun yerini alan küçük lenfosit infiltrasyonu ve marjinal zon diferansiasyonu ile karakterli bir lenfomadır. Beyaz pulpada arada transforme blastlar ve kırmızı pulpada hem küçük, hem de büyük hücre infiltrasyonu izlenir. Çoğu 50 yaş üstündedir. Dalak yanısıra, dalağın hiler lenf bezleri, kemik iliği ve kan sıklıkla tutulum gösterir. Genelde periferik lenf bezi tutulumuna rastlanmaz. Dalak orta derecede büyümüştür. Dalağın beyaz pulpasında nodüler tutulum izlenir. Geniş soluk sitoplazmalı, küçük ile orta boy arası marjinal zon hücrelerini andıran hücrelerden oluşan infiltrasyon mevcuttur. Kırmızı pulpada daha iri hücrelerin oluşturduğu küçük nodüller görülür ve sıklıkla sinüslerin de infiltrasyona uğradığı saptanır. Plazmositik diferansiyasyon görülebilir (30). Tümör hücrelerinde yüzey anti-igm antikoru pozitif, anti-igd antikoru pozitif veya negatif, sitoplazmik Ig ekspresyonu pozitif veya negatif, CD20, CD79a, BCL2 ekspresyonu mevcut iken, anti-cd5, CD10, CD23, nükleer cyclin D1, CD103 ve TRAP (Tartrat Rezistan Asit Fosfataz) antikorları ile reaksiyon izlenmez. Mukoza ilişkili lenfoid dokularda görülen EN- MZL düşük dereceli B hücre immünfenotipli bir HDL dir. Tükrük bezi, ince ve kalın barsak, akciğer gibi dokulardan kaynaklanır. Monositoid B lenfositlerden oluşur, plazma hücre diferansiyasyonu gösterebilir. Etiyolojide Sjögren sendromu, Hashimoto tiroiditi, Helikoakter Pilori enfeksiyonu rol oynar. Geç dönemde uzak yayılım ya da DBBHL transformasyonu görülebilir. N-MZL (Monositoid B hücreli lenfoma) 6. ve 7. dekadda sıktır, kadın/erkek oranı 13
2/1 dir. Olguların 3/4 ünde lenfadenopati mevcuttur. Histopatolojik olarak monositoid B hücrelerden sentrosit benzeri hücrelere dek değişen morfolojilerde atipik lenfositler, büyük lenfositler ve plazma hücrelerinden oluşan heterojen bir proliferasyon görülür. Nadiren kemik iliği ve periferik kana yayılım söz konusudur. Kemik iliğinde nodüler ve interstisyel infiltrasyon yapar. İntrasinüzoidal lenfoma hücreleri karakteristik bir bulgudur. En sık görülen patern parafoliküler ve interfoliküler patern olup, tümör hücreleri reaktif foliküller çevresinde görülür ve bu paterne marjinal zon paterni denir. Olguların %20'sinde kapsüler skleroz görülür. Olguların %30 unda monotipik plazma hücre proliferasyonu saptanır. Sinüs infiltrasyonu, marjinal zon-parafoliküler alan infiltrasyonu veya lenf bezi yapısının tümüyle silinmesi şeklinde paternler izlenebilir. Tümör; monositoid B hücreleri yanında, sentrosit benzeri hücreler, küçük lenfositler, plazmositoid lenfositler ve plazma hücreleri gibi hücrelerin heterojen karışımından oluşur. Büyük hücreler (sentroblastlar veya immunoblastlar) her zaman mevcuttur. Monotipik B hücreleri IgM ve pan-b hücre belirleyicileri eksprese ederler. Tümör hücrelerinde anti-cd10, CD5 ve CD25 antikorları ile genellikle reaksiyon saptanmaz (2). MANTLE HÜCRELĠ LENFOMA Mantle hücreli lenfoma nın (MHL) tüm HDL ler içindeki oranı farklı serilerde %2-11 arasında değişmektedir (31,32). MHL erkeklerde daha sık görülmektedir. En sık orta ve ileri yaş grubunda görülür, 50 yaşın altında oldukça seyrektir (31). MHL olguları tipik olarak kliniğe, çok sayıda (2 5 cm çapında) lenfadenopati ile başvururlar. Olguların yarıya yakınında konstitüsyonel semptomlar bulunur, bunlar arasında en sık görülen kilo kaybıdır, gece terlemesi daha seyrektir. Splenomegali sık görülür (33). Gastrointestinal sistem ve kemik iliği tutulumu oldukça sıktır. Kromozom 11 de cyclind1 geni ile kromozom 14 deki Ig ağır zincir elemanlarının birleşmesine neden olan t(11;14) mevcuttur (34). Küçük ile orta boy arası lenfoid hücrelerin monomorfik infiltrasyonu ile karakterli nodüler, diffüz ya da mikst paternde bir B hücre immunfenotipli HDL dir. Klasik histoloji; küçük-orta boyutta monoton görünümlü lenfositlerden oluşur. Neoplastik lenfositlerin sitoplazması dardır, düzensiz nükleer kontur, kondanse nükleer kromatin, göze çarpmayan nükleol izlenir. İmmünofenotipik olarak neoplastik hücrelerde yüzey IgM veya IgD pozitiftir, %20 olguda ise IgM ve IgD birlikte pozitiftir. Tümör hücrelerinde Pan-B antijenleri (CD19, CD20, CD22) yanısıra, HLA-DR, BCL2, CD5, CD43, cyclind1 antijjen ekspresyonları saptanır. BCL6 ve CD10 immünreaktivitesi görülmez, anti-cd23 antikor ekspresyonu negatif veya zayıf pozitiftir (2). 14
FOLĠKÜLER LENFOMA Amerika Birleşik Devletleri nde ve Avrupa da 2. en sık görülen HDL olup erişkin lenfomalarının %40 ını oluşturur. Gelişmekte olan ülkelerde ve Asya da daha nadirdir. En sık orta yaşta görülür (ortalama 59 yaş). Kadın ve erkekte aynı oranda görülür (27). Sitolojik olarak 3 dereceye ayrılır. Derece 1 ve derece 2 FL nispeten yavaş seyir gösterirken, derece 3 FL ler agresif seyreder. Vakaların büyük çoğunluğunda BCL2 geninin aktivasyonuyla sonuçlanan t(14;18) vardır (BCL2 normal hücre siklusunda apoptozisi engeller). Bu translokasyon derece 1 ve derece 2 FL lerde %90, derece 3 FL lerde %70 oranında mevcuttur. Translokasyon t(14:18) olguların sadece %10 unda tek genetik anormalliktir (35). Vakaların %90'ında en azından kısmen foliküler patern izlenir. Neoplastik foliküller, normal lenf bezi yapısını ortadan kaldıran, sırt sırta vermiş, mantle zon içermeyen ve sınırları belirgin olmayan, reaktif foliküllerde görülen polarizasyon ve fagositik histiyositlerin yarattığı yıldızlı gök paterni bulunmayan, uniform boyutlarda foliküllerden oluşurlar. Dalakta beyaz pulpa, kemik iliğinde paratrabeküler ve nodüler paternde tutulum izlenir (2,29). FL antijenik uyarıyla germinal merkezler içinde çoğalan sentrofoliküler hücrelerden kaynaklanır. Sentrofoliküler hücreler; sentrositler (çentikli, boyutları küçükten büyüğe değişen hücreler), sentroblastlar (çentiksiz büyük hücreler) ve bunların arasına yerleşmiş foliküler dendritik hücrelerin oluşturduğu bir karışımdır. İmmünfenotipik olarak neoplastik hücreler pan-b hücre antijenleri olan CD19, CD20, CD22 ve CD79a eksprese ederler. Sıklıkla yüzey immünoglobülinleri pozitiftir (IgM ile birlikte ya da onsuz IgD, IgG, nadiren IgA) (36). Neoplastik hücreler genel olarak antiapopitotik protein BCL2 eksprese ederler. Bu özellik FL ile reaktif foliküler hiperplaziyi birbirinden ayıran en önemli özelliklerdendir. En önemli sitogenetik anomali BCL protein yapım artışına yol açan t(14;18)(q32;q21) dir (37). BURKĠTT LENFOMA Çocuk ve erişkinlerde sık görülen hızlı seyirli bir HDL dir. Histolojik olarak aynı ancak coğrafi ve epidemiyolojik olarak farklı 3 alt tipi vardır: Sporadik, endemik ve immünyetmezlik ilişkili. Endemik BL Ekvatoral Afrika'da 15 yaş altındaki çocuklarda en sık görülen malign tümördür. Endemik bölgelerde yetişkinlerde de BL gelişebilir. Bu hastaların yaş ortalaması yaklaşık 30 olup tümörler gastrointestinal sistem veya lenf bezleri yerine çenede ortaya çıkma eğilimindedir. Sporadik BL sanayileşmiş ülkelerde ortaya çıkar ve farklı çalışmalarda tüm HDL lerin yaklaşık % 1 ile 2 sini oluşturur. Immün yetmezlik ilişkili BL, HIV enfeksiyonu sonucu edinilmiş immün yetmezlik sendromu (AIDS) ve diğer immün yetmezlik durumlarında gelişir. Abdominal tümörler (barsak periton, over ) tutulumu da sık 15
izlenir. Lösemik prezentasyon Afrikalı larda nadirdir. En hızlı büyüyen neoplazi olarak kabul edilir. Ağır kemoterapi ile tedavi mümkündür. Patogenezde Myc geninde translokasyon: Kromozom 8 de t(8;14) bulunur. Özellikle endemik BL, EBV enfeksiyonu ile ilişkilidir. Histolojik olarak monoton, küçük lenfosit ile büyük çentikli hücre boyutu arasında yuvarlak oval nükleuslu, 2-5 nükleole sahip lenfositlerden oluşur. Tümör içinde belirgin makrofaj hakimiyeti mevcuttur. Sık hücre ölümü nedeniyle yıldızlı gök manzarası görünümü izlenir. Tümör hücreleri immunfenotipik olarak panb antijenleri eksprese ederler. Anti-CD10 ve BCL6 antikorları ile immünreaktivite mevcuttur. Ki-67 proliferasyon indeksi %90 ın üzerindedir. BCL2, CD5, CD23, TdT immünreaktivitesi görülmez (2,29). DĠFFÜZ BÜYÜK B HÜCRELĠ LENFOMA Batı toplumlarında HDL lerin en sık görülen tipidir. HDL lerin yaklaşık olarak %30-40 lık kısmını oluşturur. Gelişmekte olan ülkelerde bu oran daha yüksektir. Ülkemizde görülen HDL hastalarının yaklaşık olarak %50 si DBBHL dir (38). DBBHL, önceden mevcut olan düşük dereceli periferik B-hücreli bir lenfomadan dönüşüm ile ortaya çıkabileceği gibi, primer olarak da gelişebilir. DSÖ sınıflamasında nadir varyantlar ile birlikte altı morfolojik alt tip tanımlanmıştır ve bunlar arasında prognoz açısından farklılıklar bulunmaktadır (39). DBBHL de mikroskobik olarak diffüz proliferasyon gösteren iri (olgun lenfositin iki katından büyük) neoplastik B-hücreleri izlenir (39). Ortalama görülme yaşı 70 olmakla birlikte çocuklar da dahil olmak üzere geniş bir yaş aralığında izlenir. Erkeklerde biraz daha fazladır. Son senelerde görülme sıklığı artmıştır (39,40). Kesin etiyolojisi bilinmemektedir. Sıklıkla primer olarak gelişir, ancak düşük dereceli lenfomalardan (örn; FL, KLL, EN-MZL, LPL) transformasyon sonucu da gelişebilir. Bazı DBBHL olgularında otoimmün hastalık ve immün yetmezlik bulunur. Ekstranodal olguların bazılarında lokal kronik inflamasyon, yumuşak doku ve kemiğin süpüratif inflamasyonu, radyasyon etkisi, postmastektomi lenfödem, metal protezler ve uzun süren piyotoraks gibi öncül lezyonlar bildirilmiştir. Altta yatan bir immün defekt risk faktörüdür (39,41). DBBHL nodal veya ekstranodal olarak ortaya çıkabilir ve ekstranodal olgular % 40 ın üzerindedir (20,39,42). Gastrointestinal bölge (mide, ileoçekal bölge) en sık ekstranodal alan olmakla birlikte herhangi bir bölgeden de çıkabilir. Lösemik prezantasyon ile ortaya çıkış FL ye göre daha seyrektir (39). Hastalar hızla büyüyen, sıklıkla semptomatik olan bir kitle ile kliniğe başvururlar ancak evrelemede hastaların çoğunun yaygın bir tutuluma sahip oldukları görülür (39,43). Makroskopik olarak tutulan lenf bezi homojen yapıda ve balıketi kıvamındadır. DBBHL genellikle tuttuğu dokunun yapısını makroskopik ve mikroskopik olarak tamamen siler, bazen lokal tutulum olabilir. Tümörde 16
kanama ve nekroz alanları seçilebilir, kitle fibrozis içerebilir veya içermeyebilir (39). Mikroskobik olarak lenf bezinde parsiyel tutulum interfoliküler veya sinüzoidal infiltrasyon şeklindedir. Bazı olgularda sklerozun neden olduğu yalancı foliküler patern izlenebilir ve bu tip olgularda CD21, CD35 gibi dendritik hücre belirleyicileri ile gösterilebilen, FL için tipik olan foliküler dendritik hücre ağı görülmez. Ekstranodal olgularda tümör organa ait epiteli ortadan kaldırır. Mukozal tutulumda lenfoepitelyal lezyon görülebilir. MALT tip bir lenfomada tümörde büyük hücreli alanlar görüldüğünde, tanı ekstranodal DBBHL olmalıdır (40). DĠFFÜZ BÜYÜK B HÜCRELĠ LENFOMA MORFOLOJĠK VARYANTLARI Sentroblastik Varyant Diffüz Büyük BHücreli Lenfoma Sentroblastik varyant DBBHL'nin en sık görülen varyantıdır. Morfolojik olarak reaktif GM de bulunan sentroblastlara benzer görünümlü neoplastik hücreler izlenir. Neoplastik hücreler 2-4 arası nükleol içeren, ince kromatine sahip, veziküler nükleuslu, dar bazofilik sitoplazmalı, orta veya büyük boyuttadır. Bu varyantta immünoblast benzeri tümör hücreleri izlenebilir ancak bunlar tümörde %90'dan az oranda olmalıdır. Sentroblastik ve immünoblastik varyant ayırımı bazen sıkıntılı olabilmektedir. Sentroblastik varyant kendi içerisinde monomorfik, multilobule ve polimorfik olarak alt varyantlara ayrılabilir (20,39,40). İmmünohistokimyasal olarak neoplastik hücreler değişik pan-b hücre belirleyicilerini (CD19, CD20, CD22 ve CD79a vb.) eksprese eder. Birçok olguda yüzey Ig leri gösterilebilir (IgM>IgG). CD5 immunreaktivitesi %10 olguda pozitiftir. CD10 ekspresyonu değişkendir. Neoplastik hücrelerin az bir kısmında zayıf bir CD30 ekspresyonu görülebilir. Ki-67 ile proliferatif indeks genellikle % 40 dan yüksektir (20,39,40). Ġmmünoblastik Varyant Diffüz Büyük B Hücreli Lenfoma Bu varyant histomorfolojik olarak nükleuslarında tek, santralize nükleol içeren ve oldukça iri bol bazofilik sitoplazmaya sahip olan immünoblastik hücreleri %90 dan fazla oranda içerir. Plazma hücre diferansiyasyonu görülebilir, tümörde plazma hücresi ve plazmablastlar izlenebilir (20,39,43). İmmünohistokimyasal bulgular büyük oranda sentroblastik varyant ile aynıdır. Plazmasellüler diferansiasyon içeren olgular immünoblast, plazmablast ve proplazma hücrelerine benzer şekilde Ig hafif zincir ekspresyonu gösterirler (20). 17
Anaplastik Varyant Diffüz Büyük B Hücreli Lenfoma Histomorfolojik olarak Reed-Sternberg hücrelerine benzeyen bizar, pleomorfik nükleus içeren yuvarlak, oval veya poligonal şekilli çok büyük hücrelerden oluşur. Karsinomu andıran neoplastik hücre toplulukları izlenir ve genel olarak sinüzoidal paternde büyüme görülür. Tanı ALK (anaplastik lenfoma kinaz) pozitifliğinin gösterilmesi ile konur. Bu varyantın sitotoksik T-hücrelerinden gelişen anaplastik büyük hücreli lenfoma ile ilişkisiz olduğu akılda tutulmalıdır (20,39). İmmunohistokimyasal olarak neoplastik hücreler B-hücre ilişkili antijenler (CD19, CD20, CD22) ve CD30 ekspresyonu gösterirler. CD30 ekspresyonu kuvvetli membranöz veya golgi zon boyanmasından, soluk diffüz sitoplazmik boyanmaya kadar değişken şekilde izlenir. Neoplastik hücreler ayrıca CD23, CD21, CD38, CD71, CD25 gibi aktivasyonla ilişkili antijenleri de eksprese ederler. Neoplastik hücrelerde CD45 ekspresyonu görülebilir, ancak CD15 ekspresyonu sıklıkla izlenmez (20). T-Hücre/Histiyositten Zengin Varyant Diffüz Büyük B Hücreli Lenfoma Histomorfolojik olarak bu varyantta esas hücre komponenti neoplastik olmayan T- hücreleri ve bazen eşlik eden histiyositlerdir. Tümörde T-hücreleri ve histiyositler %90 dan fazladır. Neoplastik büyük B hücre oranı kural olarak %10 dan azdır (40). Histiyositler epiteloid görünümde olabilir. Neoplastik hücreler atipiktir ve sentroblast, immünoblast veya Reed Sternberg hücresine benzer görünümdedirler. Az sayıda neoplastik özellikte küçük B hücreleri bulunabilir. Neoplastik küçük B-hücrelerinden zengin alanların varlığı nodüler lenfosit baskın Hodgkin lenfoma ile ayırıcı tanıda güçlüklere neden olsada nodüler paternin izlenmemesi ayrımda yardımcıdır. İnfiltrasyon paterni diffüzdür ve ince retiküler fibrozis sıklıkla mevcuttur (39). Kemik iliği tutulumu paratrabeküler veya diffüz infiltrasyon şeklinde izlenir (20). İmmunohistokimyasal olarak T-hücreleri immünofenotipik olarak genellikle CD4 pozitif ve CD8 negatiftir. Büyük B hücreleri pan-b belirteçleri ile boyanır. Çoğu vakada monotipik yüzey ve sitoplazmik Ig ler neoplastik hücrelerde gösterilebilir, oldukça nadir CD30 ve EMA (epitelyal membran antijeni) ekspresyonu mevcuttur (20). Plazmablastik Varyant Diffüz Büyük B Hücreli Lenfoma Nadir bir DBBHL varyantıdır ve tipik olarak HIV enfeksiyonlu hastalarda oral kavitede ortaya çıkar. Olguların çoğu immünsupresedir ve viral enfeksiyon (sıklıkla EBV) öyküsü mevcuttur (44). Histomorfolojik olarak genelde immünoblastik lenfomadan ayırt edilmesi zordur (39). Histolojik görünüm göreceli olarak monomorfiktir. Sıklıkla 18
makrofajların arasında dağılmış köşeli görünümde iri neoplastik hücreler koheziv büyüme paterni gösterirler. Neoplastik hücreler belirgin tek nükleol veya çok sayıda nükleol içerir. Nükleus ekzantrik veya santral yerleşimlidir. Neoplastik hücreler B immünoblast ve plazma hücresi arasındaki farklı diferansiyasyon dönemlerini gösterdiklerinden plazmablastik diye tanımlanırlar. Dutcher cisimcikleri ve Russel cisimcikleri bulunmaz. Giemza ile bazofilik boyanan nispeten geniş sitoplazma izlenir. Apopitoz sıktır, tek hücre nekrozu ve çok sayıda mitoz izlenir. İnfiltrasyonda klasik öncü plazma hücreleri ve olgun plazma hücreleri görülmez. Neoplastik hücrelerle iç içe çok az reaktif lenfosit bulunur (20). İmmunohistokimyasal olarak AIDS ile ilişkili plazmablastik DBBHL varyantında CD20 ve CD45 ekspresyonu izlenmez veya çok belirsizdir. % 50 den fazla olguda sitoplazmik IgG ekspresyonu görülür ve sadece üçte birinde Ig hafif zinciri gösterilebilir. Plazmablastik varyantta sıklıkla VS38C (plazma hücre antijeniklon kodu) monoklonal antikorunun plazma hücreleri ile güçlü reaksiyonu görülür. Ayrıca CD138 antijen ekspresyonu da görülür. CD45 ve CD20 ile negatif veya zayıf pozitif immünreaktivite, olguların yarısında CD79a'nın güçlü ekspresyonu, anti-vs38c antikoru ile pozitiflik belirgin plazma hücre diferansiyasyonunun göstergesidir. BCL2 protein ekspresyonu heterojendir. BCL6 ekspresyonu hücrelerin sadece bir kısmında izlenir (20). Full-Lenght Anaplastik Lenfoma Kinaz Ekpresyonu Gösteren Diffüz Büyük B.Hücreli Lenfoma Erişkinlerde ve erkeklerde daha sık görülen agresif seyirli bir lenfoma tipidir. Monomorfik görünümde büyük immünoblast benzeri hücrelerden oluşur. Bu hücreler iri, santralize nükleol içeren yuvarlak, soluk nükleuslu, geniş amfofilik sitoplazma içeren, bazen plazmablastik diferansiasyon gösteren hücrelerdir. Reed-Sternberg hücrelerine benzer hücreler izlenebilir. Tutulan lenf bezinde diffüz infiltrasyon görülür ve sinüsler tümör hücreleri ile doludur. İmmunohistokimyasal olarak tümör hücreleri anti-cd30 antikoru ile negatif, CD45 ile zayıf pozitif, EMA ile güçlü pozitif, anti-vs38c antikoru ile pozitif reaksiyon verir. Hücreler hafif zincir yapısında sitoplazmik IgA içerirler. Tumor hücrelerinde nadiren CD4, CD57 ve MUM1 ekspresyonu görülebilir. Pan-T ve B hücre ilişkili belirleyicileri (CD20, CD79a, CD3) eksprese etmezler. ALK boyamada granüler sitoplazmik ve golgi zonunda noktasal pozitiflik izlenir (39). 19
DĠFFÜZ BÜYÜK B HÜCRELĠ LENFOMA: GEN EKSPRESYON PROFĠLĠ VE ALT TĠPLER Son yıllarda DBBHL ler morfolojik alt tiplerin yanısıra B-hücre gen ekspresyon profili (GEP) dikkate alınarak iki alt gruba ayrılmıştır. Birleşik Devletler Ulusal Kanser Enstitüsü mrna gen ekspresyon profillerine dayanarak DBBHL leri GMK ve ABK olarak sınıflamış, CHOP tedavisine Rituximab eklenmesinin sağkalımı artırdığı tesbit edilmiştir (45). GMK DBBHL ler Uluslararası prognostik indeks (IPI) skorundan bağımsız olarak daha iyi prognoza sahiptirler (46). Çok sayıda çalışma ile DBBHL lerin genotipik özellikleri ortaya konulmaya başlanmıştır. DBBHL lerin bazılarında tipik olarak BL de görülen t(8;14)(q24;q32) translokasyonu ve MYC geninde 8q24 translokasyonu tespit edilmiştir. Ayrıca bazı agresif DBBHL vakalarında BCL6 gen yeniden düzenlenmesi veya t(14;18)(q32;q24) olduğu izlenmiştir (47). Son zamanlarda DBBHL lerde prognoz tahmini ve tedavi stratejisinin belirlenmesinde önem kazanan GMK ve ABK tip tümörlerde genetik ve moleküler yolağın açıklanabilmesi için çalışmalar yapılmıştır (48-51). Diffüz büyük B hücreli lenfoma alt tiplemesi için yapılan geniş gen ekspresyon çalışmalarında bu tümörlerin değişik diferansiyasyon aşamalarında takılan B lenfositlerden kaynaklandığı gösterilmiştir. Araştırmalarda ABK tip DBBHL lerde SPIB onkogeninin tekrarlayan kromozom dizileriyle upregüle (artırarak düzenleme) olduğu tespit edilmiştir. SPIB: ETS ailesi transkripsiyon faktörlerini kodlayan bir protoonkogen olup bundaki bir mutasyon onkogen haline dönüşmesine neden olmaktadır. SPIB normalde germinal merkez reaksiyonu için gerekli olan plasmositoid dentritik hücrelerde ve lenfositlerde bulunur. GMK alt tip DBBHL lerde mir-17-92 mikrorna kümesinin onkogenik varyantı ve tümör supresör gen olan PTEN (phosphatase and tensin homolog) delesyonu izlenir (48). Yapılan bir çalışma sonucuna göre ABK tip, NF-kB (Nuclear factor kappa-light-chainenhancer of activated B cells) yolunun yapısal aktivasyonu, B hücre reseptör yolunun kronik aktivasyonu ile seyreden antiapopitotik özellikte, kemoterapiye dirençli kötü prognozla ilişkili bir alt tiptir. ABK tipte IRF4/MUM1 ekspresyonuna neden olan NF-kB yapısal aktivasyonu izlenir (IRF4 ve MUM1 plasmositik diferansiyasyon ile ilişkili transkripsiyon faktörüdür). ABK tiplerin çoğu BCL2 overekspresyonu, tümör supresör gen ve INK4A-IRF (Inhibitor of Kinase 4 - Interferon regulatory factor) kaybı gösterirler. Bu değişiklikler kemoterapi direncinde önemlidir. GMK tip DBBHL ler germinal merkez B hücrelerinden köken alırlar. Bu tipte t(14:18) translokasyonu, daha az sıklıkla p53 mutasyonu ve PTEN delesyonu izlenir 20
(48). Yine bir araştırma farklı ve spesifik iki yolun malign transformasyona neden olduğunu; BCL2 yeniden düzenlenmesi ve C-REL amplifikasyonunun (C-REL; bir protoonkogen olup REL geninde kodludur) GMK alt tip gelişiminde, NFkB yolunun aktivasyonunun ABK subtip gelişiminde etkili olduğunu ortaya koymaktadır (7,49). Diffüz büyük B hücreli lenfoma için yapılan diğer genetik çalışmalarda Chen ve ark. (50) kromozom 1 kaybı ve GMK tipte kromozom 12 kazanımı tespit etmişlerdir. Ayrıca başka araştırmalarda GMK ve ABK alt tiplerde çeşitli genetik anormallikler bulunmuştur. ABK alt tipe sahip vakalarda 3q, 18q, ve 19q kazanımı, 6q ve 9p21 kaybı, GMK alt tipe sahip vakalarda 1q, 2p, 7q ve 12q kazanımı tespit edilmiştir. Bazı agresif DBBHL vakalarında 9p21 kaybı (p16 ink4a lokus) rapor edilmiştir (51). ALGORĠTMALAR Gen ekspresyon profili çalışmaları DBBHL nin germinal merkez ve germinal merkez dışı alt tiplerini ayırt etmede kullanılır. GEP pahalı ve pratik olmayan bir yöntemdir ve bu nedenle immunohistokimyasal algoritmalar tercih edilmektedir. Günümüze kadar birçok algoritma geliştirilmiştir. Bu konuda yaygın kabul ve yankı bulan ilk araştırma Hans ve ark. (9) tarafından yayınlanmıştır. Hans ve ark. anti-cd10, MUM1 ve BCL6 antikorları kullanarak oluşturdukları algoritmada Rituximab sız CHOP tedavisi alan vakaları kullanmışlardır. GEP sonuçlarıyla uyum GMK için %71, GMK dışı için %88 olarak tespit edilmiştir (9). Hans algoritması, sonradan geliştirilen ve GEP analizi ile uyumu karşılaştırılan bazı algoritmalarla kıyaslanmıştır.daha sonraki bir araştırmada Choi ve ark. anti-gcet1, MUM1, CD10, BCL6 ve FOXP1 antikorlarını kullanarak önerdikleri algoritmanın GEP ile %93 oranında uyumlu olduğunu bildirmişlerdir. Choi ve ark.aynı gruba uyguladıkları ve GEP ile %86 uyum saptadıkları Hans algoritmasına göre kendi algoritmalarının daha tanısal olduğunu belirtmişlerdir (10). Daha sonra Meyer ve ark. (52) yaptıkları çalışmada GEP sonuçlarını farklı algoritmalarla karşılaştırmışlar, Choi algoritması ile %87, Hans algoritması ile %86, Muris algoritması (53) ile %77, Nyman algoritması (54) ile %81, Natkunam algoritması (55) ile %74, kendilerinin önerdiği algoritma (Tally algoritması) ile %93 oranında GEP sonuçları ile uyum saptamışlardır. Meyer ve ark. oluşturdukları Tally algoritmasında anti-cd10, GCET1, FOXP1, MUM1 ve LMO2 antikorlarını kullanmışlar ve GEP ile yüksek oranda uyum bildirmişlerdir. Ancak daha sonra yapılan bir araştırmada bu algoritmanın GEP ile uyumunun daha düşük derecede olduğu bildirilmiştir (56). 2012 yılında yapılan geniş katılımlı ve çaplı bir çalışmada Visco ve ark. (11) GEP sonuçları ile diğer algoritmalara göre daha yüksek uyuma sahip olduğunu bildirdikleri Visco- 21
Young algoritmasını önermişlerdir. Dörtlü ve üçlü immunohistokimyasal belirteç kullanarak iki algoritma geliştirmişlerdir. Dörtlü algoritmada anti-cd10, GCET1, FOXP1 ve BCL6 antikorları kullanmışlar, üçlü algoritmada anti-gcet1 antikorunu çıkarmışlardır. Sonuçta iki yöntemin benzer sonuç vermesi üzerine üçlü algoritmanın daha uygun olduğunda karar kılmışlardır. Algoritmayı dizayn ederken Hans algoritmasında olduğu gibi CD10 ekspresyonunu temel alarak pozitif boyananları direkt GMK olarak ayırmışlardır. Özellikle FOXP1 in germinal merkez evresi ve aktive B hücre arasındaki geçişte önemli rol oynaması nedeniyle anti-cd10 antikoru ile immunekspresyon saptanmayan olguları anti-foxp1 antikoru ile boyamış ve FOXP1 immunreaktivitesi gösteren vakaları ABK olarak sınıflamışlardır. Hem CD10 hem de FOXP1 ekspresyonu göstermeyen vakalarda ise son olarak BCL6 ekspresyonu aranmış ve anti-bcl6 antikoru ile pozitif boyanan vakalar GMK olarak, boyanma göstermeyen vakalar ABK alt tip olarak kabul edilmiştir (11). ALT TĠPLEMEDE KULLANILAN ĠMMUNOHĠSTOKĠMYASAL BELĠRTEÇLER FOXP1: Forkhead Box Protein P1 Forkhead box protein P1; B hücre gelişimi için gerekli olan winged-helix biçimli transkripsiyon faktörüdür. FOXP1 kromozom 3p de yerleşik bir tümör supresör gene bağımlıdır. Anti-FOXP1 antikoru reaktif lenfoid dokuda B hücrelerini germinal merkez ve çevresinde pozitif boyar, plazma hücrelerinde boyanma görülmez (57). FOXP1 normalde aktive B hücrelerde, mantle zon ve germinal merkezdeki bazı B hücrelerde immunohistokimyasal pozitiflik gösterir. FOXP1 geni 3p14.1 de lokalizedir ki bu alan birçok tümörde heterozigot kayıp içeren tumör supresör özellik taşır. Bu genin mrna ekspresyonu özellikle ABK DBBHL de artar. Renal hücreli karsinom, meme kanseri, FL ve DBBHL gibi değişik tümörlerde FOXP1 ekspresyonu izlenebilir (23,24). FOXP1 overekspresyonu MALT lenfoma ve DBBHL de kötü prognozla ilişkilidir (58). CD10: Akut Lenfositik Lösemi Antijeni Tek zincirli 100kDa ağırlığında tip 2 hücre yüzey proteinidir. Lenfoid dokularda folikül germinal merkezinde sınırlıdır. Foliküler lenfomayı diğer düşük dereceli lenfomalardan ayırmakta son derece yararlıdır (59). CD10 membran ilişkili bir nötral endopeptidazdır. İnsan dokularının birçoğunda eksprese edilir. Özellikle reaktif lenfoid dokuların germinal merkez hücrelerinde ekspresyonu belirgindir (60). DBBHL lerde CD10 22
ekspresyonunun iyi prognozla ilişkili olduğu gösterilmiştir. Ancak tek başına prognozu belirlemek için yeterli değildir (61). MUM1/IRF4: Multipl Myelom Onkojen 1/ Ġnterferon Regulatör Faktör 4 İnterferon düzenleyici faktör ailesine bağlı lenfoidspesifik bir transkripsiyon faktörüdür (62). Normalde plazma hücreleri ve germinal merkez hücrelerinden eksprese edilir. DBBHL lerde %50-70 oranında pozitiftir (63). MUM1 germinal merkez B hücre diferansiyasyonunda maturasyonun son aşamasında eksprese olur. Bu nedenle ABK fenotipinin belirleyicisidir (64). BCL6: B Cell Lymphoma 6 Aynı isimli proteini kodlayan bir protoonkogendir. Reaktif lenfoid dokuda foliküler merkezdeki B lenfositlerden ekprese edilir. DBBHL lerin %60-70 inde immunreaktivite gösterir. BCL6 nın overekspresyonu germinal merkez B lenfositlerin terminal diferansiyasyonunu inhibe eder ve transformasyona neden olur (65,66). BCL6 bir zinc-finger proteini transkripsiyonel reseptördür. Özellikle germinal merkez B hücreleri ve CD4 pozitif T hücrelerinden eksprese edilir (67). GCET1/Serpin A9/Centerin: Germinal Center Expressed Transcript 1 Centerin ismi ile de anılan GCET1 serin proteaz inhibitör ailesine bağlı kromozom 14q32 de yerleşik bir moleküldür (68). GCET1 in germinal merkezdeki Ki67 pozitif sentroblastları boyadığı gösterilmiştir. Bu hücreler CD40 sinyali ile uyarılmış ve bunun sonucunda GCET1 ekspresyonunda artış olan ve prolifere olup somatik hipermutasyona giden sentroblastlardır. Bir çalışmada GCET1: FL de %92, BL de %37, DBBHL de %47 oranında pozitif bulunmuştur (69). GM fenotipli B hücreli lenfomalarda GCET1 ekspresyonunu araştıran bir çalışmada GCET1 boyama sonuçlarının CD10 ile korele olduğu bildirilmiştir (70). GCET2: Germinal Center Expressed Transcript 2 Lenfoid dokularda normalde germinal merkez B hücrelerinde eksprese edilir. Bir adaptör protein olan GCET2 lenfosit migrasyonunu engeller ve dinlenme halindeki hücrelerden (GCET1 in aksine) eksprese edilir. Germinal merkez karanlık zonunda BCL6 ve GCET2 nin farklı hücreleri pozitif boyadığı tespit edilmiştir (13,71). DBBHL da GCET2 23
ekspresyonu diğer prognostik faktörlerden bağımsız olarak iyi prognoz ile ilişkili bulunmuştur (72). LMO2/Rhombotin-2: LIM Domain Only 2 Kromozom 11p13 te kodlu normal hematopoezde yapısal olarak gerekli olan, eritropoezde rol alan bir transkripsiyon faktörüdür (73). LMO2 hematopoetik prekürsör hücrelerde, CD34 pozitif blastlarda, germinal merkez, mantle ve splenik marjinal zon B hücrelerinde eksprese edilir. LMO2 pozitivitesi GMK tip DBBHL ile uyumludur. Akut ve kronik lösemilerde genellikle pozitiftir. B akut lenfoblastik lösemi/lenfomada %88, küçük lenfositik lenfomada %5, MHL de %14, FL de %57, BL de %41, mediastinal DBBHL de %83, lenfosit predominant Hodgkin lenfomada %100, klasik HL de %10 pozitif bulunmuştur (74). LMO2 pozitifliği DBBHL de uzun sağkalımla koreledir (75). LMO2 normal T lenfositlerde eksprese edilmez ancak çocukluk çağında Akut T hücreli lenfoblastik lösemide sıklıkla pozitiftir (6). 24
GEREÇVE YÖNTEM Çalışmaya Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı arşivindeki 1998-2011 yılları arasında tanı almış 172 adet B hücre immünfenotipli HDL alındı. Olgu seçiminde immünohistokimyasal boyama için uygunluk ve istatistiksel açıdan değerlendirme için yeterli sayı ön planda tutulduğundan, olgu dağılımı tümör tiplerinin toplumda görülme sıklığını yansıtmamaktadır. Çalışmaya dahil edilen olgu sayısının yeterliliği açısından Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyoistatistik ve Tıbbi Bilişim Anabilim Dalı ndan görüş ve öneriler alındı. Pozitif kontrol dokuları ile birlikte uygulanan immünohistokimyasal boyamalardan sonuç alınamayan 4 olgu, dokuların antijenitesini kaybetmesi nedeniyle çalışma dışı bırakıldı. 168 olgu çalışmaya dahil edildi. Olgulara ait arşivimizde bulunan hematoksilen-eozin (H&E) boyalı preparatlar yeniden değerlendirilip, tümörü en iyi temsil eden ve immünohistokimyasal çalışma için en uygun bloklar seçildi. Bu blokların tümünden yeni kesitler alınarak H&E boyandı. 2008 yılı öncesi tanı alan tüm vakalar DSÖ 2008 Lenfoma Sınıflaması na göre tekrar incelendi. Tanı verildiği tarihte çeşitli nedenlerle yapılamayan veya yapıldığı halde değerlendirme için yetersiz nitelikte olduğu kabul edilmiş olan 32 olguya gerekli immünohistokimyasal boyamalar (CD3, CD20, CD5, CD23, CD10, CyclinD1, BCL2, BCL6,TdT) uygulandı. 90 adet DBBHL olgusuna immünohistokimyasal olarak anti-cd10, BCL6, FOXP1, MUM1, GCET1, GCET2, LMO2 antikorları çalışıldı. 19 FL, 13 MZL, 21 MHL, 9 BL ve 16 KLL olgusuna anti-foxp1 antikoru uygulandı. Her antikor için kataloglarda belirtilen kontrol dokuları kullanılarak kontrol boyamaları yapıldı. Çalışmada kullanılan antikorlar ve özellikleri Tablo 3 te verilmiştir. 25
Tablo 3. ÇalıĢmada kullanılan antikorlar Antikor Firma Klon Dilüsyon FOXP1 ABCAM JC12 1/100 CD10 Diagnostic BioSystems 56C6 Kullanıma hazır GCET1 ABCAM RAM341 1/50 GCET2 Bioss Poliklonal 1/50 LMO2 ABCAM SP51 1/100 MUM1 DAKO MUM1p Kullanıma hazır BCL6 DAKO PG-B6p Kullanıma hazır BCL2 Thermo Scientific-Neomarkers 100/D5 Kullanıma hazır CD20 Thermo Scientific-Neomarkers L26 Kullanıma hazır CD5 DAKO 4C7 Kullanıma hazır CD23 DAKO 1B12 Kullanıma hazır CD3 DAKO PS1 Kullanıma hazır CyclinD1 DAKO EP12 Kullanıma hazır TdT DAKO SEN28 Kullanıma hazır FOXP1: Forkhead Box Protein P1, CD:Cluster of Differantiation,Cluster of Designation, GCET1:Germinal center expressed transcript 1, GCET2: Germinal center expressed transcript 2, LMO2: LIM Domain Only 2, MUM1: Multiple Myeloma Oncogene 1, BCL2:B-Cell Lymphoma 2 Protein, BCL6: B-Cell Lymphoma 6Protein, TdT:Terminal Deoksinükleotidil Transferaz. Ġmmünohistokimyasal boyamada Ģu iģlem sırası takip edildi: 1- Polilizinli ve pozitif şarjlı lamlar üzerine 4 mikron kalınlığında kesitler alındı. 2-56ºC etüvde 1 gece bekletilerek deparafinizasyon işlemine başlandı. 3- Deparafinizasyona ksilen ile devam edildi. Bu işlem 60 C etüvde 3 kez 10 ar dakika ksilende bekletme ve her 10 dakikanın ardından 5 er dakika solüsyon yenilenerek dışarıda soğumaya bırakma şeklinde uygulandı. 4- Ksilenin giderilmesi için %96 lık alkol muamelesine geçildi. Kesitler alkolde 60 C etüvde her seferinde solusyon yenilenerek 4 defa 10 ar dakika tutuldu. 5- Lamlar 3 kez distile sudan geçirildi. 6- Dokularda bulunan endojen peroksiti bloke etmek için metanolde hazırlanmış %3 lük H2O2 de 37 C etüvde 15 dakika bekletildi. 7- Distile suda 5 dakika bekletildi. 8- Lamlar ph 7.4 olarak hazırlanmış PBS solusyonunda 10 dakika bekletildi. 26
9- EDTA buffer %10 luk solüsyonda maksimum devirde 20 dakika, 600 devirde 10 dakika muamele edildi (CD3, CD20, CD5, CD23, CD10, CyclinD1, BCL2, BCL6, TdT, FOXP1, MUM1, GCET1, LMO2). GCET2 için %2 lik DAKO Target Retrieval solüsyonu kullanıldı. 10- Oda ısısında yarım saat bekletildi. 11- Distile sudan geçirildi. 12- Lamlar ph 7.4 olarak hazırlanmış PBS solusyonunda 10 dakika bekletildi. 13- Reaktiflerin kesit dışına taşmasını engellemek için lamlardaki kesitlerin etrafı Pap pen ile çizildi. 14- Her lama Large Volume Ultra V Blok damlatıldı ve 10 dakika tutuldu (Ref: TA-125-UB, LOT: AUB120320B, Thermo Scientific). 15- Distile suda 3 dakika bekletildi. 16- PBS ile 5 dakika muamele edildi.. 17- Primer antikor solüsyonu damlatıldı ve 60 dakika oda ısısında bekletildi. 18- Lamlar üzerindeki antikorlar distile su ile uzaklaştırılıp PBS solusyonu ile 5 dakika muamele edildi. 19- Biotinylated Goat Anti-Polyvalent solusyonunda 15 dakika, oda ısısında bekletildi (Ref: TP-125-BN, LOT: PBN120313A, Thermo Scientific). 20- PBS ile 5 dakika muamele edildi. 21- Streptavidin Peroxidase solüsyonunda 15 dk oda ısısında bekletildi (Ref: TS- 125-HR, LOT: SHR120314A, Thermo Scientific). 22- PBS ile 5 dakika muamele edildi. 23- Oda ısısında AEC kromojen ile 10 dakika inkübe edildi (LOT: 20718426, Genemed). 24- Çeşme suyunda 5 dakika bekletildi. 25- Hematoksilen zıt boya 2 dakika süre ile uygulandı. 26- Çeşme suyunda 3 dakika bekletildi. 27- %1 lik amonyakta 20 sn bekletildi. 28- Çeşme suyundan geçirildi. 29- Aquamount ile kapatıldı. 27
Değerlendirme: Tüm kesitler önce tez araştırmacısı tarafından daha sonra da tez yöneticisi ile birlikte değerlendirildi. Tüm immünohistokimyasal boyamalar için kataloglarında belirtilen boyama şekli (sitoplazmik, membranöz vb) esas alındı. İlk aşamada 2008 yılı öncesi vakalar DSÖ 2008 Lenfoma Sınıflaması na göre değerlendirilerek gerekli görülen 32 olguya immünohistokimyasal boyamalar (CD3, CD20, CD5, CD23, CD10, CyclinD1, BCL2, BCL6, TdT) yapıldı. Tüm olgular DSÖ 2008 Lenfoma Sınıflaması na göre tekrar tanı verilerek sınıflandı. Küçük lenfositik lenfoma,dbbhl, FL, MZL, MHL ve BL olgularına uygulanan FOXP1 boyamada orta ve kuvvetli derecede nükleer boyanma anlamlı kabul edildi. Bu olgular; 5 büyük büyütme alanında görülen neoplastik hücrelerin boyanma yüzdesine göre %< 10 boyanma 0, % 10-30 arası 1, % 31-50 arası 2, % >50 boyanma 3 olarak skorlandı. Skor 2 ve 3 olgular FOXP1 ekspresyonu açısından anlamlı pozitif kabul edildi (14). Küçük lenfositik lenfoma, DBBHL, FL, MZL, MHL ve BL olgularındaki anti-foxp1 antikoru ile boyama sonuçları istatistiksel olarak analiz edilerek karşılaştırıldı. Diffüz büyük B hücreli lenfoma olgularına uygulanan FOXP1, BCL6, MUM1 ve LMO2 için nükleer, GCET2 için sitoplazmik, CD10 için membranöz ve sitoplazmik+membranöz, GCET1 için sitoplazmik ve membranöz boyanma pozitif kabul edildi. CD10, FOXP1, BCL6, MUM1, GCET1 pozitifliği için Hans, Choi ve Visco-Young algoritmalarında bildirilen eşik değerler esas alındı (9-11). İmmünohistokimyasal boyama yapılan bütün olgularda tümör hücrelerinin en yoğun olduğu 5 büyük büyütme alanı incelendi. Neoplastik olmayan hücreler safdışı bırakılarak tümördeki immünreaktivite oranı tespit edildi. Algoritmalarda kullanılan immünohistokimyasal belirteçler ve kabul edilen eşik değerler Tablo 4 te verilmiştir (9,11,14). Tablo 4.Algoritmalarda kullanılan immunohistokimyasal belirteçler ve neoplastik.. hücrelerde pozitif olarak kabul edilen boyanma yaygınlığının yüzde olarak.eģik değerleri CD10 FOXP1 BCL6 MUM1 GCET1 Hans 30-30 30 - Choi 30 80 30 80 80 Visco-Young 30 60 30 - - -; Belirtilen algoritmada kullanılmayan antikorlar için kullanılmıştır. FOXP1: Forkhead Box Protein P1, CD10:Cluster of Differantiation 10,Cluster of Designation 10, GCET1:Germinal center expressed transcript 1, MUM1: Multiple Myeloma Oncogene 1, BCL6: B-Cell Lymphoma 6 Protein. 28
Ekspresyon pozitifliği açısından GCET2 ve LMO2 için boyanma yaygınlığının eşik değeri 30 olarak alındı (13,76). Tüm DBBHL olguları Hans, Choi ve Visco-Young algoritmalarına göre GMK veya ABK olarak alt tiplere ayrıldı. Algoritmalar arasındaki uyum ve farklar istatistiksel olarak değerlendirildi. Alt tipleme için uygulanan antikorların (CD10, FOXP1, BCL6, MUM1, GCET1) ve bu algoritmaların hiçbirinde yer almayan GCET2 ve LMO2 nin algoritmasonuçlarıyla uyumu istatistiksel olarak ortaya konuldu. Alt tipleme için kullanılan algoritmalar Şekil 5 te verilmiştir (11). ġekil 5. Alt tiplemede kullanılan algoritmalar (11) FOXP1: Forkhead Box Protein P1, CD10:Cluster of Differantiation 10,Cluster of Designation 10, GCET1:Germinal center expressed transcript 1, MUM1: Multiple Myeloma Oncogene 1, BCL6: B-Cell Lymphoma 6 Protein, ABK: Aktive B Hücre Kökenli, GMK: Germinal Merkez Kökenli. 29
ĠSTATĠSTĠKSEL YÖNTEM Sonuçlar sayı (%) olarak ifade edildi. Değişkenler arasındaki farklılığı incelemek için Ki-kare testi kullanıldı. Değişkenler arasında uyum olup olmadığını incelemek için Kappa test istatistiği kullanıldı, p<0.05 değeri istatistiksel anlamlılık sınır değeri olarak kabul edildi. İstatistiksel analizler Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyoistatistik ve Tıbbi Bilişim Anabilim Dalı nda SPSS 20.0 (lisans no: 10240642) paket programı kullanılarak yapıldı. 30
BULGULAR Çalışmaya 1998-2011 yılları arasında Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı nda tanı alan, retrospektif olarak incelenen 90 DBBHL, 19 FL, 13 MZL, 21 MHL, 9 BL ve 16 KLL olgusu dahil edildi. Olgulara ait yaş ve cinsiyet dağılımı Tablo 5 te verilmiştir. Tablo 5. Olguların yaģ ve cinsiyet dağılımı Tanı Olgu sayısı YaĢ aralığı YaĢ ortalaması E/K oranı DBBHL 90 17-89 62,14 1,19 FL 19 35-78 59 0,9 MZL 13 42-81 62,61 1,16 MHL 21 45-85 66,47 2,5 BL 9 17-79 38,22 1,25 KLL 16 41-77 63,31 3 KLL: Küçük lenfositik lenfoma, MHL: Mantle hücreli lenfoma, DBBHL: Diffüz büyük B hücreli lenfoma, MZL: Marjinal zon lenfoma, FL: Foliküler lenfoma, BL: Burkitt lenfoma, E/K: Erkek/Kadın. DSÖ 2008 lenfoma sınıflamasına göre tanıların yenilenmesi: 1998-2011 yılları arasında tanı alan ve çalışmaya dahil edilen 168 B hücre immunfenotipli HDL olgusuna yeni kesitler alınarak H&E boyaması yapıldı (Şekil 6,7). 2008 yılı öncesi tanı alanlardan gerekli görülen 32 olguya immünohistokimyasal boyamalar (CD3, CD20, CD5, CD23, CD10, CyclinD1, BCL2, BCL6, TdT) uygulandı. 6 adet olguda tanı güncelleştirmesi yapıldı. Tanıları yenilenen olgular Tablo 6 da,çalışmaya dahil edilen tüm olguların listesi Tablo 7a ve 7b de verilmiştir. 31
Foliküler Lenfoma, H&E x100 Foliküler Lenfoma, H&E x 200 Marjinal zon lenfoma H&E x 200 Küçük Lenfositik Lenoma, H&E x200 ġekil 6. Olgulara ait örnek mikroskobik görüntüler. H&E: Hematoksilen ve Eosin boyama. 32
Burkitt lenfoma H&E x100 Burkitt lenfoma H&E x200 Diffüz büyük B hücreli lenfoma, H&E x200 Diffüz büyük B hücreli lenfoma, H&E x200 ġekil 7. Olgulara ait örnek mikroskobik görüntüler. H&E:Hematoksilen ve Eosin boyama. 33
Tablo 6. Tanı güncellemesi yapılan olgular Yıl-Olgu no* Tanı Yeni tanı 2000-44 HDL, B hücreli küçük lenfositik tip (DSÖ-2008) MHL Ġmmunohistokimyasal boyama sonuçları CD20, CD5, cyclind1 pozitif BCL6, CD10, CD23 negatif 2000-43 HDL, küçük çentiksiz B hücreli 2004-45 Küçük lenfositik lenfoma 1999-75 HDL, B hücreli küçük lenfositik tip MHL MHL KLL CD20, cyclind1, CD5 pozitif CD10, CD23 negatif CD20, cyclind1, CD5 pozitif BCL6, CD10 negatif CD5, CD23 pozitif CD10, cyclind1 negatif 1998-77 HDL, diffüz küçük hücreli KLL CD5, CD23, CD79a pozitif CD10, cyclind1 negatif 2006-78 HDL, küçük B hücreli KLL CD5, CD23 pozitif CD10, cyclind1 negatif * Tablo 7b de verilmiş olgu numaralarıdır. HDL: Hodgkin Dışı Lenfoma, MHL: Mantle Hücreli Lenfoma, KLL: Küçük Lenfositik Lösemi, BCL6: B-Cell Lymphoma 6 Protein, CD:Cluster of Differantiation,Cluster of Designation, DSÖ: Dünya Sağlık Örgütü. 34
Tablo 7a. Olgu listesi Olgu No Yaş C Tanı Biyopsi bölgesi CD10 FOXP1* FOXP1.VY/C** BCL6 MUM1 H/C** GCET1 GCET2 LMO2 HANS CHOİ VİSCO-Y. 1 56 k DBBHL Dalak hilusu LN N 3 P/P N N/N N N N ABK ABK ABK 2 62 e DBBHL Supraklaviküler LN P 0 N/N P P/N P P P GMK GMK GMK 3 72 e DBBHL İnguinal LN N 1 N/N P N/N P P P GMK GMK GMK 4 81 e DBBHL Servikal LN N 2 N/N N P/N N P N ABK ABK ABK 5 71 e DBBHL Mide P 1 N/N N N/N P P P GMK GMK GMK 6 54 k DBBHL Mediasten N 3 P/N N P/P N N P ABK ABK ABK 7 61 k DBBHL Servikal LN P 2 N/N N N/N P P P GMK GMK GMK 8 52 e DBBHL İnguinal LN P 1 N/N N P/N P P P GMK GMK GMK 9 68 k DBBHL Aksiller LN N 0 N/N N P/N N N P ABK ABK ABK 10 66 e DBBHL Boyun LN N 3 P/P N N/N N N N ABK ABK ABK 11 71 k DBBHL Tonsil N 3 P/P P P/P P N N ABK ABK ABK 12 69 k DBBHL Boyun LN N 3 P/P P P/P N P P ABK ABK ABK 13 51 e DBBHL Dalak N 3 P/P P P/N N P P ABK ABK ABK 14 68 k DBBHL Uterus N 0 N/N N P/N N N N ABK ABK ABK 15 76 k DBBHL Omentum LN P 0 N/N N N/N P N P GMK GMK GMK 16 63 k DBBHL Aksiller LN N 1 N/N P P/N P P P ABK GMK GMK 17 40 e DBBHL Boyun LN N 2 N/N N P/N N P P ABK ABK ABK 18 72 e DBBHL Submandibuler LN N 0 N/N P N/N N P P GMK GMK GMK 19 43 e DBBHL Nazofarenks N 0 N/N P P/N N P P ABK GMK GMK 20 73 k DBBHL Aksiller LN N 1 N/N P P/N N N P ABK GMK GMK 21 45 e DBBHL İnguinal LN N 2 N/N N P/P N N N ABK ABK ABK 22 58 k DBBHL Uterus N 1 N/N P N/N N N P GMK GMK GMK 23 70 k DBBHL Dalak N 3 P/P N P/P N N N ABK ABK ABK 24 60 k DBBHL Uterus N 3 P/P N P/P N P N ABK ABK ABK 25 59 e DBBHL Aksiller LN N 1 N/N N P/N P P P ABK GMK ABK 35
Tablo 7a. Olgu listesi (devam) Olgu No Yaş C Tanı Biyopsi bölgesi CD10 FOXP1* FOXP1.VY/C** BCL6 MUM1 H/C** GCET1 GCET2 LMO2 HANS CHOİ VİSCO-Y. 26 74 k DBBHL Servikal LN N 0 N/N P P/N P P N ABK GMK GMK 27 69 k DBBHL Uterus N 2 N/N N P/N N N N ABK ABK ABK 28 60 e DBBHL Testis N 2 N/N N P/P N N N ABK ABK ABK 29 76 e DBBHL Farenks P 1 N/N N N/N P N N GMK GMK GMK 30 67 e DBBHL Aksiller LN N 0 N/N P N/N N P P GMK GMK GMK 31 40 k DBBHL Uyluk YD P 2 N/N P N/N P P P GMK GMK GMK 32 75 k DBBHL Kol yumuşak doku N 1 N/N N P/P N P N ABK ABK ABK 33 69 k DBBHL İ. Barsak N 1 N/N N P/P N N N ABK ABK ABK 34 45 e DBBHL Boyun LN N 0 N/N N P/N N N N ABK ABK ABK 35 77 e DBBHL Dil kökü N 2 N/N P N/N P N P GMK GMK GMK 36 78 e DBBHL Servikal LN N 0 P/P P P/N N P P ABK ABK ABK 37 70 k DBBHL Boyun LN P 0 N/N N N/N N P P GMK GMK GMK 38 69 k DBBHL Temporal kitle N 3 P/P N P/P N N N ABK ABK ABK 39 79 k DBBHL Supraklaviküler LN P 0 N/N N P/N N P N GMK GMK GMK 40 21 e DBBHL Batın LN N 1 N/N P P/N N P P ABK GMK GMK 41 79 k DBBHL İnguinal LN N 1 N/N N P/P P N N ABK ABK ABK 42 49 k DBBHL İnguinal LN P 0 N/N N P/N N P P GMK GMK GMK 43 84 e DBBHL Boyun LN N 0 N/N N P/P N N N ABK ABK ABK 44 66 k DBBHL Uyluk YD N 3 P/P N P/N N N N ABK ABK ABK 45 58 k DBBHL Servikal LN P 0 N/N N P/N P P P GMK GMK GMK 46 50 k DBBHL Dalak N 1 N/N N P/P P P N ABK ABK ABK 47 63 e DBBHL Retroperiton N 2 N/N N P/N N P N ABK ABK ABK 48 43 e DBBHL Oksipital kitle N 2 N/N N N/N N P N ABK ABK ABK 49 68 e DBBHL Dalak P 1 N/N P P/P N P P GMK GMK GMK 50 89 e DBBHL Tonsil P 0 N/N N P/P N P P GMK GMK GMK 36
Tablo 7a. Olgu listesi (devam) Olgu No Yaş C Tanı Biyopsi bölgesi CD10 FOXP1* FOXP1.VY/C** BCL6 MUM1 H/C** GCET1 GCET2 LMO2 HANS CHOİ VİSCO-Y. 51 26 k DBBHL Servikal LN P 0 N/N P P/P P N P GMK GMK GMK 52 66 e DBBHL Omentum LN N 2 N/N N P/N N N N ABK ABK ABK 53 69 e DBBHL Aksiller LN P 2 N/N N N/N P N P GMK GMK GMK 54 67 e DBBHL Boyun LN P 0 N/N P P/N P P P GMK GMK GMK 55 74 e DBBHL Servikal LN N 3 P/N N P/P N N N ABK ABK ABK 56 57 e DBBHL Boyun LN P 0 N/N P P/N N N P GMK GMK GMK 57 26 e DBBHL Submandibuler LN P 0 N/N N P/N N N P GMK GMK GMK 58 40 e DBBHL Servikal LN N 2 N/N N P/N N N P ABK ABK ABK 59 21 k DBBHL Mediasten P 1 N/N N N/N N N P GMK GMK GMK 60 55 e DBBHL Submandibuler LN N 3 P/P P P/P N N N ABK ABK ABK 61 56 k DBBHL Servikal LN N 1 N/N P P/P N N P ABK GMK GMK 62 77 e DBBHL Aksiller LN N 2 N/N N P/P P N P ABK ABK ABK 63 76 e DBBHL Boyun LN P 0 N/N P P/N P P P GMK GMK GMK 64 63 k DBBHL İnguinal LN N 0 N/N P N/N N N P GMK GMK GMK 65 53 e DBBHL Dalak P 0 N/N N P/N P P P GMK GMK GMK 66 37 k DBBHL Supraklaviküler LN P 1 N/N P P/N P N P GMK GMK GMK 67 49 e DBBHL Boyun LN N 2 N/N N P/P P N P ABK ABK ABK 68 71 e DBBHL Aksiller LN N 2 N/N N P/P N N N ABK ABK ABK 69 44 k DBBHL Boyun LN N 1 N/N P N/N N P P GMK GMK GMK 70 55 k DBBHL İ. Barsak N 0 N/N N P/N N N N ABK ABK ABK 71 56 e DBBHL Tonsil N 0 N/N P N/N N P P GMK GMK GMK 72 47 e DBBHL Saçlı deri N 2 N/N P N/N N P P GMK GMK GMK 73 68 e DBBHL Nazofarenks P 1 N/N P N/N P P P GMK GMK GMK 74 54 e DBBHL M. Spinalis N 3 P/P N P/P P P P ABK ABK ABK 75 11 k DBBHL İ. Barsak P 1 N/N N P/P P P P GMK ABK GMK 37
Tablo 7a. Olgu listesi (devam) Olgu No Yaş C Tanı Biyopsi bölgesi CD10 FOXP1* FOXP1.VY/C** BCL6 MUM1 H/C** GCET1 GCET2 LMO2 HANS CHOİ VİSCO-Y. 76 62 e DBBHL Tonsil N 2 N/N N N/N P P P ABK GMK ABK 77 60 e DBBHL Aksiller LN N 0 N/N P N/N N P P GMK GMK GMK 78 62 k DBBHL Dalak N 3 P/P N P/N N P P ABK ABK ABK 79 76 k DBBHL İnguinal LN N 0 N/N P N/N P P P GMK GMK GMK 80 42 e DBBHL Aksiller LN P 2 N/N P N/N P N P GMK GMK GMK 81 77 e DBBHL Aksiller LN N 2 N/N N N/N P P P ABK GMK ABK 82 79 k DBBHL Boyun LN N 3 P/N N P/P N N N ABK ABK ABK 83 67 k DBBHL Submandibuler LN P 0 N/N P N/N P P P GMK GMK GMK 84 64 e DBBHL Mide P 3 P/P P N/N P P P GMK GMK GMK 85 78 k DBBHL Meme N 3 P/N N P/P N P N ABK ABK ABK 86 64 e DBBHL Servikal LN N 1 N/N P N/N N P P GMK GMK GMK 87 83 e DBBHL Cilt P 2 N/N N P/N P P N GMK GMK GMK 88 64 k DBBHL Boyun LN N 0 N/N N P/N N N N ABK ABK ABK 89 89 k DBBHL Nazofarenks P 1 N/N P P/P N P P GMK GMK GMK 90 76 e DBBHL İnguinal LN N 1 N/N P P/N P P P ABK GMK GMK *%0-10 arası yaygınlıkta boyanma 0, %10-30 arası 1, %30-50 arası 2, %50 ve üzeri 3 olarak skorlanmış, 0 ve 1 skor negatif, 2 ve 3 pozitif olarak değerlendirilmiştir.**algoritmalara göre pozitiflik için farklı eşik değerleri mevcuttur. P:pozitif, N: negatif, H: Hans algoritmasına göre, C: Choi algoritmasına göre, VY: Visco-Young algoritmasına göre, LN: Lenf nodu, e: Erkek, k: Kadın, C: Cinsiyet, ABK: Aktive B hücre kökenli, GMK: Germinal merkez kökenli. 38
Tablo 7b. Olgu listesi Olgu no Yaş C Tanı Biyopsi bölgesi FOXP1* 1 57 k FL Batın LAP 0 2 60 e FL Servikal LN 3 3 60 e FL Aksiller LN 0 4 64 k FL Aksiller LN 2 5 63 e FL İnguinal LN 0 6 65 k FL Juguler LN 1 7 55 e FL İnguinal LN 2 8 56 e FL Aksiller LN 0 9 78 e FL Tonsil 2 10 62 k FL Aksiller LN 3 11 35 e FL Servikal LN 3 12 53 k FL İnguinal LN 1 13 67 e FL Aksiller LN 0 14 62 k FL Aksiller LN 2 15 66 k FL İnguinal LN 3 16 38 e FL Servikal LN 0 17 58 k FL Juguler LN 3 18 46 k FL İnguinal LN 0 19 76 k FL Servikal LN 2 20 17 k BL Uyluk kas içi kitle 3 21 39 k BL Mide 3 22 45 k BL Boyun kitle 3 23 17 k BL Beyin 0 24 23 e BL İ.barsak 1 25 41 e BL Juguler LN 1 26 79 e BL Mide 1 27 32 e BL Aksiller LN 3 28 51 e BL Batın kitle 3 29 65 k MHL Tonsil 1 30 63 e MHL İnguinal LN 3 31 74 k MHL Servikal LN 2 32 76 e MHL İnguinal LN 3 33 67 e MHL İnguinal LN 3 34 73 e MHL Tonsil 3 35 66 e MHL Tonsil 2 36 71 e MHL Tonsil 0 37 82 k MHL Servikal LN 2 38 71 e MHL Aksiller LN 1 39 45 e MHL Dalak 3 40 60 k MHL Servikal LN 3 39
Tablo 7b. Olgu listesi (devam) Olgu no Yaş C Tanı Biyopsi bölgesi FOXP1* 41 56 e MHL Servikal LN 3 42 81 e MHL Paratrakeal LN 1 43 58 k MHL Servikal LN 2 44 64 e MHL Servikal LN 2 45 73 e MHL Aksiller LN 1 46 45 e MHL Tonsil 3 47 60 e MHL Aksiller LN 2 48 85 e MHL Akciğer 1 49 61 k MHL Servikal LN 2 50 45 e MZL Dalak 0 51 51 e MZL Submandibular gland 2 52 60 k MZL Dalak 1 53 81 k MZL İ.barsak 0 54 54 e MZL Dalak 1 55 66 e MZL Dalak 3 56 71 k MZL Dalak LN 2 57 74 k MZL Servikal LN 3 58 64 k MZL Servikal LN 1 59 81 k MZL Servikal LN 3 60 42 e MZL Submandibular gland 2 61 79 e MZL Mide 0 62 46 e MZL Parotis 0 63 54 e KLL Servikal LN 1 64 55 e KLL Nazofarenks 3 65 53 e KLL Servikal LN 3 66 65 k KLL Aksiller LN 0 67 74 e KLL Aksiller LN 0 68 76 k KLL Servikal LN 0 69 73 e KLL Servikal LN 2 70 71 e KLL Servikal LN 0 71 62 e KLL Servikal LN 3 72 41 e KLL Servikal LN 3 73 56 k KLL Supraklaviküler LN 2 74 74 e KLL Servikal LN 2 75 49 e KLL Servikal LN 3 76 63 k KLL Aksiller LN 1 77 77 e KLL Aksiller LN 0 78 70 e KLL Servikal LN 2 *%0-10 arası yaygınlıkta boyanma 0, %10-30 arası 1, %30-50 arası 2, %50 ve üzeri 3 olarak skorlanmış, 0 ve 1 skor negatif, 2 ve 3 pozitif olarak değerlendirilmiştir.**algoritmalara göre pozitiflik için farklı eşik değerleri mevcuttur. FL: Folliküler lenfoma, BL: Burkitt lenfoma, MHL: Mantle hücreli lenfoma, MZL: Marjinal zon lenfoma, KLL: Küçük lenfositik lenfoma, LN: Lenf nodu, e: Erkek, k: Kadın, C: Cinsiyet. 40
ĠMMÜNOHĠSTOKĠMYASAL BULGULAR Tüm olgulardaki FOXP1 ekspresyonu: Orta ve kuvvetli derecede nükleer boyanma anlamlı kabul edildi. Bu olgular; neoplastik hücrelerin boyanma yüzdesine göre %< 10 boyanma 0, % 10-30 arası 1, % 31-50 arası 2, % >50 boyanma 3 olarak skorlandı (Şekil 8). Skor 2 ve 3 olgular anlamlı FOXP1 ekspresyonu açısından pozitif kabul edildi (14). FOXP1 boyama sonuçları Tablo 8 de verilmiştir. Tablo 8.Tüm olgulardaki FOXP1 ekspresyonu Olgu sayısı Skor 0 Skor 1 Skor 2 Skor 3 Pozitif olgu Pozitiflik yüzdesi FL 19 7 2 5 5 10 %52 MHL 21 1 5 7 8 15 %71 MZL 13 4 3 3 3 6 %46 KLL 16 5 2 4 5 9 %56 BL 9 1 3 0 5 5 %55 DBBHL 90 29 23 20 18 38 %42 FL: Foliküler lenfoma, MHL: Mantle hücreli lenfoma, MZL: Marjinal zon lenfoma, KLL: Küçük lenfositik lenfoma, BL: Burkitt lenfoma, DBBHL: Diffüz büyük B hücreli lenfoma İstatistiksel olarak DBBHL, FL, MHL, MZL, KLL ve BL de FOXP1 ekspresyonu açısından anlamlı farklılık bulunmadı ( p>0,005). 41
Foliküler Lenfoma, FOXP1 x100 Foliküler Lenfoma, FOXP1 x200 Marjinal zon lenfoma, FOXP1 x200 Mantle hücreli lenfoma, FOXP1 x200 Mantle hücreli lenfoma, FOXP1 x100 ġekil 8. Foliküler lenfoma, Marjinal zon lenfoma ve Mantle hücreli lenfomada immünohistokimyasal olarak FOXP1 ekspresyonu. 42
ALGORĠTMA SONUÇLARI - ANTĠKOR ĠLĠġKĠSĠ Antikorların kullanılmadığı diğer algoritmalar ile uyumu ve immünreaktivite anlamlılığı da istatistiksel olarak değerlendirilmiştir. Diffüz büyük B hücreli lenfomada algoritmalara göre FOXP1 ekspresyonu: Orta dereceli ve kuvvetli nükleer pozitiflik anlamlı kabul edildi (Şekil 9). Neoplastik hücrelerde Visco-Young algoritması için %60, Choi algoritması için %80 ve üzeri yaygınlıkta boyanma pozitif olarak değerlendirildi (10,11). Algoritmalara göre FOXP1 boyanma sonuçları Tablo 9 da verilmiştir. Tablo 9. Choi ve Visco-Young algoritmasında FOXP1 ekspresyonu Pozitif Negatif Toplam *CHOI GMK (n:50) 1 49 90 ABK (n:40) 13 27 *VISCO- YOUNG GMK (n:48) 1 47 90 ABK (n:42) 17 25 *Choi algoritmasında FOXP1 pozitifliği için yaygınlık eşik değeri %80 dir. Visco-Young algoritmasında FOXP1 pozitifliği için yaygınlık eşik değeri %60 tır. GMK: Germinal merkez kökenli, ABK: Aktive B hücre kökenli. İstatistiksel olarak FOXP1 pozitif yaygınlık eşik değeri %60 alındığında Hans, Choi ve Visco-Young algoritmalarının tümünde GMK ve ABK arasında FOXP1 ekspresyon pozitifliği ve negatifliği açısından anlamlı fark bulundu (p<0,001). FOXP1 pozitifliği ile algoritmalarda ABK tanısı arasındaki uyum; Hans algoritması ile önemsiz uyum (κ=0,304), Choi algoritması ile orta dercede (κ=0,429), Visco-Young algoritması ile önemsiz uyum (κ=0,398) bulundu. Pozitif yaygınlık eşik değeri %80 alındığında Hans, Choi ve Visco-Young algoritmalarının tümünde GMK ve ABK arasında FOXP1 pozitifliği ve negatifliği açısından anlamlı fark bulundu (Hans algoritması için; p=0,002, Choi ve Visco-Young algoritması için; p<0,001). FOXP1 pozitifliği ile algoritmalarda ABK tanısı arasındaki uyum; Hans algoritması ile önemsiz uyum (κ=0,225), Choi algoritması ile önemsiz uyum (κ=0,326), Visco-Young algoritması ile önemsiz uyum (κ=0,301) bulundu. 43
Diffüz büyük B hücreli lenfoma, FOXP1x100 Diffüz büyük B hücreli lenfoma, FOXP1 x200 ġekil 9.Diffüz büyük B hücreli lenfomada FOXP1 ekspresyonu. Diffüz büyük B hücreli lenfomada algoritmalara göre CD10 ekspresyonu: Her 3 algoritmadada kullanılan anti-cd10 antikoru için membranöz ve sitoplazmik+membranöz boyanmalar pozitif kabul edildi (Şekil 10). Üç algoritma için boyanma yaygınlık eşik değeri %30 alındı (9-11). Algoritmalara göre CD10 boyanma sonuçları Tablo 10 da verilmiştir. Tablo 10. Algoritmalarda CD10 ekspresyonu Pozitif Negatif Toplam HANS GMK (n:41) 29 12 90 ABK (n:49) 0 49 CHOI GMK (n:50) 28 22 90 ABK (n:40) 1 39 VISCO- YOUNG GMK (n:48) 29 19 90 ABK (n:42) 0 42 GMK: Germinal merkez kökenli, ABK: Aktive B hücre kökenli. İstatistiksel olarak Hans, Choi ve Visco-Young algoritmalarının tümünde GMK ve ABK arasında CD10 ekspresyon pozitifliği ve negatifliği açısından anlamlı fark bulundu (p<0.001). CD10 ekspresyon pozitifliği ile algoritmalarda GMK tanısı arasındaki uyum; Hans algoritması ile güçlü (κ=0.680), Choi algoritması ile orta dercede (κ=0.550), Visco-Young algoritması ile güçlü (κ=0.616) bulundu. 44
Diffüz büyük B hücreli lenfoma, CD10 x100 Diffüz büyük B hücreli lenfoma, CD10 x200 ġekil 10.Diffüz büyük B hücreli lenfomada CD10 ekspresyonu. Diffüz büyük B hücreli lenfomada algoritmalara göre BCL6 ekspresyonu: Her 3 algoritmadada kullanılan anti-bcl6 antikoru için nükleer boyanmalar pozitif kabul edildi (Şekil 11). 3 algoritma için boyanma yaygınlık eşik değeri %30 alındı (9-11). Algoritmalara göre BCL6 immünekspresyon sonuçları Tablo 11 de verilmiştir. Tablo 11. Algoritmalarda BCL6 ekspresyonu Pozitif Negatif Toplam HANS GMK (n:41) 24 17 90 ABK (n:49) 12 37 CHOI GMK (n:50) 32 18 90 ABK (n:40) 5 35 VISCO- YOUNG GMK (n:48) 33 15 90 ABK (n:42) 5 37 GMK: Germinal merkez kökenli, ABK: Aktive B hücre kökenli İstatistiksel olarak Hans, Choi ve Visco-Young algoritmalarının tümünde GMK ve ABK arasında BCL6 immunreaktivite pozitifliği ve negatifliği açısından anlamlı fark bulundu (p<0.001). BCL6 ekspresyonu ile algoritmalarda GMK tanısı arasındaki uyum; Hans algoritması ile önemsiz uyum (κ=0.356), Choi algoritması ile orta dercede (κ=0.519), Visco- Young algoritması ile orta derecede (κ=0.552) bulundu. 45
ġekil 11. Diffüz büyük B hücreli lenfomada BCL6 ekspresyonu (x200). Diffüz büyük B hücreli lenfomada algoritmalara göre MUM1 ekspresyonu: Orta ve kuvvetli nükleer pozitiflik anlamlı kabul edildi (Şekil 12). Neoplastik hücrelerde Hans algoritması için %30, Choi algoritması için %80 ve üzeri yaygınlıkta MUM1 ekspresyonu pozitif olarak değerlendirildi (10,11). Algoritmalara göre MUM1 immünekspresyon sonuçları Tablo 12 de verilmiştir. Tablo 12. Algoritmalarda MUM1 ekspresyonu Pozitif Negatif Toplam *HANS GMK (n:41) 17 24 90 ABK (n:49) 44 5 *CHOI GMK (n:50) 5 45 90 ABK (n:40) 22 18 *Hans algoritmasında MUM1 pozitifliği için yaygınlık eşik değeri >%30 dur. Choi algoritmasında MUM1 pozitifliği için yaygınlık eşik değeri >%80 dir. GMK: Germinal merkez kökenli, ABK: Aktive B hücre kökenli. İstatistiksel olarak MUM1 pozitifliği için yaygınlık eşik değeri %30 alındığında Hans, Choi ve Visco-Young algoritmalarının tümünde GMK ve ABK arasında MUM1 immunekspresyon pozitifliği ve negatifliği açısından anlamlı fark bulundu (p<0.001). Anti MUM1 antikor pozitifliği ile algoritmalarda ABK tanısı arasındaki uyum; Hans algoritması ile orta dereccede (κ=0.473), Choi algoritması ile orta dercede (κ=0,400), Visco-Young algoritması ile önemsiz uyum (κ=0.348) bulundu. 46
Pozitif yaygınlık eşik değeri %80 alındığında Hans, Choi ve Visco-Young algoritmalarının tümünde GMK ve ABK arasında MUM1 pozitifliği ve negatifliği açısından anlamlı fark bulundu (p<0.001). MUM1 immünreaktivitesi ile algoritmalarda ABK tanısı arasındaki uyum; Hans algoritması ile önemsiz uyum (κ=0.313), Choi algoritması ile orta derecede (κ=0.465), Visco-Young algoritması ile önemsiz uyum (κ=0.384) bulundu. ġekil 12.Diffüz büyük B hücreli lenfomada MUM1 ekspresyonu (x200). Diffüz büyük B hücreli lenfomada algoritmalara göre GCET1 ekspresyonu: Sitoplazmik ve membranöz boyanma pozitif kabul edildi (Şekil 13). Neoplastik hücrelerde Choi algoritması için %80 ve üzeri yaygınlıkta boyanma pozitif olarak değerlendirildi (10,11). Choi algoritmasına göre immünekspresyon sonuçları Tablo 13 de verilmiştir. Tablo 13. Choi algoritmasında GCET1 ekspresyonu Pozitif Negatif Toplam CHOI GMK (n:50) 27 23 90 ABK (n:40) 7 33 GMK: Germinal merkez kökenli, ABK: Aktive B hücre kökenli İstatistiksel olarak Hans, Choi ve Visco-Young algoritmalarının tümünde GMK ve ABK arasında GCET1 pozitifliği ve negatifliği açısından anlamlı fark bulundu (Hans algoritması için; p=0.002 - Choi ve Visco-Young algoritması için; p<0.001). GCET1 immünreaktivitesi ile algoritmalarda GMK tanısı arasındaki uyum; Hans algoritması ile 47
önemsiz uyum (κ=0.308), Choi algoritması ile önemsiz uyum (κ=0.390), Visco-Young algoritması ile önemsiz uyum (κ=0.331) bulundu. Diffüz büyük B hücreli lenfoma, GCET1 x100 Diffüz büyük B hücreli lenfoma, GCET1 x400 ġekil 13.Diffüz büyük B hücreli lenfomada GCET1 ekspresyonu. Diffüz büyük B hücreli lenfomada algoritmalara göre GCET2 ekspresyonu: Algoritmalarda kullanılmayan anti-gcet2 antikoru için sitoplazmik boyanma anlamlı kabul edildi (Şekil 14). Ekspresyon pozitifliği açısından boyanma yaygınlığının eşik değeri %30 olarak alındı (76).GCET2 boyama sonuçlarının algoritma sonuçları ile karşılaştırılması Tablo 14 te verilmiştir. Tablo 14. GCET2 boyama sonuçlarının algoritma sonuçları ile karģılaģtırılması Pozitif Negatif Toplam HANS GMK (n:41) 30 11 90 ABK (n:49) 21 28 CHOI GMK (n:50) 36 14 90 ABK (n:40) 13 27 VISCO- YOUNG GMK (n:48) 34 14 90 ABK (n:42) 16 26 GMK: Germinal merkez kökenli, ABK: Aktive B hücre kökenli 48
İstatistiksel olarak Hans algoritmasında GMK ve ABK arasında GCET2 ekspresyon pozitifliği ve negatifliği açısından anlamlı fark bulunmadı (p=0.008). Choi ve Visco-Young algoritmalarının her ikisinde GMK ve ABK arasında GCET2 pozitifliği ve negatifliği açısından anlamlı fark bulundu (Choi algoritması için: p<0.001 Visco-Young algoritması için: p=0.02). GCET2 pozitifliği ile algoritmalarda GMK tanısı arasındaki uyum; Hans algoritması ile önemsiz uyum (κ=0.279), Choi algoritması ile önemsiz uyum (κ=0.361), Visco-Young algoritması ile önemsiz uyum (κ=0.324) bulundu. Diffüz büyük B hücreli lenfoma, GCET2 x200 Diffüz büyük B hücreli lenfoma, GCET2 x400 ġekil 14.Diffüz büyük B hücreli lenfomada GCET2 ekspresyonu. Diffüz büyük B hücreli lenfomada algoritmalara göre LMO2 ekspresyonu: Algoritmalarda kullanılmayan anti-lmo2 antikoru için nükleer boyanma anlamlı kabul edildi (Şekil 15). Ekspresyon pozitifliği açısından boyanma yaygınlığının eşik değeri %30 olarak alındı (13).LMO2 immünekspresyon sonuçlarının algoritma sonuçları ile karşılaştırılması Tablo 15 te verilmiştir. 49
Tablo 15. LMO2 boyama sonuçlarının algoritma sonuçları ile karģılaģtırılması Pozitif Negatif Toplam HANS GMK (n:41) 38 3 90 ABK (n:49) 20 29 CHOI GMK (n:50) 46 4 90 ABK (n:40) 12 28 VISCO- YOUNG GMK (n:48) 44 4 90 ABK (n:42) 14 28 GMK: Germinal merkez kökenli, ABK: Aktive B hücre kökenli. İstatistiksel olarak Hans, Choi ve Visco-Young algoritmalarının tümünde GMK ve ABK arasında LMO2 ekspresyon pozitifliği ve negatifliği açısından anlamlı fark bulundu (p<0.001). LMO2 pozitifliği ile algoritmalarda GMK tanısı arasındaki uyum; Hans algoritması ile orta derecede (κ=0.528), Choi algoritması ile orta derecede (κ=0.593), Visco- Young algoritması ile orta derecede uyum (κ=0.570) bulundu. Diffüz büyük B hücreli lenfoma, LMO2 x100 Diffüz büyük B hücreli lenfoma, LMO2 x200 ġekil 15.Diffüz büyük B hücreli lenfomada LMO2 ekspresyonu. LMO2 ve GCET2 ile diğer antikorlar arası karģılaģtırma: Bir germinal merkez belirteci olan GCET2 ile algoritmalarda kullanılan germinal merkez belirteçleri olan CD10, BCL6 ve GCET1 arasında istatistiksel olarak anlamlı ilişki bulunmamıştır (p>0.005). Diğer germinal merkez belirteci olan LMO2 ile CD10, BCL6 ve 50