KEMİĞİN DEV HÜCRELİ LEZYONLARINDA HÜCRE SİKLUS PROTEİNLERİNİN (SİKLİN D1, SİKLİN D3, P21, P27) VE Ki-67 NİN DEĞERLENDİRİLMESİ

T.C. ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ PATOLOJİ ANABİLİM DALI KEMİĞİN DEV HÜCRELİ LEZYONLARINDA HÜCRE SİKLUS PROTEİNLERİNİN (SİKLİN D1, SİKLİN D3, P21, P27) VE Ki-67 NİN DEĞERLENDİRİLMESİ Dr. AYŞE GÖKDEMİR UZMANLIK TEZİ TEZ DANIŞMANI Prof. Dr. GÜLFİLİZ GÖNLÜŞEN ADANA 2006

T.C. ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ PATOLOJİ ANABİLİM DALI KEMİĞİN DEV HÜCRELİ LEZYONLARINDA HÜCRE SİKLUS PROTEİNLERİNİN (SİKLİN D1, SİKLİN D3, P21, P27) VE Ki-67 NİN DEĞERLENDİRİLMESİ Dr. AYŞE GÖKDEMİR UZMANLIK TEZİ TEZ DANIŞMANI Prof. Dr. GÜLFİLİZ GÖNLÜŞEN ADANA 2006 Bu çalışma Çukurova Üniversitesi Araştırma Fonu Tarafından Desteklenmiştir. ( TF2004LTP23 )

TEŞEKKÜR Tez konumun belirlenmesinde ve bu çalışmanın her aşamasında bilgi ve desteğini esirgemeyen sayın hocam Prof. Dr. Gülfiliz Gönlüşen e, istatistik aşmasındaki emeği ve sabrı için Doç. Dr. Gülşah Seydaoğlu ya, titiz ve özverili çalışmaları için teknisyen Gülafer Korkut a teşekkür ederim.

İÇİNDEKİLER İÇİNDEKİLER... i TABLO LİSTESİ... ii ŞEKİL LİSTESİ... iii KISALTMA LİSTESİ...iv ÖZET VE ANAHTAR SÖZCÜKLER...v ABSTRACT KEYWORDS... vi 1. GİRİŞ...1 2. GENEL BİLGİLER...2 2.1. Kemiğin yapısı ve fonksiyonları...2 2.2. Kemiğin dev hücre içeren tümörleri ve lezyonları...8 2.2.1. Dev hücreli kemik tümörü...9 2.2.2. Anevrizmal kemik kisti...14 2.2.3. Dev hücreli reperatif granülom...16 2.2.4. Tendon kılıfının dev hücreli tümörü...18 2.3. Hücre siklusu...21 2.3.1. Siklinler ve siklin bağımlı kinazlar...22 2.3.2. Siklin bağımlı kinaz inhibitörleri...25 2.3.3. Ki-67...27 3. GEREÇ VE YÖNTEM...28 3.1. Strept avidin-biotin boyama yöntemi...28 3.2. Değerlendirme...30 4. BULGULAR...31 5. TARTIŞMA...40 6. SONUÇLAR...47 7. KAYNAKLAR...48 8. ÖZGEÇMİŞ...54 i

TABLO LİSTESİ Tablo 1: Tüm olguların cinsiyet, yaş ve lokalizasyonlara göre dağılımı... 32 Tablo 2: DHKT olgularında DH ve MN hücrelerdeki pozitif hücre sayıları (%).... 33 Tablo 3: DHRG olgularında DH ve MN hücrelerdeki pozitif boyanan hücre sayıları (%).... 33 Tablo 4: AKK olgularında DH ve MN hücrelerdeki pozitif boyanan hücre sayıları (%)... 33 Tablo 5: TKDHT olgularında DH ve MN hücrelerdeki pozitif boyanan hücre sayıları (%)... 33 Tablo 6: Tüm olgulardaki MN hücrelerin boyanma yüzdeleri... 36 Tablo 7: Tüm olgulardaki DH lerin boyanma yüzdeleri... 37 ii

ŞEKİL LİSTESİ Şekil no: Sayfa no: Şekil 1: İskeleti oluşturan kemiklerin bölgesel şematik görünümü... 2 Şekil 2: Tübüler kemikte zonların şematik görünümü... 3 Şekil 3: Tübüler kemik bölgeleri ve zonları... 3 Şekil 4: Kompakt kemikte osteon ve havers sistemlerinin şematik görünümü... 5 Şekil 5: Kemiği oluşturan hücrelerin histolojik görünümü (HE)... 6 Şekil 6: İntramembranöz ossifikasyon (HE)... 7 Şekil 7: Enkondral ossifikasyon (HE)...7 Şekil 8: DHKT nin en sık görüldüğü yaş grubu ve lokalizasyon... 9 Şekil 9: Direk grafide epifiz ve metafiz yerleşimli DHKT... 10 Şekil 10: Radius distalinde kemik kontürünü genişleten iyi sınırlı eksantrik DHKT kitlesi... 11 Şekil 11: DHKT de çok sayıda osteoklast tipi dev hücreler ve MN hücreler (HE)... 11 Şekil 12: Klavikulada kanla dolu kistik boşluklar ile karakterize AKK... 14 Şekil 13: AKK de kistik boşluklar çevresinde DH, lenfosit infiltrasyonu izlenenin fibröz çeperi yapı (HE)...15 Şekil 14: DHRG de direk grafide iyi sınırlı litik lezyon.... 17 Şekil 15: DHRG de çok sayıda DH ler (HE)... 17 Şekil 16: TKDHT de DH ler, köpük hücreleri, lenfositler (HE).... 18 Şekil 17: TKDHT de DH ler ve köpük hücreleri (HE)... 19 Şekil 18: Hücre siklusunun şematik görünümü... 21 Şekil 19: Siklinler ve CDK ların hücre siklusundaki fonksiyonlarının şematik görünümü... 23 Şekil 20: Hücre siklusunda G1-S geçişi... 24 Şekil 21: Hücre siklusunda siklinler, CDK lar ve CDKI ların fonksiyonlarının şematik görünümü... 26 Şekil 22: AKK de MN hücre ve DH lerde siklin D1 pozitifliği... 34 Şekil 23: TKDHT de siklind1 ile DH lerde pozitif, MN hücrelerde negatif, boyanma.... 34 Şekil 24: DHKT de MN hücrelerde ve DH lerde Siklin D3 pozitifliği... 34 Şekil 25: DHRG da MN hücre ve DH lerde P21 pozitifliği... 34 Şekil 26: DHKT de MN hücre ve DH lerde p27 pozitifliği... 35 Şekil 27: TKDHT de MN hücre ve DH lerde p27 pozitifliği... 35 Şekil 28: DHKT de Ki-67 ile MN hücrelerde pozitif, DH lerde negatif boyanma... 36 Şekil 29: TKDHT de Ki-67 ile MN hücrelerde pozitif, DH lerde negatif boyanma... 36 Şekil 30: Olguların MN hücrelerinin boyanma yüzdeleri... 37 Şekil 31: Olguların DH lerindeki boyanma yüzdeleri... 38 iii

KISALTMA LİSTESİ DHKT AKK DHRG TKDHT YDDHT DH MN CDK CDKI RANK RANKL HE : Dev Hücreli Kemik Tümörü : Anevrizmal Kemik Kisti : Dev Hücreli Reperatif Granülom : Tendon Kılıfının Dev Hücreli Tümörü : Yumuşak Dokunun Dev Hücreli Tümörü : Dev Hücre : Mononükleer : Siklin Bağımlı Kinaz : Siklin Bağımlı Kinaz İnhibitörü : Receptor Activator for Nuclear Factor Kappa B : Receptor Activator for Nuclear Factor Kappa B Ligand : Hematoksilen Eozin iv

ÖZET Kemiğin Dev Hücreli Lezyonlarında Hücre Siklus Proteinlerinin (Siklin D1, Siklin D3, P21, P27) ve Ki-67 nin Değerlendirilmesi Hücre siklus proteinleri, siklusun fazları arasındaki geçişlerde önemli fonksiyona sahiptir. Bu proteinlerdeki değişiklikler, çeşitli insan tümörlerinin patogenezlerinde rol almaktadır. Çalışmamızda, kemiğin dev hücreli tümörü ile dev hücre içeren benign lezyonlarından olan anevrizmal kemik kisti, dev hücreli reperatif granülom ve benzer morfolojiye sahip tendon kılıfının dev hücreli tümöründe hücre siklus proteinleri ile hücre proliferasyonu araştırıldı ve birbirleri ile karşılaştırıldı. Çalışma grubuna arşivimizden 70 olgu (18 dev hücreli kemik tümörü, 15 anevrizmal kemik kisti, 21 dev hücreli reperatif granülom ve 16 tendon kılıfının dev hücreli tümörü) dahil edildi. Olgulara immünohistokimyasal yöntemle, hücre siklus proteinlerinden siklind1, siklind3, p21, p27 ve proliferasyon belirleyicisi olarak Ki-67 uygulandı. SiklinD3, p21 ve p27 boyanması tüm olgular için benzerdi. SiklinD1, siklind3, p21 ve p27 ile dev hücrelerde mononükleer hücrelerden daha yüksek oranda pozitiflik elde edildi ve bu sonuç bize bu proteinlerin dev hücre diferansiyasyonunda rol aldığını düşündürdü. SiklinD1, tendon kılıfının dev hücreli tümörü olgularının tamamında mononükleer hücrelerde negatif bulundu. Bu nedenle bu lezyondaki mononükleer hücrelerin kemik lezyonlarındaki mononükleer hücrelerden farklı immünofenotipik özellikte olduğu düşünüldü. Ki-67 boyanması olguların tamamında oldukça karakteristik olup yalnızca mononükleer hücrelere sınırlı idi. Olguların hiçbirinde dev hücrelerde Ki-67 pozitifliği saptanmaması dev hücrelerin proliferatif aktivitelerinin olmadığını destekledi. Bu bulgularla her dört lezyonda da proliferatif aktiviteden mononükleer hücrelerin sorumlu olduğu ve dev hücre oluşum mekanizmalarının tüm gruplarda benzer olduğu görüşüne ulaşıldı. Sonuç olarak mononükleer hücreler proliferatif aktiviteden sorumludur ve hücre siklus proteinleri dev hücre oluşumu ile ilişkilidir. Dev hücrelerin osteolitik aktivitesinden dolayı siklus proteinlerini hedef alan çalışmalar; cerrahi dışı tedavi olanağı sağlayabilir. Anahtar sözcükler: Dev hücre, hücre siklus proteinleri, kemik, Ki-67. v

ABSTRACT The Evaluation of Cell Cycle Proteins (CyclinD1, CyclinD3, P21, P27) and Ki-67 in Giant Cell Lesions of Bone The cell cycle proteins have a crucial function in the transition between cycle phases. The alterations of these proteins have an important role in pathogenesis of several human tumors. In our study; cell cycle proteins (cyclind1, cyclind3, p21, p27) and cell proliferation have been investigated in giant cell tumor of bone, aneurysmal bone cyst, giant cell reperative granuloma and giant cell tumor of tendon sheaths that has similar morphology. Besides, the findings were compared within the all groups. Seventy cases (18 giant cell tumor of bone, 15 aneurysmal bone cyst, 21 giant cell reperative granuloma, 16 giant cell tumor of tendon sheaths) have been retrieved from the files. CyclinD1, cyclind3, p21, p27 as cell cycle proteins and Ki-67 as a proliferation marker were applied by immunohistochemical method in all cases. CyclinD3, p21 and p27 staining were similar for all cases. The numbers of positive staining with CyclinD1, cyclind3, p21 and p27 in giant cells were found higher than mononuclear cells indicating that these cycle proteins may have a key role in giant cell differentiation. CyclinD1 revealed negative staining in mononuclear cells of all giant cell tumor of tendon sheaths. We thought that these mononuclear cells in giant cell tumor of tendon sheaths may have different immunophenotypical features than mononuclear cells of the other bone lesions. Ki-67 staining was restricted in mononuclear cells of all cases which was a very characteristic feature. None of the cases showed positive Ki-67 staining in giant cells. This finding supported that giant cells do not have any proliferative activity. In conclusion, mononuclear cells are responsible for the proliferative activity and the cell cycle proteins are associated with the giant cell formation. Because of the osteolytic activity of giant cells, studies targeting these cycle proteins can provide non-surgical treatment opportunity. Key words: Bone, cell cycle proteins, giant cell, Ki-67. vi

1. GİRİŞ Kemiğin dev hücreli lezyonları, gerek davranışları gerekse ayırıcı tanı problemleri açısından bir grup klinikopatolojik antitedir. Bazıları gerçek neoplazm olsa da diğerleri reaktif veya reperatif lezyonlardır. 1 Bunlar sıklıkla lokal agressif seyirlidirler ve kemikte litik lezyonlar oluşturup patolojik kırıklara sebep olabilirler. Bu lezyonların total eksizyonu yerleşim yerleri nedeni ile fonksiyonel kayıplara neden olabileceğinden genellikle mümkün olmamaktadır. Bu nedenle küretajla tedavi edilirler ve sık rekürrens gösterirler. 2 Son yıllarda yapılan birçok çalışmada neoplazilerin çoğuna, hücre siklus mekanizmasındaki bir veya birkaç seviyedeki kopukluğun neden olduğu görüşüne varılmıştır. 3 Bu görüşten yola çıkarak dev hücreli kemik tümörlerinde (DHKT) ve kemiğin dev hücre (DH) içeren lezyonlarında da hücre siklus protenlerinin rolü araştırılmıştır. 4-7 Kemikteki lizisten DH lerin sorumlu olduğu düşünülmektedir. Bu yüzden DH oluşum mekanizmasını, dolayısı ile osteolizisin patogenezini açıklamayı ve bu mekanizmaya yönelik cerrahi dışı tedavi stratejileri geliştirmeyi amaçlayan çalışmalar artmaktadır. 2 Çalışmamızda kemikte litik lezyonlarla seyretmeleri ve osteoklast tipi DH içermeleri ve sık rekürrens göstemeleri gibi ortak özelliğe sahip olan DHKT, dev hücreli reperatif granülom (DHRG), anevrizmal kemik kisti (AKK) ve tendon kılıfının dev hücreli tümörü (TKDHT) olgularını inceledik. Bu lezyonlarda hücre siklus proteinlerinin rolünü araştırmayı ve sonuçları birbirleri ile karşılaştırarak bu lezyonlar arasındaki farkları belirlemeyi hedefledik. DH lerin, dolayısı ile osteolizisin oluşum mekanizmasının aydınlanması, bu gün için tek tedavi seçeneği cerrahi olan ve total eksizyonları yerleşim yerleri nedeniyle genellikle mümkün olmayan bu lezyonlarda cerrahiye alternatif veya ilave medikal tedavilerin geliştirilmesine ışık tutacaktır. 1

2. GENEL BİLGİLER 2.1. Kemiğin Yapısı ve Fonksiyonları Kemikler, mekanik, koruyucu ve metabolik fonksiyonları olan özelleşmiş dokulardır. Mekanik olarak vücudun yapısal bütünlüğünü ve hareketini sağlar. Koruyucu fonksiyonu, akciğer, kalp, santral sinir sistemi gibi birçok vital organ ve kemik iliği üzerinedir. Metabolik olarak ise kemikler başta kalsiyum ve fosfor olmak üzere çeşiti iyonların deposudur. 1 İskelete şeklini veren, santral aksistir (kafatası, vertebral kolon ve sakrum) ve aksiyal iskelet olarak adlandırılır. Ekstremite kemikleri, skapula ve pelvis dahil, appendiküler iskeleti oluşturur. Akral iskelet ise el ve ayak kemiklerinden oluşur (Şekil 1). Aksiyal Gövde Appendiküler Aksiyal Akral Akral Şekil 1: İskeleti oluşturan kemiklerin bölgesel şematik görünümü 1. 2

Gros görünümlerine göre kemikler temelde yassı ve tübüler olmak üzere iki ana gruba ayrılırlar. Genel olarak gövde ve kraniofasiyal kemikler (kafatası, skapula, klavikula, pelvis ve sternum) yassı kemik sınıfındadır. Ekstremite kemikleri ve kostalar tübülerdir. Tübüler kemikler de uzun (ör: femur, tibia, humerus) ve kısa (ör: falankslar, metatarslar, metakarplar) olmak üzere ikiye ayrılırlar. Karpal ve tarsal kemikler ve patella epifisioid olarak adlandırılır, gelişimi ve tümör gelişimi açısından uzun kemiklerin epifizinin analoğudur. Tübüler kemiklerin bölgeleri ve zonları: Epifiz: İmmatür kemikteki büyüme plağı ve kemik bitimi arasındaki, matür kemikte ise büyüme plağı skarı ve kemik bitimi arasındaki bölgedir. Metafiz: Kemiğin büyüme plağına bitişik bölgesidir Diafiz veya şaft: Metafizler arasındaki bölgedir. Fizis: Kemiğin büyüme plağı ile ilgili bölgesidir (Şekil 2,3). 1 Fizis Radyolojik (diagnostik) metafiz Epifiz Metafiz (Anatomik) Epifiz Büyüme plağı Metafiz Diafiz Diafiz Şekil 2: Tübüler kemikte zonların şematik görünümü. 1 Şekil 3: Tübüler kemik bölgeleri ve zonları. 3

Yapısal özellikler: Her kemikte korteks olarak adlandırılan periferal bir kompakt tabaka vardır. İçte ise süngerimsi veya trabeküler kemik bulunur, bu alana medüller kavite de denir. Medüller kavitedeki intertrabeküler alanda, yağ dokusu, fibrovasküler yapılar ve hematopoetik doku bulunur. 1 Ayrıca kemikler birçok destek dokuya sahiptir. Bunlardan ilki, periost adı verilen, kemiğin dış yüzeyini sıkıca saran, ince bir fibröz membrandır. Benzer yapıda fakat daha ince bir membran olan endosteum ise korteks içerisine uzanır. Bu membranlar osteojenik potansiyele sahiptir ve tamir reaksiyonunda önemlidirler. İkinci önemli destek doku ise yaygın kan damarı çatısıdır. Kemikler zengin damar yapısına sahiptir ve bu damarların çoğu epifiz ve metafizden kemiğe girerler. Ayrıca büyük besleyici arterler diafizden girer. 8 Mikroskopik Özellikler: Mikroskobik düzeyde kemik iki komponentten oluşur; hücreler ve ekstrasellüler matriks. 8 Ekstrasellüler matriks; kollajen, proteoglikanlar ve minerallerden oluşur. Kollajen kemiğin ekstrasellüler matriksinin en büyük kısmını oluşturur. Yetişkinlerdeki hemen hemen tüm kemik kollajeni birbirine parelel lameller yapılardan oluşur, bu nedenle lameller kemik olarak adlandırılır. Kemik metabolizması arttığında acilen kollajen matrikse ihtiyaç olur ve bu lameller yapı bozulur, yerini keçemsi (woven) kemik denilen rastgele yerleşmiş kollajen fibrilleri alır. Keçemsi kemik, erken enkondral ve membranöz ossifikasyon, kırık iyileşmesi sırasındaki kallus oluşumu, periosteal reaksiyon, endosteal iyileşme süreci ve hızlı kemik yapımı sırasında görülür. Proteoglikanlar; matriksin major nonkollajenöz komponentidir. Hyalüronik asitten oluşan bir kor ve etrafında çeşitli sülfate glikozaminoglikanlardan meydana gelir. Mineraller; iskelet, ekstrasellüer organik matriks üzerine minerallerin çökmesi ile rijid hale gelir. Bu mineraller karbonat içeren hidroksiapatit kristali [Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 ] anoloğudur. Kompakt kemikte osteon veya havers sistemleri denilen alt birimler vardır. Osteonlar ortalama 50 µm çapta, 1 cm uzunlukta, kemiğin uzun eksenine parelel yerleşmiş yapılardır. Santralinde havers kanalı vardır ve bu kanaldan bir veya iki kapiller damar ve nadiren de sinir lifleri geçer. Ayrıca Volkmann kanalları adı verilen ve osteonlara dik olarak yerleşen yapıların içinden de damarlar geçer. Bu kanallar ilik kavitesinde veya periostta havers kanalları ile birleşirler (Şekil 4). 1 4

Osteon Kanalikül Trabeküller Osteon Havers kanalı Periost Volkmann kanalı Şekil 4: Kompakt kemikte osteon ve havers sistemlerinin şematik görünümü. Kemiği oluşturan hücreler; osteoblastlar, osteositler ve osteoklastlardır: Osteoblastlar; kemik matriksini sentezlemek üzere özelleşmiş hücrelerdir. Küboidal veya alçak kolumnar şekillidirler (Şekil 5). Lameller kemik sentezi sırasında osteoblastlar osteoid etrafında kutuplaşırlar ancak keçemsi kemikte bu düzgün yapı yoktur. 1 Belirgin endoplazmik retikulum ve golgi aparatı vardır. Golgi aparatı, hematoksilen eozin boyalı preparatlarda nükleusun kenarında amfofilik alanlar şeklinde görülür. Bol miktarda alkalin fosfataz sentezlerler. Bu enzim, osteoblastların sitoplazmasında spesifik histokimyasal yöntemlerle gösterilebilir. Ayrıca Paget hastalığı ve kemik oluşturan tümörlerde, artmış osteoblastik aktivite nedeni ile serumda da alkalin fosfataz düzeyi yükselebilir. 8 Osteositler; kemik matriksi içine yerleşmiş oval nükleuslu dar sitoplazmalı hücrelerdir (Şekil 5). 8 Osteoblastlardan daha yavaş olmak üzere kemik yapım ve yıkımını sağlarlar. Osteoblastlardan daha fazla sayıdadırlar. Sitoplazmik uzantıları kanaliküller boyunca uzanır ve kemik hücre sinsityumunun major kısmını oluşturur. 1 Osteoklastlar; kemik ve kalsifiye kıkırdağın rezorpsiyonundan sorumlu hücrelerdir. Lizozomal enzimatik aktiviteleri vardır (asit fosfataz, kollajenaz ve çeşitli proteolitik enzimler). Osteoklastlar, monosit makrofaj kökenlidir ve onların bazı antijenik özelliklerini taşırlar. 1 Morfolojik olarak 20-100 µm çaplı, sıklıkla Howship 5

lakünaları olarak bilinen kemik yüzeyindeki rezorpsiyon kraterlerinde yerleşmiş, sitoplazmik sınırları düzensiz multinükleer hücrelerdir (Şekil 5). 8 Kemik yüzeyine tutunması, parathormon tarafından uyarılır, kalsitonin tarafından inhibe edilir. Osteoblast Osteosit Osteoklast Şekil 5: Kemiği oluşturan hücrelerin histolojik görünümü (HE). Kemik Gelişimi: Fetal kemik formasyonu ve postnatal büyüme, iki yolla olur: 1. İntramembranöz ossifikasyonda fetal mezenkimal hücre kümeleri direk osteoblastlara diferansiye olurlar (Şekil 6). İntramemranöz kemik oluşumu sırasında başlangıçta ayrı ayrı merkezlerde ossifikasyon alanları görülür ve bunlar genişleyerek birleşirler. Büyüme, özellikle konveks yüzdeki periostun kambium tabakasında osteoidin depolanması ile olur. Tübülasyon ve şekillenme ise konkav yüzdeki osteoklastik aktivite ile gerçekleşir. 1 2. Enkondral kemik oluşumununda ise önce kıkırdak matriks oluşur. Bu matriks, osteoid depozisyonu için iskelet oluşturur (Şekil 7). Kıkırdak matrikste fokal kalsifikasyonlar olur, vasküler invazyon ve osteoblastlar görülür. Böylece büyüme plağı ve eklem yüzeyleri hariç kıkırdak matriksin yerini kemik alır. Epifizyel büyüme plağı ve metafizyel kemikteki mezenkimal-vasküler bileşkede sürekli olarak gelişen kıkırdağı, osteoblastik diferansiyasyon ve osteoid formasyonu takip eder. Aynı hızda osteoklastlar tarafından rezorbsiyon 6

gerçekleştirilir. Sonuç olarak epifizyel plağın kalınlığı sabit kalırken uzun kemikte büyüme gerçekleşir. Büyümenin tamamlanmasıyla epifizyel plak kademeli olarak ortadan kalkar. Şekil 6: İntramembranöz ossifikasyon (HE). 1 Kıkırdak matriks Ossifikasyon alanı Şekil 7: Enkondral ossifikasyon (HE). 1 7

2.2 Kemiğin Dev Hücre İçeren Tümörleri ve Lezyonları Tümör benzeri lezyonlar DHRG Hiperparatiroidi / Brown tümör Fibröz displazi Cherubizm Metafizyel fibröz defekt Benign fibröz histiyositom Langerhans hücreli histiyositozis Benign Tümörler DHKT Osteoblastom Kondromiksoid fibrom Kondroblastom Malign Tümörler Osteoklast tipi dev hücreden zengin osteosarkom Metastatik karsinom Myelom, plazmositom Kistik Lezyonlar ve diğerleri AKK Basit kemik kisti Kallus Yumuşak Dokunun Dev Hücreli Tümörleri Benign TKDHT İntermediate Yumuşak dokunun dev hücreli tümörü (YDDHT) Malign DH li malign fibröz histiyositom / DH içeren indiferansiye pleomorfik sarkom. 9 8

2.2.1. Dev Hücreli Kemik Tümörü DHKT, lokal agresif seyirli benign bir tümördür. İlk defa 1940 yılında Jaffe et al. tarafından tanımlanmıştır. 10 Tüm primer kemik tümörlerinin %4-5 ini, primer benign tümörlerinin de %20 sini oluşturur. En sık 20-40 yaşları arasında görülmekle birlikte seyrek olarak iskelet maturasyonu tamamlanmamış kişilerde ve nadiren de 10 yaş altındaki çocuklarda görülebilir. 1 Yapılan geniş serilerde bir miktar kadın predominansı saptanmıştır. Dikkat çekici bir ırksal varyasyon olmamakla birlikte bazı coğrafik varyasyonlar bulunabilir. 1 DHKT, tipik olarak uzun kemiklerin uçlarını, özellikle de distal femur, proksimal tibia, distal radius ve proksimal humerusta görülür. Yassı kemikler %5 oranında tutulur ve özellikle pelvis tutulumu sıktır. Aksiyal iskelette ise en sık sakrum tutulur, %5 ten az olguda el ve ayağın tübüler kemikleri etkilenir (Şekil 8). 1 Pik insidans İnsidans Dekadlar Şekil 8: DHKT nin en sık görüldüğü yaş grubu ve lokalizasyon. 1 9

görülür. 1 Radyoloji: Spesifik anatomik pozisyonlarda ve kemik maturasyonunu Hastalar tipik olarak, tümörün olduğu bölgede ağrı, şişlik ve hareket kısıtlılığı ile gelirler. %5-10 olguda patolojik kırık görülür. Direk grafide kemiği genişleten, ekzantrik yerleşimli, litik alanlar görülür. Lezyon epifizde ve buna bitişik metafizde yerleşir, sıklıkla subkondral plağa, bazen de eklem içine uzanır. Nadiren tümör metafize sınırlıdır; bu durum genellikle adölesanlarda, büyüme plağı açık olduğunda tamamlamış hastalarda radyolojik görünüm oldukça karakteristiktir. Direk grafide genellikle iyi sınırlı, ekzantrik, subkondral alanda epifiz ve metafizi içeren radyolusent alanlar şeklindedir (Şekil 9). Korteks genellikle genişlemiştir. Şekil 9: Direk grafide epifiz ve metafiz yerleşimli DHKT. Lezyonun sınırları değişkendir ve bu özellik radyolojik derecelendirme/ evrelendirme sisteminin temelini oluşturur: Tip1 sakin lezyonlar; sklerozisle çevrelenmiş, iyi sınırlı lezyonlardır. Tip2 aktif tümörler; iyi sınırlı fakat etrafında sklerozisi bulunmayan, korteksi incelten ve genişleten lezyonlardır. Tip3 agressif tümörler; sınırları düzgün olmayan, sıklıkla kortikal yıkım ve çevre yumuşak dokuya yayılım gösteren tümörlerdir. Bu derecelendirme sistemi histolojik görünümle 10

korelasyon göstermemektedir. Bilgisayarlı tomografi (BT) ile kortikal incelme ve penetrasyon konusunda daha doğru değerlendirme yapılır. Manyetik rezonans (MR) ise intraosseöz yayılım, yumuşak doku yayılımı ve eklem tutulumlarını göstermede daha kullanışlı bir görüntüleme yöntemidir. 1 Makroskobi: İntakt spesmenlerde radyolojik görüntüye parelel olarak ekzantrik yerleşimli kemik destrüksiyonu alanları izlenir. Bu alan sıklıkla inkomplet reaktif kemik dokusu ile çevrilidir. Genellikle kırmızı kahverenklidir, ksantomatöz değişikliklere bağlı sarı, fibrozise bağlı olarak da beyaz alanlar görülebilir (Şekil 10). Kanla dolu kistik boşluklar içerebilir ve bu nedenle AKK ile karışabilir. 1 Şekil 10: Radius distalinde kemik kontürünü genişleten iyi sınırlı ekzantrik DHKT kitlesi. 1 Şekil 11: DHKT de çok sayıda osteoklast tipi DH ler ve MN hücreler (HE). 11

Histopatoloji: DHKT histolojik olarak üç tip hücreden oluşur: 1. Tümörün proliferatif komponentini oluşturan mononükleer (MN) mezenkimal stromal hücreler. 2. Monosit benzeri, hematopoetik kökenli, osteoklast prekürsörü MN hücreler. 3. Osteoklast benzeri multinükleer DH ler (Şekil 11). 11-13 MN mezenkimal hücreler iğsi, fibroblast benzeri hücrelerdir ve sıklıkla puro şeklinde nükleus içerirler. Bu hücreler tümörün bazı alanlarında daha baskın olup fibröz bir zemin veya storiform patern oluşturabilirler. Bu alanlarda DH ler daha az sayıdadır. 14 Monosit benzeri hücreler ise belirgin santral nükleolusa sahip oval nükleuslu hücrelerdir. Bu hücrelerin, periferik kandaki monositlerin, içerdikleri bazı reseptörler sayesinde endotelden geçerek tümör stromasına yerleştiği ve osteoklastogenezisi uyaran bazı faktörler sayesinde de multinükleer DH leri oluşturduğu düşünülmektedir. 15 MN hücrelerin her iki tipinde de mitotik figürler görülebilir ancak atipik mitoz yoktur. Eğer varsa DH den zengin sarkom düşünülmelidir. 14,16 Tümördeki DH sayısı olgudan olguya farklılıklar gösterebilir. Ayrıca DH lerdeki nükleus sayısı da oldukça değişkendir (5-100 adet). DH nükleusları, monosit benzeri MN hücrelerin nükleusları ile özdeştir fakat bu hücrelerde mitoz asla görülmez. Bazı olgular fibrozis, köpük hücreleri ve hemosiderin birikimi gibi regresif değişiklikler içerebilir. İnfarkt benzeri nekroz alanları sıktır. Nadiren reaktif kemik ve osteoid oluşumu görülebilir. 14 DH ler MN hücreler arasında diffüz dağılım gösterirler. Multinükleer DH lerin kemik rezorpsiyonundan sorumlu olduğu ve bunların osteoklast olduğuna dair kanıtlar artmaktadır. 17 DHKT olgularında %10 oranında sekonder AKK gelişir. Tümör içinde özellikle patolojik kırıklar veya biyopsiye ikincil küçük kemik yapıları görülebilir. Yumuşak dokuya yayılan veya akciğerde görülen tümör, primer lezyonla özdeştir ve sıklıkla etrafı reaktif kemik dokusu ile çevrilidir. Dikkat çekici bir özellik, vakaların üçte birinde, özellikle lezyonun periferinde, damar içi tümör trombüslerinin varlığıdır, bunun prognostik önemi yoktur. Özellikle büyük lezyonlarda nekroz alanları sıktır. 16 12

Tedavi ve prognoz: DHKT nin tedavisinde birinci tercih küretaj ve kemik greftidir. 1 Küretaja kriyoterapinin eklendiği bazı merkezlerde rekürrenslerin azaldığı görülmüştür. 1 Eğer tümörün yerleşimi veya evresi uygunsa, seçilmiş bazı olgularda geniş eksizyon yapılabilir. Geniş eksizyon ve allograft veya prostetik replasmanlara rağmen lezyon belirgin olarak küçültülebilir ancak tamamen yok olmaz. Bu nedenle de tekrarlar. Tekrarlayan lezyonlar ikinci bir küretajla tedavi edilirler. Yumuşak doku rekürrensleri ise DHKT lerin nadir görülen lokal komplikasyonudur. Bu durum tipik olarak cerrahi tedavi sırasında yumuşak dokuya tümör implantasyonu ile gerçekleşir. Rekürrensler genellikle primer lezyonun cerrahisinden sonraki ilk üç yıl içerisinde görülür. Ancak nadiren uzun yıllar sonra da ortaya çıkabilir. Geçmişte hastalığın kontrolü için lokal radyoterapi uygulanmasının lokal rekürrensleri önlediği görülmüştür. Daha sonra DHKT lerde gelişen malign transformasyonların önceki radyoterapilere bağlanması üzerine bu uygulamadan vazgeçilmiştir. 18 Ancak nadiren, vertebralar gibi anatomik yerleşimleri nedeni ile teknik olarak eksizyonları ve tam küretajları mümkün olmayan olgularda hala hastalığın kontrolü için radyoterapi kullanılmaktadır. 19-21 Bu lokalizasyonlar için arteriyel embolizasyonla gerçekleştirilen vazookluziv tedavi de bir diğer tedavi seçeneğidir. 22 DHKT ler lokal agresif seyirlidir ve nadiren akciğere uzak metastaz yaparlar. Geniş serilerde bu oran %2-9 dur. 14 Histolojisine bakılarak davranışı tahmin edilemez. Tanıdan ortalama 3-4 yıl sonra %2 olguda, soliter ve multipl akciğer metastazı görülür. Bu metastazların bazıları çok yavaş büyür (benign pulmoner implantlar), bazıları da spontan regresyona uğrar. Çok küçük bir kısmı da progressif seyir göstererek hastanın ölümüne neden olur. 16 Sarkom gelişimi en ciddi ama nadir görülen bir komplikasyondur ve daha önce de bahsedildiği gibi bunların major sebebi önceki radyoterapidir. Primer malign DHKT ise çok nadirdir. 13

2.2.2 Anevrizmal Kemik Kisti AKK, kemiğin benign kistik bir lezyonudur. İlk defa 1942 de Jaffe ve Linchtenstein tarafından tariflenmiştir. 1 Primer (%70) veya diğer malign ya da benign kemik tümörlerine sekonder olarak gelişebilir. Primer kemik tümörlerinin %2,5 ini oluşturur. 1 En sık ilk iki dekadda olmak üzere tüm yaş gruplarında görülebilir. Sıklıkla femur, tibia ve humerus gibi uzun kemiklerin metafizi ve vertebraların posterioru etkilenir. Morfolojik olarak kemiğin primer AKK leri ile özdeş lezyonlar nadiren yumuşak dokuda da tariflenmiştir. 23 Ağrı ve şişlik en sık görülen semptomdur, bu bulgular nadiren kırığa sekonder de gelişebilir. Vertebral lezyonlarda, sinirlere ya da medulla spinalise bası sonucu nörolojik semptomlar görülebilir. Radyoloji: AKK nin radyolojik görüntüsü oldukça karakteristik olup çoğu olguda tanı koydurucudur. Genellikle ince subperiostal reaktif kemik dokuyla çevrili, iyi sınırlı, litik, ekzantrik yerleşimli büyük lezyonlardır. BT ve MR ile kist sıvısının özelliği ve sekonder AKK olgularında, alttaki primer lezyon saptanabilir. 23 Makroskobi: Septalarla ayrılmış, kanla dolu kistik boşluklar içeren düzensiz lobüler yapıda ancak iyi sınırlı, süngerimsi, multiloküle kitlelerdir (Şekil 12). Kistik yapıların çapı 1 mm den cm lere kadar değişebilir. Arada daha solid alanlar görülebilir, bu alanlar AKK nin solid alanlarına veya alttaki primer lezyona ait olabilir. 1 Şekil 12: Klavikulada kanla dolu kistik boşluklar ile karakterize AKK. 1 14

Mikroskobi: Mikroskobik özellikler de makroskobik bulgulara parelellik gösterir. Histolojik olarak primer AKK de, fibröz septalarla ayrılmış, kanla dolu kistik boşluklar izlenir. Septalar ve daha solid alanlar, çok sayıda kapiller yapılar, multinükleer DH ler, inflamatuar hücreler ve ekstravaze eritrositler içeren gevşek fibröz dokudan oluşur (Şekil 13). Genel olarak genç granülasyon dokusuna benzer. Kistik alanları döşeyen bir epitel genellikle görülmez ancak fokal alanlarda yassılaşmış endotel benzeri hücreler bulunabilir. Bazen immünohistokimyasal olarak endotelyal proliferasyon görülebilirse de elektron mikroskobik bulgular bu boşlukların endotelle döşeli olduğunu doğrulamaz. Osteoklast benzeri DH ler genellikle kanama alanları çevresinde düzensiz gruplar oluşturur. Reaktif kemik oluşumu hemen daima fokaldir, nadiren belirgin olur. Bu alanlardaki immatür osteoid doku ile birlikte şişkin osteoblastlar, osteoid üreten malign tümör şüphesi uyandırır. Mitoz sıklıkla bulunur, çok sayıda da olabilir ancak atipik mitoz yoktur. Nekroz patolojik kırık olmadığı sürece pek görülmez. 23 Şekil 13: AKK de kistik boşluklar çevresinde DH, lenfosit infiltrasyonu izlenenin fibröz çeperi yapı (HE). 15

Sekonder AKK lerin çoğu DHKT, osteoblastom, kondroblastom ve fibröz displazi gibi benign lezyonlara eşlik eder. Ancak AKK benzeri değişiklikler sarkomlarla, özellikle de osteosarkomlarla da birlikte olabilir. 8 Tedavi ve prognoz: AKK ler lokal destrüktif lezyonlardır, çeşitli deformitelere fonksiyon kayıplarına neden olabilir. Vertebrada ya da kraniofasial kemiklerde yerleştiğinde vital yapılara bası yaparak ölüme bile neden olabilir. 24-28 Prognoz genellikle iyidir. Bazı lezyonların boyutlarında büyüme olmaksızın radyolojik olarak intralezyoner sklerozis gelişebilir. Ancak çoğu lezyonda büyüme olur ve cerrahi müdahale gerektirir. En etkili tedavi lezyonun tamamının eksizyonudur ancak fonksiyonel kayıplara neden olacağı için bu genellikle yapılmaz. Sıklıkla küretaj ve kemik grefti yapılır. Küretajı takiben %20-70 oranında rekürrens görülür. 1,29,30 2.2.3. Dev Hücreli Reperatif Granülom (Santral Dev Hücreli Granülom) DHRG, tipik olarak çene kemiğinde görülen, soliter, osteolitik seyirli benign bir tümördür. İlk defa 1953 yılında Jaffe tarafından tarif edilmiştir. 1 Genellikle çocuklarda ve genç erişkinlerde ve ağırlıklı olarak da kadınlarda görülür. Pik insidansı ikinci dekaddır ve hastaların çoğu 10-25 yaşları arasındadır. 31 Kemikte kistik lezyonlar oluşturur. 32 Hemen daima maksilla ve mandibulada, özellikle de anterior bölgelerinde yerleşir. İkinci sıklıkta el ve ayaktaki kısa tübüler kemikler tutulur. Bu kemiklerdeki lezyonlar metafiz ve diafiz yerleşimlidir. İskelet maturasyonunu tamamlamış kişilerde epifize invazyon görülebilir ancak bu tutulum daima metafiz veya diafizdeki primer lezyona eşlik eder. 1 Uzun tübüler kemiklerde ve vertebralarda son derece nadirdir. 33 Radyolojik olarak kafa ve yüz kemiklerinde nadiren ince trabekülasyonlar oluşturan yuvarlak veya oval radyolusent alanlar şeklinde izlenir (Şekil 14). Lezyonun sınırları belirgindir ve minimal reaktif sklerozis içerir. Kemik konturlarında genişleme ve kortekste belirgin incelme görülebilir. Korteks genellikle intakttır ve periost reaksiyonu izlenmez. El ve ayakların kısa tübüler kemiklerinde ise lezyon metafiz veya diafizde santral yerleşimlidir. Kemik konturları belirgin olarak genişlemiş ve incelmiştir ancak korteks sağlamdır. 1 16

Şekil 14: DHRG de direk grafide iyi sınırlı litik lezyon. Şekil 15: DHRG de çok sayıda DH ler (HE). Histolojik olarak çok sayıda osteoklast benzeri DH, fibrolastlar, değişken oranlarda kollajen, oldukça sellüler vasküler bir stroma ve sıklıkla yeni kemik formasyonu izlenir (Şekil 15). Stromal fibroblastlarda mitoz nadiren görülebilir. Dikkat çekici özelliği, skar benzeri stromal doku bantlarının ayırdığı düzensiz dağılım gösteren multinükleer DH lerin varlığıdır. Taze ve eski kanama odakları hemen daima bulunur. Osteoklast benzeri DH ler kanama alanlarına yakın bölgelerde yerleşme eğilimindedir. Bu görünümün hemoraji alanlarındaki fagositik yanıt olabileceği düşünülmüştür. Az sayıda MN iltihap hücresi ve osteoblastlarla çevrili reaktif yeni kemik oluşumu genellikle vardır. Reaktif kemik oluşumu bazan oldukça yaygın olup lezyonun diğer elmentlerini gizleyebilir. Mikroskopik olarak AKK benzeri hemorajik kist oluşumları sıklıkla mevcuttur. Osteolizisin patogenezi tam olarak bilinmemekle birlikte son çalışmalar, osteoklast tipi DH lerin buna neden olduğunu göstermiştir. 2,7,34 Benzer mikroskobik görünüm lezyonun çene dışı lokalizasyonlarında da görülür. Tedavi: Çene ve kısa tübüler kemik yerleşimli DHRG olguları genellikle kemik grefti olmaksızın yalnızca küretajla tedavisi yeterli olmaktadır. 31,35 Maksilladaki lezyonlar ise geçiçi de olsa steroid tedavisinden fayda görür. 36 Küretajla tedavi edilen olgularda %33-50 oranında rekürrens görülür. 35 17

2.2.4. Tendon Kılıfının Dev Hücreli Tümörü TKDHT sıklıkla eklemlerin sinovyasından, bursadan ve tendon kılıfından köken alan bir lezyondur. Bu tümörler genellikle, yerleşim yerlerine göre (intra veya ekstraartiküler) ve büyüme paternlerine göre (lokalize veya diffüz) çeşitli alt gruplara ayrılırlar. Bunların klinik özellikleri ve davranışları farklıdır. 9 TKDHT nin lokalize formu: Sinovyal benzeri MN hücre proliferasyonu ve buna eşlik eden değişken sayıda osteoklast benzeri DH ler, köpük hücreleri, siderofajlar ve inflamatuar hücrelerle karekterizedir (Şekil 16). Her yaşta görülebilmekle birlikte genellikle 30-50 yaşlar arasında ve kadınlarda sık görülür. Sıklıkla parmaklarda, ağırlıklı olarak da el parmaklarında görülür. Daha nadir olarak ayak bileği, ayak, diz ve çok nadiren de dirsek ve kalça eklemi tutulabilir. Parmaktaki lezyonlar tipik olarak interfalangial ekleme komşu lokalizasyonludur. Komşu kemiği erode veya infiltre edebilir, nadiren cilde invazyon gösterebilir. En sık klinik bulgu ağrısız sişliktir. Tümör, yıllar içinde çok yavaş olarak büyür. %1-50 olguda travma öyküsü vardır. 9 Şekil 16: TKDHT de DH ler, köpük hücreleri, lenfositler (HE). 18

Radyolojik olarak, nadiren çevre eklem ve kemik dokularda dejeneratif değişikliğe neden olan iyi sınırlı yumuşak doku kitlesi şeklinde görülürler. Hastaların bir kısmında kemikte kortikal erozyon görülebilir. 37 Makroskobik olarak küçük (0,5-4 cm), iyi sınırlı, lobule kitlelerdir. Tutulan ekleme göre daha büyük boyutlarda olabilir. 9,37 Kesit yüzü benekli görünümdedir: İçerdiği lipid ve hemosiderin miktarına bağlı olarak gri-pembe bir zemin üzerinde sarı veya kahverengi benek tarzında yapılar izlenir. 37 Mikroskopik incelemede, yer yer fibröz kapsülle çevrili, içerdiği MN hücre, DH, köpüksü makrofaj, siderofaj ve stroma oranına bağlı olarak değişik morfolojik görüntü sergileyebilen lezyonlardır (Şekil 17). Osteoklast benzeri DH ler bazen kolaylıkla seçilebilmekle birlikte oldukça sellüler olan tümörlerde seçilemeyebilir. MN hücrelerin çoğu yuvarlak veya iğsi soluk sitoplazmalı, sıklıkla çentik içeren yuvarlak veya böbrek şekilli nükleusa sahiptirler. Nodülün periferinde genellikle kümeler oluşturan ksantom hücreleri görülür ve buna kolesterol yarıkları da eşlik edebilir. Hemosiderin pigmenti hemen hemen tüm vakalarda vardır. Şekil 17: TKDHT de DH ler ve köpük hücreleri (HE). 19

Stromada çeşitli derecelerde hyalinizasyon olabilir, nadiren de osteoid benzeri görünüm sergileyebilir. Mitotik aktivite 10 büyük büyütme alanında ortalama 3-5 adet olmakla birlikte 20 ye kadar ulaşabilir. Nadiren fokal nekroz da görülebilir. İmmünohistokimyasal olarak MN hücreler CD68 pozitiftir. Multinükleer DH ler de CD68, CD45 ve TRAP gibi markerlarla pozitif reaksiyon verir. 9,38-41 TKDHT lokal eksizyonla tedavi edilir ve sık rekürrens gösterir (%4-30). Rekürrens daha çok sık mitoz içeren ve yüksek sellüleriteye sahip olgularda görülür. 37 Ancak bu rekürrensler destrüktif değildir ve reeksizyonlarla kontrol altına alınır. 9 20

2.3. Hücre Siklusu 1882 yılında Flemming, kromatin kümeleşmesinden sonra olan hücre bölünmesini mitoz olarak adlandırmıştır. Hücrelerin herbiri mitozla meydana gelir ve S fazında kromozomal DNA replike olur. Mitoz S fazı arasında G1, S fazı mitoz arasında da G2 fazı yer alır (Şekil 18). 42 Şekil 18: Hücre siklusunun şematik görünümü. 44 G1 Fazı: G1 fazı siklusun en uzun ve en değişken fazıdır. Bu faz, iki farklı siklus kontrol noktası ile düzenlenir: kısıtlama noktası ve G1 DNA hasar noktası. Her iki kontrol noktasında da birçok kanserde kayıp vardır. G0 ve Büyüme Kontrolü: Vücuttaki birçok hücre, özel fonksiyonları gerçekleştirmek üzere diferansiye olmuştur ve artık bölünmezler. Böyle hücreler G0 olarak adlandırılan, G1 fazının özel bir kompartmanında yer alırlar. G0 fazı tamamen hareketsiz bir faz değildir; gerçekten bu hücreler sıklıkla protein sentezi ve sekresyonu 21

ile meşguldürler ve oldukça aktif olabilirler. G0 daki hücreler çeşitli uyaranlara yanıt olarak siklusa tekrar girebilirler. S Fazı: G1 fazı boyunca kromozomlar, prereplikasyon komplekslerini oluşturmak üzere modifiye olurlar. Replikasyon, kromozomal DNA boyunca replikasyon orjini denilen farklı bölgelerden başlayabilir. Kromozomal replikasyon üniteleri replikasyon kümelerinden oluşur. Genomun transkribe bölgesi genellikle S fazının erken döneminde replike olur, oysa inaktif heterokromatin bölgesi geç dönemde replike olur. G2 Fazı: G2 fazı boyunca hücrelerde DNA yapıları tamir edilir ve hücre mitoza hazırlanır. Eğer replike olmamış veya hasarlı DNA saptanırsa, G2 DNA hasarı kontrol noktası denilen protein kinaz basamağı tetiklenir. Bu olay, mitoza giriş için gerekli olan siklin bağımlı kinazın (CDK) inaktivitesine neden olur. Sonuçta G2 fazında gecikme meydana gelir. Bu kontrol noktasındaki enzimlerde oluşabilecek defektler kansere neden olabilir. M Fazı: Profaz, prometafaz, metafaz, anafaz ve telofaz olmak üzere, beş farklı fazdan oluşur. Bu fazların sonunda hücrenin kromozomları ve sitoplazması ikiye bölünür. Hücre Siklus Geçişlerinin Biyokimyasal Temeli: Hücre siklusu fazları arasındaki geçişler, protein kinazlar ve fosfatazlar tarafından tetiklenir. 42 2.3.1. Siklinler ve Siklin Bağımlı Kinazlar Hücrelerin, hücre siklusuna girişi ve ilerleyişi, siklinlerin seviyeleri ve aktivitelerindeki değişiklikler tarafından kontrol edilir. Hücre siklusunun spesifik fazlarında çeşitli siklinlerin seviyeleri pik yapar, daha sonra hızla düşer ve hücre, siklusun bir sonraki fazına girer. Siklinler, fonksiyonlarını CDK larla kompleks oluşturarak gerçekleştirirler. CDK lar hücre siklusu sırasında düzenli olarak fakat inaktif formda yapılır. Siklinlere bağlandıktan sonra fosforile olarak aktif forma dönüşürler. Siklinler ise hücre siklusunun spesifik fazlarında sentezlenirler, görevleri CDK ları aktive etmektir (Şekil 19). Siklinler ve CDK ların farklı kombinasyonları hücre siklusundaki önemli geçişlerde rol alır. SiklinD1 amplifikasyonu ve/veya protein 22

overekspresyonu bazı epitelyal kanserler (meme, özefagus, mesane, akciğer ve skuamöz hücreli karsinom), lenfomalar, bazı santral sinir sistemi tümörleri gibi birçok tümörde gösterilmiştir. Ayrıca memenin benign ve premalign lezyonları, oral ve laringeal mukozanın epitelyal displazilerindeki siklind1 değişiklikleri, malign transformasyon gelişmeden önce gösterilmiştir. 43-46 Siklusun kendi içinde kontrolleri vardır. Başlıca iki denetim noktası G1/S ve G2/M geçişleridir. Her ne kadar hücre siklusundaki her basamak önemli ise de G1 den S fazına geçiş, hücre siklusundaki çok önemli bir kontrol noktasıdır. S fazı, siklusun geri dönüşü olmayan bir noktasıdır. 43 Bu noktada hücrede ya genom replikasyonu olur, ya hücre sessiz kalır ya da diferansiye olur. 44 Şekil 19: Siklinler ve CDK ların hücre siklusundaki fonksiyonlarının şematik görünümü. 44 Hücre büyüme sinyali aldığında, D tipi siklinler sentezlenir (Şekil 19). D tipi siklinler çok kısa yarılanma ömrüne sahiptir (yaklaşık 30 dakika) ve sentezleri büyüme faktörlerine bağımlıdır. Büyüme faktörleri olmadığında sentezi hemen durur. Bu durum D tipi siklinlerin büyüme faktörü sensörü gibi davrandığı fikrini doğurmuştur. Üç tip hücre spesifik siklind vardır; siklind1, siklind2 ve siklind3. 46 Bunlar CDK4 ve CDK6 ya bağlanırlar ve G1 in erken safhalarında stimüle 23

olurlar. G1 in geç dönemlerinde ise siklin E lerin sentezi uyarılır. Siklin E ler CDK2 ye bağlanırlar. SiklinD/CDK4, siklind/cdk6 ve sikline/cdk2 kompleksi retinoblastom proteinini fosforile eder (Şekil 20). Bu kritik bir reaksiyondur çünkü bu noktadan sonra hücre S fazına girer ve DNA sentezi başlar. Bu seviyedeki siklin salınımını etkileyen bir mutasyon, hücrelerin kolayca S fazına geçişine olanak sağlar. 44 Şekil 20: Hücre siklusunda G1-S geçişi. 44 S fazından G2 fazına geçiş, siklina seviyelerindeki artış ile gerçekleşir. SiklinA, CDK2 ve CDK1 ile bağlanır. SiklinA/CDK2 kompleksinin fosforilasyonu ile G2 fazına geçilir. CDK1 in rolü tam olarak bilinmemektedir. 42 24

SiklinB/CDK1 fonksiyonu G2 den M fazına geçişi kontrol eder. G2 fazında; siklinb sentezlenir, CDK1 e bağlanır, siklin B/CDK1 kompleksi oluşur, fosforilasyonla aktive olur, siklinb/cdk1 kompleksinin aktivasyonu ile M fazına geçiş gerçekleşir. Daha sonra çeşitli proteinler mitoz sırasında devreye girer, DNA replikasonu, mitotik iğ formasyonu olur ve ilgili siklinler ubiquitin-proteosome yolu ile ortamdan uzaklaştırılır. 42 2.3.2. Siklin Bağımlı Kinaz İnhibitörleri Aktif CDK kompleksinin sentezi ve yok edilmesi CDK inhibitörleri (CDKI) ile de düzenlenir. Bu inhibitörler hücre siklusunda CDK ların aktivitesini dengelerler. Bunların seviyesindeki değişiklikler, bazı tümörlerde veya hücre yaşlanmasında görülebilir, normal siklusun ilerleyişini değiştirebilirler. 42 Son çalışmalar, CDKI ların birçok hücrenin diferansiyasyon, proliferasyon ve apoptozis kontrolünde rol alabileceğini göstermiştir. 47,48 Siklin-CDK komplekslerinin aktivitesi iki CDK inhibitörü aile tarafından sıkı denetim altındadır: İlki, p21, p27 ve p57 den oluşan CIP/KIP ailesi, diğeri ise p15, p16, p18 ve p19 dan oluşan INK4 ailesidir. 3 INK4 yalnızca CDK4 ve CDK6 ile bağlanır. CIP/KIP ailesinin substratı ise daha geniştir: siklind ler siklina lar ve sikline ler (Şekil 21). 44 İlk gruptakiler, siklinlere ve siklin bağımlı kinazlara bağlanarak bunların birbirleri ile kompleks oluşturmalarını engellerler. P21 in transkripsiyonel aktivasyonu p53 ün kontrolü altındadır ancak bazı hücrelerin diferansiyasyonu sırasındaki p21 düzenlenmesi p53 ten bağımsızdır. 44,49,50 P53 ün hücre siklusundaki asıl rolü hasarlı hücrelerin siklustaki kritik geçişlerdeki progresyonunu yavaşlatmak, durdurmak veya hücreyi apoptozise götürmektir. 43 P53, insan kanserlerinde en sık mutasyona uğrayan gendir. P53 inaktive olduğunda DNA hasarına yanıt olarak oluşan p21 düzenlenmesi de kaybolur. 51 P27 ise TGF beta gibi büyüme supresörlerine yanıt olarak hücre siklus arresti ile diferansiyasyon ve kontakt inhibisyonda rol alır. 42 P27 ekspresyon kaybı akciğer, meme ve mesane gibi birçok tümörde gösterilmiş, kötü prognoz ve agresif davranışla korele bulunmuştur. 45,52,53 Ayrıca p21 ve p27 nin hücrelerin terminal diferansiyasyonu sonucu hücre 25

siklusundan çıkması ve proliferatif aktivitesini kaybetmesinde rolü olduğunu gösteren çalışmalar vardır. 54 Şekil 21: Hücre siklusunda siklinler, CDK lar ve CDKI ların fonksiyonlarının şematik görünümü. 44 CDK inhibitörleri negatif büyüme düzenleyicisidir ve bunların tümör baskılayıcı fonksiyonu olabilir. Tersine hücre siklusundaki negatif düzenleyicilerin fonksiyonel inaktivitesi, hücre siklus kontrolünün bozulmasına ve bu nedenle neoplastik transformasyona katkıda bulunur. Gerçekten P16 kaybı ve P27 seviyesindeki azalmanın çeşitli kanserlerde prognostik anlamı saptanmıştır. 3,55 26

2.3.3. Ki-67 Ki-67 proteini, 319-358 kda ağırlığında, nükleer nonhiston bir proteindir. 56 İlk defa 1983 te Gerdes et al. tarafından tanımlanan bir proliferasyon belirleyicisidir. 57 Hücre siklusunun aktif fazlarında (G1, S, G2 ve M) eksprese edilir, fakat G0 fazındaki hücrelerde bulunmaz. 57 Bu nedenle gerek normal dokularda gerekse neoplastik dokularda, büyüme fraksiyonundaki hücreleri göstermede mükemmel bir belirleyicidir. Tümördeki Ki-67 pozitif hücre fraksiyonu (Ki-67 labeling indeks) sıklıkla hastalığın klinik gidişi ile pareleldir. Ki-67 labeling indeks, mitoz sayısı ile karşılaştırıldığında daha sensitiftir. Çünkü bu yöntemle yalnızca mitoz fazındaki hücreler değil, aynı zamanda proliferatif fazdaki tüm hücreler belirlenebilmektedir. Genel olarak mitoz sayısı ile iyi korelasyon gösterir. Hücre siklusunda Ki-67 ekspresyonu ilk olarak G1 fazının geç dönemlerinde ortaya çıkar ve sonraki tüm fazlarda pozitiftir. Yarılanma ömrü yaklaşık 90 dakikadır. Bu protein, tüm proliferatif hücrelerde (normal hücre veya tümör hücresi) immünohistokimyasal olarak nükleer boyanma paterni gösterir. 58 Yapılan çeşitli çalışmalarda Ki-67 labeling indeksin farklı malignitelerle ilişkisi gösterilmiştir. Örneğin multipl myelomda hastalığın seyri ile Ki-67 ekspresyonu arasında korelasyon saptanmıştır. Ayrıca multipl myelomu, önemi belirlenemeyen monoklonal gammapatilerden, folliküler lenfomayı reaktif folliküler hiperplaziden ayırmada da bu belirleyici faydalı bulunmuştur. 59-61. Ki-67 indeksinin, yumuşak doku sarkomlarında da hasta surveyi ve uzak metastaz oluşumu ile ilişkili olduğu görülmüştür. 58 27

3. GEREÇ VE YÖNTEM Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı nda 2000-2006 yılları arasında tanı almış 18 DHKT, 15 AKK, 21 DHRG, 16 TKDHT olgusu çalışma grubuna alındı. Olgulara ait hematoksilen eozin boyalı preparatlar ışık mikroskobunda incelendi. Seçilen uygun preparatlara ait bloklardan immünohistokimyasal çalışma için her lama iki adet 5 mikron kalınlığında kesitler alındı. Parafin bloklardan hazırlanan kesitlere Strept Avidin-Biotin kompleks immünperoksidaz yöntemi ile siklind1, siklind3, p21, p27 ve Ki-67 antikoru uygulandı. Tüm antikorlar için pozitif kontrol olarak tonsil dokusu kullanıldı. 3.1. Strept avidin-biotin boyama yöntemi Dokuların hazırlanması Parafin bloklardan 5 mikron kalınlığında alınan kesitler 60 C lik ısıda etüvde 30-45 dakika bekletilerek üzerindeki parafin eritildi. Aynı etüv içerisindeki ksilollü şale içerisinde kesitler 10 dakika bekletildi. Etüvden çıkarılan kesitler üç kez ksilol serisinden 5 er dakika geçirilerek çalkalandı. Sonra %95 lik 3 ayrı alkol şalesinde 5 er dakika tutularak distile suda iyice yıkandı. %3 lük H 2 O 2 (hidrojen peroksit) ile 5 dakika inkübe edildi. Daha sonra tekrar distile suda iyice yıkandı. SiklinD1 Boyanma Evreleri 1. Kesitler HIER solusyonu içerisine konularak Beko 1550 model mikrodalga fırının medium konumunda 10 dakika inkübe edildi. Daha sonra oda ısısında 20-30 dakika aynı solüsyon içerisinde bekletildi. (HIER solüsyonu: Tris/EDTA (10/1mM) ph 9: 1-21 gr Tris. 0,37 gr EDTA, 1000 ml distile suda çözülerek ph 9 a ayarlanır). 2. Kesitler, ph 7,4 olan fosfat buffer (PBS) solüsyonunda 3-5 dakika yıkandı. Doku çevresi silindi. 28

3. Doku üzerine 1/150 oranında dilüe edilerek hazırlanan primer SiklinD1 antikoru (NCL CyclinD1-GM Batch: L112518 mause monoklonal) damlatılarak 60 dakika oda ısısında nemli ortamda bırakıldı. 4. Kesitler PBS ile 3-5 dakika yıkanarak doku çevresi silindi. 5. Dokuların üzerine biotin damlatıldıktan sonra 25 dakika nemli ortamda, oda ısısında bekletildi. 6. Kesitler tekrar PBS ile 3-5 dakika yıkanarak doku çevresi silindi. 7. Kesitler üzerine strept avidin damlatılarak 30 dakika nemli ortamda oda ısısında bekletildi. 8. Kesitler tekrar PBS ile 3-5 dakika yıkanarak doku çevresi silindi. 9. Dokuların üzerine AEC kromojen substrat damlatılarak oda ısısında 5-20 dakika bekletildi. 10. Lamlar, Aqueous- Mount Low Viscosity Ref: AML 030 Lot: 10500 Scytec marka kapatma maddesi ile kapatılarak mikroskopta incelemeye hazır hale getirildi. SiklinD3 Boyanma Evreleri Yukarıda anlatılan basamaklar üçüncü aşamaya kadar aynı şekilde uygulandı. Primer antikor aşamasında doku üzerine 1/30 oranında dilüe edilerek hazırlanan siklind3 antikoru (NCL Batch 112306 mouse monoclonal) damlatılarak 60 dakika oda ısısında nemli ortamda bırakıldı. Sonraki aşamalar aynı şekilde uygulanarak kesitler incelemeye hazır hale getirildi. P21 (WAF-1) Boyanma Evreleri Yukarıda anlatılan basamaklar üçüncü aşamaya kadar aynı şekilde uygulandı. Primer antikor aşamasında doku üzerine 1/30 oranında dilüe edilerek hazırlanan p21 antikoru (NCL-WAF-1 mause monoclonal Batch: 115212) damlatılarak 60 dakika oda ısısında nemli ortamda bırakıldı. Sonraki aşamalar aynı şekilde uygulanarak kesitler incelemeye hazır hale getirildi. 29

P27 Boyanma Evreleri Yukarıda anlatılan basamaklar üçüncü aşamaya kadar aynı şekilde uygulandı. Primer antikor aşamasında doku üzerine 1/40 oranında dilüe edilerek hazırlanan p27 antikoru (NCL p27 mouse monoclonal Batch: 117708) damlatılarak 60 dakika oda ısısında nemli ortamda bırakıldı. Sonraki aşamalar aynı şekilde uygulanarak kesitler incelemeye hazır hale getirildi. Ki-67 Boyanma Evreleri Yukarıda anlatılan basamaklar üçüncü aşamaya kadar aynı şekilde uygulandı. Primer antikor aşamasında doku üzerine 1/30 oranında dilüe edilerek hazırlanan Ki-67 antikoru (Zymed Ret/cat no: 18-0192 mause) damlatılarak 60 dakika oda ısısında nemli ortamda bırakıldı. Sonraki aşamalar aynı şekilde uygulanarak kesitler incelemeye hazır hale getirildi. 3.2. Değerlendirme Tüm kesitler ışık mikroskobunda iki araştırmacı tarafından birlikte değerlendirildi. Tüm antikorlar için nükleer boyanma pozitif kabul edildi. Ki-67 için tüm kesitlerde 500 MN hücre sayıldı. Pozitif boyanan hücrelerinin total hücrelere oranı hesaplandı. SiklinD1, siklind3, p21 ve p27 için tüm kesitlerde 500 MN ve 200 DH sayıldı. Pozitif boyanan hücrelerin sayısı MN ve DH ler için ayrı ayrı hesaplandı. Pozitif boyanan DH sayısı tüm DH sayısına oranlanarak pozitif DH yüzdesi, pozitif boyanan MN hücre sayısı tüm MN hücre sayısına oranlanarak da pozitif MN hücre yüzdesi hesaplandı. Tüm antikorlar için %5 in üzerindeki boyanma pozitif, altındaki ise negatif olarak değerlendirildi. DH ve MN hücrelerin boyanma yüzdesi ve tümör tipi arasındaki ilişki, ki kare istatistik yöntemi kullanılarak saptandı. 30