NODAL DİFFÜZ BÜYÜK B- HÜCRELİ LENFOMA

T.C. Sağlık Bakanlığı İstanbul Eğitim ve Araştırma Hastanesi Patoloji Kliniği Şef: Doç. Dr. Erol Rüştü Bozkurt NODAL DİFFÜZ BÜYÜK B- HÜCRELİ LENFOMA OLGULARINDA ZAP-70 EKSPRESYONUNUN MORFOLOJİK VARYANT VE FENOTİPİK ALT GRUPLAR İLE İLİŞKİSİ Dr. Meltem ÖZNUR UZMANLIK TEZİ İstanbul-2008

T.C. Sağlık Bakanlığı İstanbul Eğitim ve Araştırma Hastanesi Patoloji Kliniği Şef: Doç. Dr. Erol Rüştü Bozkurt NODAL DİFFÜZ BÜYÜK B- HÜCRELİ LENFOMA OLGULARINDA ZAP-70 EKSPRESYONUNUN MORFOLOJİK VARYANT VE FENOTİPİK ALT GRUPLAR İLE İLİŞKİSİ Dr. Meltem ÖZNUR UZMANLIK TEZİ (Tez Danışmanı: Uzm.Dr.Gülben ERDEM HUQ) İstanbul-2008

BAŞLARKEN, Hastanemizde çağdaş çalışma, araştırma ve eğitim olanakları sağlayan Başhekimimiz Op. Dr. Özgür Yiğit e saygılarımı sunuyorum. Asistanlık sürecimi hayatımın en önemli deneyimlerinden biri haline getiren; inanılmaz bilgi birikimine sahip olduğu patoloji ve embriyoloji konusundaki bilgilerinden sınırsız bir şekilde faydalanmama imkan tanıyarak mesleki gelişimimde önemli yer sahibi olan; insani değerler, etik ve saygı kuralları konusunda asla taviz vermeyerek gözümde örnek bir insan olan; daima saygı ve hürmetle anacağım klinik şefim, sayın hocam Doç. Dr. Erol Rüştü BOZKURT a minnetlerimi sunuyorum. Asistanlığım süresince yardımlarını esirgemeyen klinik şef yardımcımız Uz. Dr. Bilgin Aksoy a; Hayata bakışıma yön vermemde önemli yer sahibi olan, desteğini daha ilk tanıştığımız günden beri esirgemeyen, başlangıçta tez danışmanım olmayı kabul ederek beni onurlandıran, daha sonra ise tezim ve patolojinin her alanında bildiklerini önüme cesurca sunmaktan çekinmeyen tez danışmanım Uz. Dr. Gülben ERDEM HUQ a; Şahsına münhasır karakteriyle çoğu zaman anlamakta güçlük çektiğim ancak bilimsel zekâsını takdir ettiğim, patoloji bilgisi ve insani anlamda daima desteğini hissettiren Uz. Dr. Kemal BEHZATOĞLU na; Asistanlığım süresince bilgi ve deneyimlerini paylaşmaktan çekinmeyen, her zaman destek olduklarını hissettiren Uz. Dr. Osman Nuri HÜTEN, Uz. Dr. Zuhal GÜCİN, Uz. Dr. Cem LEBLEBİCİ, Uz. Dr. Feray GÜNVER, Uz. Dr. Esra PAŞAOĞLU, Uz. Dr. Nevra

DURSUN ve asistanlığa alışmamdaki katkılarını unutamayacağım, özverili, hoşgörülü tavırları ile örnek insanlar Uz. Dr. Fadime BAHADIR ve Uz. Dr. Tuğçe GÜZEL ÇAY a; Özel kişiliğine, dürüstlüğü ve açık sözlülüğüne her zaman imrendiğim seneler önce tanışmamıza rağmen hayatıma daima yeni bir yerde yeniden dâhil olması nedeniyle artık hayatımdan çıkartamayacağıma inandığım As. Dr. Şule CANBERK BAŞARAN a; asistanlık hayatımın son senelerinde hayatıma dâhil olan ama inanılmaz bir arkadaşlık bağı kurmayı başardığım As. Dr. Pelin YILDIZ a; asistanlık sürecimde ayrı ve özel yer sahibi olan gerektiğinde akrabalarımdan öte yakın hissettiğim As. Dr. Gülzade KARAMAN ve As. Dr. Melike ÖZCAN a; Çalışmalarımda ve asistanlık sürecimin her aşamasında insan ve iş arkadaşı olarak titiz ve hassas davranışlarıyla benden yardımlarını esirgemeyen başta Aslı Tüysüz olmak üzere Ali Osman SAMAN, Hanife YILMAZ, Mürsel DİKMEN, Recep ÖNAL, Hacı Ali KURT, Abdullah ÇELİK, Erhan AKYOL, Ahmet AKILLI, Büşra KESKİN, Hatice ERTOP, Burcu ATAY, Tuğba AYŞAR,, Koray CENGİZ, Ayşe BALTÜRK, Fatma ÇOBAN, Mehmet ÖĞREN ve Ayşe BAYIR a; Hayatımda bana yaşattığı ilgi, güven ve sevilme duygusu yanında, benim bugünlere gelmemdeki destek ve özverisi için eşim Teoman ÖZNUR a; hayatımıza kattığı anlam için meleğim, biricik kızımız Eylül e; Tüm kalbimle teşekkürlerimi sunuyorum. Ömürleri bu günümü görmeye yetmemiş olan; sevgi dolu bir aile ortamında yetişmemi sağlayan, beni yetiştirmede özen ve hassasiyet gösteren sevgili annem ve babamın hatırası önünde saygıyla eğiliyorum. 4

İÇİNDEKİLER ÖZET/SUMMARY.. 1-3 GİRİŞ 4 GENEL BİLGİLER. 5-19 MATERYAL VE METOD... 20-21 BULGULAR. 22-26 TARTIŞMA.. 27-31 RESİMLER.. 32-41 SONUÇLAR. 42 KAYNAKLAR. 43-47 5

KISALTMALAR DBBHL: Diffüz Büyük B-Hücreli Lenfoma WHO: World Health Organization (Dünya Sağlık Örgütü) REAL: Revised Europian Lymphoma Study Group NHL: Non-Hodgkin lenfoma GM: Germinal Merkez GMD: Germinal Merkez dışı NK: Natural killer B-KLL: B-Kronik lenfositik lösemi FL: Foliküler lenfoma MZL: Marjinal zon lenfoma MHL: Mantle hücreli lenfoma THZBHL: T hücre/histiyositten zengin B hücreli lenfoma NLPHL: Nodüler lenfosit predominant Hodgkin lenfoma LEL: Lenfoepitelyal lezyon ABHL: Anaplastik büyük hücreli lenfoma IPI: International prognostic index CD: Cluster Designation MUM1/IRF4: Multiple myeloma oncogen 1/Interferon Regulating Factor 4 ZAP-70: Zeta-chain (TCR) associated protein kinase 70 PBS: Phosfate buffer saline ALK: Anaplastic lymphoma kinase Ig: İmmünglobulin SSS: Santral sinir sistemi EBV: Ebstein Barr virüs kda: Kilodalton AEC: 3-amino-9-etil karbazol 6

ÖZET Difüz büyük B-hücreli lenfoma (DBBHL) erişkinde en sık görülen Hodgkin-dışı lenfoma olup, heterojen klinik, histolojik, immünofenotipik ve genetik özellikler ile karakterizedir(1,2). Dünya Sağlık Örgütü(WHO) difüz büyük B-hücreli lenfomaları altı morfolojik varyanta (sentroblastik, immünoblastik, anaplastik, T-hücreden zengin, plazmablastik ve tam boy-alk) ayırmaktadır (3). cdna and oligonükleotid mikro dizi yöntemleri kullanılarak yapılan son araştırmalar, DBBHL ların B-hücre farklılaşma gen ekspresyon profiline göre moleküler alt gruplarını tanımlamıştır: Germinal merkez (GM) B-hücre benzeri DBBHL, aktive B- hücre benzeri DBBHL ve tip 3 DBBHL(4). Germinal merkez(gm) B-hücre benzeri DBBHL lı hastalar, aktive B-hücre benzeri DBBHL veya tip 3 DBBHL lı hastalara göre daha olumlu klinik gidişe sahiptir (5). İmmünohistokimyasal çalışmalar, DBBHL ların büyük bir kısmında bc16/cd10/mum1 ile B-hücre farklılaşma immünofenotiplemesinin prognoz ile ilişkili ve cdna sınıflamasını öngörebildiğini göstermiştir (4,6,7). Zeta-ilişkili protein-70 (ZAP-70), tirozin kinazların bir üyesi olup T-hücre reseptör sinyalizasyonu, doğal öldürücü hücre (NK) aktivasyonu ve erken B-hücre gelişiminde önemli rol oynar. ZAP-70 normalde olgun B-hücrelerinde ekspresse olmaz. Bununla birlikte immünoglobülin ağir zinciri değişken bölgesi mutasyonsuz kronik lenfositik lösemi/küçük lenfositik lenfoma (KLL/SLL) olgularının bir kısmında kötü klinik gidiş ile ilişkilidir (8,9,10,11,12). 35 olguda, immünohistokimyasal metotları kullanarak CD10, bcl6, MUM1/IRF4 ve ZAP-70 ekspresyonu değerlendirildi. Olgular germinal merkez B-hücreli (GM) veya germinal merkez dışı (GMD) olarak sınıflandı. Bu sınıflamaya gore, 18 (%51,43) olgu GM grubunda, 17 (%48,57) olgu GMD grupta yer aldı. ZAP-70 ekspresyonu 35 olgunun 9 (%25,7) unda saptandı. GM ve GMD grupta ZAP-70 ekspresyonu önemli derecede farklı değildi: GM grubundaki 18 olgunun 3 (%33,3) ünde ve GMD grubundaki 17 olgunun 6 (%66,6) sında positifti (p=0,208). ZAP-70 ekspresyon durumu ve fenotipik alt gruplar ile morfolojik varyant arasında ilişki görülmedi (p=0,795). Bizim sonuçlarımız, ZAP-70 ile immünohistokimyasal çalışmanın DBBHL hastalarında klinik gidişatı öngöremediğini desteklemektedir. Daha çok hastanın yer aldığı bir çalışma, ZAP-70 pozitif ve ZAP-70 negatif ile GM ve GMD grup arasında klinik gidişatın farklılığını gösterebilir. 1

SUMMARY Diffuse large B-cell lymphomas (DLBCL) represent the most common type of adult non-hodgkin's lymphomas and are characterized by heterogeneous clinical, histological, immunophenotypic and genetic features (1,2). The 2001 WHO classification distinguishes six morphological variants (centroblastic, immunoblastic, anaplastic, T-cell rich, plasmablastic and full length-alk) of diffuse large B-cell lymphomas (3). Recent investigations using cdna and oligonucleotide microarrays have identified molecularly distinct groups of DLBCL with respect to the B-cell differentiation gene expression profile: the germinal center (GC) B-cell-like DLBCL, the activated B-cell-like DLBCL and the type 3 DLBCL (4). Patients with GC B-cell-like DLBCL had more favorable clinical outcome than those with activated B-cell-like or type 3 DLBCL (5). Immunohistochemical studies have shown that the bc16/cd10/mum1 B-cell differentiation immunophenotypes are prognostically relevant and may predict the cdna classification in a sizable fraction of DBBHL (4,6,7). Zeta-associated protein (ZAP)-70, a member of tyrosine kinases, plays an important role in T-cell receptor signaling, natural killer (NK) cell activation and early B-cell development. ZAP-70 is not normally expressed in mature B cells. However, ZAP-70 is expressed in a subset of cases of chronic lymphocytic leukemia/small lymphocytic lymphoma (CLL/SLL) with unmutated immunoglobulin heavy-chain variable region (IgVH) genes and is associated with poor clinical outcome (8,9,10,11,12). Thirty-five nodal de novo DLBCL cases were reclassified according to the World Health Organization (WHO) classification of lymphoma in 2001(3). Of the 35 cases of N- DLBCLs, 26 (74,3%) were reclassified as centroblastic, 4 (11,4%) immunoblastic, 2 (5,7%) T-cell/histiocytes rich, 2 (5,7%) anaplastic, and 1 (2,9%) plasmablastic. Using immunohistochemical methods, CD10, bcl6, MUM1/IRF4, and zetaassociated protein (ZAP)-70 expression were evaluated in 35 cases. These cases were classified as germinal center B-cell (GCB) or non-gcb phenotype. In this classification, 18 cases (51,43%) were placed in the GCB group, and 17 (48,57%) were placed in the non-gcb group. ZAP-70 expression was positive in 9 (25,7%) of 35 cases. The expression of ZAP-70 in the GCB and non-gcb groups was not significantly different: 3 (33,3%) of 18 cases in the GCB group and 6 (66,6%) of 17 cases in the non-gcb group tested positive 2

(p=0,208). ZAP-70 expression status and phenotypical subtype showed no association with morphological variant (p=0,795). Our results suggest that immunohistochemical study with ZAP-70 cannot predict the clinical outcomes of DLBCL patients. A study with a larger number of patients may show a difference in clinical outcomes between ZAP-70 positive and ZAP-70 negative groups and between GCB and non-gcb groups. 3

GİRİŞ Diffüz büyük B-hücreli lenfomalar (DBBHL) erişkinde en sık görülen ve klinik, immünofenotipik ve genetik özellikleri açısından oldukça heterojen bir lenfoid neoplazi grubudur (1,2). İlk kez Revised Europian Lymphoma Study Group (REAL) sınıflamasında ayrı bir lenfoma tipi olarak tanımlanmış, en son Dünya Sağlık Örgütü (WHO) sınıflamasında yine ayrı bir tip olarak ve eklenen alt tipleriyle birlikte yerini almıştır (3). DBBHL, önceden mevcut olan düşük gradlı periferik B-hücreli bir lenfomadan dönüşüm ile ortaya çıkabileceği gibi, de novo olarak da gelişebilir. WHO sınıflamasında nadir varyantlar ile birlikte altı morfolojik alt tip tanımlanmıştır ve bunlar arasında prognoz açısından farklılıklar bulunmaktadır (3). Son yıllarda, aynı morfolojik alt tip içinde yer alan olguların prognostik heterojenitesinin gözlenmesi üzerine, farklı prognoza sahip olgular arasında fenotipik ve genotipik farklılıklar ortaya koyulmaya çalışılmaktadır. Bu açıdan; de novo DBBHL olgularının bir kısmında normal germinal merkez B-hücrelerinin gen ekspresyonunun, diğer bir kısmında normal aktive periferik kan B-hücrelerinin gen ekspresyonunun bulunduğu, bir üçüncü grupta ise belirgin ekspresyonun bulunmadığı saptanmıştır(4). Böylece DBBHL lar germinal merkez profili ve non-germinal merkez profili gösteren olmak üzere iki fenotipik alt guba ayrılmaya çalışılmakta ve germinal merkez profili gösterenlerin daha iyi prognoza sahip oldukları bildirilmektedir(5). Zeta-chain-associated protein kinase 70 (ZAP-70) protein-tirozin kinaz ailesinden, normalde T-hücreleri ve natural killer hücrelerinde ekspresse edilen, T-hücre sinyalinin başlamasında kritik rolü olan bir proteindir. B-hücreli kronik lenfositik lösemi (B-KLL) olgularında negatif prognostik faktör olarak saptanmıştır. DBBHL olgularının bir kısmında da ZAP-70 ekspresyonu bildirilmektedir ancak bu olguların morfolojik ve fenotipik alt tiplere göre dağılımı açısından yapılan araştırmalar sınırlı sayıdadır (8,9,10,11,12). Bu çalışmada; DBBHL ların germinal merkez profili ve non-germinal merkez profili gösteren alt grupları arasında ZAP-70 ekspresyonu ve prognostik değeri araştırılmıştır. 4

GENEL BİLGİLER HİSTOLOJİ VE EMBRİYOLOJİ Lenf nodunda en dışta ince bağ dokusundan oluşmuş kapsül bulunur. Kapsül parankim içine trabekül denilen uzantıları verir. Parankim, korteks ve medulla olarak ikiye ayrılır. Korteks, dış korteks ve parakorteksten oluşur. Dış korteks B lenfosit, parakorteks T lenfosit bölgesidir. Stroma ve parankim arasındaki mesafelere sinüs denir. Kapsül ile dış korteks arasında subkapsüler sinüs bulunur. Subkapsüler sinüs ara sinüsler aracılığı ile medüller sinüslere bağlanır. Medüller sinüsler eferent lenfatiğe açılır ve bu lenf nodunu hilustan terkeder. Afferent lenfatik damar, dış yüzden kapsülü delerek çok sayıda lenfositi subkapsüler sinüse akıtır. Sinüsün her iki yüzü uzantılı, H&E kesitlerde görülmeyen sinüs içinde ağ oluşturan littoral hücreler ile döşelidir (13,14). Dış kortekste primer veya sekonder lenfoid folliküller bulunur. Primer folliküller uyarı almamış olup, küçük lenfositlerden oluşur. Sekonder folliküller antijenik uyarı almışlardır ve GM içerir. GM lerde ağırlıklı olarak sentrositler, sentroblastlar, tingible body makrofajlar yer alır. GM leri küçük lenfositlerden oluşan mantle zone çevreler. Bunun çevresinde bazen küçük lenfositten hafif büyük nüveleri olan, soluk ya da berrak sitoplazmalı hücrelerin yeraldığı marjinal zone gözlenir. Foliküller arasında kalan bölge parakortekstir. Burada T hücreleri, postkapiller venüller, immünoblastlar, az sayıda B hücreleri, plazma hücreleri ve interdigitating dendritik hücreler bulunur. Medulla, düzensiz dallanmalar oluşturan hücre kordonları ve bunların aralarındaki medüller sinüslerden oluşur (14,15). Lenf nodları ve myeloid doku lateral mezodermden gelişir. Lenfatik sistem beşinci haftanın sonunda gelişmeye başlar. Sisterna şiliyi oluşturan ön kısım hariç çoğalan ve gruplar oluşturan mezenkimal hücreler tüm lenfatik kapiller pleksusu invaze eder ve lenf nodu gruplarını oluşturur. Mezenkimal hücreler kapsül, trabekül ve retiküler ağı meydana getirir. Lenfoblastlar ilk fark edilen lenfoid progenitörlerdir ve yaklaşık sekizinci haftada tüm kan hücrelerini oluşturan mezenkim kaynaklı hemasitoblastlardan veya direkt lenfatikler etrafındaki mezenkimal hücrelerden gelişir. 12. haftada görülenler kemik iliğinden orijin alan kök hücrelerden gelişir ve kan yoluyla lenfoid organlara (lenf nodu, 5

dalak, timus, tonsil) giderek yerleşir. Embriyonik yaşam boyunca karaciğerde az miktarda yapım varken yolk sakta yoktur. Lenfoblastlar 2-3 kez bölünerek daha küçük prolenfositleri oluşturur. Bunlar T ve B lenfosit yüzey antijenlerini içermezler. Bazıları timusa göç eder ve T lenfosit özelliği kazanır ve akabinde periferik lenfoid organların özel bölgelerine gider. Kemik iliğinde kalan diğer lenfositler B lenfositlere farklılaşır, periferik lenfoid organlara gidip orada çoğalır (13,14). B-HÜCRE GELİŞİM AŞAMALARI Kemik iliğindeki pluripotent stem hücre, lenfosit dizisi de dahil tüm kan hücrelerinin kaynağıdır(13). Pluripotent kök hücreler bölünerek iki özelleşmiş öncül hücreye değişir: lenfoid kök hücre ve myeloid kök hücre. Lenfoid kök hücre hem B lenfosit hem de T lenfositin öncülüdür. Myeloid kök hücre lökosit, eritrosit, megakaryosit ve makrofajların öncülüdür (14). Matür B-hücre neoplazileri normal B-hücre diferansiasyon aşamalarını taklit eder. İsimlendirme ve sınıflama da bu temelde yapılır. Normal B-hücre diferansiasyonu başlangıç hücresi prekürsör B lenfoblasttır. Bu hücrelerde Ig VDJ geni yeniden düzenlenmeye uğrar ve yüzey Ig farklılaşması olur, sonuçta naif B-hücreleri oluşur. Naif B-hücreleri IgM(+),IgD(+) ve CD5(+) tir (3,15). Naif B-hücreleri kan dolaşımındaki küçük boyutlu dinlenme halindeki lenfositlerdir, primer lenfoid foliküllerde ve folikülün mantle bölgesinde yerleşirler. Bunlar dolaşan B- hücreleridir. Tümörleri düşük gradlı ve klinikleri yavaş seyirlidir. Sıklıkla normal naif B- hücrelerinin davranışına uygun olarak geniş alana yayılır, lösemik olabilir. CD5(+) B- hücrelerinden B-hücreli KLL(%50) ve Mantle hücreli lenfoma gelişir (3,15). Antijenle karşılaşan naif B-hücreleri blastlara dönüşür, prolifere olur ve sonunda IgG ve IgA antikoru sekrete eden plazma hücreleri ve bellek B-hücrelerine olgunlaşırlar. Antijenle karşılaşan naif B-hücrelerden dönüşüm sonucu oluşan blastik hücreler primer foliküle göç ederler. Primer foliküldeki foliküler dendritik hücre ağı ile birlikte germinal merkezi oluştururlar. Germinal merkezin blastik hücreleri sentroblast olarak bilinir. Bu hücreler veziküler nüve, 1-3 adet belirgin ve periferik yerleşimli nükleol, dar bazofilik sitoplazmalı büyük hücrelerdir. Çoğunda yüzey immünoglobülini ve bcl-2 protein ekspresyonu yoktur. Bu durum apopitotik hücre ölümüne çok uğradıklarını gösterir. Sentroblastlar bcl-6 protein eksprese ederler. Bu bir nükleer zinc transkripsiyon faktörüdür. 6

Sentrosit ve sentroblastların her ikisinde de eksprese edilir. Naif B-hücreleri, bellek B- hücreleri, mantle hücreleri ve plazma hücrelerinde bcl-6 ekspresyonu görülmez. Aynı özellikler CD10 için de geçerlidir. Germinal merkezde Ig değişken (IgV) bölge geninde somatik mutasyon meydana gelir, sonuçta sadece az sayıda prekürsör hücreden kaynaklanan ve belirgin intraklonal farklılık gösteren bir hücre popülasyonu oluşur ve bazı hücrelerden IgM, IgG ve IgA yapımı tetiklenir. Bu mekanizma ile geç primer veya sekonder immün yanıtta uygun IgG veya IgA yapımı meydana gelir. Germinal merkezde bcl-6 geni, Ig genlerinden daha az oranda somatik mutasyona uğrar(3,15). Pek çok büyük B-hücreli lenfoma hücrelerinin en azından bir kısmı sentroblastları anımsatan hücrelerden oluşur. Bunların IgV bölge ve sıklıkla da bcl-6 gen mutasyonu göstermeleri germinal merkezden köken aldıklarını işaret eder (3,4,15). Burkitt lenfoma hücreleri de bcl-6 (+) ve Ig gen mutasyonu gösterir. Burkitt ve Büyük B-hücreli lenfomaların her ikisi de klinik olarak agresif tümörlerdir (3,16). Sentroblastların olgunlaşmış hali sentrositlerdir. Bunlar çentikli folikül merkez hücreleridir. Orta boyutlu, düzensiz nüveli, belirsiz nükleollü ve dar sitoplazmalı hücrelerdir. Sentrositler yüzey immünoglobülini ekspresse eder. Progenitor hücresi ile karşılaştırıldığında, ağır zincir sınıfında meydana gelen somatik mutasyonlar sonucu değişmiş bir antikor bağlanma bölgesi içerir. Mutasyonlu sentrositlerde, foliküler dendritik hücrelerin uzantılarındaki antijen tuzaklarına afinitedeki artış sonucu, apopitotik ölüme neden olan antijene afinite azalır. Bu uzantılar apopitozisten kurtulmayı sağlar ve sonuçta yeniden bcl-2 protein ekspresyonu başlar. Foliküler dendritik hücre ve T-hücrelerinin yüzey molekülleri (CD23 ve CD40 ligand) ile etkileşim sayesinde sentrositler bcl-6 ekspresyonunu kaybeder ve sentrosit ya bellek B-hücresi ya da plazma hücresine farklılaşır. Foliküler lenfomanın germinal merkezin B-hücreleri olan sentrosit ve sentroblastların tümörü olduğuna inanılmaktadır. Ancak daha çok sentrosit içerir çünkü sentrositlerin apopitoza gidişi, t(14;18) ve normal bcl-2 protein ekspresyonun kaybı yoluyla engellenmektedir (3). Bellek B-hücreleri, tipik olarak folikülün marjinal bölgesinde bulunurlar. Bu hücreler yuvarlak veya hafifçe düzensiz nüve, hafif yoğun kromatin ve az miktarda soluk sitoplazma içerir. Bu hücreler tipik olarak yüzey IgM eksprese eder ama IgD ve Pan B antijenleri, CD5 ve CD10 ekspresyonu yoktur. Plazma hücreleri; yoğun kromatin ve bol, bazofilik sitoplazma, baskın olarak IgG veya IgA içerir, yüzey Ig ve pan B antijenlerini 7

içermez. CD138 ve CD79a eksprese ederler. Bellek B-hücreleri ve plazma hücrelerinde IgV bölgesi genleri mutasyona uğramıştır ancak mutasyonlar devam etmez ve bunlar intraklonal farklılık göstermezler. Postgerminal merkez hücreleri olasılıkla yüzeylerindeki integrin ekspresyonu yoluyla antijen stimülasyonuna uğrayan dokulara yerleşebilir. Marjinal zon lenfoma, postgerminal merkez hücreleri özellikle de marjinal zonun bellek B- hücrelerinden derive olur (3,15). Plazma hücreli myelom kemik iliği yerleşimli IgG veya IgA üreten plazma hücrelerinden gelişir (3).B lenfosit gelişim aşamaları,lokalizasyonları ve gelişen lenfoma tipleri şekil 1 de gösterilmiştir. ŞEKİL 1: B lenfosit gelişim aşamaları, lokalizasyonları ve B-hücreli lenfomalar (3) DİFÜZ BÜYÜK B-HÜCRELİ LENFOMA LENF NODÜLÜ PARAKORTEKSİ B İMMÜNOBLAST LENFOPLAZMASİTOİD LENFOMA LENF NODÜLÜ MEDULLASI PLAZMASİTOİD LENFOSİT KEMİK İLİĞİ KEMİK İLİĞİ VE PRİMER FOLİKÜL BURKİTT LENFOMA FOLİKÜLER B BLAST FOLİKÜLER LENFOMA PLAZMASİTO M/ MYELOM SENTROSİT KEMİK İLİĞİ PREKÜRSÖR B LENFOBLAST NAİF B- HÜCRE GERMİNAL MERKEZ PLAZMA HÜCRESİ PREKÜRSÖR B ALL/LBL B-KLL MANTLE HÜCRELİ LENFOMA MANTLE HÜCRE DİFÜZ BÜYÜK B-HÜCRELİ LENFOMA SENTROBLAST MARJİNAL ZON + MONOSİTOİD B-HÜCRE MARJİNAL ZON LENFOMA 8

DİFFÜZ BÜYÜK B-HÜCRELİ LENFOMA (DBBHL) Normal lenfositin iki katından büyük, normal makrofaj boyutuna eşit veya daha büyük neoplastik B-hücrelerinin diffüz proliferasyonudur (3). Batıdaki tüm non-hodgkin lenfomaların %30-40 ıdır. Gelişmiş ülkelerde yüksek oranda görülür. Ortalama görülme yaşı 70 tir, ancak yaş aralığı geniş olup çocuklarda bile ortaya çıkabilir. Erkeklerde hafifçe fazladır. Görülme sıklığı son senelerde artmıştır (3,17). Nodal veya ekstranodal olabilir. %40 ın üzerinde olgu ekstranodaldir (3,16,18). En sık ekstranodal alanlar gastrointestinal bölge (mide veya ileoçekal bölge) olmakla birlikte herhangi bir bölgeden örneğin deri, SSS, kemik, testis, yumuşak dokular, tükürük bezi, kadın genital organları, böbrek, karaciğer, Waldeyer halkasından da çıkabilir. Kemik iliği tutulumu ve/veya periferik kan tutulumu ile prezentasyonu foliküler lenfomaya göre daha seyrektir (3).Hastalar tipik olarak çok hızlı büyüyen, sıklıkla semptomatik nodal veya ekstranodal kitle ile prezente olurlar. Ancak evrelemede pek çok hasta yaygın hastalığa sahiptir (2,3). Kesin etyolojisi bilinmemektedir. Sıklıkla de novo gelişir, ancak düşük gradeli lenfomaların (ör. FL, B-KLL/SLL, ekstra nodal marginal zon B-hücreli lenfoma, lenfoplazmasitoid lenfoma, NLPHL) transformasyonu ile de gelişebilir (3,17,18,19). Bazı olgularda immün yetmezlik ve otoimmün hastalık bulunur. Bazı ekstranodal olgularda lokal kronik inflamasyon, radyasyon, postmastektomi lenfödem, kemik ve yumuşak dokunun süpüratif inflamasyonu, metal implantlar ve uzun süreli piyotoraks gibi öncüler bildirlmiştir. EBV pozitifliği gibi altta yatan immün defekt risk faktörüdür (19). DL tedavi edilmezse ölümcüldür. Oysa ki tedavi ile potansiyel kürabl olup %50 olgu uzun süre hastalıksız yaşayabilir. Tedavide CHOP (siklofosfamid, doksorubisin, vinkristin ve prednizon)+ rituksimab kullanılır(19). 9

PATOLOJİK BULGULAR Makroskopi: Lenf nodu homojen balıketi kıvamındadır. Çoğu zaman dokunun tamamını siler, bazen kısmi tutulum olabilir. Olguların tümünde hemoraji ve nekroz seçilebilir. Tümöral kitle fibrozis içerebilir veya içermeyebilir (3). Mikroskopi: Genellikle diffüz arşitektürde olup lenf nodunun arşitektürünü tamamen siler, arasıra parsiyel tutulum olabilir. Lenf nodunda interfoliküler veya sinüzoidal infiltrasyon şeklinde parsiyel tutulum olabilir. Bazı olgularda skleroz görülür ve pseudonodüler patern oluşur ancak bu olgularda gerçek folikül formasyonu olmaması nedeniyle CD21,CD35 vb dendritik hücre belirleyicileri ile foliküler lenfoma için tipik olan foliküler dendritik hücre ağı seçilmez. Ekstranodal olgularda epitel yapısını yıkarak yerini alır. Mukozal alanlarda LEL görülebilir. Malt tip lenfoma yanında büyük hücreli alanlar varsa tanı DBBHLekstranodal olarak konmalıdır (17). Sitolojik olarak çok heterojendir, morfolojik varyantlar tanımlanmıştır. Sıklıkla nüvelerinde küçük hücreli lenfomanın kondanse kromatin paternine zıt olarak açık ve veziküler kromatin paterni gösterir. Nükleoller tek veya multipl, değişken boyuttadır (17,20). MORFOLOJİK VARYANTLARI Sentroblastik Varyant Morfoloji: Sentroblastik varyant DBBHL'nın en büyük ve en önemli varyantıdır (3,18). Reaktif GM de bulunan sentroblastlara morfolojik görünümleri benzeyen sellüler komponentten oluşan tümörleri içeren varyanttır. Bu hücreler dar bazofilik sitoplazmalı, ikiden dörde kadar membrana bitişik nükleol içeren, ince kromatinli, yuvarlak veya oval şekilli, veziküler nükleuslu, orta veya büyük boyuttadır (10-14 mm). Bu varyant immunoblastları anımsatan tümör hücreleri içerebilir ancak bunlar %90'dan az oranda olmalıdır. Sentroblastik ve immünoblastik varyant arasındaki sınır keskin değildir ve iki varyantın ayırımı günlük rutinde problem yaratmaktadır. Kendi içinde monomorfik, multilobule ve polimorfik alt varyantlara ayrılabilir (3,17,18). 10

Monomorfik alt varyantta; çoğu neoplastik hücre tipik sentroblastları anımsatır, monoton görünüm vardır. Multilobule alt varyantta; nükleuslar üçten fazla lob içerir ve hücre boyutları ortadan büyüğe değişir. Kromatini çok ince ve sıklıkla nükleolü çok zor seçilen hücrelerdir. Polimorfik alt varyant; sentroblast benzeri ve immünoblast benzeri hücrelerin ve her ikisine de benzeyen hücrelerin karışımından oluşur (18). İmmunohistokimyasal özellikler: Hücreler değişik Pan B-hücre markerlarını (CD19, CD20, CD22 ve CD79a vb.) eksprese eder. Pek çok olguda yüzey Ig gösterilebilir (IgM>IgG). CD5 %10 olguda pozitif olabilir. CD10 ekspresyonu değişken oranda görülür. Değişken, ancak genellikle neoplastik hücrelerin az bir kısmında zayıf CD30 ekspresyonu görülür. Proliferatif indeks Ki-67 ile gösterilebilir, sıklıkla % 40 dan yüksektir (3,17,18). İmmünoblastik Varyant Morfoloji: Bu varyant; tek, santralde lokalize nükleol ve oldukça iri bol bazofilik sitoplazma içeren immünoblastik hücreleri %90 dan fazla oranda içerir. Plazma hücre diferansiasyonu olabilir veya olmayabilir, ayrıca plazma hücresi ve plazmablastlarla karışık görülebilir (2,3,18). Bu histolojik kriterlere göre bu varyant DLBCL nın sadece çok az bir kısmını oluşturur. Kiel klasifikasyonuna göre bu varyant tüm NHL ların sadece %4 ünü oluşturur. Bazı çalışmalarda immünoblastik varyant çok agresif grup olarak identifiye edilmiştir(18). Bu varyantın ekstramedüller tutulumlu plazmablastik varyant plazma hücreli myelom ile ayırımda klinik ve/veya immünfenotipik bulgular çok önemlidir (3). İmmunohistokimyasal özellikler: İmmünohistokimyasal özellikleri büyük ölçüde sentroblastik varyant ile aynıdır. Plazmasellüler diferansiasyon gösteren olgularda immünoblast, plazmablast ve proplazma hücresine benzer Ig hafif zincir ekspresyonu gösterirler (18). Anaplastik Varyant Morfoloji: Reed-Stenberg hücrelerine benzeyen bizar, pleomorfik nüve içeren yuvarlak, oval veya poligonal çok büyük hücrelerden oluşur. Hücreler karsinomu andıracak şekilde kohezyon gösterir ve genellikle sinüzoidal paternde büyürler (3). Tanı ALK pozitifliğinin 11

gösterilmesi ile konur (18). Bu varyant Sitotoksik T-hücrelerinden kaynaklanan anaplastik büyük hücreli lenfoma ile biyolojik ve klinik olarak ilişkisizdir (3). İmmunohistokimyasal özellikler: Neoplastik hücreler B-hücre ilişkili antijenler (CD19, CD20, CD22) ile birlikte CD30 ekspresyonu gösterirler. CD30 ekspresyonu güçlü membranöz veya golgi boyanmasından, zayıf diffüz sitoplazmik boyanmaya kadar değişken şekildedir. Bu boyanma paternleri T/Null hücreli ALKL nin devamlı güçlü membranöz ekspresyonuna zıttır. CD30 a ek olarak CD23, CD21, CD38, CD71 ve CD25 gibi aktivasyon ilişkili antijenleri eksprese eder. CD45 neoplastik hücrelerde eksprese edilebilir, ama CD15 ekspresyonu sıklıkla yoktur (18). T-hücre /Histiositten Zengin Varyant Morfoloji: Bu varyantta esas hücre komponenti non-neoplastik T-hücreleri ve/veya histiyositlerdir. Küçük T-hücreleri ve histiositler %90 dan fazladır. Neoplastik büyük B- hücreleri kural olarak tüm hücrelerin %10 undan azdır (17). Histiositler epiteloid görünümde olabilir. Büyük hücreler oldukça atipiktir, L&H hücreleri, sentroblast, immünoblast veya Reed Stenberg hücrelerine benzer. Az sayıda olmak üzere küçük B- hücreleri bulunabilir. Küçük B-hücrelerinin sayıca artmış olduğu alanların varlığı nodüler lenfosit baskın Hodgkin lenfoma ile karışmasına neden olur ancak nodüler paternin olmaması ayrımda yardımcıdır. Büyüme paterni diffüzdür ve ince retiküler fibrozis sıklıkla vardır (3). Kemik iliği tutulumu paratrabeküler veya diffüz büyüme paterni şeklinde olabilir. Hücresel kompozisyon primer biyopsi materyali ile benzerdir (18). İmmunohistokimyasal özellikler: %90'dan fazla miktarda bulunan küçük lenfositlerin baskın olarak T-hücre fenotipinde, az sayıdaki büyük hücrelerin ise B-hücre fenotipinde olduğu görülür. T-hücreleri immünofenotipik olarak genellikle CD4(+) ve CD8(-) hücrelerdir. Büyük B-hücreleri pan-b markerları ile boyanır. Pekçok olguda monotipik yüzey ve sitoplazmik Ig gösterilebilir. J zincir ekspresyonu sadece az sayıda olguda gösterilebilir. Çok nadiren CD30 ve EMA ekspresyonu saptanır (18). Plazmablastik Varyant Morfoloji: Tipik olarak HIV enfeksiyonlu kişilerde oral kavitede ortaya çıkan nadir bir DBBHL varyantıdır. Çoğu vaka immünsupresedir ve/veya viral enfeksiyon (sıklıkla EBV) hikayesi mevcuttur (21). Morfolojik olarak genellikle immünoblastik lenfomadan 12

ayıredilemez (3). Histolojik görünüm relatif olarak monomorfiktir. Sıklıkla tingible body makrofajların arasında dağılmış dört köşeli görünümde büyük neoplastik hücreler koheziv büyüme gösterirler. Neoplastik hücreler tek belirgin nükleol veya çok sayıda nükleol içeren, ekzantrik veya santral yerleşmiş nüveler içerirler.. Tümör hücreleri B- immünoblast ve plazma hücresi arasında değişik diferansiasyon dönemleri gösterdiklerinden plazmablastik diye tanımlanırlar. Russel cisimcikleri ve dutcher cisimcikleri bulunmaz. Sitoplazma boldur ve giemsa ile boyanınca koyu bazofilik görülür. Apopitotik figürler boldur ve sıklıkla tek hücre nekrozu ve çoksayıda mitotik figür görülür. İnfiltrasyon klasik proplazma hücreleri ve matür plazma hücrelerinden yoksundur. Neoplastik hücrelerle karışık sadece çok az reaktif lenfosit bulunur (18). İmmunohistokimyasal özellikler: AIDS ilişkili plazmablastik DBBHL varyantında CD20 ve CD45 gibi ortak lenfoid antijen ekspresyonu ya yoktur veya çok belirsizdir. Hastaların yarıdan fazlasında IgG monotipik sitoplazmik ekspresyonu görülür ve sadece üçte birinde Ig hafif zinciri gösterilebilir. Plazmablastik varyantta sıklıkla VS38C monoklonal antikorunun plazma hücreleri ile güçlü reaksiyonu görülür. CD138 antijen ekspresyonu da görülür. Bu varyantta CD45 ve CD20 ile negatiflik veya zayıf boyanma olması, olguların %50'sinde CD79a'nın güçlü ekspresyonu, VS38C ile değişmez pozitiflik olması belirgin plazma hücre diferansiasyonunu gösterir. Olgu analizlerinde bcl-2 protein ekspresyonu heterojendir. Bcl-6 ekspresyonu hücrelerin sadece bir kısmında olur (18). Full-Lenght Alk Ekpresyonu Gösteren Dlbcl Monomorfik büyük immünoblast benzeri hücrelerden oluşur. Bu hücreler büyük santral nükleol içeren yuvarlak, soluk nüveli, bol miktarda amfofilik (Giemsa ile bazofilik) sitoplazma içeren ara sıra plazmablastik diferansiasyon gösteren hücrelerdir. Bazen Reed- Stenberg hücrelerine benzer hücreler görülür. Lenf nodu tamamı ile infiltre olup, sinüsler tümörle invazedir. Tümör hücreleri CD30 negatif, CD45 pozitif (zayıf), EMA pozitif (güçlü), vs38c (endoplazmik retikulum ilişkili marker) pozitiftir. Hücreler hafif zincir restriksiyonlu intrasitoplazmik Ig A içerirler. CD4 ve CD57 dışında diğer T ve B-hücre ilişkili belirleyicileri içermezler. ALK protein granüler sitoplazmik ve golgide dot like pozitiflik gösterir. ALK kinaz upregülasyon mekanizması bilinmemektedir. Bu lenfoma sıklıkla erişkinlerde ve erkeklerde görülür. Bu hastalık agresif seyreder (3). 13

FENOTİPİK VARYANTLARI DBBHL yukarıda bahsedilen morfolojik alt tiplerin yanında son yıllarda B-hücre gen ekspresyon profili dikkate alınarak da bazı alt tiplere ayrılmıştır. Buna göre DBBHL; germinal merkez profili gösteren ve germinal merkez-dışı profil gösteren (aktive B- hücreli veya tip 3) olmak üzere iki gruba ayrılmaktadır (2,4,22,23). Bu ayrım yapılırken esas olarak bcl-6, CD10, MUM-1 (IRF4) ekspresyonu dikkate alınmaktadır (şekil 2). Germinal merkez profili; CD10(+) veya CD10(-), bcl-6(+), MUM1(-) olarak tanımlanmıştır. Germinal merkez dışı profil; CD10(-), bcl-6(-) veya CD10(-), bcl-6(+), MUM1(+) olarak tanımlanmıştır (4,7,22,24,25,26). ŞEKİL 2: İmmünohistokimyasal profil temelinde olguların germinal merkez ve germinal merkez-dışı B-hücre subgruplarına ayırım algoritması. 14

GM İLİŞKİLİ ANTİJENLER Bcl-6 DBBHL da olguların %30 ve üzerinde bir protoonkogen olan Bcl-6 yı da kapsayan kromozom 3q27 bölgesi anomalileri görülmektedir. Bcl-6protein normal lenfoid dokuda GM-B-hücreleri tarafından eksprese edilen ve squence-spesifik-transcriptional inhibitör fonksiyonu gösteren bir zinc-finger proteindir(4). Bcl-6 baskılayıcı genler, hücre siklus kontrolü, inflamasyon ve lenfosit aktivasyon ve diferansiasyonunda gerekmektedir. Bcl-6 ekspresyonu, nodal veya ekstranodal alanları da içeren çeşitli DBBL serilerinde %57 ile %100 arasında değişen oranlarda bulunmuştur. Bu farklılığın nedeni kullanılan antijen teknikleri ve çeşitli hibridom klonlarına bağlıdır. Bcl-6 proteini hücre çekirdeğinde bulunduğu için buna karşı olan monoklonal ve poliklonal antikorlar, hücre çekirdeğinde pozitiftir. Bcl-6 protein ekspresyonu normal lenfoid dokuda GM-B-hücrelerinde(sentroblast ve sentrosit) mevcut iken folikül mantle alanındaki naive B-hücrelerinde yoktur. Ayrıca immünoblast, plazma hücreleri, germinal merkez içinde yer alan makrofaj ve foliküler dendritik hücrelerde Bcl-6 ekspresyonu yoktur. Marjinal zon B-hücreleri ile foliküler ve interfoliküler alanda CD4+ T lenfositlerinin küçük bir bölümünde bcl-6 ekspresyonu görülebilmektedir. DBBL immünoblastik varyantta bcl-6 ekspresyonu sentroblastik varyanta göre daha düşüktür. Bu bulgular normal lenfoid dokudaki bulgular ile benzerdir. Nodal veya ekstranodal DBBL arasında ekspresyon farkı yoktur. DBBL ların aksine mantle hücreli ve düşük grade li marginal zon lenfomalarda ekspresyon negatif iken düşük grade komponentle birlikte olan yüksek grade li marginal zon lenfomada bcl-6 ekspresyonu gösterildi. Bu bulgularla kabul edilen hipotez; bcl-6 protein ekspresyonunun daima lenfomanın GM hücre orijinli olduğunu işaret etmesidir. İmmünohistokimyasal olarak yapılan çalışmalarda bcl-6 protein ekspresyonunun seviyesi ile bcl-6 gen yeniden düzenlenmenin varlığı ya da yokluğu arasında bir ilişki yoktur ve bcl-6 protein ekspresyonunun prognostik önemi henüz araştırılmaktadır (4,18). 15

CD10 CD10 100 kd ağırlığında GM-B-hücreleri, lenfoid prekürsörler ve bazı epitelyal hücre yüzeyinden eksprese olan bir proteolitik enzimdir. İn vivo ve in vitro çalışmalarda B-hücre gelişiminin düzenlenmesinde CD10 un fonksiyonu olduğu görüldü.cd10 ekspresyonu lenfoblastik, Burkitt ve foliküler lenfomanın karakteristik bir bulgusudur(4,27). CD10 foliküler lenfomanın büyük bölümünde pozitif iken diğer küçük hücreli lenfomalarda negatiftir. DBBL da olguların %20-40 ında parafin kesitlerde pozitiflik mevcuttur. Boyanma tümör içinde homojen ve membranözdür.cd10 pozitifliğinin sıklığı DBBL nın prezentasyon alanına göre farklılık göstermemektedir(28). CD10(+) ve CD10(-) olgular arasında klinik özellikler benzerdir. CD10 un prognostik önemi için yapılan yalnızca birkaç çalışma mevcuttur ve sonuçlar çelişki yaratmaktadır. Xu ve arkadaşlarının yaptığı çalışmada CD10 ekspresyonunun zıt prognostik faktör olduğu tespit edilmiştir (27). POST-GM İLİŞKİLİ ANTİJENLER MUM1/IRF4 (Multiple Myeloma Oncogen 1/ Interferon Regulating Factor 4) Multipl myelomda görülen t(6;14)(p25;q32) sonucu, 14.kromozomda yer alan MUM1/IRF4 arasındaki jukstapozisyon, MUM1/IRF4 geninin yüksek ekspresyonuna neden olmaktadır. Bu da tümörogeneziste yer almaktadır. Normal B-hücrelerinde MUM1 ekspresyonu, GM B-hücre diferansiasyonunun son aşaması ve plazma hücre matürasyonuna kadar ki aşamalarda görülebilmektedir. İmmünohistokimyasal olarak normal lenfoid dokuda MUM1 ekspresyonu hem plazma hücreleri ve bazı aktive T- hücrelerinde hem de apikal açık zonda yer alan bcl-6(-) GM B-hücrelerinin bir bölümünde tespit edilmiştir(29). MUM1 in boyanma paterni genellikle nükleer, bazen de sitoplazmik pozitiflik şeklindedir. DBBL da MUM1 ekspresyonu, B-hücre diferansiasyonunun geçiş evresinden köken aldığını işaret etmektedir ve olguların %50-70 inde bildirilmektedir. Mikro dizi analizinde, MUM1 in aktive B-hücre benzeri DBBHL tarafından eksprese edilen gen grupları içinde yer aldığı görülmüştür (30). 16

VS38c VS38c,nolineage spesifik Mouse monoklonal bir antikordur ve endoplazmik retikulum ile tepkime göstermektedir. Lenfoid dokularda,yoğun sekretuar aktivite gösteren plazma ve plazmablastik hücreler ile kuvvetli reaksiyon vermektedir (21). CD138 (syndecan-1) CD138, çeşitli ekstrasellüler matriks proteinleri ile bir köprü gibi görev yapan hücre yüzey adezyon molekülüdür. Esas olarak epitelyal hücreler ve hemapoetik B-hücre dizisinde eksprese edilmektedir. CD138 kemik iliğinden köken alan prekürsör B-hücreleri tarafından eksprese edilirken naive B ve GM B-hücrelerinde ekspresyon yoktur. Bu proteinin tekrar ekspresyonu B-hücresinin germinal merkezden çıkıp immünoblast ya da plazma hücresine matürasyonu boyunca görülmektedir (18). VS38c ve CD138 in her ikisi hem normal hem de neoplastik plazma hücreleri ve küçük B-hücreli lenfomanın plazmasitik diferansiasyon gösteren tipinde pozitiflik gösterirken DBBL da seyrek olarak görülmektedir (21). Ancak terminal diferansiye hücre kaynaklı olduğu düşünülen AIDS ilişkili lenfomalarda VS38c ve CD138 ekspresyonu oldukça sıktır. CD138, primer efüzyon lenfoması ve AIDS ilişkili immünoblastik lenfomada eksprese edilmektedir. VS38c ise Ig gen yeniden düzenlenmesi ve AIDS ilişkili immünoblastik DBBL nın tanısında kullanılmaktadır (31). DİFFÜZ BÜYÜK B-HÜCRELİ LENFOMALARDA PROGNOZ DBBHL agresiftir ama çoklu ajan kemoterapisi ile kür olabilir. Klinik parametrelerin temel alındığı IPI (international prognostik indeks) yaşam süresi ile yakından ilişkilidir (2,3). Yüksek proliferatif indeks bazı serilerde kötü prognoz ile ilişkili bulunmuştur (32). Bcl-2 ekspresyonu yaşam süresinden bağımsız olarak kötü seyir ile ilişkilidir. Malign hücrelerin çoğunda p53 aşırı salınımı diğer bir kötü prognostik belirleyicidir. Pek çok çalışma immünoblastik varyantın sentroblastik varyanttan hafifçe daha kötü prognozlu olduğunu bildirmiştir, diğer bazı çalışmalar ise bunu reddetmektedir. Bcl-6 translokasyonu iyi prognozla ilişkilidir. GM profili gösteren olgular, GMD (aktive B) profili gösterenlere göre daha iyi prognoza sahiptir (3). 17

ZAP-70 (Zeta-chain (TCR)-associated protein kinase 70): Moleküler ağırlığı 70 kilodalton (kda) olan, tirozin kinaz ailesinden bir proteindir (şekil 3). ZAP-70 normalde T-hücre ve natural killer hücrelerde eksprese edilir. T-hücre sinyalizasyonunun başlatılmasında kritik bir role sahiptir (8). ZAP-70 B-hücrelerinde de eksprese edilir ve kronik lenfositik lenfomanın farklı formlarında prognostik olarak kullanılır. T lenfositler; T-hücre reseptör (TCR) leri antijen sunan hücrelerin (makrofaj, dendritik hücre ve B-hücre vb.) sundukları antijen parçalarının uzantıları ile etkileşime girince aktive olurlar. Bu aktivasyondan sonra tirozin kinaz hücre içindeki CD3 kompleksini fosforile ve aktive eder. ZAP-70 ile bağlanan CD3-zeta, CD3 ailesinin en önemli üyesidir. ZAP-70 in SH2-bölgesi ZAP-70 transmembran proteinini fosforile eder ki CD3-zetanın immünoreseptörtirozin-temel aktivasyon motifleri (ITAMs) çift fosforile olur. Fosforile LAT (T-hücre aktivasyonunun bağlayıcısı) sinyal proteinleri bağlanması değiştiği için sonuçta birçok gen yapımı gerçekleşir, T-hücre aktivasyonu oluşur. Bu durum T-hücre farklılaşması, çoğalması ve sitokin sekreyonuna izin verir (33). ŞEKİL 3 : ZAP-70 in moleküler yapısı (33) 18

Son yıllarda yapılan çalışmalarda protein ZAP-70 varlığının immünoglobulin ağır zincir mutasyonu içermeyen KLL olgularında bildirilmesi dikkat çekicidir. KLL; indolent seyirli, tedavide yalnızca izlemin kullanıldığı bir hastalık olmasına rağmen, bazı olgular klinik olarak çok hızlı seyirli olup, erken agresif tedaviye ihtiyaç duymaktadır. ZAP-70 bu agresif seyreden grubu belirlemede kullanılan bir parametredir. Son çalışmalarda KLL subtiplerinde IgV genlerinde somatik hipermutasyon yokluğunda ZAP-70 artmış olarak izlenir. Ig genlerindeki somatik hipermutasyon germinal merkez farklılaşma devresindeki B-hücrelerinin değişim mekanizmasını aktive eder. Somatik hipermutasyon B-hücreleri için belirleyicidir. IgV genleri mutasyonsuz olan KLL ler germinal merkezi pas geçen naif, pregerminal B-hücrelerinden, mutasyonlu olan KLL ler postgerminal merkez hücrelerinden kaynaklanır. Mutasyonsuz IgV genleri içerenler daha kötü prognozludur. ZAP-70 ekspresyonu Ig V genlerinde somatik hipermutasyon yokluğu ile koreledir (8,9,10,11,12). Bu çalışmada; düşük gradlı periferik B-hücreli lenfomalardan B-KLL de mutasyon içeren ve içermeyen grubu ayırt ederek prognostik belirleyici olarak kullanılan ZAP-70 in, son yıllarda tanımlanan DBBHL morfolojik ve fenotipik alt gruplarındaki ekspresyonu araştırılmıştır. 19

MATERYAL VE METOD Ekim 2001-Mayıs 2008 yılları arasında Sağlık Bakanlığı İstanbul Eğitim ve Araştırma Hastanesi Patoloji Kliniği tarafından tanı konulan 35 adet nodal de novo DBBHL olgusu çalışmaya alındı. Olgular seçilirken daha evvel kliniğimizde uygulanarak raporlarda belirtilmiş olan CD20, CD3, CD5, CD38, SiklinD1, CD21 boyanma özellikleri göz önüne alınmıştır. Seçilen olguların 34 ü CD20 pozitif 1 i CD20 negatif, tümü CD3 negatif, CD5 negatif ve SiklinD1 negatiftir. Olguların tümü formalinde fikse edilmişti. Doku takibinden sonra hazırlanan parafin bloklar ve H+E preperatlar arşivden bulundu. Olgulara ait H+E boyalı kesitler tekrar gözden geçirilerek immünohistokimyasal çalışma için uygun parafin bloklar seçildi. İmmünohistokimyasal çalışma ve değerlendirmeye elverişli olmayanlardan yeniden H+E için 3-4 mikron kalınlığında kesitler alındı. İmmünohistokimyasal olarak CD10,Bcl- 6,MUM-1(IRF4) ve ZAP-70 antikorları uygulandı. Hazırlanan preparatlar iki ayrı patolog tarafından ışık mikroskobunda incelendi. Olguların morfolojik ve immünohistokimyasal özellikleri kaydedildi. KULLANILAN ANTİKORLAR Çalışmamızda toplam 35 olguya CD10,Bcl-6,MUM-1(IRF4) ve ZAP-70 antikorları uygulandı. Kullandığımız antikorlar liyofilize doku kültürlerinden elde edildiği için uygun dilsyon oranlarına göre distile su ile sulandırıldı (Tablo 1). TABLO 1: Kullanılan primer antikorlar ANTİKOR FİRMA KLON DİLÜSYON CD10 Novocastra 56C6 1:100 Bcl-6 Novocastra LN22 1:100 MUM-1 (IRF4) Diagnostic Biosistem MUM1p 1:25 ZAP-70 Neomarkers 2F3.2 1:200 20

İMMÜNOHİSTOKİMYASAL BOYAMA YÖNTEMİ İmmünohistokimyasal çalışma streptovidin-avidin-biotin yöntemiyle yapıldı. İmmünohistokimyasal boyama için parafin bloklardan pozitif şarjlı lamlara 3-4 mikronluk kesitler alındı. Kesitler 60 0 C etüvde bir gece bekletilerek deparafinize edildi. Etüvden çıkarıldıktan sonra 15 dakikada 5 kez ksilenden geçirilerek deparafinizasyon tamamlandı. Daha sonra 20 dakikada üç farklı %99 luk ve üç farklı %96 lık etil alkolden geçirilerek hidrate edildi. Distile suda 5 dakika yıkandı. Mikrodalga fırında, 4 defa 5 dakika olmak üzere, Bcl-6 için 0.01M lik EDTA buffer (ph=8.0), diğerleri için 0.01 lik sitrat buffer (ph=6.0) içinde kaynatıldı. Mikrodalgadan çıkarıldıktan sonra 20 dakika oda ısısına gelinceye kadar bekletildi. Distile su ile yıkandı. Fosfat buffer salin (PBS) de 2 kez üçer dakika bekletildi. Lam üzerindeki dokuların etrafı hidrofobik kalemle çizildi. %3 lük hidrojen peroksit ile 15 dakika bekletildikten sonra PBS te 2 kez üçer dakika bekletildi. 10 dakika protein blokajı yapıldı. Yıkamadan sonra primer antikorlar damlatılarak 1 saat süreyle inkübasyona bırakıldı. PBS te 2 kez üçer dakika bekletildikten sonra 15 dakika süreyle streptavidin peroksidaz uygulandı. Tekrar PBS ten geçirilen dokular AEC kromojen ile 15 dakika inkübe edildi. Renk alan preperatlar distile suda yıkandıktan sonra Mayer hematoksilende bir dakika bekletildi. Distile su ile yıkandıktan sonra uygun kapama vasatı ile kapatıldı. İSTATİSTİKSEL DEĞERLENDİRME: Bu çalışmada istatistiksel analizler GraphPad Prisma V.3 paket programı ile yapılmıştır. Verilerin değerlendirilmesinde tanımlayıcı istatistiksel metotların (ortalama, standart sapma) yanı sıra ikili grupların karşılaştırmasında bağımsız t testi, nitel verilerin karşılaştırmalarında ki-kare testi kullanılmıştır. Sonuçlar, anlamlılık p<0,05 düzeyinde değerlendirilmiştir. 21

BULGULAR Ekim 2001-Mayıs 2008 yılları arasında Sağlık Bakanlığı İstanbul Eğitim ve Araştırma Hastanesi Patoloji Kliniği tarafından rapor edilen 35 adet nodal de novo DBBHL olgusu çalışmaya alındı. Çalışmaya alınan en genç olgu 21 yaşında, en yaşlı olgu 83 yaşında olup, bu olguların yaş ortalaması 60.09 olarak saptandı. Olguların %45,7 (n=16) si kadın ve %54,3 (n=19) ü erkekti. TABLO 2: Olguların yaş ortalaması n Minimum Maksimum Ortalama Standart sapma Yaş 35 21 83 60,09 17,63 TABLO 3: Olguların cinsiyet oranları Cinsiyet n % Kadın 16 45,7 Erkek 19 54,3 Total 35 100,0 Olgular CD10, bcl-6 ve MUM1 ile immünohistokimyasal boyanma özellikleri göz önüne alınarak germinal merkez fenotipi gösterenler ve germinal merkez dışı fenotip gösterenler olmak üzere iki alt tipe ayrıldı. Germinal merkez fenotipi gösteren olgu sayısı 18 (%51.43), germinal merkez fenotipi göstermeyen olgu sayısı 17 (%48.57) idi. TABLO 4 : Olguların fenotipik alt tip yüzdeleri Fenotipik alt grup N % Germinal Merkez 18 51,43 Germinal Merkez Dışı 17 48,57 Total 35 100,0 22

GRAFİK 1: Germinal merkez ve germinal merkez dışı olguların yaşa göre dağılımı. Yaş 70 65 60 55 50 45 40 Germinal Merkez Nongerminal Merkez Olguların H+E kesitlerdeki morfolojik özellikleri değerlendirilerek WHO-2001 de belirtilen morfolojik varyantlar ayırt edildi. Bu değerlendirme sonucunda 26 olgu (%74,3) sentroblastik varyant, 4 olgu (%11,4) immünoblastik varyant, 2 olgu (%5,7) T-hücreden zengin varyant, 2 olgu (%5,7) anaplastik varyant ve 1 olgu (%2,9) plazmablastik varyant olarak belirlendi. Belirlenen morfolojik varyantlar ile daha önce rapor edilen varyantlar arasında farklılık saptanmadı. TABLO 5: Olguların morfolojik varyantlara göre dağılımı MORFOLOJİK TİPLER N % Sentroblastik varyant 26 74,3% İmmünoblastik varyant 4 11,4% T-Hücre/ histiyosittten zengin varyant 2 5,7% Anaplastik varyant 2 5,7% Plazmablastik varyant 1 2,9% Sentroblastik varyant 15 olgu (%83,3) germinal merkez fenotipinde, 11 olgu (%64,7) germinal merkez dışı fenotipinde idi. İmmünoblastik varyant 1 olgu (%5,6) germinal merkez fenotipinde, 3 olgu (%17,6) germinal merkez dışı fenotipinde idi. T- hücreden zengin varyant 2 olgu (%11,1) germinal merkez fenotipinde idi. Anaplastik varyant 2 olgu (%11,8) germinal merkez dışı fenotipinde idi. Plazmablastik varyant 1 olgu (%5,9) germinal merkez dışı fenotipinde idi. Morfolojik varyant ile fenotip arasında istatistiksel olarak anlamlı ilişki saptanmadı (p=0,795). 23

TABLO 6 : Morfolojik varyantların germinal merkez ve germinal merkez dışı fenotipik alt tiplere oranları. Germinal Nongerminal Morfolojik Tipler Merkez Merkez Total Sentroblastik Varyant 15 83,3% 11 64,7% 26 74,3% İmmünoblastik v 1 5,6% 3 17,6% 4 11,4% T-hücreden zengin v 2 11,1% 0 0,0% 2 5,7% Anaplastik v 0 0,0% 2 11,8% 2 5,7% Plazmablastik v 0 0,0% 1 5,9% 1 2,9% χ²:1,67 p=0,795 GRAFİK 2: Germinal merkez ve germinal merkez dışı fenotipik alt grupların morfolojik varyantlara göre dağılımı. Morfolojik Varyantlar Tipler Germinal Merkez Nongerminal Merkez % 90,0% 80,0% 70,0% 60,0% 50,0% 40,0% 30,0% 20,0% 10,0% 0,0% Sentroblastik Varyant İmmünoblastik v T Hücreden zengin v Anaplastik v Plazmablastik v Olgulardan 8 i ZAP70 ile sitoplazmik boyanma, 1 i sitoplazmik ve nükleer boyanma gösterdi. Her iki boyanma paterni pozitif boyanma olarak değerlendirildi. ZAP70 ile pozitif boyanma gösteren 3 olgu (%33.3) germinal merkez fenotipi, 6 olgu (%66.7) germinal merkez dışı fenotipi göstermekte idi. 26 olgu ZAP70 negatifti. Bunlardan 15 olgu (%57.7) germinal merkez fenotipi, 11 olgu (%42.3) germinal merkez dışı fenotipinde idi. Fenotipik alt tip ile ZAP70 ekspresyonu arasında istatistiksel olarak anlamlı ilişki saptanmadı (p=0,208). 24

GRAFİK 3: ZAP-70 ekspreyonunun cinsiyete göre dağılımı. ZAP-70 Negatif Pozitif % 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Kadın Erkek TABLO 7: ZAP-70 ekspreyonunun germinal merkez ve germinal merkez dışı fenotipik alt gruplara oranları ZAP-70 Negatif Pozitif Germinal Merkez 15 57,7% 3 33,3% Nongerminal Merkez 11 42,3% 6 66,7% χ²:1,58 p=0,208 GRAFİK 4: ZAP-70 ekspreyonunun germinal merkez ve germinal merkez dışı fenotipik alt gruplara göre dağılımı. ZAP-70 Negatif Pozitif % 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Germinal Merkez Nongerminal Merkez 25

ZAP70 pozitif olarak izlenen 6 olgu (%66,7) sentroblastik varyant, 1 olgu (%11,1) immünoblastik varyant, 1 olgu (%11,1) T-hücreden zengin varyant, 1 olgu (11,1) anaplastik varyant morfolojisinde idi. ZAP70 ile boyanma göstermeyen 20 olgu (%76,9) sentroblastik varyant, 3 olgu (%11,5) immünoblastik varyant, 1 olgu (%3,8) T-hücreden zengin varyant, 1 olgu (%3,8) anaplastik varyant ve 1 olgu (%3,8) plazmablastik varyant morfolojisinde idi. Morfolojik varyant ile ZAP70 ekspresyonu arasında istatistiksel olarak anlamlı ilişki saptanmadı (p=0,795). TABLO 8 : Morfolojik varyantlara göre ile ZAP-70 ekspresyon oranları. ZAP-70 Negatif Pozitif Sentroblastik Varyant 20 76,9% 6 66,7% İmmünoblastik v 3 11,5% 1 11,1% T-hücreden zengin v 1 3,8% 1 11,1% Anaplastik v 1 3,8% 1 11,1% Plazmablastik v 1 3,8% 0,0% χ²:1,67 p=0,795 GRAFİK 5: ZAP-70 ekspresyonunun morfolojik varyantlara göre dağılımı. ZAP-70 Negatif Pozitif % 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Sentroblastik İmmünoblastik THZBHL Anaplastik Plazmablastik 26

TARTIŞMA Diffüz büyük B-hücreli lenfomalar (DBBHL) erişkinde en sık görülen lenfoid neoplazi grubudur(1,2,3,21). WHO sınıflamasında yer alan morfolojik varyantların aynı patolog tarafından tekrar edilebilirliği ve patologlar arası uyumluluğu oldukça azdır (21).Üstelik aynı morfolojik alt tip içinde yer alan olguların prognozları farklılık gösterebilmektedir. Son yıllarda DBBHL olguları fenotipik ve genotipik olarak alt tiplere ayrılmaya ve yeni prognostik parametreler ortaya koyulmaya çalışılmaktadır (4). Zeta-chain-associated protein kinase 70(ZAP-70) protein-tirozin kinaz ailesinden, normalde T-hücreleri ve natural killer hücrelerinde ekspresse edilen, T-hücre sinyalinin başlamasında kritik rolü olan bir proteindir. B-hücreli kronik lenfositik lösemi (B-KLL) olgularında negatif prognostik faktör olarak saptanmıştır (8). DBBHL olgularının bir kısmında da ZAP-70 ekspresyonu bildirilmektedir ancak bu olguların morfolojik ve fenotipik alt tiplere göre dağılımı belirlenmiş değildir (9,11). Bu çalışmada; DBBHL ların morfolojik ve fenotipik alt grupları, DBBHL larda ZAP-70 ekspresyonu sıklığı ve bu ekspresyonun alt gruplar ile ilişkisi araştırılmıştır. DBBHL ortalama 70 yaşta ortaya çıkar ve hafif oranda erkek baskınlığı (M/F=1,2/1) gösterir (18). Muris ve ark. %63,3 (n=45) erkek ve %43,7 (n=28) kadın olmak üzere toplam 71 de novo DBBHL olgusunun yaş ortalamasını 62 (23-82) olarak bildirmişlerdir (30). Bizim çalışmamızdaki %54,3 (n=19) erkek ve %45,7 (n=16) kadın olmak üzere toplam 35 de novo DBBHL olgusunun yaş ortalaması 60.09 (21-83) olarak izlenmiş olup literatürdeki bulgularla uyumlu bulunmuştur. Benzer şekilde olgularımızın erkek /kadın oranı =1,1/1 olarak bulunmuş olup literatürdeki bulgularla uyumludur (18). WHO klasifikasyonunda DBBHL nın 6 morfolojik varyantı tarif edilmektedir. Bunlar 4 ana iki de az görülen varyant olarak belirtilmiştir. Ana varyantlar sentroblastik, immünoblastik, T-hücre/ histiositten zengin ve anaplastik varyantlardır. Az görülen varyantlar ise plazmablastik ve full-lenght ALK ekspresyonu gösteren varyanttır. En sık görülen varyant sentroblastik varyanttır(3). Çalışmamızda 26 olgu (%74,3) sentroblastik varyant, 4 olgu (%11,4) immünoblastik varyant, 2 olgu (%5,7) T-hücreden zengin varyant, 2 olgu (%5,7) anaplastik varyant ve 1 olgu (%2,9) plazmablastik varyant olarak değerlendirilmiştir. Yeniden değerlendirilen morfolojik varyantlar ile aynı patolog tarafından daha önce rapor edilenler arasında farklılık saptanmamıştır. İki ayrı patoloğun 27

saptadığı morfolojik varyantlar arasında da fark oluşmamıştır. WHO sınıflamasında en sık varyant olarak bildirilen sentroblastik varyant bizim çalışmamızda da en sık (%74,3) varyant olarak izlenmiştir. Olgularımız arasında az görülen varyantlardan plazmablastik varyant olmak üzere sadece bir olgu mevcuttur. Alizadeh ve ark. DBBHL da germinal merkez B-hücre benzeri ve aktive B-hücre benzeri olmak üzere moleküler olarak farklı iki grup ayırt etmişlerdir (34). Rosenwald ve ark bu iki gruptan farklı olarak Tip3 DBBHL tanımı yapmışlardır (35). GM B-hücre fenotipi gösteren olgular, normal germinal merkez B-hücre genlerini (CD10, bcl-6, CD38vb.); aktive B-hücre fenotipi gösteren olgular periferik kan B-hücre genlerini (MUM1vb.) ekspresse etmekte, Tip 3 fenotipi gösteren olgular ise herhangi bir geni yüksek düzeyde eksprese etmemektedir (34,35). Bununla birlikte, Alizadeh ve Rosenwald in çalışmalarında kullanılan cdna mikroarray ve oligonükleotid mikroarray teknolojisinin rutinde uygulanması kolay olmadığından, immünohistokimyasal yöntemler kullanılarak fenotipik alt grupları belirlemeye yönelik araştırmalar yapılmıştır. Bu çalışmalarda B-hücrelerinin farklılaşma antijenleri göz önüne alınmıştır. Farklılaşma antijenlerinden CD10 ve bcl-6 germinal merkez B-hücrelerinde ekprese edilir (36). MUM1/IRF4 ise germinal merkezden çıkarken veya çıktıktan sonraki B-hücreleri ve plazma hücre farklılaşmasına uğrayan B-hücrelerinin değişken sayıda V(H) somatik mutasyona uğraması sonucu eksprese edilmeye başlar (37). Hans ve ark. DBBHL ları rutin patolojik materyalde immünohistokimyasal olarak bcl-6/mum1/cd10 antikorları ile B- hücre farklılaşma aşamalarına göre sınıflamışlardır. Bu çalışmada; CD10 pozitif veya bcl-6 pozitif ve MUM1 negatif olgular germinal merkez fenotipinde, bunun dışındaki olgular germinal merkez dışı fenotipte kabul edilmiştir. Ayrıca bu ayırımın prognostik olarak yararlı olduğunu ileri sürmüşlerdir (6). Daha sonra Chang ve Berglund un önderliğindeki iki ayrı araştırmada, bu üç antikorla de novo DBBHL olguları prognostik alt gruplara ayrılmaya çalışılmış GM tipi DBBHL ların aktive ve Tip 3 DBBHL lardan daha iyi prognozlu oldukları bildirilmiştir (22,38,39). Haarer ve ark 40 DBBHL olgusunda gen ekspresyon profili ile yapılan alt tiplemenin, rutin immünohistokimya ile yapılan tipleme ile uyumlu olduğunu ve tek başına immünohistokimyasal çalışmanın prognozu belirlemede kullanılabileceğini vurgulamışlardır (5). Çalışmamızda 35 de novo DLBCL olgusu, bcl-6, MUM1, CD10 ekspresyonu temelinde GM ve GMD olmak üzere iki gruba ayrılmıştır. 35 olgudan 18 (%51,43) i GM, 28

17 (%48,57) si GMD fenotipi göstermektedir. Hans ve arkadaşları 152 DBBHL olgusunun 64 (%42) ünün GM, 88 (%58) inin GMD fenotipe sahip olduğunu saptamışlardır (6). Berglund ve arkadaşları 161 olguda 82 (%50,9) GM, 79 (%49,1) GMD fenotip saptamışlardır (22). İngilizce literatürde germinal merkez ve germinal merkez dışı B-hücre fenotipi gösteren olguların morfolojik varyantlar ile ilişkisini ele alan başlı başına bir çalışma mevcut olmayıp Ching-Hung Lin ve arkadaşlarının santral sinir sistemi ve nodal DBBHL larda yaptıkları bir çalışmada; nodal DBBHL ların morfolojik varyantları ile GM ve GMD fenotipe sahip olmaları arasında anlamlı bir ilişki saptamadıkları göze çarpmaktadır (26). Bizim çalışmamızda da morfolojik varyant ile fenotip arasında istatistiksel olarak anlamlı ilişki saptanmamıştır. Bu konuda daha geniş serilerde çalışmaya gereksinim vardır. Bazı çalışmalarda fenotipik alt tip ile apopitoz ve proliferasyon durumu arasındaki ilişki araştırılmıştır. Bu amaçla GM ve GMD olgularda bcl2, bcl-xl, bax, bak, bad, bid, gibi apopitoz belirleyicileri, Ki67 gibi proliferasyon belirleyicileri ve siklin A, siklin B1, siklin D3, siklin E, p53, Rb, p16, p27 gibi hücre siklus proteinleri ekspresyonu değerlendirilmiş, bunların prognoz ile ilişkisi araştırılmıştır. Bai ve arkadaşları apopitotik durumun artışı, proapopitotik proteinlerin yüksek, antiapopitotik proteinlerin düşük ekspresyonunu hem GM tipi immünprofil hem de iyi prognoz ve tedaviye iyi yanıt ile ilişkili bulmuşlardır (7). Tirozin fosforilasyonundaki bozukluklar kanserden immün yetmezliğe pek çok hastalığın patogenezinde rol alır. ZAP-70 in T-hücre reseptör sinyalizasyonundaki rolü iyi tanımlanmıştır. Önceleri ZAP-70 ekspresyonunun T ve NK hücrelerinde sınırlı olduğu düşünülürken, son zamanlarda erken B-hücre gelişiminde de rol oynadığı ileri sürülmektedir. Başlangıçta sürpriz şekilde B-KLL olgularında ekspresse olduğu saptanmış, sonraları yüksek ZAP_70 ekspresyonunun mutasyonsuz KLL ve kötü prognoz ile korele olduğu gösterilmiştir. Hayvan modellerinde ZAP-70 in B-hücre gelişiminin erken döneminde zorunlu bir protein olduğu gösterilmiştir (11). Scielzo ve arkadaşları ZAP-70 in farklı olgunlaşma aşamalarındaki B lenfositlerin sinyal yolağında potansiyel rolü olduğunu, ZAP-70 ekspresyonunun yalnızca KLL ye özgü olmadığını ve ZAP-70 ekspresyon kaybının malign B lenfositler için varlığından daha anormal bir bulgu olduğunu ileri sürmüşlerdir (36). Admirand ve arkadaşları ZAP-70 in altı prekürsör B- lenfoblastik lösemi/lenfoma olgusından beşinde eksprese edilmesini, ZAP-70 in normal B- 29

hücre gelişiminde prob-hücreden preb-hücreye kadar ki dönemde rolü olduğuna atfetmektedir (8). Wang ve ark. DBBHL olgularının %26,7 sinde ZAP-70 ekspresyonu saptamışlardır (10). Carreras ve Villamor un tüm B-hücreli neoplazileri kapsayan çalışmalarında DBBHL olgularında %2 oranında ZAP-70 ekspresyonu bildirilmiştir (9). Admirand ve arkadaşları ise Hodgkin ve non-hodgkin olgularını içeren 341 olguluk çalışmalarında DBBHL olgularında (n=26) ZAP-70 ekspresyonu saptamamıştır. Bu çalışmada B-hücreli lenfomalarda değişken sitoplazmik boyanma yanında baskın nükleer boyanmayı pozitif kabul etmişlerdir (8). Wang ın çalışmasında ise pozitif kontrol olan T-hücre boyanmasını referans alarak sitoplazmik boyanmayı pozitif olarak kabul etmişlerdir (10). Biz kontrol hücreleri olan T lenfositlerdeki boyanma şeklini ekspresyon varlığı olarak kabul ettik. Olgularımızdan 8 i sitoplazmik, 1 i sitoplazmik ve nükleer boyanma olmak üzere 9 olguda ekspresyon saptadık. ZAP-70 ile fenotipi alt tip ilişkisini araştıran yalnızca bir çalışma dikkati çekmektedir. Friberg ve arkadaşlarının 28 de novo olguyu kapsayan bu çalışmasında; germinal merkez dışı fenotip gösteren olgularda ZAP-70 ekspresyonu anlamlı olarak daha yüksek oranda bulunmuş ve ZAP-70 in gelecekte bir prognostik belirleyici olabileceği ileri sürülmüştür(11). Bizim çalışmamızda da ZAP70 ile pozitif boyanma gösteren 3 olgu (%33.3) germinal merkez fenotipi, 6 olgu (%66.7) germinal merkez dışı fenotip göstermektedir. 26 olgu ZAP-70 negatiftir. Bunlardan 15 olgu (%57.7) germinal merkez fenotipi, 11 olgu (%42.3) germinal merkez dışı fenotipindedir. Fenotipik alt tip ile ZAP70 ekspresyonu arasında istatistiksel olarak anlamlı ilişki saptanmamıştır (p=0,208). Friberg ve arkadaşlarının çalışmasında nükleer ve sitoplazmik paternde olmak üzere; hiç boyanma olmayan olgular negatif, 0-%25 arası boyanma skor 1 pozitif, %26-%50 boyanma skor 2 pozitif, %51-%100 boyanma skor 3 pozitif olarak değerlendirilmiş ve buna göre hiç negatif olgu yer almamıştır (11). Biz bu çalışmada; %10 ve üzeri oranda olmak üzere, sitoplazmik ya da sitoplazmik ve nükleer boyanmayı pozitif olarak değerlendirdik. Ayrıca değerlendirme yapılırken pozitif kontrol olan T lenfositlerin büyük B-hücrelerini çevrelediği alanları yanlış pozitiflik olasılığına karşın değerlendirme dışında tuttuk. Sitoplazmik boyanma paterni lenfoid dokularda kolayca değerlendirilebilen, nükleer, membranöz, Golgi bölgesi boyanma paternleri gibi, sınırları keskin bir patern değildir. Özellikle dar sitoplazmalı sentroblastik hücrelerin baskın olduğu olgularda büyük hücreleri 30

çevreleyen T lenfosit sitoplazmalarının boyanması yanlışlıkla büyük hücrenin sitoplazmasında boyanma varlığı gibi algılanabilmektedir. Friberg ve arkadaşlarının çalışmasında yapılan skorlama yöntemiyle 28 olgunun tamamı pozitif kategoride yer almıştır. 0-%25 arası boyanma olan olgular skor 1 pozitif olarak kabul edilmiş, örneğin %1 oranında, diğer bir deyişle nadir hücrede boyanma gözlenen olgularda boyanan hücrelerin T lenfositler ile yakın komşuluğu olup olmadığı konusunda bilgi verilmemiştir. Ayrıca tamamı ZAP-70 pozitif olan 28 olgunun, 14 ü GM, 14 ü GMD fenotipe sahip olmak üzere alt gruplar arası eşit dağılım gözlenmektedir (11). Diğer yönden, Admirand ve arkadaşlarının 26 DBBHL olgusunun hiçbirinde ZAP-70 ekspresyonu bulunmaması da dikkat çekicidir ve benzer nedenle olabilir (8). Zira bu çalışmada pozitiflik sınırı %20 üzerinde hücrenin boyanması olarak kabul edilmiştir. Çalışmamızda morfolojik varyant ile ZAP70 ekspresyonu arasında istatistiksel olarak anlamlı ilişki saptanmadı (p=0,795). İngilizce literatürde; morfolojik varyantlar ile ZAP-70 ekspresyonu ilişkisini araştıran çalışmaya rastlamadık. 31

RESİMLER Resim 1: DBBHL, sentroblastik varyant (H&E). Resim 2: DBBHL, immünoblastik varyant (H&E). 32

Resim 3: DBBHL, T-hücreden zengin B-hücreli varyant (H&E). Resim 4: DBBHL, anaplastik varyant (H&E). 33

Resim 5: DBBHL, plazmablastik varyant (H&E). Resim 6: DBBHL, GM tipi. Yaygın nükleer bcl-6 ekspresyonu izlenmektedir (AEC). 34

Resim 7: DBBHL, GM tipi, Yaygın membranöz CD10 ekspresyonu izlenmektedir (AEC). Resim 8: DBBHL, GM tipi. MUM-1 ile küçük reaktif T-hücrelerinde nükleer ve sitoplazmik boyanma izlenmekte iken neoplastik hücrelerde boyanma izlenmemektedir (AEC). 35

Resim 9: DBBHL, GM tipi. ZAP-70 ile küçük reaktif T-hücrelerinde sitoplazmik boyanma izlenmekte iken neoplastik hücrelerde boyanma izlenmemektedir (AEC). Resim 10: DBBHL, GM tipi. ZAP-70 ile küçük reaktif T-hücrelerinde kuvvetli, büyük neoplastik hücrelerde zayıf sitoplazmik boyanma izlenmektedir (AEC). 36

Resim 11: DBBHL, GMD tip. Sağda CD10 ile kalıntı GM hücrelerinde kuvvetli boyanma izlenmekte iken neoplastik hücrelerde boyanma izlenmemektedir (AEC). Resim 12: DBBHL, GMD tip. Ortada bcl-6 ile kalıntı GM hücrelerinde boyanma izlenmektedir. Neoplastik hücrelerde bcl-6 ekspresyonu mevcut değildir (AEC). 37

Resim 13: DBBHL, GMD tip. MUM-1 ile tümör hücrelerinde kuvvetli nükleer boyanma izlenmektedir (AEC). Resim 14: DBBHL, GMD tip. ZAP-70 ile bazı tümör hücrelerinde kuvvetli sitoplazmik ve zayıf nükleer boyanma, küçük reaktif T-hücrelerinde kuvvetli sitoplazmik boyanma izlenmektedir (AEC). 38

Resim 15: DBBHL, GMD tip. ZAP-70 ile tümör hücrelerinde ekspresyon izlenmemektedir (AEC). Resim 16: DBBHL, anaplastik varyant ve GMD tip. CD20 ile kuvvetli membranöz boyanma izlenmektedir (AEC). 39

Resim 17: DBBHL, anaplastik varyant ve GMD tip. Bcl-6 ile tümör hücrelerinde ve sol alt köşede normal GM de nükleer boyanma izlenmektedir (AEC). Resim 18: DBBHL, anaplastik varyant ve GMD tip. MUM-1 ile kuvvetli nükleer, zayıf sitoplazmik boyanma izlenmektedir (AEC) 40

Resim 19: DBBHL, anaplastik varyant ve GMD tip. ZAP-70 ile tümör hücrelerinde ekspresyon izlenmemektedir. Küçük reaktif T-hücrelerinde kuvvetli sitoplazmik boyanma izlenmektedir (AEC). Resim 20: DBBHL, anaplastik varyant ve GMD tip. ZAP-70 ile tümör hücrelerinde sitoplazmik boyanma izlenmektedir (AEC). 41

SONUÇLAR 1. Olgularımızın yaş ortalaması 60,09 (21-83) olarak bulunmuştur. 2. Cinsiyet oranı E/K=1,1/1 olarak bulunmuştur. 3. Morfolojik inceleme sonucunda sentroblastik varyant %74,3 oranında (26 olgu), immünoblastik varyant %11,4 (4 olgu), T-hücreden zengin varyant %5,7oranında (2 olgu), anaplastik varyant %5,7oranında (2 olgu) ve plazmablastik varyant %2,9 oranında (1 olgu) bulunmuştur. 4. İmmünohistokimyasal çalışma sonucunda germinal merkez fenotipi gösteren grup %51.43 oranında (18 olgu), germinal merkez fenotipi göstermeyen grup %48.57 oranında (17olgu) bulunmuştur. 5. Morfolojik tip ile germinal merkez fenotipi gösteren grup ve germinal merkez fenotipi göstermeyen grup arasında istatistiksel olarak anlamlı ilişki bulunmamıştır (χ 2 =1,67, p=0,795). 6. Morfolojik tip ile ZAP-70 ekspresyonu arasında istatistiksel olarak anlamlı ilişki bulunmamıştır (χ 2 =1,67, p=0,795). 7. Germinal merkez fenotipi gösteren grup ve germinal merkez fenotipi göstermeyen grup ile ZAP-70 ekspresyonu arasında istatistiksel olarak anlamlı ilişki bulunmamıştır (χ 2 =1,58, p=0,208). 8. Cinsiyet ile ZAP-70 ekspresyonu arasında anlamlı ilişki bulunmamıştır (χ 2 =0,47, p=0,492). 42

KAYNAKLAR 1. Rosai J. and Ackerman s Surgical Pathology, 9th ed.vol II St. Louis, Mosby, 2004; 1946-50. 2. Mılls SE Sternberg s Diagnostic Surgical Pathology, 4th ed. Vol I Philadelphia, Lıppıncot Williams and Wilkins, 2004;815-18. 3. Jaffe ES, Haris NL, Stein H, Vardiman JW. World Health Organization Classification of Tumours. Pathology and Genetics Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. Lyon, IARC Pres, 2001; 171-176. 4. Bai M, Skyrlas A, Agnantis NJ, Kamina S, Papoudou-Bai A, Kitsoulis P, Kanavaros P. B-cell differentiation, apoptosis and proliferation in diffuse large B- cell lymphomas. Anticancer Res. 2005 Jan-Feb; 25(1A):347-62. 5. Haarer CF, Roberts RA, Frutiger YM, Grogan TM, Rimsza LM. Immunohistochemical classification of de novo, transformed, and relapsed diffuse large B-cell lymphoma into germinal center B-cell and nongerminal center B-cell subtypes correlates with gene expression profile and patient survival. Arch Pathol Lab Med. 2006 Dec; 130(12):1819-24. 6. Hans CP, Weisenburger DD, Greiner TC, Gascoyne RD, Delabie J, Ott G, Müller- Hermelink HK, Campo E, Braziel RM, Jaffe ES, Pan Z, Farinha P, Smith LM, Falini B, Banham AH, Rosenwald A, Staudt LM, Connors JM, Armitage JO, Chan WC. Confirmation of the molecular classification of diffuse large B-cell lymphoma by immunohistochemistry using a tissue microarray. Blood. 2004 Jan 1; 103(1):275-82. Epub 2003 Sep 22. 7. Bai M, Skyrlas A, Agnantis NJ, Kamina S, Tsanou E, Grepi C, Galani V, Kanavaros P.Diffuse large B-cell lymphomas with germinal center B-cell-like differentiation immunophenotypic profile are associated with high apoptotic index, high expression of the proapoptotic proteins bax, bak and bid and low expression of the antiapoptotic protein bcl-xl. Mod Pathol. 2004 Jul; 17(7):847-56. 8. Admirand JH, Rassidakis GZ, Abruzzo LV, Valbuena JR, Jones D, Medeiros LJ. Immunohistochemical detection of ZAP-70 in 341 cases of non-hodgkin and Hodgkin lymphoma. Mod Pathol. 2004 Aug; 17(8):954-61. 43

9. Carreras J, Villamor N, Colomo L, Moreno C, Ramón y Cajal S, Crespo M, Tort F, Bosch F, López-Guillermo A, Colomer D, Montserrat E, Campo E. Immunohistochemical analysis of ZAP-70 expression in B-cell lymphoid neoplasms. J Pathol. 2005 Mar; 205(4):507-13. 10. Wang J, Young L, Win W, Taylor CR. Distribution and ZAP-70 expression of WHO lymphoma categories in Shanxi, China: a review of 447 cases using a tissue microarray technique Appl Immunohistochem Mol Morphol. 2005 Dec; 13(4):323-32. 11. Fridberg M, Servin A, Anagnostaki L, Linderoth J, Berglund M, Söderberg O, Enblad G, Rosén A, Mustelin T, Jerkeman M, Persson JL, Wingren AG. Protein expression and cellular localization in two prognostic subgroups of diffuse large B- cell lymphoma: higher expression of ZAP70 and PKC-beta II in the non-germinal center group and poor survival in patients deficient in nuclear PTEN. Leuk Lymphoma. 2007 Nov; 48(11):2221-32. 12. Cruse JM, Lewis RE, Webb RN, Sanders CM, Suggs JL. Zap-70 and CD38 as predictors of IgVH mutation in CLL. Exp Mol Pathol. 2007 Dec; 83(3):459-61. 13. Abbas AK, Litchman AH; Cellular and Molecular Immunology. 4th ed.w.b.saunders Company.London, Newyork, Sydney, Toronto, 2000.189-196. 14. Kierszenbaum AL, MD, PhD. Histoloji ve Hücre Biyolojisi.Ankara.Palme yayıncılık. 2006.267-280. 15. Knowles DM. Neoplastic Hematopathology. 2th Ed. A Wolters Company., Philadelphia, 2001. 1-324. 16. McClure RF, Remstein ED, Macon WR, Dewald GW, Habermann TM, Hoering A, Kurtin PJ. Adult B-cell lymphomas with burkitt-like morphology are phenotypically and genotypically heterogeneous with aggressive clinical behavior. Am J Surg Pathol. 2005 Dec; 29(12):1652-60. 17. Hsi ED Hematopathology.1th ed.philadelphıa, Churcil Livingstone, 2007:259-82. 18. Knowles DM. Neoplastic Hematopathology. 2th Ed. A Wolters Company., Philadelphia, 2001. 855-913. 19. Fletcher CDM, Diagnostik Histopathology of Tumors. 3th Ed. Volüm II.Churchill Livingstone Elsevier.,2007. 1260-62. 44

20. Uherova P, Ross CW, Schnitzer B, Singleton TP, Finn WG The clinical significance of CD10 antigen expression in diffuse large B-cell lymphoma. Am J Clin Pathol. 2001 Apr; 115(4):582-8. 21. Simonitsch-Klupp I, Hauser I, Ott G, Drach J, Ackermann J, Kaufmann J, Weltermann A, Greinix HT, Skrabs C, Dittrich C, Lutz D, Pötter R, Mannhalter C, Lechner K, Chott A, Jaeger U. Diffuse large B-cell lymphomas with plasmablastic/plasmacytoid features are associated with TP53 deletions and poor clinical outcome. Leukemia. 2004 Jan; 18(1):146-55. 22. Berglund M, Thunberg U, Amini RM, Book M, Roos G, Erlanson M, Linderoth J, Dictor M, Jerkeman M, Cavallin-Ståhl E, Sundström C, Rehn-Eriksson S, Backlin C, Hagberg H, Rosenquist R, Enblad G. Evaluation of immunophenotype in diffuse large B-cell lymphoma and its impact on prognosis. Mod Pathol. 2005 Aug; 18(8):1113-20. 23. Ree HJ, Yang WI, Kim CW, Huh J, Lee SS, Cho EY, Ko YH, Charney D. Coexpression of Bcl-6 and CD10 in diffuse large B-cell lymphomas: significance of Bcl-6 expression patterns in identifying germinal center B-cell lymphoma. Hum Pathol. 2001 Sep; 32(9):954-62. 24. Colomo L, Lopez-Guillermo A, Perales M, Rives S, Martinez A, Bosch F, Colomer D, Falini B, Montserrat E, Campo E. Clinical impact of the differentiation profile assessed by immunophenotyping in patients with diffuse large B-cell lymphoma. Blood. 2003 Jan 1; 101(1):78-84. Epub 2002 Aug 8. 25. de Leval L, Braaten KM, Ancukiewicz M, Kiggundu E, Delaney T, Mankin HJ, Harris NL. Diffuse large B-cell lymphoma of bone: an analysis of differentiationassociated antigens with clinical correlation. Am J Surg Pathol. 2003 Sep; 27(9):1269-77. 26. Lin CH, Kuo KT, Chuang SS, Kuo SH, Chang JH, Chang KC, Hsu HC, Tien HF, Cheng AL. Comparison of the expression and prognostic significance of differentiation markers between diffuse large B-cell lymphoma of central nervous system origin and peripheral nodal origin. Clin Cancer Res. 2006 Feb 15;12(4):1152-6. 27. Xu Y, McKenna RW, Molberg KH, Kroft SH. Clinicopathologic analysis of CD10+ and CD10- diffuse large B-cell lymphoma. Identification of a high-risk 45

subset with coexpression of CD10 and bcl-2. Am J Clin Pathol. 2001 Aug; 116(2):183-90. 28. Ree HJ, Ohsima K, Aozasa K, Takeuchi K, Kim CW, Yang WI, Huh JY, Lee SS, Ko YH, Kwon MS, Cho EY, Choi YL, Rhee JC, Kikuchi M, Mori S. Detection of germinal center B-cell lymphoma in archival specimens: critical evaluation of Bcl- 6 protein expression in diffuse large B-cell lymphoma of the tonsil. Hum Pathol. 2003 Jun; 34(6):610-6. 29. Tsuboi K, Iida S, Inagaki H, Kato M, Hayami Y, Hanamura I, Miura K, Harada S, Kikuchi M, Komatsu H, Banno S, Wakita A, Nakamura S, Eimoto T, Ueda R. MUM1/IRF4 expression as a frequent event in mature lymphoid malignancies. Leukemia. 2000 Mar; 14(3):449-56. 30. Muris JJ, Meijer CJ, Vos W, van Krieken JH, Jiwa NM, Ossenkoppele GJ, Oudejans JJ. Immunohistochemical profiling based on Bcl-2, CD10 and MUM1 expression improves risk stratification in patients with primary nodal diffuse large B cell lymphoma. J Pathol. 2006 Apr; 208(5):714-23.17.Am J Surg Pathol. 2003 Sep; 27(9):1269-77. 31. Carbone A, Gloghini A, Larocca LM, Capello D, Pierconti F, Canzonieri V, Tirelli U, Dalla-Favera R, Gaidano G. Expression profile of MUM1/IRF4, BCL-6, and CD138/syndecan-1 defines novel histogenetic subsets of human immunodeficiency virus-related lymphomas. Blood. 2001 Feb 1; 97(3):744-51. 32. 32.Braziel RM, Arber DA, Slovak ML, Gulley ML, Spier C, Kjeldsberg C, Unger J, Miller TP, Tubbs R, Leith C, Fisher RI, Grogan TM. The Burkitt-like lymphomas: a Southwest Oncology Group study delineating phenotypic, genotypic, and clinical features. Blood. 2001 Jun 15; 97(12):3713-20. 33. Deindl S,Kadlecek TA,Brdicka T,Cao X,Weiss A,Kuriyan J. Structural basis for the inhibition of tyrosine kinase activity of ZAP-70. Cell. 2007 May 18;129(4):735-46 34. Alizadeh AA, Eisen MB, Davis RE, Ma C, Lossos IS, Rosenwald A, Boldrick JC, Sabet H, Tran T, Yu X, Powell JI, Yang L, Marti GE, Moore T, Hudson J Jr, Lu L, Lewis DB, Tibshirani R, Sherlock G, Chan WC, Greiner TC, Weisenburger DD, Armitage JO, Warnke R, Levy R, Wilson W, Grever MR, Byrd JC, Botstein D, 46

Brown PO, Staudt LM. Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature. 2000 Feb 3; 403(6769):503-11. 35. Rosenwald A, Wright G, Chan WC, Connors JM, Campo E, Fisher RI, Gascoyne RD, Muller-Hermelink HK, Smeland EB, Giltnane JM, Hurt EM, Zhao H, Averett L, Yang L, Wilson WH, Jaffe ES, Simon R, Klausner RD, Powell J, Duffey PL, Longo DL, Greiner TC, Weisenburger DD, Sanger WG, Dave BJ, Lynch JC, Vose J, Armitage JO, Montserrat E, López-Guillermo A, Grogan TM, Miller TP, LeBlanc M, Ott G, Kvaloy S, Delabie J, Holte H, Krajci P, Stokke T, Staudt LM; Lymphoma/Leukemia Molecular Profiling Project. The use of molecular profiling to predict survival after chemotherapy for diffuse large-b-cell lymphoma. N Engl J Med. 2002 Jun 20; 346(25):1937-47. 36. Dogan A, Bagdi E, Munson P, Isaacson PG. CD10 and BCL-6 expression in paraffin sections of normal lymphoid tissue and B-cell lymphomas. Am J Surg Pathol. 2000 Jun; 24(6):846-52. 37. Falini B, Fizzotti M, Pucciarini A, Bigerna B, Marafioti T, Gambacorta M, Pacini R, Alunni C, Natali-Tanci L, Ugolini B, Sebastiani C, Cattoretti G, Pileri S, Dalla- Favera R, Stein H. A monoclonal antibody (MUM1p) detects expression of the MUM1/IRF4 protein in a subset of germinal center B cells, plasma cells, and activated T cells. Blood. 2000 Mar 15; 95(6):2084-92. 38. Wright G, Tan B, Rosenwald A, Hurt EH, Wiestner A, Staudt LM. A gene expression-based method to diagnose clinically distinct subgroups of diffuse large B cell lymphoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Aug 19; 100(17):9991-6. Epub 2003 Aug 4. 39. Chang CC, McClintock S, Cleveland RP, Trzpuc T, Vesole DH, Logan B, Kajdacsy-Balla A, Perkins SL. Immunohistochemical expression patterns of germinal center and activation B-cell markers correlate with prognosis in diffuse large B-cell lymphoma. Am J Surg Pathol. 2004 Apr; 28(4):464-70. 47