Kan Gruplarının Saptanması

İ.Ü. Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Sürekli Tıp Eğitimi Etkinlikleri Herkes İçin Transfüzyon Tıbbı Sempozyum Dizisi No: 44 Mayıs 2005; s. 67-85 Kan Gruplarının Saptanması Dr. Hülya Bilgen Eritrosit antijenleri ve antikorları ara sındaki reaksiyonların gösterilmesinde çe şitli serolojik yöntemler kullanı lır. Eritrosit antijenlerinin saptanmasında kullanılan serolojik yöntemlerin baş lıcaları: 1. Hemaglütinasyon a. Lam (Sli de) Yön te mi b. Tüp Yön te mi c. Jel Sant rifügasyon Yöntemi d. Mikroplak Yöntemi 2. RİA (Radio immun assay) 3. EİA (Enzim immun assay) 4. PCR, (polimerase chain reaction) ola rak sıralanabilir. Elektrolitli ortamda eritrositlerin yüzeyindeki antijenler ortamda bulunan kendilerine özgü antikorlar ile birleştiklerinde eritrositler birbirine yapı şarak gözle görülebilecek büyüklükte kümeler oluşturarak çökerler. Bu olaya hemaglütinasyon denir. Aglütinasyon reaksiyonunda iki ayrı aşa ma var dır. Birincisi antikorların eritrositlere tutulması, ikincisi de antikor kaplı hücrelerin birbirlerine tutunması dır. ZE TA PO TAN Sİ YEL Serum fizyolojik (SF) içerisinde süspansiyon yapılan eritrositler birbirleri ne or ta la ma 25 nm uzak lıkta dururlar. Bu uzak lık, erit ro sit le rin yü zey lerindeki negatif elektriksel yük nedeni ile birbirlerini itmesi sonucu olu şur. Eritrositlerin yüzeylerindeki negatif yükün derecesi zeta potansiyel olarak ifade edilmektedir. Eritrosit yüzeyi negatif yükle kaplı dır. Serum fizyolojik 67

Hülya Bilgen içerisinde süspansiyon yapıldıklarında katyonlar (+ yüklü sodyum iyonu) da eritrosit yüzeyini kaplar. Bu nedenle zeta potansiyel denildi ğin de tek ba şına eritrosit yüzeyindeki negatif yük anla şılmamalı dır. Zeta potansiyel eritrosit yüzeyindeki negatif yük ile onu ku şatan katyonların oluşturdu ğu potansiyel farkı nı gösterir. Zeta potansiyel küçüldükçe eritrositler sı vı or tam da bir birlerine yakla şırlar. Antikorların eritrositlere tutunmasında Zeta potansiyelin op ti mal dü ze yi IgM için -22-17mV, IgG için ise -11-4.5 mv dur. He mag lü ti nas yon So nuç la rı na Et ki Eden Fak tör ler 1. Fiziksel Koşullar a. İnkübasyon ısı sı IgM ti pi an ti kor lar...4-27*c (Oda ısı sında) IgG ti pi an ti kor lar...30-37*c (İnkübatör) b. İnkübasyon süresi c. Santrifuj hız ve sü re si d. Ortam: ph,liss solusyonu,enzimler,makromoleküller 2. Erit ro sit ler a. Yüzey antijenlerinin tipi, sayı sı, lokalizasyonu ve immünojenitesi, b. Homozigot veya heterozigot olmaları 3. Se rum Protein içeriği ve antikorların ya pı ve tür leri Fark lı Bi rey le re Ait Erit ro sit ler de ki Ni te lik Far kı 1. Ba zı erit ro sit an ti jen le ri nin ho mo zi got ve he te ro zi got hüc re ler de ki re aktiviteleri arasında büyük farklar vardır. (C, c, M, S, Jka ) 2. Ba zı eritrosit antijenlerinin reaktivitesi, bireyler aynı fenotipte olmasına rağmen değiş ken dir (P1, I, i, Lea, Leb, Sda, Vel, Ch/Rg) 3. Ye ni do ğan lar ve ye tiş kin ler de an ti jen le rin re ak ti vi te si fark lı d ır. I,Lea,Leb ve Sda ye ni do ğan eritrositlerinde çok zayıf olarak gösterilebilirler. A, B, P1, Lua, Lub, Yta, Xg ve Vel antijenlerinin reaktivitesi yetişkinlere göre daha düşük tür. Rh, K, Fy, Jk, MNSs, Di, Do, Sc, Coa ve Aua an ti jen le ri ise do ğum da tam ge lişmiştir. A ve B antijenleri basit lineer veya dallanan kompleks ya pılar şeklinde bulunabilir. Yetişkin ve yenido ğan lar da ki A, B ve H ak tivitesi membran yüzeyindeki dallanan kompleks yapıların sa yı sı ile il gilidir. Yetişkinlerde çok sayıda dallanan oligosakkaritler ve daha çok sa yıda terminal antijen bulunur. 68

Kan Gruplarının Saptanması Hemaglütinasyonda reaksiyon şiddetine bağ lı ola rak olu şan kümeler makroskobik olarak de ğerlendirilirken dikkatli olunmalı dır. Tab lo 1 de ki de ğerlendirme prensiplerine göre aglütinasyon okunur ve kaydedilir. Tab lo 1. Aglütinasyonun Değerlendirilmesi Aglütinasyon Değerlendirme ++++ Bir tek büyük küme, serbest hücre yok +++ Birkaç büyük küme, serbest hücre yok ++ Çok sayıda büyük ve küçük küme, serbest hücre yok + Çok sayıda küçük küme, zeminde serbest hücre var Mikroaglütinasyon Makroskobik negatif, mikroskobik bazı alanlar 6-8 hücreli kümeli Şüpheli Makroskobik negatif, çok nadir mikroskobik 6-8 hücreli küme Rulo Oluşumu Mikroskobik olarak kümeler para dizisi şeklinde Negatif Makroskobik ve mikroskobik küme yok Mixed field Çok sayıda büyük ve küçük küme, zeminde serbest eritrosit var Erit ro sit Süs pan siyo nu Ha zır la ma Eritrosit antijen ve antikorları ile il gi li tüm test ler de erit ro sit le rin SF ile yıkanarak kendi serumlarından uzaklaş t ı rılmaları ter cih edi len bir ön işlem olmalı dır. Yıkama yapılmaması durumunda şu sa kıncalar oluşabilir: 1. Eritrosit süspansiyonundaki fibrinojen serumdaki rezidüel trombin ile etkile şerek pıhtı oluşturabilir. 2. Rulo formasyonu oluşma olası lı ğı ar tar. 3. Plazmadaki antikomplementer özellikteki antikoagulanlar kompleman bağlayan antikorların ta nı mında karı şıklı ğa ne den ola bi lir. 4. Lak toz, ne omi sin gi bi ko ru yu cu mad de ler erit ro sit süs pan si yo nu na eklendi ğin de has ta se ru mun da bu mad de le re kar şı antikor varsa hatalı pozitif sonuçlara neden olabilir. Bu tip antikorların ço ğu SF ile yıkanan eritrositlerle reaksiyona girmez. 5. ABO, Le wis, Chi do/rod gers, Ii an ti jen le ri plaz ma da da bu lu nur lar. Plazmadaki antijenler antiserumu inhibe ederek hatalı negatif sonuçlara yol açabilirler. 6. Plaz ma, al bü min oto ag lü ti nin le ri içe re bi lir ve se rum-al bü min ka rı şı mına tam kan ek len di ğinde yanlış pozitif sonuçlar çıkabilir. 69

Hülya Bilgen Saklama Koşullarının Erİtrosİt Antİjenlerİne Etkİsİ 1. Eritrositler, +4 C nın üze rin de CPDA-1 ve ya-2 ya da SAG-M ek len miş kan torbalarında 35-42 gün süreyle saklandıklarında, eritrosit antijenlerinde M ve P1 antijenleri dı şında aktivite kaybı minimaldir. 2. Pıhtılaş mış olarak saklanan kan örneklerinde antikoagulanlı kanlara göre antijenik aktivite kaybı da ha hızlı dır. Bu nedenle torbalara kan alındıktan sonra set tamamen boşaltı lıp ka nın antikoagulan madde ile tamamen karışması sağlandık tan son ra set ye ni den dol du rul ma lı dır. 3. Re agent erit ro sit ler tam kan gi bi ba zı antikoagulan solusyonlar (CPD, ACD) içinde saklanabilirler. Sıklıkla kullanılan inozin eklenmiş modifiye Alsever solusyonunda (adeninli veya adeninsiz olarak) antibiyotiklerin de eklenme si ile+4 C de 35 gün sak la na bi lir ler. 4. Erit ro sit le rin ko ru yu cu so lüs yon da süs pan si yon ya pıl ma dan ön ce lökositlerden mümkün olduğunca arındı rılmaları gerekir. Lökositler proteolitik enzimler içerdiklerinden dolayı plazma inhibitörlerinin yoklu ğunda eritrosit lizisine neden olabilirler. Bazı aminoglikozid grubu antibiyotiklerin lökositlerden proteolitik enzim salı nı mı nı uyar dıkları gözlenmiştir. Özellikle LISS te sak lanan eritrosit süspansiyonlarında neomisin varlı ğı bu du ru ma yol açabilir. 5. Eritrositler Sitrat Fosfat Gliserol solüsyonunda 20 C de bir yıl sak lanabilirler. Bu süre zarfında sadece P1 antijeni zayıf reaktif bulunur. Çözünen eritrositler testten önce azaltılan gliserol ve trisodyum sitrat kullanılarak en az iki kez yıkanır, da ha son ra yıkama işlemine SF ile devam edilir. Serum veya Plazma Kullanımı Kan gu rup la ma test le rin de se rum ter cih edil me li dir. Çün kü plaz ma 37 C de inkübe edildiğinde pıhtılaşabilir. Ayrıca bazı antikorların saptanması kompleman aktivasyonuna ba ğımlı dır. Sitrat ve EDTA gibi antikoagulanlar kompleman aktivasyonunu kalsiyumu şe lat la ya rak en gel ler. Bu da plaz ma kullanı mındaki sakıncalardan birini oluşturur. Antiserumların saklanması 1. Antiserumlar, mikrobiyal kontaminasyon olmadan +4 C de 1-2 yıl,- 20 C de yıl lar ca et kin lik le ri ni kay bet me den sak la na bi lir ler. 2. Antiserumlara koruyucu maddeler eklenebilir. Potansiyel tehlikesine rağmen sodyum azid halen bir çok ticari antiserumda koruyucu olarak kullanılmaktadır. 3. Antiserumlarda koruyucu olarak bazı antibiyotikler de kullanılmaktadır. Ancak hasta serumunda antibiyotiklere kar şı antikor bulundu ğunda 70

Kan Gruplarının Saptanması yıkanmadan hazırlanan eritrosit süspansiyonlarında hatalı pozitif sonuçlara neden olabilir. 4. An ti-a ve an ti-b an tiserumlarına karıştırılmamalır için bo ya ek lenir. Genellikle bunlar an ti-a için ma vi, an ti-b için sa rı renkte boya eklenir. Antiseumların belirlenmesinde her ne kadar renk fak törü güvenilir de olsa antiserum her za man eti ket oku narak tanımlanmalı ve kontrol edilmelidir. ABO SİS TE Mİ NE AİT KAN GRUP LA RI NIN SAP TAN MA SI Pro to kol 1: Lam (sli de) Yön te mi ile ABO Grup la ma Serolojik Yöntem: Hemaglütinasyon Prensip: Forward Gruplama (Eritrosit yüzeyindeki antijenlerin gösterilmesi) Ör nek: Bazı üreticiler lam testlerinin tam kan da ya pılması nı önerirken, di ğerleri serum fizyolojik, serum veya plazma ile hazırlanan daha seyreltik konsantrasyonlardaki eritrosit süspansiyonları nın kullanı mı nı önerdikleri için lam tes ti ya pılmadan önce üretici firmanın prospektüs önerilerine bakılması gereklidir. Prosedür 1. Te miz ve eti ketli (anti-a yazılmış) bir la ma bir dam la an ti-a dam la tı lır. 2. İkin ci te miz ve eti ketli (anti-b yazılmış) bir la ma bir dam la an ti-b damlatı lır. 3. Bu an ti se rum la ra pa ra lel test ya pı la cak sa üçün cü bir te miz ve eti ket li (anti-a,b yazılmış) bir la ma bir dam la an ti-a,b dam la tı lır. 4. Tercihan dördüncü bir temiz ve etiketli (kontrol yazılmış) lam da ay rıca hazırlanır. Bu la ma bir dam la has ta se ru mu ve ya plaz ma sı damlatı lır. 5. Lamlara test edilecek eritrositlerin iyice karış tı rılmış bi rer dam la süs pansiyonu (serum fizyolojik, serum ya da plazmada) damlatı lır (kullanılacak doğru konsantrasyonu belirlemek için üre tici önerilerine bakı lır). 6. An ti se rum ve erit ro sit ler her bir lam için ay rı, temiz bir aplikatör çubuk ile ka rış tı rı lır ve çu buk atı lır. Ka rı şım yak la şık 20 x 40 mm lik bir ala na ya yılmalı dır. 7. Lamlar sürekli olarak hafifçe öne ve arkaya doğru hareket ettirilerek 2 dakika kadar sallanır. Lam lar bu sü re zar fında çok ısı t ılmış ve ya so ğutulmuş bir alana konulmaz. Serum/eritrosit karı şı mına enfeksiyöz ajanlar bula şabilece ği için elle dokunulmaz. 8. Tüm lamlardaki sonuçlar okunur, yorumlanır ve kaydedilir. 71

Hülya Bilgen Yorum 1. Herhangi bir ABO antiserumuyla güçlü eritrosit aglütinasyonu, sonucun pozitif olduğu anlamına gelir. 2. İki dakika sonunda pürüzsüz eritrosit süspansiyonu negatif sonuçtur. 3. Za yıf ya da şüp he li re ak si yon ve ren ör nek ler tüp tes ti ile tek rar edil melidir. 4. Kontrol lamında aglütinasyon görülmesi nonspesifik bir ag lütinasyon olarak değerlendirilir ve otoantikorların var lı ğı nı gösterir. 5. De ğerlendirme Tablo 2 ye göre yapı lır. Tab lo 2. Forward Gruplamada Sonuçların Değerlendirilmesi Kan Grubu Anti-A Anti-B Anti-A,B A + - + B - + + AB + + + O - - - TEK NİK UYA RI LAR 1. Lam yerine seramik veya porselen fayans üzerinde bu yöntem asla denenmemelidir. Önceki denemelerden kalan ve iyi temizlenmemiş antiserum ya da hüc re ka lıntıları hatalı sonuçlara neden olabilir. 2. Za yıf veya negatif reaksiyon veren tüm an tiserum-eritrosit karı şımları mikroskobik olarak da kontrol edilmelidir. Bir damla karı şım lam-lamel arası preparat hazırlanak mikroskobun küçük büyütme objektifinde incelenir. Negatif so nuç lar tüp tes ti ya da baş ka bir se ro lo jik yön tem le doğrulanmalı dır. 3. Temiz lamların üzerine ilk önce antiserumlar damlatılmalı dır. Çün kü önceden eritrosit süspansiyonları damlatılmış lamların üzerine antiserum solusyonları nın damlatılması sırasında damlalıkların dolayı sıyla antiserumların kontaminasyonu söz konusu olabilir. Laboratuvar uygulayı cı sı nın her za man bu sıra ile hareket etmesi giderek bir ref leks halini almalı dır. 4. Ka rış tı rı cı çu buk lar için cam ba getler tavsiye edilmez. Çünkü cam bagetlerin iyi temizlenememesinden dolayı üzerinde bulunan antiserum ya da hücre ka lıntıları yan lış reaksiyonlara neden olabilir. 5. Lam la rın üzerinde oluşabilecek hafif kuruma zayıf pozitif aglütinasyon olarak değerlendirilmemelidir. 72

Kan Gruplarının Saptanması 6. Sonuçların de ğerlendirilmesi ikinci bir laboratuvar uygulayı cı sı tarafından da ya pılmalı dır. Bu şekilde birbirinden ba ğımsız çift de ğerlendirme olası yanlış lıkları çok azaltacaktır. 7. Her şeye rağmen ABO grupları tayininde lam testleriyle her zaman doğru sonuçlar alınamaz. Kan merkezleri eldeki olanakları de ğerlendirerek uygun bir serolojik yöntem belirlemelidir. Gelişmiş tekniklerin kullanı mı olanaksız ise tüp yöntemi en uygun yöntem olarak seçilmelidir. Protokol 2: Tüp Testi ile ABO Gruplama Serolojik Yöntem: Hemaglütinasyon Prensip: Forward Gruplama ( Eritrosit yüzeyindeki antijenlerin gösterilmesi) Ör nek: ABO gruplaması için hasta ya da donör eritrositleri kullanı lır. Test eritrositleri doğal se rum/plaz ma ya da se rum fiz yolojikle süspansiyon haline getirilebilir ya da serum fizyolojikle yıkanıp tekrar süspansiyon yapılabilir. Bu konuda antiserum üreticisi firmanın prospektüs önerilerine uyulmalı dır. Prosedür 1. Te miz ve eti ketli (anti-a yazılmış) bir test tü pü ne bir dam la an ti-a damlatı lır. 2. İkin ci bir te miz ve eti ketli (anti-b yazılmış) tü pe bir dam la an ti-b damlatı lır. 3. Bu an ti se rum la ra pa ra lel test ya pılacaksa üçüncü temiz ve etiketli (anti- A, B ya zılmış) bir tü pe bir dam la an ti-a,b dam la tı lır. 4. Dördüncü temiz ve etiketli (kontrol yazılmış) bir tü pe bir dam la has ta yada donör serumu veya plazması damlatı lır. 5. Her bir tü pe bir dam la test edi lecek eritrositlerin en az 3 kez yıkanmış %2-5 lik süs pansiyonundan (serum fizyolojik, serum ya da plazma ile ha zırlanmış) damlatı lır. 6. Tüp içerikleri yavaşça karış t ı rı lır ve yak la şık 900-1000 x g de 15-30 sn. süreyle santrifüj edilir. Alternatif olarak tüpler santrifüj edilmeden 1 saat oda ısı sında bırakı lır. 7. Tüplerin dibindeki eritrosit birikintileri tekrar yavaşça süspanse edilir ve makroskobik olarak aglütinasyon açı sından incelenir. 8. Test sonuçları okunur, yorumlanır ve kaydedilir. Eritrosit test sonuçları ABO reverse gruplama prensibi ile kar şılaş t ırarak doğrulanır (reverse bölümüne ba kı nız). 73

Hülya Bilgen Yorum 1. Erit ro sit test tüp le ri nin her han gi bi rin de ki ag lü ti nas yon so nu cun po zi tif olduğu anlamına gelir. 2. Bir eritrosit birikintisinin tekrar süspanse edilmesinden sonra eritrosit süspansiyonun pürüzsüz olması ne ga tif test so nu cu dur. 3. Kontrol tüpünde aglütinasyon görülmesi non-spesifik bir aglütinasyon olarak değerlendirilir ve otoantikorların var lı ğı nı gösterir. 4. De ğerlendirme Tablo 2 ye göre yapı lır. TEK NİK UYA RI LAR 1. Za yıf veya negatif reaksiyon veren tüm an tiserum-eritrosit karı şımları mikroskobik olarak kontrol edilmelidir. Bir damla karı şım lam-la mel ara sı preparat hazırlanarak mikroskobun küçük büyütme objektifinde incelenir. 2. An ti-a ve An ti-ab de ag lütinasyon şiddeti zayıf (+, ++) ise A subg rupları araş t ı rılmalı dır. 3. Te miz tüp le re ilk ön ce an tiserumlar damlatılmalı dır. Çünkü önceden eritrosit süspansiyonları dam la tılmış tüplerin üzerine antiserum solüsyonlarının damlatılması sırasında damlalıkların (dolayı sıyla antiserumların) kontaminasyonu söz konusu olabilir. 4. Sonuçların de ğerlendirilmesi ikinci bir laboratuvar uygulayı cı sı ta rafın dan da ya pılmalı dır. Bu şe kil de çift de ğerlendirme olası yan lış lıkları çok azaltacaktır. Pro to kol 3: Tüp Tes ti ile Kar şıt (Reverse) Grup la ma Serolojik Yöntem: Hemaglütinasyon Prensip: Ters (Re verse) Gruplama (eritrosit yüzeyinde ta şınmayan antijenlere kar şı serumdaki mevcut antikorları gösterme ) Ör nek: Has ta ya da do nör se rum ve ya plaz ma ör ne ği kullanı lır. Araç-Gereç: A1, A2, B ve O gru bu erit ro sit ler. Bu hüc re ler ha zır ticari kitler şeklinde temin edilebilir. Ya da her gün laboratuvarda grubu bilinen eritrositlerden % 2-5 süspansiyon hazırlanarak elde edilir. Prosedür 1. Test tüplerinin üzerine sırası ile A1, A2, B, O ya zılarak etiketlenir. 2. Her tü pe 2-3 dam la hasta serumu damlatı lır. 3. A1 eti ket li tü pe bir dam la A1 erit rosit süspansiyonu, A2 etiketli tüpe bir damla A2 eritrosit süspansiyonu, B etiketli tüpe bir damla B eritrosit süspansi- 74

Kan Gruplarının Saptanması yo nu, O eti ket li tü pe bir dam la O erit ro sit süs pan si yo nu dam la tı lır (A2 ve O eritrosit testleri tercihe bağ lı dır). 4. Tüp içerikleri yavaşça karış t ı rı lır ve yak la şık 900-1000 x g de 15-30 sn. süreyle santrifüj edilir. 5. Tüp ler hemoliz bulgusu açı sından incelenir. Eritrosit birikintileri tekrar yavaşça süspanse edilir ve aglütinasyon açı sından incelenir. 6. Test sonuçları okunur, yorumlanır ve kay de di lir. Se rum test so nuç la rı ABO for ward grup la ma ile sap ta nan lar la kar şılaş tı rılarak doğrulanır. 7. Za yıf serum reaksiyonları nı güç len dir mek için tüp ler 5-15 dak. bo yun ca oda ısı sında inkübe edilir. Yorum 1. Test tüplerinin her hangi birindeki aglütinasyon sonucun pozitif oldu ğu anlamına gelir. Pozitif testlerde beklenen reaksiyonlar +3 ile +4 tür. 2. Bir erit rosit birikintisinin tekrar süspanse edilmesinden sonra eritrosit süspansiyonun pürüzsüz olması negatif test sonucudur. 3. De ğerlendirme Tablo 3 e göre ya pı lır Tab lo 3. Reverse Gruplamada Sonuçların Değerlendirilmesi Kan Grubu Serumda bulunan Bilinen Eritrosit Süspansiyonları Antikorlar A B O A Anti-B - + - B Anti-A + - - AB - - - - O Anti-A, Anti-B + + - Oh (Bombay) Anti-A, Anti-B, Anti-H + + + TEK NİK UYA RILAR 1. Santrifüj yapılmadan de ğerlendirilme yapıldı ğında zayıf aglütinasyon olu şur. Bu yüz den re ver se grup la ma sa de ce tüp, jel sant ri fü gas yon, mik rop lak serolojik yöntemleri ile yapılabilir. Lam yöntemi ile ya pılamaz. 2. Za yıf (+, ++) veya negatif reaksiyon veren tüm tüp karı şımları mik rosko bik ola rak kont rol edil me li dir. Bir dam la ka rı şım lam-lamel arası preparat hazırlanarak mikroskobun küçük büyütme objektifinde incelenir. 75

Hülya Bilgen 3. Eğer anti-a ve anti-b antikorları serumda çok az miktarlarda ise onları reverse gruplama ile ortaya koymak güç ya da olanaksız olabilir. 4. Hastanın ka nın da A ve B grup an tijenleri dı şında başka antijenlerle reaksiyon veren atipik antikorlar varsa grup saptanması güçlük gösterebilir. ABO Grup la ma Test le rin de So nuç la rın De ğer len di ril me si Alı cı ve do nör ler de hem for ward hem de kar şıt gruplama testleri birlikte yapılmalı ve so nuç lar kar şılaş t ı rılmalı dır (Ba kı nız Tab lo 4). Eğer for ward ve re verse gruplama arasındaki uyumsuzluk donörde saptanmış ise ne den ay dınlatılmadan kan transfüzyonda kullanılmamalı dır. Eğer kan po tan si yel bir alı cı ya ait ise has ta nın klinik durumuna göre Rh uygun O gurubu kan (eritrosit süspansiyonu) araş t ırmalar tamamlanıncaya kadar transfüze edilebilir. Ancak kan verilmeden önce ileri değerlendirmeler için hastadan yeterli miktarda kan örne ği alı nıp saklanmalı dır. Forward Gruplamadan Kaynaklanan Uyumsuzluklar 1. Tab Ya lo kın 4. Sık dönemde Rastlanan ABO transfüzyon Gruplarının veya Tanımlanması kemik iliği transplantasyonu yapılan Fenotip Forward Gruplama Reverse Gruplama (ABO/Rh) (hücre A1, A2, B, O) Anti-A Anti-B Anti-AB Anti-H Anti-A1 A1 A2 B O A1* +4 - +4 -/± +3 - - +4 - Aınt** +4 - +4 +3/+2 +3/+2 - - +4 - A2*** +4 - +4 +2 - -/+ - +4 - A3 +2mf - +2 +3 -? - +4 - Am -/+ - -/+ +4 - - - +4 - Ax -/+2 - +/+2 +4 - +2 -/+ +4 - Ae1 - - - +4 - +2 - +4 - B - +4 +4 - +4 +4 - - B3 - +1mf +2mf +3 +4 +4 - - Bm - - -/+ +4 +4 +4 - - Bx - -/+ -/+2 +4 +4 +4 - - AB +4 +4 +4 - +3 - - - - A2B +4 +4 +4 - -? - - - O - - - +4 - +4 +4 +4 - Oh (Bombay) - - - - - +4 +4 +4 +4 * Anti-A1 pozitifliği daima anti-h pozitifliğinden daha kuvvetlidir. hastalarda ** Anti-A1 iki ve farklı anti-h da eritrosit reaksiyon popülasyonuna şiddeti aynıdır. bağ lı kime ra. 2. *** Var Anti-A1 yant pozitifliği A ve B daima gen le anti-a1 ri ta şıyan pozitifliğinden ki şilerde daha zayıf kuvvetlidir. antijenlerin varlı ğı. Lösemi 76

Kan Gruplarının Saptanması gibi bazı hastalıklarda eritrosit yüzey antijenlerindeki zayıflama. 3. Ka lıtsal ya da kazanılmış poliaglütinasyonda membran bozuklu ğuna bağ lı ola rak olu şan modifiye eritrositlerin anti-a, anti-b veya her ikisi ile birlikte aglütinasyonu. 4. Anormal konsantrasyondaki serum proteinleri veya makromoleküller nedeni ile oluşan nonspesifik agregasyonun aglütinasyonu taklit etmesi. 5. Serumlarında yüksek konsantrasyonda A ve B antijenleri bulunan ki şilerde bu antijenlerin antiserumdaki (reagent) antikorları nötralize etmesi. 6. Antiserumlardaki boyalara kar şı ge lişmiş antikorların ne den ol du ğu hatalı pozitiflikler. Re ver se Grup la ma dan Kay nak la nan Uyum suz luk lar 1. Tam pıhtılaşmamış serum veya plazmada bulunan küçük fibrin parçacıkları nın aglütinasyon sanılması. 2. Anormal konsantrasyondaki proteinlerin veya intravenöz kontrast maddelerin neden olduğu nons pe si fik ag re gas yon. 3. Di ğer erit rosit antijenlerine kar şı ge lişmiş antikorların test hüc re le ri bu antijeni ta şıyorsa pozitif sonuç vermesi. 4. Yenidoğan dö ne min de ilk 4-6 ay, yaş lılar ve immün sistemi baskılanmış ki şilerde düşük immünglobulin düzeyinin hatalı negatif sonuçlara neden olması. Uyumsuzlukları Çö züm le me ye Yö ne lik İlk İş lem ler For ward ve re ver se grup la ma so nuç la rındaki uyumsuzlukta ilk yapılacak işlem teknik hataları elimine etmek için uygun ko şullarda testi tekrar etmektir. İlk ça lışmada eğer erit rositler hastanın kendi serumunda süspanse edilmiş ise SF ile yıkandıktan sonra süspanse edilmelidir. Eğer uyumsuzluk devam ediyor ise 1. Hatalı etiketleme veya kontamine örnek olası lı ğı dü şünülerek yeni kan örneği ile test tek rar la nır. 2. Hem has ta hem de bi li nen erit ro sit ler (re ver se grup la ma da kul la nılan) ye ni den en az üç kez yıkamalıdır. 3. Forward gruplamada anti-a, lektin A1 ve anti-h, reverse gruplamada ise A2 hüc re le ri ile so ğuk aglütininlere bağ lı et ki yi ir de le mek için ye tişkin ve kordon O eritrositleri kullanı lır. 4. İnkübasyonun 30 dakika oda ısı sında yapılması za yıf antijen ve antikor- 77

Hülya Bilgen lara bağ lı reaksiyonların incelenmesini kolaylaş tı rır. 5. Eş zamanlı ya pılan testlerden birisi oda ısı sında diğe ri ise +4 C da in kübe edilebilir. Değer len dir me ve bu Aşa ma da Ya pı la cak İşlem ler 1. Uyumsuzluk, beklenilen bir antijenin yokluğu şeklinde ise ya zayıf antijenik ya pı da bir al lel var dır ve ya her han gi bir has ta lık ne de ni ile an ti je nik ak ti vi te azal mıştır. 1.1 Eritrositler ficin, papain veya bromelin gibi bir enzimle muamele edilir. Bu uygulama antiserumlarla daha kuvvetli aglütinasyon sağlar. 1.2 Erit ro sit ler bek le nen an ti je ne ait an tiserumla (anti-a veya anti-b) oda ısı sında inkübe edilir. Böylelikle antikorların adsorbe olması sağ la nır. İn kübasyondan sonra eritrositler iyice yıkanır ve elu ate ha zırlanır. Elde edilen elu ate bi li nen A, B ve O re agent hüc re le ri ile test edi lir. Eğer hasta eritrositleri A antijeni ta şıyorsa anti-a ile inkübe edildi ğinde bu antikorlar adsorbe olur ve elde edilen eluate A reagent hücreleri ile aglütinasyon oluşturur. 1.3 A, B ve H mad de le ri ni ta şıma yönünden tükürük ile hemaglütinasyon inhibisyon testi yapı lır. Bu test sa dece sekretör kişilerde yararlı dır. Ancak olasılık % 80 ol du ğu için denenmelidir. Eğer tükürükte aranan antijenik madde varsa antiserumla inkübe edildiğinde antikorlara bağlanır. Antikor bu aşamada bağlandı ğı için ek lenen aynı antijenik yapıdaki eritrositleri aglütine edemez. 2. Uyum suz luk an ti-a ve ya an ti-b ile bek len me dik po zi tif lik şek lin de ise 2.1 Kazanılmış B fenotipi: Hasta serumu reverse gruplamada anti-b içermesine rağmen hastanın forward gruplamasın da an ti-a,b ve an ti-b ile za yıf pozitiflik vardır. Mikrobiyal bir enzim olan deasetilaz etkisi ile A an tijeninin de ğişmesi sonucu oluşur. Enzim, A antijenin immünodominant şekeri N-asetil gli ko za mi ne et ki eder ve B an ti je ni ne ya ni ga lak to za ben zer ya pıya dönüşür. Kazanılmış B ak ti vi te si gös te re bi len tek hüc re A1 dir. 2.1.1 Hastanın ta nı sı öğrenilmelidir. Kazanılmış B antijeni kolon ve rektum karsinomaları, Gram negatif bakterilere bağ lı enfeksiyonlar ve intestinal obstrüksiyonla ilişkilidir. 2.1.2 Has ta se ru mu ve has ta erit rositleri ile test tek rarlanır. Hasta serumundaki anti-b, kazanılmış B antijenik determinantları nı aglütine etmez. 2.1.3 Monoklonal anti-b kullanılarak test tekrarlanır. Monoklonal anti-b de kazanılmış B an tijenik determinantları ile aglütinasyon oluşturmaz. 2.1.4 İnsan orjinli anti-b nin ph sı 6 ya ayar lanır. Bu du rum da da ag lü tinasyon olmaz. 78

Kan Gruplarının Saptanması 2.1.5 Has ta sek re tör ise tük rükte B an tijenleri aranır. Kazanılmış B an tijenleri tükrükte bulunmaz. 2.2 Kazanılmış A benzeri antijen: ABO sistemindeki uyumsuzluklar bazen de Tn poliaglütinasyon ile ilişkilidir. Hematopoetik kök hücre de genetik disfonk si yon so nu cu gö rü lür. Özel gli ko zil trans fe raz ye ter siz li ği var dır. Tn eritrositler insan orjinli veya monoklonal antiserumlarla test edildiklerinde sanki kazanılmış A benzeri antijen ta şıyormuş gibi hareket ederler. Test ön cesi eritrositler enzimle muamele edilirlerse Tn eritrositlerdeki A benzeri antijen tahrip olurken normal eritrositlerdeki A antijeni enzimlerden etkilenmez. 2.3 Çift po pu las yo na bağ lı aglütinasyon: Sıklıkla A veya B grubundaki ki şilere O grubu kan transfüzyonundan sonra görülür. Ayrıca kemik ili ği transplantasyonu veya intrauterin eritropoetik doku exchange i sonrası oluşan kimerism de benzer bulgulara neden olur. Jel santrifügasyon testinde çift populasyonların ayırt edilmesi çok kolaydır. Ancak pozitif hücreler jelin üstünde ka lırken antijen negatif hücreler mikrotüpün tabanına çöker. 2.4 Antikorlarla kaplı eritrositler: Yenidoğan hemolitik hastalı ğı, im mün hemolitik anemiler ve hemolitik transfüzyon reaksiyonlarında eritrositlerin yüzeyi antikorlarla kaplanmış t ır. 2.4.1 An ti kor lar IgG ya pı sında ise 45 C de 10-30 dak. in kü bas yon ile elüs yon Chlo ro qu ine dip hosp ha te ile mu ame le et me Asit Glisin/EDTA ile muamele etme 2.4.2 Antikorlar IgM yapı sında ise 37 C de ısı tılmış SF ile yıkayarak elüsyon 2-mercaptoethanol (2-ME) veya dithiothreitol (DTT) ile muamele etme 3. Uyumsuzluk reverse gruplamadan kaynaklanıyorsa 3.1 Serumda anti-a ve/veya anti-b yoksa 3.1.1 Agamaglobulinemi, hipogamaglobulinemi 3.1.2 Yenidoğanlar ve yaş lılar 3.1.3 Çok yük sek an ti-a ve/veya anti-b konsantrasyonuna bağ lı olarak antikor fazlalığı prozon 3.2 For ward grup la ma sı A ile uyum lu ki şide serumda anti-a1 varlı ğı: A2, A2B, A3, Ax ve Ae1 grup la rında görülür. 3.2.1 A1, A2, B ve O hüc re le ri kul la nılarak reverse gruplama yapı lır. 3.2.2 Eritrositler lektin-a1 ve an ti-h ile test edi lir. A2 gru bu bi rey le re sa de ce A2 ve ya O gru bu kan trans fü ze edi le bi lir. 79

Hülya Bilgen 3.2.3 So ğuk re aktif otoantikor varlı ğı : Ör ne ğin an ti-i tüm eriş kin erit ro sitlerini aglütine eder. Bu na re agent erit ro sit ler de da hil dir. Oto an ti kor la ra bağ lı aglütinasyon anti-a veya anti-b ile olu şan aglütinasyona göre daha zayıftır. Se rum ve re agent erit ro sit ler 37 C e ka dar ısı t ı lır. Test 37 C de ya pı lır. An cak zayıf reaktif anti-a ve anti-b bu yöntemle gösterilemez. Çünkü 37 C bu antikorlar için gereken optimal ısı nın üzerindedir. Bu duruma engel olmak için an tig lo bu lin tes ti de ya pılmalı dır. Rutinde kullanılan Coombs serumları an ti- IgG ya pı sındadır. Anti-A ve anti-b antikorları genellikle IgM ya pı sında olduğu için po li va lan Co ombs se ru mu kul la nılmalı dır. 3.2.4 Otoadsorbsiyon tekni ği de kul la nılabilir. Otoadsorbsiyonla soğuk aglütininler elimine edildikten sonra reverse gruplama yapı lır. 3.3 An ti-p1, an ti-m gi bi al lo an ti kor la rın var lı ğı : 3.3.1 Alloantikor tanımlanır 3.3.2 Test hücrelerinin bu antijenleri ta şı yıp ta şımadı ğı araş tı rı lır. 3.3.3 Bu antijenleri ta şı ma yan re agent erit ro sit ler le test tek rar la nır. 3.4 Ru lo olu şumu: Anormal konsantrasyonda serum proteinleri içeren örneklerle yapılan çalışmalarda eritrositler aglütine olmuş gibi görülebilir. Mikroskobik inceleme ile gerçek aglütinasyondan kolayca ayrı lır. Çün kü eritrositler para dizisi gibi kümelenmiştir. Serum-dilüe edilerek kullanı lırsa prob lem çö züm le nir. Bu di lüs yon da na di ren an ti-a ve/ve ya an ti-b ne ga tif bulunur. Pro to kol 4: Za yıf A ya da B Subg rup la rın da Ad sorb si yon ve Elus yon Prensip: Za yıf A ya da B an ti je ni olan erit ro sit ler an ti-a ya da an ti-b ile aglütine olmayabilir, ancak spesifik antikorlar eritrosit yüzeyine tutunur (adsorbsiyon). Adsorblanan bu antikorun elüsyonla uzaklaş t ı rılması, bilinen spesifikliğe sahip antikorla reaksiyona girme kapasitesi bulunan aktif antijenin var lı ğı nın belirlenmesini sağlar. Araç-Gereç 1. İnsan poliklonal anti-a ve/veya anti-b (bazı monoklonal ABO gruplama antiserumları ph ve osmolarite deği şikliklerine duyarlı dır ve adsorbsiyon/ elüsyon testlerinde kullanıl mak için uy gun de ğildir). 2. Elüsyon solüsyonu/organik çözücü Prosedür 1. Test edi le cek erit ro sit le rin 1 ml si se rum fiz yo lo jik ile en az 3 kez yıkanır. 80

Kan Gruplarının Saptanması Son yıkamadan sonra süpernatan atı lır. 2. Za yıf A var yan tından şüpheleniliyorsa eritrositlere 1 ml anti-a antiserumu veya zayıf B var yan tından şüpheleniliyorsa eritrositlere 1 ml anti-b antiserumu eklenir. 3. Eritrositler antiserumla karış tı rı lır ve 1 sa at sü rey le 4 C de in kü be edilir. 4. Ka rı şım, eritrositlerin toplanması için santrifüje edilir. Süpernatan antiserum atı lır. 5. Erit ro sit ler te miz bir test tü püne aktarı lır. 6. Erit ro sit ler en az 8 kez faz la mik tar da (10 ml ya da da ha faz la) so ğuk (4 C) serum fizyolojik ile yı kanır. Son yı ka ma dan son ra sü per na tan ser best antikor yönünden test edil mek üze re alı na rak sak la nır. 7. Yıkanmış eritrosit süspansiyonuna eşit mik tarda serum fizyolojik eklenir ve iyi ce ka rış tı rı lır. 8. Adsorbe edilen antikorlar, ABO antikorları nın tekrar saptanmasında kullanı lan uy gun bir yön tem le elüs yo na uğratı lır (56 C lik su ban yo sun da 10 dak. inkübasyon, deterjan veya organik çözücülerle işlem vb). 9. Eritrositlerin toplanması için sant rifüje edilir. 10. Süpernatan eluate temiz bir test tüpüne aktarı lır. 11. Elu ate, an tiserum olarak eğer anti-a kullanılmış sa 3 fark lı A1 gru bu ve 3 fark lı O grubu eritrositlere kar şı oda ısı sında, 37 C de ve indirekt antiglobulin tes tiy le test edi lir. 12. Eluate, antiserum olarak eğer an ti-b kullanılmışsa benzer şekilde 3 farklı B gru bu ve 3 fark lı O grubu eritrosite kar şı test edi lir. 13. Son yıkamadan sonra elde edilen ve ayrılan süpernatan (yukarıda 6 ncı basamak) eritrositlere bağ lı olmayan tüm antikorları göstermek için aynı şekilde test edilir. Yorum 1. Eğer elu ate spe si fik A ya da B erit rositleriyle antiglobulin testinde aglütine olur ya da reaksiyona girerse ve O eritrositleriyle reaksiyona girmezse, eritrositlerin yüzeylerinde spesifik antikora bağlanma kapasitesi bulunan aktif A ya da B antijeni mevcut demektir. 2. Eğer elu ate O erit ro sit le riy le de re ak si yo na gi rer se elu ate için de an ti-a ya da an ti-b den baş ka bir an ti kor bu lun du ğu an la şı lır. Rh ANTİJENİNİN SAPTANMASINDA KULLANILAN YÖNTEMLER Protokol 5: Rh Tayininde Tüp Testi 81

Hülya Bilgen Serolojik Yöntem: Hemaglütinasyon Prosedür 1. Te miz, işaretlenmiş bir test tü pü nün içi ne bir dam la an ti-d se ru mu damlatı lır. 2. İşaretlenmiş (kontrol yazılmış) ikin ci bir tü pün içi ne uy gun kont rol ajanından bir damla damlatı lır. 3. Her tüpe test edilecek %2-5 lik eritrosit süspansiyonundan (SF, serum veya plazma içindeki) birer damla damlatı lır. Alternatif olarak, eşit miktarda eritrositi her tüpe paylaş tır mak için te miz aplikatör çubuklar kullanı lır. 4. Nazikçe karış t ı rı lır ve üreticinin önerdiği hız ve zamanda santrifüje edilir. 5. Eritrosit birikintisi nazikçe tüp hareketi ile resüspande edilir ve aglütinasyon açı sından kontrol edilir. Eritrositleri transfer etmek için çubuk kullanılmışsa, eritrosit birikintisi kaldı rıl ma dan ön ce her tü pe 1 dam la serum fizyolojik ilave etmek, resüspansiyona yardımcı olacak daha fazla sı vı sağlayacaktır. 6. Reaksiyonlar derecelendirilir ve test ile kontrol sonuçları kaydedilir. Yorum 1. Anti-D tüpündeki aglütinasyon 2+ ve kont rol tü pü non re ak tif ise ge çer li bir test oluşturur ve test edilen eritrositlerin D+ oldu ğunu gösterir. 2. Kontrol tüpünde aglütinasyon varsa veya anti-d tüpündeki aglütinasyon < 2+ ise, da ha ile ri test ler ol mak sı zın (ba kı nız za yıf D [Du] tes ti) Rh ti pi pozitif olarak de ğerlendirilmemelidir. 3. Hem anti-d hem de kontrol tüplerindeki düz bir eritrosit süspansiyonu ne ga tif test so nu cu dur. Bu nok ta da has ta la rın ka nı D negatif ola rak gö zük se de, do nör ka nı mutlaka D antijenin zayıf formları için za yıf D (Du) tes ti ne ta bi tutulmalı dır. Lam yön te mi ile gü ve ni lir Du tes ti ya pılamaz. Protokol 6: Zayıf D Testi (DU Testi) Serolojik Yöntem : Hemaglütinasyon Prensip: D antijeni her za man güç lü re ak si yon ver me ye bi lir. Ba zı eritrositler, bir çok an ti-d aja nı tarafından direkt aglütine edilemeyecek zayıflıkta bir D antijeni ta şır. D antijeninin bu zayıf durumu, en belirgin olarak, test eritrositinin anti-d ile bekletilmesinden sonra İndirekt Antiglobulin Test (İAT) ile tanımlanabilir. Prosedür 1. Te miz, işaretlenmiş test tüpüne bir damla anti-d antiserumu damlatılır. 82

Kan Gruplarının Saptanması 2. İkin ci bir işaretlenmiş (kontrol yazılmış) test tüpüne uygun kontrol ajanından bir damla damlatı lır. 3. Her iki tü pe, test edi le cek SF ile ha zırlanmış %2-5 erit ro sit süs pan siyonundan birer damla damlatı lır. İstenirse kontrol testi yerine, test edilecek eritrosit üzerinde bir Direkt Antiglobulin Test (DAT) uygulanabilir. Ancak kontrol ajanı ile birlikte bir IAT uygulamak daha iyidir. Çünkü di ğer yön temde aja nın tüm komponentleri yanlış pozitif sonuçlar verebilir. 4. Üreticinin firma prospektüsleri direktifleri doğrultusunda, her iki tüp de karış tı rı lır ve 37 C de 15-30 da ki ka bek le ti lir. 5. 900-1000 x g de, 15-45 sa ni ye sant ri füj edi lir. 6. Nazikçe eritrosit kümeleri resüspande edilir ve aglütinasyon olup olmadı ğına bakı lır. Eğer, bu nok tada, anti-d ile test hücrelerinde güçlü bir aglütinasyon varsa ve kontrolde böyle bir durum yoksa, test örne ği D+ ola rak kaydedilir. Testin antiglobulin fazına geçmeye gerek yoktur. 7. Test edilen eritrositlerde aglütinasyon yoksa veya şüpheli bir ag lütinasyon var sa erit ro sit ler çok mik tar da SF ile 3 ve ya 4 kez yı ka nır. 8. Son yıkamadan sonra SF tamamen dökülür ve tüpün ağız ke narları kurulanır. 9. Üreticinin direktifleri doğrultusunda 1-2 damla anti-igg damlatı lır. 10. Nazikçe karış tı rı lır ve 900-100 x g de, 15-30 sa ni ye sant ri füj edi lir. 11. Her eritrosit birikintisi nazikçe kaldı rı lır, aglütinasyon olup olmadı ğına bakı lır, test sonucu derecelendirilir ve kaydedilir. 12. Eğer tes tin so nu cu ne ga tif ise, re ak si yon, bi li nen IgG-du yar lı eritrositler ek le ne rek, tek rar sant ri füj edi lir ve tek rar ag lü ti nas yon kont ro lü ya pılmak suretiyle doğrulanabilir. Bu noktada olu şan aglütinasyon, test karı şı mı nın içinde ak tif AHG ol du ğunu gösterir. Yorum 1. Za yıf D testi prosedürüne mutlaka bir diluent kontrol testi veya bir direkt antiglobulin testi eşlik etmelidir. Anti-D tüpünde aglütinasyon varken kontrol tüpünde olmaması testin pozitif oldu ğunu gösterir. Kan D+ olarak sı nıflandı rılmalı dır. Bu tür erit ro sit le ri D -, Du + ola rak ra por et mek doğru de ğildir. 2. Anti-D testinde aglütinasyon olmamışsa sonuç negatiftir. Bu, eritrositlerde D ak ti vi te si yok de mek tir ve D - ola rak sı nıflandı rı lır. 3. Kont rol tes ti po zi tif ise, za yıf D tes ti için ge çer li bir yo rum ya pılamaz. Bu durumda, eğer test edilen eritrositler hastaya ait ise Rh- kan verilmelidir; eğer 83

Hülya Bilgen donöre ait ise eritrositler transfüzyon için kullanılmamalı dır. Protokol 7: Otoaglütinasyonu Dağıtmak için Thiol Ajanları Kullanımı Prensip: So ğuk ta re ak ti ve olan oto an ti kor la rın ne den ol du ğu aglütinasyonu dağıtmak için, pentamerik IgM moleküllerinin inter-subunit disulfid bağlarına yapı şan Thiol ajanları kullanılabilir. Thiol ajanları ile ken di ken di ne aglütine olan eritrositlerin (otoaglütinasyon) önlenmesi, kan gruplama testinde kullanmak için uygun bir örnek elde etmemizi sağlar. Araç-Gereç 1. 0.01 M dit hi oth re itol (DTT) ve ya 0.1 M 2-mercaptoethanol (2-ME) 2. Phosp ha te-buf fer sa li ne (PBS), ph 7.3 e ayar lanmış. 3. Yıkanmış eritrosit süspansiyonu. Prosedür 1. PBS de %50 lik bir konsantrasyona kadar, eritrositler dilüe edilir. 2. Süspansiyona eşit mik tar da PBS de 0.01 M DTT ve ya PBS de 0.1M 2-ME eklenir. 3. 37 C de 10 da ki ka (2-ME) ve ya 15 da ki ka (DTT) bek letilir. 4. Erit ro sit ler 3 kez yıkanır. 5. İşlemden geçmiş eritrositler %3-5 lik SF konsantrasyonunda dilüe edilir ve kan gruplama testinde kullanı lır. Pro to kol 8. DAT po zi tif erit ro sit ler de Rh ta yi ni Prensip: Eritrositlerin IgG ile yo ğun bir şekilde kaplandı ğı durumlarda an tig lo bu lin-re ak tif se rum ile test yap mak zor dur ve yüksek proteinli aglütine edici ajanlarla yapılan testler de pratik de ğildir. Eritrosit membran bütünlü ğünü bozmadan veya antijen yapı sı nı de ğiştirmeden eritrositi antikordan ayırmak gerekebilir. Elüsyon prosedürü, aktif antikor şeklinde hareket edenlerden farklı bir şe kil de, an ti kor suz erit ro si tin ha zırlanması ama cıyla kullanı lır. Prosedür 1. Uy gun ebat ta ki bir test tü pü ne 1 ha cim yıkanmış, antikor kaplı eritrosit süs pan si yo nu ve 3 ha cim se rum fiz yolojik konur. Diğer bir tü pe, eşit mik tarlar da SF ile ça lı şılması dü şünülen antijen (genellikle D) için pozitif olan yı kanmış, eritrosit süspansiyonu konur. Bu bize ayırma işleminin antijen reaktivitesine zarar verip vermediğini kontrol etmemizi sağlar. 2. Her iki tü pün içe rik le ri yak la şık 45 C de 10-30 dakika bekletilir. Tüp sık sık çal kalanmalı dır. Bekletme süresi, antiglobulin reaktivitesinin gücünü 84

Kan Gruplarının Saptanması gösteren, antikor kaplama derecesi ile kabaca orantı lı olmalı dır. 3. Erit ro sit ve SF yi ayır mak için tüp ler sant ri füj edi lir. SF so lüsyonu atılır. 4. Elüs yon işlemi yapılmamış eritrositlerdeki antiglobulin test sonuçları ile elüsyon yapılmış eritrositlerdeki direkt antiglobulin test sonuçları kar şılaş tı rılmak suretiyle, önceden antikor kaplanmış eritrositlerin antikordan kurtulma de re ce si test edi lir. Eğer an tikor kaplanma durumu azalmış ama ha la mev cut ise 1 den 3 e ka dar olan ba sa mak lar tek rar edi lir. 5. Elus yon ya pılmış eritrositler, dü şük pro te in li an ti-d ile test edi lir. Not 1. Kan gruplama antiserumları (ör ne ğin An ti-d) ile test edi len erit ro sit lerde aglütinasyon yoksa, elüsyon yapılmış erit ro sit le rin tüm an ti je nik re ak ti vi tesini kaybetmedi ği gösterilmelidir. Görünü şe göre, bir diluent kontrolüne paralel olarak D- eritrositler, anti-c ve anti-e ile test edilmelidir. Eritrositler, her iki an ti se rum ile de ag lü ti ne ol mu yor sa D tes tin de ki ne ga tif so nuç lar şüphelidir. 2. Eritrosit ve SF, 56 C de, 3 dakika tutmak suretiyle, alternatif bir elüs yon tekni ği de kul la nılabilir. Bu ısı da da ha uzun sü re bek let mek an ti je nik re ak ti viteye zarar verecektir. KAYNAKLAR 1. Ulusal Kan Merkezleri ve Transfüzyon Tıbbı Kursu VII, 2004. 2. Transfusion Service Procedure Manual. Houston, TX: The University of Texas M. D. Anderson Cancer Center, 2002. 3. http://matcmadison.edu/ 4. Cullough J.Mc, Transfusion Medicine, 2nd edition: 181-219, 2005. 5. Daniels G. Human Blood Groups,2nd ed.,cambridge,ma: Blackwell Science, 2002. 6. P.Learoyd and R. Knight, BBTS An Introduction to Blood Transfusion Science and Blood Bank Practice, 2002. 7. Standards for blood banks and transfusion services, 21st ed. Bethesda, MD: American Association of Blood Banks, 5.12.1, 5.15.5.1, 2002. 8. www.transfusionontario.org. 9. Package insert: MTS Diluent 2 PLUS Red Blood Cell Diluent, rev. 2-14-01. Pompano Beach, FL: Micro Typing Systems, Inc. 85