Fare meme kanseri modelinde duysal sinirlerin metastaz oluşumundaki rolü ve etki mekanizması Dr. Nuray Erin Akdeniz Üniversitesi Tıp Fakültesi Mitojenik sinyaller, Baskılanmış temas inhibisyonu Apopitozdan kaçış anjiyogenez Ekstraselluler matriksin degredasyonu (MMPler) Hücre hücre adhezyonunun kaybı Migrasyon (göç) Endotel boyunca adhezyon ve migrasyon (Intravazasyon) TF antijeni, galectin-3, integrins Modified from Huber, Kraut and Beug, Current Opinion in Cell Biology 2005, 17:548 558 1
Proteolizis ve migrasyon (ekstravazasyon) Mikrometastaz Sağkalım ve proliferasyon (çoğalma) sinyalleri Makrometastaz Modified from Huber, Kraut and Beug, Current Opinion in Cell Biology 2005, 17:548 558 Evsahibi dokunun cevabı İntrensek özellikler Sistemik cevap mikroçevre (büyüme faktörleri, sitokinler, ECM-ile ilişkili büyüme faktörleri) Metastatik potansiyel Organa spesifik fenotipler 2
Kanser heterojen hücrelerden oluşmakta ve sadece birkaç tanesi metastaz oluşturabilmektedir. Sağkalım çoğalma (Proliferasyon) Anjiyogenez Proteolizis ve migrasyon (MMPler, upa, katepsinler), Etkili tedavi yok Hala oyuncuların ve/veya ilişkilerin tamamını bilmiyoruz 3
İnflamatuar hastalıklar STRES Değişmiş duysal sinir foksiyonu? Nöroendokrin değişiklikler Bağışıklık sisteminin baskılanması Kanser nüksünde ve metastazda artış Kapsaisine duyarlı duysal (afferent) sinirler Miyelinsiz küçük çaplı C ve aδ lifleri, Peptid içeren sinir sonlanmaları 4
KAPSAİSİNE DUYARLI DUYSAL SİNİRLER İnflamasyona bağlı ağrı duyumu Kanser Hücresi? Nörojenik inflamasyon *artmış kan akımı, *plazmanın ekstravazasyonu (damar dışına çıkması) *mast hücresinin degranulasyonu (parçalanması) *hiperemi *vaskuler endotele lökosit adhezyonunun artması. *anjiyogenez P maddesi duysal sinir sonlanmalarında bulunan başlıca nöromediatördür 5
P maddesi inflamasyon Anjiyogenez Mitojenik etkiler Tümör gelişiminin teşvik edilmesi Yüksek doz Kapsaisin ile tedavi 5-6 haftalık Balb/c dişi fareler Ketamin/ksilazin ile anestezi 24 Saat içinde 2 ye bölünerek 125mg/kg kapsaisin 1 hafta bekleme hücrelerinin (10 5 hücre) meme pedi içine injeksiyonu 6
Öncü Tümör 1 2 9 75mg/kg 50mg/kg Kapsaisin injekte edildi nin meme pedine injeksiyonu Balb-c fareleri, 4-5 haftalık 2002-052 # Akciğer metastazı 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 # of Lung Metastasis per Mouse Çözücü Kapsaisin 125 mg/kg vehicle capsaicin (125mg/kg) 23 gün 30 gün injeksiyonundan sonra Erin ve ark, Anticancer Res, 2004 7
Göz oğuşturma sayısı 50 40 30 20 10 0 A) 0 25 50 125 Akciğer Metastazlarının Sayısı/fare 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 Çözücü Cap-25 Cap-50 Cap-125 Doz (mg/kg) B) Mikroskopik Kalp Mets İnsidansı 100 80 60 40 20 * Çözücü Kapasisin 25 mg/kg Kapsaisin 50 mg/kg Kapsaisin 125 mg/kg * 0 Perikardial Myokardial 8
Duysal nöronların inaktivasyonu akciğer ve kalbe metastazı artırmaktadır düşündüğümüzün tersi Yüksek doz kapsaisin tedavisinden sonra P maddesinin düzeyi % 40-50 azalmaktadır 4THM injeksiyonundan 12 gün sonra 1000 Çözücü Kapsaisin 2500 Kontrol Kapsaisin SP pg/g 800 600 400 * * Deri SP pg/g 2000 1500 1000 * 200 500 0 Kalp Akciğer 0 9
Mikroarray analizleri (SAM analizi) >12000 genler Öncü tümör (duysal sinirleri aktif) Öncü tümör Duysal sinirleri inaktif 17 gende değişiklik gözlendi Duysal sinirler Mikroarray sonuçları sağlam inaktif Cap=old Chang Title 28,6935 10,3156 0.30951 RIKEN cdna 2700025J07 gene 70,015 22,5259 0.30492 guanine nucleotide binding protein, alpha 12 47,0554 22,0169 0.44519 DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 10 303,698 169,73 0.56495 coagulation factor II (thrombin) receptor 201,376 84,2194 0.44937 WW domain binding protein 3 127,402 36,761 0.28759 ELK3, member of ETS oncogene family 165,181 92,3357 0.57080 caspase 7 17,5071 11,688 0.57373 DNA segment, Chr 1, Pasteur Institute 1 406,236 141,245 0.35971 insulin-like growth factor binding protein 3 66,9687 31,5111 0.47256 poly A binding protein, cytoplasmic 4 186,771 44,2051 0.23531 a disintegrin and metalloprotease domain 10 (ADAM 10) 60,8183 30,8786 0.48271 expressed sequence AU021838 68,4435 35,6446 0.50507 chromobox homolog 1 (Drosophila HP1 beta) 110,362 44,0051 0.40290 SMC6 structural maintenance of chromosomes 6-like 1 (ye 18,5526 9,30437 0.40190 zinc finger protein 60 135,692 61,4381 0.46633 zinc finger protein 422 41,128 24,8273 0.57312 phospholipase D1 10
Apopitozun inhibisyonu primer bölgede sağkalım Duysal sinirler 64 49.5 MC11 4THM saglam inaktif 1 2 3 1 2 3 37.4 Kaspaz 7 26 Kaspaz 7 eksprasyonu ve aktivasyonu mikroçevre tarafından, spesifik olarak duysal nöronların mediyatörleriyle indüklenmektedir ADAM 10 bir metaloproteazdır 113 80.9 63.8 49.5 MC11 4THM sağlam inaktif 1 2 3 1 2 3 ADAM 10 Proteazlar metastaz oluşumunu teşvik eder??? 11
P maddesi Anjiyogenez Mitojenik etkiler spesifik olmayan inflamasyon Tümör gelişimi SP antimitojenik olabilir Neprilisin-endopeptidaz SP fregmantları- tümör hücresinin büyümesini inhibe eder 12
SP fragmantı Lynn Heasley, Oncogene 2001 ADAM 10 Neprilisin ( SPyi parcalar) Ortak substratlar 13
P Maddesi üzerinde Adam 10 hidroliz bölgeleri Ana bölgeler Minor bolgeler R-P-K-P-Q-Q-F-F-G-L-M-Nh2 P maddesi Duysal sinir sonlanmalari Sitokinler Tümör kökenli faktörler Nöromediyatörler e.g SP, CGRP Büyümenin inhibisyonu ADAM + ekspresyonu SP-nöronal ve nöron dışı SP fragmanları ADAM - Erin ve ark. Breast Cancer Res Treatment, 2006 14
Duysal nöronları inaktif hayvanlarda injeksiyonu 4THMpc Meme pedi injeksiyonu 40 Karaciğer mets/fare 30 20 10 * p< 0.001 0 4THM 3,5 3,0 * p=0.029, n=8 4THM, n=8 metastaz /fare 2,5 2,0 1,5 1,0 * p=0.006 0,5 0,0 Böbrek Adrenal 15
Küçük bir hücre populasyonu metastaz oluşturur Duysal sinirlerin inaktivasyonu primer tümör hücrelerinin metastatik alt grubunun büyümesine izin mektedir. Çözücü Kaps- Çözücü 4THMpc Gen 212,9 51,2 76,13 a disintegrin and metalloprotease domain 10 145,9 42,8 58,4 ELK3, member of ETS oncogene family 153,8 47,1 52,91 coagulation factor II (thrombin) receptor 81,3 25,8 32,0 guanine nucleotide binding protein, alpha 12 459,3 163,5 157,7 insulin-like growth factor binding protein 3 127,2 51,9 29,3 SMC6 structural maintenance of chromosomes 6-like 1 229,2 101,8 148,6 WW domain binding protein 3 20,1 12,2 12,19 DNA segment, Chr 1, Pasteur Institute 1 Yüksek düzeyde eksprese olan 8 genden 7 si hem Kap- öncü tümörlerinde hem 4THMpc öncü tümörlerinde azalmıştır 16
Sonuçlar Duysal sinir sonlanmalarının inaktivasyonu meme karsinom hücrelerinin daha agresif altgrubun büyümesini teşvik eder Kaspaz 7 ekspresyonunun azalması-yaşamsal avantaj ADAM 10 negatif kanser hücrelerinin büyümesiyle Kanser Kök Hücreleri? 17
Dizi/Küme (Cluster) Analizleri LM.5 LM.4 LM.1 LM.2 LM.3 4THMpc.1 4THMpc.2 4THMpc.3 4THMpc.5.1.2.3 4THMpc.4 -meme ca balb-c orijinli 4THMpc in kalp mets dan Daha agresif Karaciğer mets 4THMpc den orijin alan 9 gende artış 245 gen de azalış 866 gende artış 722 gende azalış 61-gende değişim 16-gen azalmış Hücre adezyon molekülleri 18
16 genin eksprasyon düzeyi Hücre Dizilerinden Öncü Tümörler MC11 4THMpc 4TLM 4THMpc 4THMpc 26 19 Claudin-4 Piko düzeyde 26 19 Claudin-4 Femto düzeyde 37.4 26 Claudin-7 19 Femto düzeyde 19
Klaudin 4 Öncü Tümörleri 4THMpc Öncü Tümörleri Karaciğer ve erken metastaz Karaciğer Metastazı Klaudin 4 Kontrol karaciğer Metastatik Karaciğer Metastazı çevreleyen karaciğer dokusu 20
Figure 4A Claudin 7 Primary 4THMpc Primary Liver and metastasis Liver and metastasis Klaudin 7 Kontrol Karaciğer Karaciğer; 4THM hücrelerinin injeksiyonundan 12 gün sonra Karaciğer; injeksiyonundan 30 gün sonra 21
Hücre Dizileri Öncü Tümörler Öncü Tümörler MC11 4THM 4TLM 4THM 4THM Marker 4THM 4THM 176 120 113 ZO-1 Sonuçlar Duysal sinir sonlanmalarının inaktivasyonu meme karsinom hücrelerinin daha agresif altgrubunun büyümesini teşvik eder Mikroarray ve protein analizleri metastatik fenotipi belirlemede hücre adezyon moleküllerindeki kaybın önemli olduğunu göstermektedir. Mikroarray sonuçları metastatik fenotipe sahip hücrelerin kök hücrelerine benzediğini ve mikroçevreye göre gen eksprasyonunun değiştiğini göstermektedir. 22
Çalışmaya Katkıda Bulunanlar Penn State Üniversitesi, Gittlen Kanser Merkezi Dr. Gary Clawson ve laboratuvarı Dr. Judith Weisz ve laboratuvarı, Dr. John Bylander Wei Zhao Akdeniz Üniversitesi, Tıp Fakültesi İç Hastalıkları ABD ve Sağlık Bilimleri Araştırma Merkezi 23