Hafta IX Genombilimde Mikrodizin Uygulamaları ve iyoinformatik Analiz DNA Mikroarrayler: SNP analizleri Doç. Dr. Hilâl Özdağ
DNA Mikrodizin Genomik Dizi SNP 5 T / G 3 SNP prob = 25 baz Perfect Match Mismatch Allel A Perfect Match Mismatch Allel
DNA Mikrodizin SNP C / A TAGCCATCGGTA N GTA C TCAATGATCAGCT ATCGGTAGCCAT G ATCGGTAGCCAT C CAT G AGTTACTA CAT G AGTTACTA PM Allel MM Allel A A ATCGGTAGCCAT T ATCGGTAGCCAT A CAT G AGTTACTA CAT G AGTTACTA PM Allel MM Allel
DNA Mikrodizin PM A MM PM MM A -4-2 -1 0 1 3 4 7 Prob Çift Seti (Kuartet) SNP başına 56 olasılık Oryantasyon başına 28 Dağıtılmış yerleşim Düz zincir 5 3 PM A MM PM MM A 3 5 Ters zincir
DNA Mikrodizin 1 2 3 4 5 6 7 PMA PMA PMA PMA PMA PMA PMA MMA MMA MMA MMA MMA MMA MMA PM PM PM PM PM PM PM MM MM MM MM MM MM MM 14 kuartet değerlendirilip en iyi 10 tanesi herbir TNP yi temsil etmek üzere seçilir. Seçilen bu 10 kuartet herbir TNP nin varlığını hem düz hem de ters zincirde inceler. Tek bir TNP yi sorgulamak üzere toplam 40 prob kullanılmaktadır.
Tek Primer Amplifikasyonu ile Karmaşıklığın Ortadan Kaldırılması
DNA Mikrodizin 250 ng Genomik DNA Xba Xba Xba RE muamelesi Tek primer ile amplifikasyon Adaptörün bağlanması 4 PCR Reaksiyonu Fragmentasyon ve işaretleme Hibridizasyon Ve Tarama
DNA Mikrodizin Mikrosatellit 10K # Marker 400 10,000 Çözünürlülük 10 cm (10 M) 1 cm (1 M) * # PCR Reak/örnek 200 (2x multipleks) 4 # PCR Primer/örnek 800 1 Süre (400 örnek) > 8 hafta 4-6 hafta elirteç başına DNA Deney başına DNA 40 ng 16,000 ng.025 ng 250 ng
DNA Mikrodizin Farklılıklar 100k 10K Dizin sayısı 2 1 Enzim sayısı 2: Xba1 ve HindIII 1: Xba aşlangıç DNA miktarı 250 ng X2 enzim = 500 ng 250 ng PCR Amplifikasyon oyutu 250-2000bp 250-1000bp Fragmente edilecek miktar 40ug 20ug Tarama Yüksek çözünülürlüklü tarama Rutin tarama Fragmentasyon reaktifinin konsantrasyonu 0.06U/uL 0.048U/uL Algoritma ve yazılım DM Algoritma ve GTT MPAM ve GDAS 2.0 Ana uygulama alanı Asosiyasyon çalışmaları ağlantı TNP ler Perlegen ve Kamu Kamu
DNA Mikrodizin
DNA Mikrodizin
DNA Mikrodizin
DNA Mikrodizin <> <>
Resequencing Tiling Strategy A ATCGGTAGCCATACATGAGTTACTA T ATCGGTAGCCATTCATGAGTTACTA 12 bases C ATCGGTAGCCATCCATGAGTTACTA ATCGGTAGCCATGCATGAGTTACTA G ATCGGTAGCCATGCATGAGTTACTA TAGCCATCGGTACGTACTCAATGAT TAGCCATCGGTAGGTACTCAATGAT A TAGCCATCGGTACGTACTCAATGAT T TAGCCATCGGTATGTACTCAATGAT C TAGCCATCGGTAAGTACTCAATGAT G CAGCT GTCGA
Resequencing Tiling Strategy TCGGTAGCCATGAATGAGTTACTAC TCGGTAGCCATGCATGAGTTACTAC TCGGTAGCCATGGATGAGTTACTAC TCGGTAGCCATGTATGAGTTACTAC ATCGGTAGCCATGCATGAGTTACTA TAGCCATCGGTACGTACTCAATGAT AGCCATCGGTAGATACTCAATGATG AGCCATCGGTAGCTACTCAATGATG AGCCATCGGTAGGTACTCAATGATG AGCCATCGGTAGTTACTCAATGATG CAGCT GTCGA
Resequencing Tiling Strategy CGGTAGCCATGCATGAGTTACTACA CGGTAGCCATGCCTGAGTTACTACA CGGTAGCCATGCGTGAGTTACTACA CGGTAGCCATGCTTGAGTTACTACA ATCGGTAGCCATGCATGAGTTACTA TAGCCATCGGTACGTACTCAATGAT GCCATCGGTACGAACTCAATGATGT GCCATCGGTACGCACTCAATGATGT GCCATCGGTACGGACTCAATGATGT GCCATCGGTACGTACTCAATGATGT CAGCT GTCGA
Resequencing Tiling Strategy GGTAGCCATGCAAGAGTTACTACAG GGTAGCCATGCACGAGTTACTACAG GGTAGCCATGCAGGAGTTACTACAG GGTAGCCATGCATGAGTTACTACAG ATCGGTAGCCATGCATGAGTTACTA TAGCCATCGGTACGTACTCAATGAT CAGCT GTCGA CCATCGGTACGTACTCAATGATGTC CCATCGGTACGTCCTCAATGATGTC CCATCGGTACGTGCTCAATGATGTC CCATCGGTACGTTCTCAATGATGTC
Resequencing Tiling Strategy GTAGCCATGCATAAGTTACTACAGC GTAGCCATGCATCAGTTACTACAGC GTAGCCATGCATGAGTTACTACAGC GTAGCCATGCATTAGTTACTACAGC ATCGGTAGCCATGCATGAGTTACTA TAGCCATCGGTACGTACTCAATGAT CAGCT GTCGA CATCGGTACGTAATCAATGATGTCG CATCGGTACGTACTCAATGATGTCG CATCGGTACGTAGTCAATGATGTCG CATCGGTACGTATTCAATGATGTCG
Resequencing Tiling Strategy TAGCCATGCATGAGTTACTACAGCT TAGCCATGCATGCGTTACTACAGCT TAGCCATGCATGGGTTACTACAGCT TAGCCATGCATGTGTTACTACAGCT ATCGGTAGCCATGCATGAGTTACTA TAGCCATCGGTACGTACTCAATGAT CAGCT GTCGA ATCGGTACGTACACAATGATGTCGA ATCGGTACGTACCCAATGATGTCGA ATCGGTACGTACGCAATGATGTCGA ATCGGTACGTATTCAATGATGTCGA
A Düz zincir C G T T C G C A
CustomSeq Resequencing Dizinleri AGCGT ACCGT A C G T A C G T Çip başına 30 kb çift zincirli DNA dizilimi okunabiliyor. Toplam 60 kb.
CustomSeq Deney Protokolü Kontrol Kalıp/Primerler Genomik DNA Kısa Ölçekli PCR Uzun Ölçekli PCR Miktar tayini-örneklerin Karıştırılması Fragmentasyon reaktifi Fragment Đşaret Hibridizasyon için oligo kontrolleri Hibridizasyon Veri analizi
Deney Akışı Đlgilenilen genlerin belirlenmesi Karıştırma ve Fragmentasyonasyon DNA fragmentleri Genomik DNA PCR Ürünleri Đşaretleme Geceboyu hibridizasyon Tarama Yıkama Đstasyonu: Yıkama/oyama Sondan işaretli fragmentler
Affymetrix CustomSeq Arrays iological Sample Probe Array 2.5 Days Wash & Stain >chr21:29595444-29636248 gtggcatgatcttggctcactgcagttcaagcaattctcctgccttagc cccctgagtagctgggattacaggtgcctgctaccaccctcagctaat tttttgtatttttaatagagacggggtttcaccatgttggccaggctggtc tcgaactcctgacctcgtgattcgtctgcctcggccttccaaagtgctg ggagtacaggcatgagccaccgcacccggcctgtatatcttttttaaa aggaaaagaacatatcccagaagtttccaactgagtttccctctgggt caataccagaattgggtgggggtcttcagctcacccctaaactcatca ttgataagcagaatgaatgaccatggctggtttagaca. Scan ~30 Kb
DNA Analiz Yazılımı Cihaz Kontrolü.DAT dosyasının oluşturulması GCOS.CEL dosyasının oluşturulması.chp dosyasının oluşturulması.chp veri karşılaştırılması GeneChip DNA Analysis Software 2.0 (GDAS)