ÇOCUKLUK ÇAĞI AKUT LÖSEMĐLERĐNDE FLT3 (FMS-Like Tyrosine Kinase 3) MUTASYONLARI

T.C. ÇUKUROVA ÜNĐVERSĐTESĐ TIP FAKÜLTESĐ ÇOCUK SAĞLIĞI VE HASTALIKLARI ANABĐLĐM DALI PEDĐATRĐK HEMATOLOJĐ BĐLĐM DALI ÇOCUKLUK ÇAĞI AKUT LÖSEMĐLERĐNDE FLT3 (FMS-Like Tyrosine Kinase 3) MUTASYONLARI Dr. Göksel LEBLEBĐSATAN TIPTA YANDAL UZMANLIK TEZĐ TEZ DANIŞMANI Prof. Dr. Yurdanur KILINÇ ADANA, 2008 I

TEŞEKKÜR Bu araştırma esnasında her aşamada büyük katkı ve desteğini gördüğüm değerli hocam Sayın Prof. Dr. Yurdanur Kılınç a, istatistiksel değerlendirmelerde danışmanlık yapan Prof. Dr. Nazan Alparslan a, örneklerin toplanması esnasında büyük yardımları geçen tüm Pediatri asistanlarına, Pediatrik Hematoloji servis ve poliklinik hemşirelerine, ve çalışma esnasında bana yardımlarını esirgemeyen Sayın Prof. Dr. Bülent Antmen ve Doç. Dr. Đlgen Şaşmaz a ve laboratuarında çalışma imkanı bulduğumuz Doç. Dr. Mustafa Yılmaz ve laboratuar çalışanlarına teşekkürü borç bilirim. I

ĐÇĐNDEKĐLER TEŞEKKÜR... I ĐÇĐNDEKĐLER... II TABLO LĐSTESĐ... IV ŞEKĐL LĐSTESĐ... V KISALTMA LĐSTESĐ... VI ÖZET... VII ABSTRACT... VIII 1. GĐRĐŞ VE AMAÇ... 1 2. GENEL BĐLGĐLER... 2 2.1. Akut Lenfoblastik Lösemi... 2 2.1.1. Klinik Karakteristikleri... 2 2.1.1.1. Mediastinal Bulgular... 4 2.1.1.2. Genitoüriner Bulgular... 5 2.1.1.3. Đskelet Sistemi Bulguları... 6 2.1.1.4. Gastrointestinal Sistem Bulguları... 6 2.1.1.5. Göz Bulguları... 7 2.1.1.6. Kardiopulmoner Bulgular... 7 2.1.1.7.Cilt Bulguları... 8 2.1.2. Laboratuar Bulgular... 8 2.1.3. Prognostik Faktörler... 11 2.1.4. Tedavi... 11 2.2. Akut Miyeloid Lösemi... 13 2.2.1. Klinik Karakteristikleri... 13 2.2.2. Sınıflama... 14 2.2.2.1. Đmmünfenotip... 14 2.2.3. Moleküler Genetik... 15 2.2.4. Prognostik Faktörler... 15 2.2.5. Tedavi... 15 2.3. FLT3 (FMS-Like Tyrosine Kinase 3)... 16 2.3.1. Normal Hematopoezde FLT3... 16 2.3.1.1. FLT3 Ligand... 16 2.3.1.2. FLT3 Reseptör... 17 2.3.1.3. FLT3 Reseptör Ekspresyonu... 18 2.3.1.4. FL nin Diğer Sitokinlerle Sinerjisi... 18 2.3.1.5. FLT3 Reseptör Uyarılması... 19 2.3.2. Lösemilerde FLT3... 20 2.3.2.1. FLT3 Đnternal Tandem Duplikasyon Mutasyonu... 20 2.3.2.2. FLT3 te Tek Amino Asit Mutasyonları... 21 2.3.2.3. FLT3 Mutant Sinyalleşme... 21 2.3.2.4. FLT3 ve Hücre Farklanması... 23 2.3.2.5. FLT3 Fosfatazlar... 24 2.3.2.6. FLT3 ve Đn Vivo Lösemi Modelleri... 24 2.3.2.7. FLT3 Mutasyonlarının AML de Klinik Anlamı... 25 2.3.2.8. FLT3 Đnhibitörleri... 28 2.3.2.9. Direnç... 30 II

3. GEREÇ VE YÖNTEM... 33 3.1. Örnek Toplama... 33 3.2. DNA Đzolasyonu... 34 3.3. RealTime PCR Çalışması... 34 3.4. Đstatistiksel Yöntemler... 35 4. BULGULAR... 36 5. TARTIŞMA... 44 6. SONUÇLAR... 49 KAYNAKLAR... 50 ÖZGEÇMĐŞ... 61 III

TABLO LĐSTESĐ Tablo No Sayfa No Tablo 1. Akut Lösemili Çocuklarda Bulgu ve Belirtiler.....3 Tablo 2. Çocukluk Çağı Akut Lenfoblastik Lösemi Tanısında Gerekli Ana Taramalar.....4 Tablo 3. Akut Lenfoblastik Lösemide FAB Sınıflaması....9 Tablo 4. Đmmunofenotipik B-Linage ALL Sınıflaması... 10 Tablo 5. T-Hücre ALL Đmmünofenotipik Sınıflama... 10 Tablo 6. Akut Lenfoblastik Lösemi Tedavisinde Prognostik Faktörler... 11 Tablo 7. ALL Ve AML nin Morfolojik Özellikleri... 13 Tablo 8. AML FAB Alt Tipleri Đle Đmmünolojik Yüzey Markırları Đlişkileri... 14 Tablo 9. ALL Olgularının Demografik Verileri ve FLT3 Mutasyon Varlığı... 37 Tablo 10. AML Olgularının Demografik Verileri ve FLT3 Mutasyon Varlığı... 38 Tablo 11. ALL ve AML Olgularının Verilerinin Karşılaştırılması... 39 IV

ŞEKĐL LĐSTESĐ Şekil No Sayfa No Şekil 1. FLT3 reseptörü... 17 Şekil 2. FLT3 ile ilgili Lösemi patogenezinde etkili yolaklar... 22 Şekil 3. Hasta gruplarında yaş (yıl) dağılımı... 36 Şekil 4. ALL ve AML hasta gruplarında Hb(g/dl) dağılımı... 39 Şekil 5. ALL ve AML hasta gruplarında Lökosit(/mm 3 ) dağılımı... 40 Şekil 6. ALL ve AML hasta gruplarında Trombosit (/mm 3 ) dağılımı... 40 Şekil 7. ALL ve AML hasta gruplarında FLT3 mutasyon dağılımı... 43 V

KISALTMA LĐSTESĐ ALL : Akut Lenfoblastik Lösemi AML : Akut Myeloblastik Lösemi FAB : French, American, British CD : Clusters of Differansion PCR : Polimerase Chain Reaction WBC : White Blood Cell mrna : Messenger Ribonucleic Acid Hb : Hemoglobin Htc : Hematokrit Plt : Platelet NHL : Non Hodgkin Lenfoma MDS : Myelodysplastik Sendrom FLT3 : FMS-like tyrosine kinase 3 FLT3/TKD : FMS-like tyrosine kinase 3/Tirozin Kinaz Domain FLT3/ITD : FMS-like tyrosine kinase 3/Internal Tandem Duplikasyonu FL : FLT-3 ligand JM : Jukstamedüller DC : Dentritik Hücre VI

ÖZET Amaç: Bu çalışmada çocukluk çağı akut lösemilerinde hücre yaşamı, farklanma ve çoğalması ile ilgili yollarla bağlantılı bir reseptör olan FLT3 ün (FMS-Like Tyrosin Kinase) mutasyonlarının lösemi hastalarında varlığı ve bu mutasyonların prognoz ve diğer klinik tablo ile ilişkilerinin araştırılması planlandı. Materyal Metod: Çalışmaya sitomorfolojik, immunohistokimyasal ve immün akımsitometrik metodlar ile ALL tanısı alan 53 hasta ile AML tanısı alan 16 çocuk hasta dahil edildi. Bulgular: ALL ve AML tanılı hasta gruplarında saptanan FLT3/TKD mutasyon dağılımı; ALL grubunda 1 hasta (% 2) ve AML grubunda 4 hasta (% 25) şeklindeydi. Mutasyon saptanan ALL hastası 8 yaşında erkek hasta FAB sınıflamasına göre ALL-L1 idi. Đmmünfenotipleme ile pre-b grubunda olan hasta risk grubu olarak SRG ye dahil olmuştu. Hasta halen hayatta ve remisyondaydı. AML grubunda FLT3/TKD mutasyonu taşıyan hastalar içinde bir hasta relaps olmuştu, ancak relaps olan hasta ile birlikte 4 hastadan üçü kaybedilmişti. Buna rağmen yapılan istatistiksel incelemelerle mutasyon taşıyan AML hastaları ile taşımayan hastalar arasında mortalite ve morbidite açısından anlamlı bir fark saptanamadı (p>0,05). Sonuç: Bu çalışmada mevcut hastalarımızda saptanmış olan FLT3/TKD mutasyonlarının prognozla ilişkisi saptanamadı. Mutasyon AML grubunda daha yüksek oranlardaydı. Ancak AML grubunda dahi mevcut hasta sayıları ile mutasyon mortalite ve morbidite açısından istatistiksel bir fark oluşturmuyordu. Netice itibarıyla daha fazla hasta örneklerini içeren çalışmalar sonucu mutasyonla ilgili daha net sonuçlara ulaşılabilmesi mümkün olacaktır. Anahtar Kelimeler: Akut Lenfoblastik Lösemi, Akut Myeloblastik Lösemi, FLT3 (FMS-Like Tyrosin Kinase) VII

ABSTRACT FLT3 MUTATIONS IN CHILDHOOD ACUTE LEUKEMIA Purpose: In this study it is aimed to investigate the presence of mutations of FLT3 receptor which is related with cellular surveillance, differentiation and proliferation pathways, and whether its presence affects prognosis and other clinical parameters in childhood leukemias. Matherial and Methods: Fifty three patients diagnosed as ALL and sixteen patients diagnosed as AML by cytomorphological, immunohistochemical and immuno flow-cytometric methods were included in this study. Results: FLT3/TKD mutation distribution in ALL and AML groups is as follows; only one patient in ALL group and 4 patients in AML group were detected. In ALL group the patient having mutation is 8 years old boy, in pre-b group ALL-L1, alive and also in remission. In the patients with mutation of AML group: one have relapsed disease and totally 3 of them deceased including relapsed patient, but there is no difference of mortality or morbidity between FLT3/TKD mutation carrying and others in AML patients statistically (p>0.05). Conclusion: In this study it is concluded that FLT3/TKD mutations have no prognostic significance within acute leukemia patients. Mutations were found to be higher in AML group than ALL, but even in AML group FLT3/TKD mutations don t mean any mortality or morbidity variations. As a result, it is possible that because of the selection of limited patient groups, the relations between mutation and prognosis may not be seen so studies including more crowded patient groups may be helpfull to find clear relations between FLT3 mutations and its results having prognostic importance. Key Words: Acute Lymhoblastic Leukemia, Acute Myeloblastic Leukemia, FLT3 (FMS-Like Tyrosin Kinase) VIII

1. GĐRĐŞ VE AMAÇ Lösemiler çocukluk çağının en çok görülen malign hastalıkları olup çocukluk çağı kanserlerinin 1/4 ünü oluşturur. ALL diğer lenfoid malignensiler gibi tek bir anormal öncül hücrenin malign dönüşümü ile klonal çoğalma sonucunda ortaya çıkmaktadır. AML ise miyeloid, monositik, eritroid ve megakaryositik hücre serilerinin kemik iliği prekürsörlerinden oluşan heterojen dağılımlı hematolojik malignansi grubudur. Özellikle AML de tedavi protokolleri üzerinde son 30 yıldır çok önemli gelişmeler olsa da halen 5 yıl hastalıksız yaşam oranı % 50 ler civarındadır. 1 Tanı anında saptanan belli klinik ve laboratuar bulguları, indüksiyon tedavisine erken yanıt da dahil olmak üzere prognostik değere sahiptirler. Bu prognostik faktörlerin saptanması modern terapötik denemelerin planlanması açısından gereklidir. Bu şekilde hastalar farklı risk gruplarına ayrılmakta ve bunlara göre de tedavi planlanmaktadır. Lösemi tedavisinde daha iyi sonuçlar elde etmeye yönelik çabalar bu amaca ulaşılabilmesi için öncelikle hastalığın patogenezinde mevcut olan faktörlere yönelinmesi gerektiğini göstermiştir. Bu nedenle lösemi patogenezinde saptanan belli mutasyonlar hem hastalığın nedenlerini anlaşılması hem de asıl amaç olan tedavi için yeni fırsatlar sunmaktadır. FLT3 bir tirozin kinaz reseptörü olup hücre proliferasyon ve farklanma yolları ile ilgilidir. Bu reseptör ile ilgili mutasyonlar akut lösemilerde saptanmış olup birçok çalışmaya konu olmuştur. Biz de bu yapı ile ilgili mutasyonların varlığını kendi hastalarımızda taramak ve dolayısı ile ileriki zamanlarda tedaviye katkısı olabilecek verileri elde etmeyi amaçladık. 1

2. GENEL BĐLGĐLER 2.1. Akut Lenfoblastik Lösemi Akut Lenfoblastik Lösemi (ALL) çocukluk çağında en sık malign hastalık olup tüm çocukluk çağı kanserlerinin % 30-35 ini kapsamaktadır. 1965 yılında sadece % 1 hasta uzun süreli yaşayabilmekte iken bugün % 80 civarında çocuk ve adolesan hastada kür sağlanmaktadır. Daha da önemlisi, lösemik relaps olan ALL hastalarında % 20-30 unda da uzun süreli ikinci remisyon sağlanmakta olup; ikinci bir kür şansına sahip olmaktadırlar. Bu başarı muhtemelen seri olarak dikkatli bir şekilde düzenlenen klinik denemelere bağlıdır. Ancak tedavi sonucundaki tüm bu gelişmelere rağmen relaps olan hatta kaybedilen ALL hasta sayısı yeni tanı alan akut myeloid lösemi hastalarından fazladır. Bu nedenle çocukluk çağı ALL, çocukluk çağı tüm kanserlerinin toplam mortalitesine anlamlı katkıda bulunmaya devam etmektedir. 2 2.1.1. Klinik Karakteristikleri ALL in klinik başvuru tablosu lenfoblast infiltrasyonu sonucu oluşan kemik iliği yetersizliği ve ekstramedüller organ infiltrasyonunun derecesine bağlıdır. Çocuk ALL hastalarının 2/3 ü tanı esnasında hastalık semptomlarını son dört hafta içinde gösterirler, buna rağmen ALL tanısı esnasında birkaç aylık hikaye de mümkündür. Đlk semptomlar genellikle nonspesifik olup letarji, düzelmeyen yorgunluk hissi, kemik ağrısı ve iştah kaybıdır. Lenfoblastların kemik iliğini istilası ile, geri kalan normal hematopoezi bozması ile daha spesifik bulgular olan anemi, kanama ve enfeksiyonlar oluşur. Down sendromu ile ALL gelişimi arasında ilişki mevcudiyeti genele göre 15 kat daha fazladır. Đmmün yetersizlik gibi diğer ilişkiler oldukça nadirdir. 3 Çocukluk çağı ALL bulgu ve belirtileri Tablo 1 de sıralanmıştır. 2

Tablo 1. Akut Lösemili Çocuklarda Bulgu ve Belirtiler Anemi bulguları Letarji, yorgunluk, hızlı tükenme, iştahsızlık Laboratuar: normokrom, normositik anemi Enfeksiyonlara hassasiyet bulguları Ateşli hastalıklar Laboratuar: azalmış mutlak nötrofil sayısı Kanamaya eğilim bulguları Purpura, mukozal kanama, hematomlar ve morarma Laboratuar: trombositopeni ve nadiren koagülopati Organ tutulum bulguları Kemik ve eklem rahatsızlıkları, hepatosplenomegali, yaygın lenf nodu büyümesi, mediastinal kitle ve beraberinde Superior Vena Kava obstrüksiyonu Sistemik hastalık bulguları Nedeni bilinmeyen ateş, kilo kaybı, gece terlemeleri Hikaye ve klinik bulgular ile lösemiden şüphelenildiğinde kan sayımı ve kan yaymasının mikroskopik incelenmesi birçok olguda hızlı tanı koydursa da normal kan sayımı ve mikroskopik inceleme tanıyı ekarte ettirmez. ALL ile asemptomatik bir çocukta gelişigüzel bir şekilde yapılan kan sayımı ile ya da hayatı tehdit eden kanama, enfeksiyon veya T-hücreli ALL örneğindeki gibi hiperlökositozlu çocuklarda görülen solunumsal sıkıntı atağı ile karşılaşılabilir. Lenfadenopati sıklıkla mevcuttur ve lökosit yüksekliği ile uyumludur. ALL tanılı çocukların % 30-60 ında tanı esnasında belirgin hepatomegali ve/ veya splenomegali mevcuttur. Hepatomegali ayrıca yüksek lökosit sayımı ile birliktedir 2. ALL primer olarak kemik iliği ve kan hastalığı olduğu halde diğer tüm organlar lösemik blast hücreleri ile infiltre olabilirler. Bu infiltrasyonlar lenfadenopati ve hepatosplenomegali gibi klinik olarak aşikar olabilirler. Ancak bazı diğer organ infiltrasyonları gizli olup sadece histolojik ya da sitolojik veya tanısal görüntüleme ile saptanabilirler. 3

2.1.1.1. Mediastinal Bulgular Anteriyor mediastinal kitle, sıklıkla timus içinde olup, diğer immünolojik subtiplerde nadir olup T-ALL li çocukların 2/3 ünde mevcuttur (Tablo 2). Tablo 2. Çocukluk Çağı Akut Lenfoblastik Lösemi Tanısında Gerekli Ana Taramalar Kan testleri Tam kan sayımı Kan sayımı oranlamaları (Periferik Yayma) Laktat dehidrogenaz Elektrolitler Renal fonksiyonlar (kreatinin, üre, ürik asit) Karaciğer fonksiyon testleri Koagülasyon taramaları Viral seroloji (Epstein Barr virüs, varisella zoster virüs, sitomegalovirüs, kızamık) Kemik iliği Kemil iliği aspirasyonu (başarısız ise trefin biyopsi) Morfoloji Đmmünofenotiplendirme Sitogenetik ve DNA içeriği, özellikle haploid ve hipodiploid kromozom anormallikler Moleküler genetik, t(4;11) ve t(9;22) translokasyonları ve RUNX1 amplifikasyonu içerecek tetkikler CNS Serebrospinal sıvı: hücre sayımı, sitospin preparasyon, protein, glukoz ve kültür Kardiyoloji Ekokardiyografi Tanısal Görüntüleme Göğüs radyografisi Kemik radyografisi (gerekli ise) Abdominal sonografi karaciğer, dalak, böbrek boyutları için Diğer Alkalin fosfataz ve miyeloperoksidaz ilik sitokimyası için gerekli olabilir. Lösemik plevral efüzyon T-ALL hastalarının bir kısmında mediastinal kitleye eşlik etmektedirler. 4 Süperiyor Vena Kava sendromu ve ciddi solunum sıkıntısı gelişebilip tıbbi acil durum oluştururlar. Đndüksiyon kemoterapisi esnasında bu hastalarda tümör lizis sendromu gelişebilir. 4

2.1.1.2. Santral Sinir Sistemi Bulguları Aşikar santral sinir sistem (CNS) lösemisi serebrospinal sıvıda lenfoblastların mevcudiyeti olup hastalığın immünolojik subtipine bağlı olarak yeni tanı alan çocukların % 1,5-10 unda saptanmaktadır. CNS lösemisi rölatif olarak az görülen matür B-hücre ve T-hücre ALL subtipleri ile lökositoz görülen olgularda daha sıktır. CNS lösemisi görülen çocuklarda tanı esnasında dikkatli bir fizik muayenede sıklıkla ense sertliği olmadan artmış kafa içi basınç bulguları (başağrısı, kusma, papilödem ve letarji) görülür ve kranyal sinir tutulumu ki sıklıkla III, IV, VI ve VII kranyal sinirlerin tutulumu saptanabilir. Aşırı kilo alma ve davranış bozuklukları da tanı esnasında hipotalamik tutulum bulgularını gösterir. 5 Lösemik blastlar CNS e hematojen ve nadiren de kafa kemikleri iliğinden direk olarak köprü venler aracılığı ile yüzeyel araknoide ulaşırlar. Đlerleyici CNS lösemisinde blastlar derin araknoidi ardından pia/glial membranlar aracılığı ile beyin parenkimini infiltre ederler. CNS lösemili çocukların çoğunda blast varlığına bağlı tanı esnasında pleositoz görülür. Blastlar sitosantrifuj ve May Grünwald Giemsa boyama ile saptanabilirler. 6 2.1.1.2. Genitoüriner Bulgular Aşikar testis tutulumu ALL hastasının prezentasyonu esnasında dikkatli palpasyon ya da sonografi ile nadiren saptanabilir. Ancak testis biyopsilerinde % 25 lere varan oranlarda lösemik blastlar saptanmıştır. 7 Lökosit sayısı > 25000/mm 3 olan hastalarda gizli testis tutulumu gözlenmiştir. Klinik testis relapsı genellikle ağrısız ve unilateraldir. Bazı erkeklerde intraabdominal lenf nodu tutulumu görülmüştür. Tek taraflı testis tutulumu görülen vakaların diğer testis biyopsilerinde de gizli tutulum saptanmıştır. Ancak yoğun çoklu ilaç tedavi rejimleri ve metotreksat kullanımı gizli testis relapsını anlamlı derecede azaltmıştır. Bu nedenle tedavi başında daha önce önerilen bilateral testis biyopsisi artık önerilmemektedir. 8 Günümüz tedavileri (St Jude, MRC/NRC protokolleri) klinik olarak gizli testis tutulumlarında radyoterapi önermeyip sadece tüm kemoterapi yoğunluğunda bir artış önermektedirler. Renal infiltrasyon oliguriye neden olup asemptomatik seyredebilir. Sonografi ya da bilgisayarlı tomografi ile böbreklerin büyük olduğu tanı anında saptanabilir. Bir 5

BFM çalışmasında renal infiltrasyon % 18 oranında izlenmiş, yalnız rasburicase (rekombinant ürat oksidaz enzimi) kullanımı ile bu vakalarda dializ ihtiyacı azalmıştır. 9 2.1.1.3. Đskelet Sistemi Bulguları ALL tanısı alan çocuk hastaların % 20-30 u özellikle alt ekstremitede olan ve topallama veya yürümeyi reddetmeye yol açan ciddi ağrı ile getirilirler. Bu çocuklar sıklıkla B prekürsör ALL dir ve normal kan sayımı ya da periferik kanda azalmış ya da saptanamayan lenfoblastlar ile başvurduklarından tanı gecikebilmektedir. 10 Yüzde yirmiye kadar ALL li çocuk metafizlerde transvers radyolusen çizgiler, subperiostal yeni kemik oluşumu ya da osteolitik lezyonlar, diffüz demineralizasyon ve vertebral kollaps ile gibi karakteristik kemik radyografik değişiklikleri ile başvururlar. 11,12 Patolojik kırıklar ve vertebral kollaps ciddi osteopeniye (lösemik osteopati) sekonder olabilir. Özellikle kalça ve dizde osteonekroz ciddi kemik ağrısına neden olabilir ki daha sıklıkla steroid olmak üzere antilösemi tedavisinin bir komplikasyonudur. 13 2.1.1.4. Gastrointestinal Sistem Bulguları Akut lösemili çocuklarda spesifik ağız boşluğu problemleri sıktır. Candida albicans infeksiyonları tanı anında ve çoklu kemoterapi esnasında sık olması nedeniyle, antifungal tedaviler yanında düzenli ağız bakımı destek tedavisinin ayrılmaz bir parçasıdır. Peteşi, özellikle dişeti kanamaları ciddi trombositopenisi olan olgularda sıklıkla görülür. Ciddi nötropeni varlığında mukozal ülserasyon, fungal ve özellikle Streptococcus viridans türü bakteriyel infeksiyonları ile birlikte görülebilir. Özellikle Herpes simpleks virüsünün neden olduğu viral infeksiyonlar nötropenik çocuklarda problem olabilir. Candida ya da HSV özefajiti retrosternal ağrı ile karakterize olup lösemili nötropenik çocuklarda flukanazol kullanımı nedeniyle nadiren görülmektedir. Lösemi hastalarında en sık gastrointestinal bulgu gaitada gizli ya da aşikar kanın varlığı olup trombositopeni, DĐC, lösemik hücre infiltrasyonu ve infeksiyonlar (örn. candida) nedenleri ile görülebilirler. Matür B-hücre ALL çocuk hastalarında sıklıkla olmak üzere özellikle sağ alt kadranda masif intraabdominal lenf nodu infiltrasyonları mevcuttur. Yoğun kemoterapiye bağlı ciddi nötropeni esnasında sağ alt kadran ağrısı, hassasiyet, abdominal distansiyon, kusma ve sepsisin oluşturduğu karakteristik sendrom (Nötropenik tiflit ya da nekrotizan enterokolit) 14 görülebilir. Sonografi sağ alt kadranda 6

barsak duvarında belirgin kalınlaşmayı gösterebilir. Özellikle steroid tedavisi döneminde görülen mide ya da duadenum peptik ülseri ALL çocuk hastalarında nadiren görülür. Ciddi kanama ya da nekrotizan pankreatit özellikle L-asparaginaz tedavisinde ALL tanılı çocuk hastalarda görülebilir ve tanı konması ve idaresi güç olabilir. Amilaz çoğunlukla olsa da her zaman yükselmeyebilir, bu dönemde lipaz düzeyi tanıya yardımcı olur. 15 Bu durumlarda barsak istirahati, intravenöz sıvı ve geniş spektrumlu antibiyotikler uygulanmalıdır. Cerrahi nadiren endike olup perforasyon ve periferik apse oluştuğunda endikedir. 16,17 Bilirubin seviyesi yüksekliği ile beraber ya da beraber olmadan karaciğer fonksiyonlarında bozulma, karaciğerin lösemik blastlar ile infiltrasyonu, özellikle L- asparaginaz, metotreksat ya da pürin analoglarının oluşturduğu kemoterapiye bağlı hepatotoksisite ya da viral hepatitlerden özellikle hepatit B ve C virüs infeksiyonları nedenleriyle görülebilir. 18 2.1.1.5. Göz Bulguları Gizli göz tutulumu, dikkatli şekilde oftalmolojik değerlendirmesi yapılan yeni tanı ALL hastası çocukların üçte birinde saptanmıştır. 19 Genel olarak gözün tüm tabakaları tutulabilir. 20 Trombositopeniye bağlı olarak retinal kanama görülebilir ve özellikle hiperlökositoz/lökostaz sendromundaki çocuklarda intrakranyal kanamaya öncülük edebilir. Aşikar lösemik göz tutulumu tanı esnasında nadir olup bu durum genellikle relaps ile daha sıklıkla ilişkilidir. Lösemik göz tutulumu olan hastaların yaklaşık yarısı belirgin CNS relapsı göstermektedirler. 21 Relaps anında okülomotor felç ve papilödem meningeal löseminin relaps anında önemli bulgularıdır. CNS ve testis tutulumları gibi günümüz yoğun çoklu kemoterapi rejimleri ile göz bulgularında gerileme kaydedilmiştir. 2.1.1.6. Kardiopulmoner Bulgular Lösemik kalp ya da akciğer tutulumu nadirdir. Ancak bu tutulumlar ALL tanılı çocuklarda hayatı tehdit edici problemlere yol açabilirler. Perikardial lösemik efüzyon ekokardiografik inceleme ile T-ALL hastası çocukların 1/3 ünde saptanmıştır ve sıklıkla lösemik plevral efüzyon ve mediastinal kitle ile beraberdir. Hayatı tehdit edici 7

hiperlökositoz/lökostaz yüksek beyaz küreli hastalarda parankimde infiltrasyon ve akciğerde staz nedeniyle ciddi respiratuvar distrese neden olabilmektedir. Hayat kurtarıcı acil önlemler içerisinde yoğun kemoterapi ve destek tedavisi ile acil lökoferez 22, 23 ve kan değişimine ihtiyaç kalmayabilir. Yoğun kemoterapi esnasında lösemili çocuklarda pulmoner komplikasyonlar genellikle infeksiyöz kökenlidir. Bakteriyel ve fungal infeksiyonlar, lösemik tutulum ve kanamanın ayırıcı tanısı akciğerin yüksek rezolüsyonlu BT si gibi görüntüleme yöntemleri ile sıklıkla mümkündür. Lösemili çocuklarda ciddi kardiyomiyopati, ciddi septisemi ve tümör lizis sendromundaki metabolik bozukluklar esnasında görülür. Geç kardiyomiyopati ise antrasiklinler ile yoğun kemoterapi sonrasında görülür. 24 2.1.1.7.Cilt Bulguları Cilt infiltrasyonları ALL tanılı çocuklarda monositik lösemilere göre oldukça nadirdir. Ancak trombositopeni sonrası ciltaltı kanama sonucu lenfoblastlar burada çoğalabilirler. 2.1.2. Laboratuar Bulgular Laboratuar verileri ALL prezantasyonunda çok farklılıklar gösteren anormal bulguları içermektedir. Normokrom normositer anemi hastaların 2/3 ünde görülür ve kemik iliği yetersizliğini gösterir. Lökosit sayısı tanı esnasında hastaların yarısında 10x10 9 /L nin üzerindedir. Ancak % 5 hastada 2x10 9 /L nin altında olup periferik kanda lenfoblast saptanamayabilir. Nadiren ise aplastik kan ve kemik iliği profili ile karşılaşılabilir. Periferik kanda görülen blastlar her zaman kemik iliği lösemi durumunu göstermez. Bazı hastalarda granülositik seride sola kayma ve promiyelositler hatta miyeloblastların görülmesi ALL, Non-Hodgkin Lenfoma (NHL), granülomatöz infeksiyonlar, osteopetrozis ve metastatik tümörlerde (nöroblastom, Ewing sarkom, rabdomyosarkom) kemik iliği infiltrasyonuna karşı görülen lökoeritroblastik yanıtın sonucu oluşabilir. Çocukluk yaş grubunda ALL hastalarında trombositopeni % 80 oranında saptanmaktadır. Normal kemik iliğinde % 5 in altında (M1 kemikl iliği) blast içerebilir. Akut Lösemi tanısı için >% 25 blast oranı gerekli olup bu oran akut lösemiyi NHL kemik iliği 8

infiltrasyonunundan ayırmak için kullanılmaktadır (stage IV NHL). Dry tap kemik infarktı, miyelofibrosis ve ya da kemik nekrozu nedeniyle görülebilir ve bu durumda kemik iliği trefin biyopsisi yapılmalıdır 25. ALL lösemik blast hücrelerinin morfolojik, immünolojik, ve genetik özelliklerine göre subgruplara ayrılmaktadır. Pimer tanı genellikle kemik iliği aspiratlarının incelenmesine dayanır. ALL blast hücrelerinin sitolojik görünümleri çok değişken olup, hatta aynı spesimende farklı görünebilir. French American British (FAB) sınıflaması morfolojik olarak üç subgruba (L1, L2 and L3) ayırmaktadır (Tablo 3). Bu sınıflamaya göre çocukluk çağı ALL lerinin % 85 i L1, % 14 ü L2 ve % 1 i L3 morfolojisine uymaktadır. Yapılan çalışmalar FAB sınıflamasının prognostik öneminin olduğunu göstermiştir. ALL-L1 alt tipi daha yüksek remisyon ve daha uzun süreli hastalıksız yaşam oranına sahiptir. Tablo 3. Akut Lenfoblastik Lösemide FAB Sınıflaması Sitoloji L1 L2 L3 Hücre boyutu Küçük, homojen Büyük, heterojen Büyük homojen Nükleer kromatin Homojen Değişken, heterojen Noktalı ve homojen Nükleus şekli Düzgün konturlu, bazen çentikli Đrregüler, sıklıkla çentikli Düzgün konturlu, oval-yuvarlak Nükleolus Görülmez veya silik, küçük 1, sıklıkla belirgin Belirgin, 1, vakuoler Sitoplazma Dar Değişken, sıklıkla büyük Orta derecede büyük Bazofilik Hafif veya orta, Değişken, bazen Çok koyu sitoplazma nadiren belirgin koyu Sitoplazmik vakuol Değişken Değişken Sıklıkla belirgin ALL subgruplarının immünfenotipleri Tablo 4 ve Tablo 5 de verilmiştir. Çocuk ALL hastaiarının yaklaşık % 10 unda sadece morfoloji hatta bazen sitokimyasal boyalar ile dahi spesifik tanı konamamaktadır. Akut lösemilerde immün fenotiplendirme ve genetik sınıflama bazı blastların belirsiz fenotipe ve genotipe sahip oldukları ve ALL ve 9

AML arasında kesin bir ayrım yapılamadığını göstermiştir. Bu gruba bifenotipik lösemi (Mixed Linege) denmektedir. Tablo 4. Đmmunofenotipik B-linage ALL Sınıflaması Marker B-prekürsör ALL Pre-B ALL B-ALL CD10 + ± ± CD19 + + + CD20 ± ± + CD22 + CD24 + + + CD34 + Sitoplazmik CD79a + + + HLA-DR + + + Sitoplazmikµ + sig + TdT + ± sig, yüzey immünoglobulin; TdT, terminal deoksinükleotidil transferaz. Tablo 5. T-Hücre ALL Đmmünofenotipik Sınıflama CD1 CD2 CD3 SCD3 SCD3 CD4 CD5 CD7 CD8 TdT Pre-T hücre + + + Erken kortikal +(75%) + + (90%) + + Geç kortikal + + + + + (25%) + (90%) + + + (90%) + Medüller + + + + ± + + ± ± CD3, sitoplazmik CD3; SCD3, yüzey CD3; TdT, terminal deoksinükleotidil transferaz. Morfolojik ve sitokimyasal yöntemlerle ayırt edilemeyen akut lösemiler genellikle immün fenotipik olarak B-prekürsör ALL ya da AML-M 0 olarak sınıflandırılırlar. Ancak tüm çocukluk çağı lösemilerinde % 2 olguda halen blastların kökeni net değildir. Bu vakalar muhtemelen çok immatür progenitör hücrelerden köken almaktadırlar. Son yıllarda kullanılan mikroarray teknolojisi bu vakaların çözümlenmesinde son derecede faydalıdır. 26 10

2.1.3. Prognostik Faktörler Klinik denemelerin retrospektif analizleri sonucu birçok önemli risk faktörleri ortaya çıkarılmış, böylece daha sonraki hasta gruplarının tedavileri, tedavi başarısızlığı relatif riskine göre düzenlenmiştir. Yüksek riskli relaps beklenen çocuklarda tedavi daha yoğun, düşük riskli hastalarda ise tedavi içerisindeki daha toksik uygulamalar, örneğin kranyal irradiasyon, antrasiklinler, epipodofilotoksinler azaltılabilir hatta uygulanmayabilir. ALL heterojen bir hastalık olması nedeniyle, farklı prognoza sahip birçok hasta populasyonu aynı tedaviyi alabilirler. Tanı anındaki farklı klinik ve laboratuvar bulguları prognoz ile ilişkilidir (Tablo 6). Belli prognostik faktörlerin relatif önemi farklı tedavi protokollerinde değişmektedir. Tedavinin yoğunlaştırılması bazı kötü özelliklerin prognostik anlamını elimine etmekte olup hastaya göre tedavinin çocukluk çağı ALL tedavisinde en önemli risk faktörü olduğunu göstermektedir. Tablo 6. Akut Lenfoblastik Lösemi Tedavisinde Prognostik Faktörler Faktör Favorable Unfavorable Yaş >1 den <6 yaş <1 yaş Beyaz Küre ( 109/L) < 20 >100 Đlk 7-gün prednison monoterapisine yanıt Yavaş yanıt* Đyi yanıt* Đlk indüksiyon terapisine yanıt (14. gün kemik iliği) M1 ilik Kromozom sayımı >50 <45 DNA indeks 1,16 <1,16 M2, M3 ilik Kromozomal translokasyonlar t(12;21) t(9;22), t(4;11) 5-yıl olaysız yaşam olasılığı > % 80 % 10 60 * Blast sayısı 1 hafta sonra < 1 10 9 /L olması iyi yanıtı gösterir. M1 ilik, < % 5 blast ve tam rejenerasyon gösteren hematopoez; M2 ilik, >% 5 den <% 25 blast ve/veya tam olmayan hematopoez rejenerasyonu; M3 ilik, >% 25 blast içeren kemik iliği. 2.1.4. Tedavi ALL de modern tedavi rejimleri remisyon indüksiyonu, santral sinir sistemi tutulumu tedavisi, konsolidasyon tedavisi ve idame tedavisi olmak üzere dört ana bölümden oluşmaktadır. Tedavinin ilk aşaması remisyonun indüksiyonudur. Remisyon tanım olarak hastada lösemiye ait herhangi bir bulgunun ya da kanıtının fizik muayene ve standart laboratuvar değerlendirmeleri ile ortadan kalkmasıdır. Bunların da ötesinde 11

kemik iliği aspirasyon incelemesinde standart sitokimyasal boyamalar ile blastik hücrelerin ortadan kalktığının gösterilmesi gerekmektedir. Klinik olarak ALL tanısı alan bir hastada yaklaşık 10 12 lösemik hücre bulunur. Bir ALL hastasında tam bir remisyon sağlanabilmesi için kemoterapi ile tüm lösemik hücre sayısının % 99 unun yok edilmesi gerekmektedir. Remisyona girdiği saptanan bir ALL li hastada sonuç olarak 10 10 lösemik hücre kalmaktadır. Aslında başarılı bir remisyon indüksiyon tedavisi alan ALL li hastalarda bu sayı çok daha fazla azalmaktadır. Remisyon indüksiyonu kemoterapisine verilen yanıt ve total lösemik hücre yükünün azaltılması tedavinin başarısı açısından önemli faktörlerdir. Vinkristin ve glukokortikoid gibi iki ana ilaç ALL li çocukların yaklaşık olarak % 85 sinde remisyon indüksiyonunu sağlamakta, bu ilaçlara L-asparaginaz ya da antrasiklin ya da her ikisinin eklenmesi ile bu oran yaklaşık % 95 lere çıkmaktadır. Đndüksiyon tedavisinin başarısızlığı nadir görülse de hastaların % 5 inde ortaya çıkmaktadır. Hastalarda tam bir remisyon sağlandıktan sonra yeni bir tedavi uygulanmazsa 1-2 ay içerisinde relaps görüldüğü gözlenmiştir. Đndüksiyon tedavisi sonrasında görünür bir remisyon sağlanmış olsa da sitomorfoloji, biyokimyasal, hücre kültürü, sitogenetik analiz, akımsitometrik ve moleküler biyolojik yaklaşımlar ile bu hastalarda reziduel gizli bir lösemik hücre yükü mevcuttur. Bu nedenle relapsları önlemede, hem lösemik ilerlemeyi önlemek, hem de lösemik hücre baskılanmasını devam ettirmek ve ilaçlara dirençli hücresel klonların ortaya çıkmasını engellemek amacıyla bir post indüksiyon tedavisi verilmelidir. Đndüksiyonda kullanılan ilaçlar idame tedavisinde genellikle faydalı değildir. Konsolidasyon tedavisi remisyon indüksiyonundan sonra verilen yoğunlaştırılmış tedavi periyodu olarak nitelendirilir. Özellikle yüksek risk grubuna giren hastalarda birçok tedavi protokolünde kullanılmaktadır. Yüksek risk grubuna dâhil olan T hücreli hastalıklarda yoğun konsolidasyon tedavisi olarak L-asparaginaz ve doksorubusin uygulanması tedavi başarısını daha iyi düzeylere çıkartabilmektedir. Đdame kemoterapisi de özellikle ilaç dozları açısından önemlidir. Randomize olarak yapılan çalışmalarda tam doz 6-merkaptopurin, metotreksat ve siklofosfamid alan hasta grubunun, yarı dozda bu ilaçları alan gruba göre daha uzun remisyon süresine sahip oldukları gösterilmiştir. Đlaçların oral olarak alındıklarında biyoyararlanımları ve ailenin tedaviye uyumu da remisyonu etkileyen önemli faktörlerdendir. Đdame kemoterapisinin 12

süresi birçok merkezde yaklaşık 2,5 ile 3 yıl arasında değişmektedir. Yapılan çalışmalarda 19 ay idame tedavisi verilen hastalarla, 3 yıl idame tedavisi verilen hasta grubu karşılaştırıldığında daha kısa süre tedavi alan grubun tedavisinin daha az başarılı olduğu saptanmıştır. Optimal tedavi süresi kızlarla erkekler arasında da farklılık göstermektedir. Kızlarda 1,5 yıllık bir tedavinin yeterli olduğu saptanırken, erkeklerde relaps oranı kızlara göre daha yüksek olduğundan tedavi bazı yerlerde total olarak 5 yıla kadar uzatılmaktadır. 27 2.2. Akut Miyeloid Lösemi Çocukluk çağı akut myeloid lösemi (AML) insidansı yenidoğan ve adölesan dönemindeki hafif bir artışın dışında genellikle tüm yaşlarda aynı orandadır. Down sendromu, Fankoni anemisi, Kostmann sendromu, Bloom sendromu, Diamond- Blackfan anemisi gibi kalıtımsal hastalıklarda AML görülme sıklığı artar. AML, miyelodisplastik sendromlar ve miyeloproliferatif hastalıklara sekonder olabilir. Đyonize radyasyona maruz kalma veya kemoterapi ajanlarına bağlı olarak da sekonder AML görülebilir. Nitrojen mustard, Siklofosfamid, Ifosfamid, Klorambusil, Melfalan, Etoposid sekonder AML gelişimi ile ilişkili kemoterapötik ilaçlardır. 2.2.1. Klinik Karakteristikleri Birçok özelliği ALL ile benzer. Miyeloblastların farklı morfolojik ve sitokimyasal özellikleri Tablo 7 de gösterilmiştir. 28 Tablo 7. ALL ve AML nin Morfolojik Özellikleri Özellik ALL AML Nükleus kromatini Yoğun, kümeleşmiş Gevşek, süngerimsi Nükleus/sitoplazma oranı Genelde büyük Küçük Nükleolus sayısı 0-2 2-5 Auer cisimciği Yok Bulunabilir Granül Yok Bulunabilir Sitoplazma Mavi Mavi-gri PAS Pozitif Negatif Sudan black Negatif Pozitif Alfa naftil asetat Negatif Pozitif Naftol ASD kloroasetat Negatif Pozitif 13

2.2.2. Sınıflama WHO sınıflamasına göre AML tanısında % 20 den fazla blast gereklidir. Ayrıca t(8;21)(q22;q22), inv(16)(p13q22), t(14;16)(p13;q22), t(15;17)(q22;q22) klonal sitogenetik anormallikler varlığında blast oranına bakılmadan AML tanısı konabilir. AML FAB sınıflaması: - Tip M 0 -Akut andiferansiye lösemi - Tip M 1 -Matürasyon olmayan miyeloblastik lösemi - Tip M 2 -Matürasyon olan miyeloblastik lösemi - Tip M 3 -Akut promiyelositik lösemi (APML) - Tip M 3V -APML mikrogranüler varyantı - Tip M 4 -Miyelomonositik lösemi - Tip M 4EOS -özellikle eozinofil artışı ile - Tip M 5 -Akut monositik lösemi - Tip M 6 -Eritrolösemi (Di Guglielmo Hastalığı) - Tip M 7 -Megakaryositik lösemi; AML M 7 de blast morfolojisi, 1-3 nükleolusu bulunan, granül içerebilen, sitoplazmasında tomurcuklanmalar olan hücrelerdir. Miyelofibrozise rastlanabilir. Sıklıkla Trizomi 21 li çocuklarda görülür. CD41, CD42, CD61 pozitif olup, CD13 ve CD33 de pozitif saptanabilir. Elektron mikroskopi incelenmesinde trombosit peroksidazı saptanabilir. FAB M 5 ve M 7 erken çocukluk yaşlarında daha sıktır. Daha büyük çocuklarda ise M 0, M 1, M 2, M 3 görülür. 2.2.2.1. Đmmünfenotip AML tanısında hücre yüzey antijenlerine karşı geliştirilen monoklonal antikorlar alt grup belirlemede yararlıdır. Tablo 8. AML FAB Alt Tipleri ile Đmmünolojik Yüzey Markırları Đlişkileri FAB HLA CD11b CD13 CD14 CD15 CD33 CD34 Glikoforin CD41 CD42 CD61 -DR M 1 /M 2 + + + + M 3 /M 3V + + + + + M 4 /M 5 + + + + + + + M 6 + + + + + M 7 + + + + + + + M 0 + + + 14

2.2.3. Moleküler Genetik 1. AML li hastaların % 15 inde t(8; 21) (q22q22) olup, FAB M 2 sınıfına girer. AML 1 -ETO füzyon geni olarak adlandırılır. 2. AML li hastaların % 15 inde inv (16) ve t(16; 16) görülür. Kemik iliğinde anormal eozinofillere ve miyelomonositik farklılaşmaya neden olur. CBFB-MYH11 kimerik proteini saptanır. 3. Akut promiyelositik lösemiler, retinoik asit reseptör α geni (17q21 de RAR α geni) ve PML geni (15q21) dengeli translokasyon ile oluşur. Bu moleküler anormalliklerin klinik önemi vardır. APML, trans-retinoik asit ile RAR α reseptörü bağlanarak tedavi edilebilir. AML1-ETO veya CBFB-MYH11 saptanması durumunda yüksek doz sitozin arabinozid tedavisi sonrası yüksek oranda uzun dönem remisyon görülür. Reseptör tirozin kinaz mutasyonları (FLT 3 ITD) pediatrik AML hastalarında daha kötü bir seyir görülür. 28 2.2.4. Prognostik Faktörler Aşağıdaki özellikler AML için kötü prognostik faktörlerdir. - Lökosit sayısı >100,000 /mm 3 - Monozomi 7 - Sekonder AML - FLT 3-ITD - Đndüksiyon kemoterapisinden sonra minimal reziduel hastalık varlığı 2.2.5. Tedavi AML tedavisinde uygulanan intensifikasyon ve indüksiyon kemoterapisi sonrası hastalarda sepsis ve fungal enfeksiyon riski artmıştır. Febril nötropenili bir çocukta erkenden geniş spektrumlu antibiyotik ve antifungal tedavi başlamak gerekir. Yeni tanı almış AML hastaları indüksiyon kemoterapisi boyunca yatırılarak hastanede takip edilmelidir. Birçok yazar, ailede HLA uygun donör varlığında, AML-M 3 ve Down sendromlu hastalar hariç AML li tüm hastalara allojenik kemik iliği naklini ilk remisyondan sonra önermektedir. Uygun donör yoksa hastalara yoğun kemoterapi uygulanmalıdır. AML-M 3 lü hastalarda trans-retinoik asit (ATRA) ile remisyon 15

sağlanabilir. Ancak ATRA tek başına kullanıldığında direnç gelişebilir, idame tedavide kullanılması önerilmez. Aynı zamanda beyin omurilik sıvısına da geçmediğinden santral sinir sistemi tutulumunda da etkisizdir. Refrakter veya rekürren akut miyeloblastik lösemi tedavisi zordur. Yüksek doz kemoterapi ile remisyon sağlansa da tekrar relaps riski yüksektir. 28 2.3. FLT3 (FMS-Like Tyrosine Kinase 3) Hematopoetik sistem saniyede bir milyon kan hücresi üretiminin dengeli bir şekilde sürdürülmesini sağlayan mükemmel işleyen bir sistemdir. Tüm hematopoetik yollar pluripotent hematopoetik kök hücresinden (HSC) köken alırlar ki bu hücreler kendini yenileme kapasitesine sahip olup kan hücre serilerinin yeniden yapılandırılmasının hayat boyu dengeli olarak sürdürülmesini sağlarlar. Matür serispesifik nesile ulaşılarak gelişimin duraklamasına kadar hematopoetik hücrelerin eşsis ekspresyon profili farklı gelişim evrelerinde sitokinler ve büyüme hormonlarının farklanma yolağını yönlendirmesini sağlarlar. 29 Hematopoetik sistem hücresel farklanma ve proliferasyon basamaklarının dengelenmesinin sağlanarak onkojenik mutasyon fırsatlarının kısıtlanmasını sağlayacak yapıdadır. Moleküler ve sistemik kontroller ve dengelere rağmen hematopoetik sistemde malign hastalıklar farklı lösemi formları şeklinde ortaya çıkmaktadır. 2.3.1. Normal Hematopoezde FLT3 2.3.1.1. FLT3 Ligand Kemik iliğinde birçok sitokin, kök hücre ya da progenitör hücre spesifik reseptörleri etkileyerek immatür hematopoetik hücrelerin birden fazla seriye farklanma ve çoğalma imkanını sağlamak üzere etki gösterirler. FLT3 ligandı (FL) erken hematopoezi FLT3 sinyal iletim yolunu uyararak kontrol eder. FL bir tip I transmembran protein olup kök hücre faktörü (SCF), makrofaj koloni stimule edici faktörleri (M-SCF) içeren küçük sitokin ailesine aittir. 30 FL mrna birçok hematopoetik ve nonhematopoetik dokularda eksprese edilmekte ise de, halen membrana bağlı çözünebilen protein olan FL protein sadece T lenfositler ve kemik iliği mikroçevresindeki stromal fibroblastlardan sentezlenmektedir. 30 FLT3 reseptör ekspresyonuna benzer olarak FL ekspresyonu mevcudiyeti hücrede FLT3 yanıtı için 16

otokrin ve parakrin sinyal mekanizmalarını gösterir. FL bu hücrelerde genel olarak sabit-durum hematopoezinde eksprese edilir, ancak serumda düşük seviyelerde idame ettirilir. 31 FL nin normal regulasyonu intrasellüler depolardan salınımını sınırlayarak primitif hematopoetik hücrelerin aşırı uyarılmalarını engeller. Son zamanlarda yapılan çalışmalar lökomojenez için bir yolun intraselüler FL tutulumunda bozulma nedeniyle ortaya çıktığını belirtmektedir. 32 2.3.1.2. FLT3 Reseptör FL, c-kit, c-fms, ve PDGFα/β yı içeren RTK alt ailesinin bir bireyi olan transmembran reseptör FLT3 ile ilişkilidir. 33 Bu sitokin reseptörler yapısal olarak yakın homolojiyi paylaşırlar ve ilkel hematopoetik hücre normal farklanmasına ve proliferasyonuna ortak olarak katılırlar. Đnsan FLT3 geni 13. kromozomda (13q12) uzunluğu 1000 kb ın üzerindedir ve 24 eksondan oluşturulur. 34 FLT3 geni 993 amino acid proteini olan ve N-bağlı glikolizasyon nedeniyle major 140kD ve minor 160kD band olarak gözlenir, glikolize olmadan ve membrana bağlı değilken 130 kd banddır. 35 FLT3 reseptör beş immün globulin benzeri domain, bir transmembran bölge, bir sitoplazmik juxtamembran domain (JM), ve iki sitoplazmik kinaz domainden oluşmaktadır 36 (Şekil 1). Şekil 1. FLT3 Reseptörü 17

olur. 41 Normal FL sinyali aynı zamanda lenfoid seri proliferasyonu ile de birliktedir. 2.3.1.3. FLT3 Reseptör Ekspresyonu FLT3 reseptör ekspresyonu yapan az sayıda hücre FL iletim özgünlüğüne karar vermektedir. Kemik iliğinde FLT3 ekspresyonu CD34+ hücreler ile dentritik prekürsör hücre subgrupları ile sınırlıdır. FLT3 ekspresyonu kısa süreli hematopoetik kök hücre (HSC) yeniden yapılandırılması ile ilgilidir 37 ve uzun süreli HSC yapılanmasında ekspresyon ile ilgili kesin kanıt mevcut değildir. FLT3 lenfoid ve myeloid farklanma potansiyelli erken hücre popülâsyonlarında yüksek seviyelerde eksprese edilmektedir 38. Bu progenitor hücreler granülosit, monosit, B ve T hücre gelişim potansiyeline sahiptir; ancak daha ilkel kök/prekürsör hücrelerinin tersine, bu popülasyon eritroid ve megakaryosit serilerini oluşturamamaktadır. FLT3 ayrıca plasenta, gonadlar ve beyinde, fonksiyonları bilinmemekle birlikte saptanmaktadır. 38 2.3.1.4. FL nin Diğer Sitokinlerle Sinerjisi Deneysel kanıtlarda FLT3 ligand (FL) sinyalleri diğer büyüme faktöriyle sinerjistik olarak miyeloid ve lenfoid seri erken öncül hücrelerinin proliferasyonlarını arttırmaktadır. FL-aracılı sinyalleşme IL-3, G-CSF, CSF-1 gibi ilgili büyüme faktörlerine yüksek derecede bağımlıdır, çünkü in vitro FL tek sitokin olarak proliferasyonu yetersiz derecede arttırır. 39 Buna rağmen, FL diğer hematopoetik büyüme faktörleri ve interlökinler ile birlikte hareket ettiğinde hematopoetik öncül hücre çoğalmasında güçlü indükleyicidir. Örneğin, FL, KIT ligand ve IL-3 ile birleştiğinde primitif hücreler ve committed myeloid progenitör hücreler üzerinde en büyük proliferatif etkiyi gösterir. 40 FL myeloid büyüme faktöleri ile committed colonyforming hücreleri gibi primitif uzun süreli kültür başlatan hücrelerinin büyümelerini arttırır. 38 FL fonksiyonu in vivo analizi erken hematopoezin idame ve proliferasyonunda hayati rolünü destekler. Farelerde hedeflenmiş FL hasarlanması miyeloid öncüllerini azaltırken FL enjeksiyonu geçici HSC çoğalması ve akım yönünde çoğalma ile kemik iliği hiperplazisi, splenomegali, hepatomegali ve lenf nodlarında büyümeye neden Aslında hedeflenmiş FL hasarlanması farelerde genel primitif hematopoetik hücrelerin azalması ile belli lenfoid prekürsör hücrelerinin azalmasına neden olmaktadır. FL eksikliği (-/-) pro-b hücreleri, dendritik hücreler (DC) ve natural killer hücrelerinde 18

azalmaya neden olarak immün sistemde bozulmaya neden olur. 42 Ligand-stimulasyonu ile FLT3 dendritik hücre ve DC marker ekspresyonu yapan belli sayıda hücrelerin gelişmesi ve çoğalmasını başlatır. 43,44 Aslında, FL ekspresyonu terapötik olarak fare modellerinde immün yanıtı arttırarak, solid ve hematopoetik tümörlerin regresyonunu sağlamak için kullanılmıştır. 46 FL ın IL-7 ve IL-11 ile birlikte eksprese edildiği deneylerde B-hücre progenitörlerinin klonal genişlemesi ve farklanması ile sonuçlanmıştır. FL ın granulosit-makrofaj koloni-stimulan faktör (GM-CSF) ya da IL-4 ile birlikte eksprese edildiğinde DC farklanması in vivo ve in vitro artmaktadır. 45 2.3.1.5. FLT3 Reseptör Uyarılması FL, FLT3 reseptörüne, plazma membranında bir homodimerin oluşturulmasını indüklemek için bağlanır. Dimer sitoplazmik domainleri birleştirerek Tyr589 ve Tyr591 gibi spesifik tirozin rezidülerinin JM domaini üzerinde transfosforilasyonunu sağlar. 47 Ortaya çıkan yapısal değişiklik tirozin kinaz domaininde otofosforilasyonu başlatmak için fosforil bağlanan bölgeleri ortaya çıkarır. Akım yönündeki sinyal yolağı apoptozis, proliferasyon ve farklanma yollarında bulunan sitoplazmik efektör moleküllerin fosforilasyonu ve aktivasyonunu içerir. FLT3 reseptörü aracılığıyla iletilen sinyal bir düzenleyici protein olan fosfatidilinositol 3-kinazın (PI3K) p85 subünitesine ve bir adaptör protein growth faktör reseptör bağlı protein 2 ye (Grb2) iletilir. 48 FLT3 reseptörü Ras proliferasyon yolunun fosfolipaz Cγ1 ve GTPaz-aktive edici proteinini(gap) içeren multiple metabolizma ve proliferasyon efektörlerine sinyal iletir. 48 Normal FLT3 sinyali ayrıca ekstraselüler-sinyal regüle edici kinazı (ERK1/2) aktive eder ancak, deregüle sinyalizasyonun anahtar hedefi olan STAT5 i zayıf bir şekilde fosforile eder. 49 Yakın çalışmalar aynı zamanda SH2-domain-içeren inositol fosfatazın da (Shp) aktive FLT3 ün direk efektörü olduğunu düşündürür. 50 FLT3 sinyaliletim yolları tam olarak haritalandırılamamış olup şu ana kadar anlaşılan kısımları primitif hematopoetik hücrelerin proliferasyon ve apoptozisindeki hayati rolünü moleküler olarak göstermektedir. FLT3 yolunun moleküler etkileri gözlenmesine rağmen, knockout (geni etkisiz) fareleri relatif olarak stabil hematopoeze sahiptir. 51 Bu sonuçlar hematopoetik büyüme faktörleri arasında fonksiyonel fazlalığı gösterse de, onlar FLT3 ün miyeloid ve lenfoid seri erken progenitör hücreleri farklanma ve proliferasyonundaki rolünden uzak değillerdir. 19

2.3.2. Lösemilerde FLT3 Onkogenez için iki önemli özellik kendini yenileme ve büyüme hormonundan bağımsız proliferasyondur. FLT3 ün aşırı undiferansiye hematopoetik hücrelerin proliferasyonuna katılması bu sinyal yolunun onkojenik potansiyelini göstermektedir. Klinik ve deneysel kanıtların herikisi de FLT3 ün lösemik blast hücrelerinin yaşam süreci ve proliferasyonlarını arttırabilen kapasiteye sahip protoonkogen olduğunu gösterirler. Wild tip FLT3 akut lenfoid lösemi, mixed lineage lösemi ve en dikkat çekici olarak da AML de % 70-100 oranlarında eksprese edilmektedir. 52 Aberan olarak aktive olan FLT3 yolu AML hastlarının % 29,9 unda gözlenmektedir. Đki tip mutasyon etkilenen FLT3 reseptöründe görülebilmektedir. 58 2.3.2.1. FLT3 Đnternal Tandem Duplikasyon Mutasyonu FLT3 reseptörü JM domainde in-frame internal tandem duplikasyon (ITD) mutasyonu FLT ilişkili AML vakalarında en yüksek frekansa sahiptir. Klinik çalışmalar FLT3-ITD mutasyonlarının AML vakalarında % 17 ile % 26 arasında olduğunu saptamışlardır. 53 ITD ilk olarak FLT3 ekspresyonu için primer lösemi spesimenleri taranırken reverse transcriptase-polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ile amplifiye edilen ürünlerin birçok hastada beklenenden uzun olması ile saptanmıştır. DNA sekansı uzunluğu 3 ile > 400 bp arasında değişen ekson 14 insersiyonal mutasyonu ortaya çıkarmıştır. 54 Mutasyona neden olan olay bilinmese de, DNA replikasyonunda hatalı onarım ya da onarım esnasında kayma nedeniyle oluştuğu düşünülmektedir. FLT3-ITD malign hücre bazlı morfolojik sınıflama olan French American British (FAB) sınıflamasında tüm subtiplerde saptanmıştır ve en sık M3 (promyelositik) subtiplerinde saptanmıştır. 55 ITD mutasyonu FLT3 reseptör yapısal aktivasyonuna neden olur. RTK(Reseptör tirozin Kinaz) ların JM bölgelerinden birçoğu kinaz domainini regüle etmek için farklı mekanizmalar aracılı etki gösterirler. Normal FLT3 reseptörü kristal yapısı, JM domainin, kinaz domain katalitik etkisini regüle edebilmek için kullandığı mekanizmayı gösterip ITD nun bu mekanizmayı nasıl bozabileceğini anlatmaktadır. JM bölümünün yapısı şunu gösterir ki, spesifik tirozin residüsü normal fosforilasyonun otoinhibisyonunu sağlamak için JM bölgesinin doğru katlanmasını engellediği zaman FLT3 aktivitesi oluşur. 47 EphR2 reseptörü RTK subfamilyası ile ilgili olup yapısal analizi, indüklenmiş fosforilasyon ayrıca JM bölgenin normal sterik engelleyici etkisi 20

bozulduğunda da olmaktadır. 56 Bunun da ötesinde, JM bölgesinin bu önleyici sekansı c-kit ve PDFGb de korunmaktadır. 57 ITD insersiyonu genellikle JM menteşe bölgesinde oluşur ve JM oryantasyonunu bozarak zayıf otoinhibisyon katalitik etkisine neden olur. Đnsersiyonel mutasyonun boyutu ve otoinhibisyonun derecesi arasında ilişki yoktur. 58 Bazı deneyler göstermektedir ki; ITD mutasyonu egzojen FL ekspresyonu sinyal seviyesini arttıramadığı için reseptörün maksimum aktivitesine neden olur. Bu arada diğer çalışmalarda ise FL ekspresyonu esnasında artmış yolak sinyalleşmesi saptanmıştır. 59 Bu tip karışık sonuçlar plazma membranı üzerindeki vahşi tip mutasyonların oranı belirlenerek yeniden değerlendirilebilir. Bu oran FLT3-ITD reseptörü mutant reseptör ile homodimerize ve vahşi tip reseptör ile heterodimerize olması nedeniyle ligandan bağımsız olarak otofosforilasyon derecesini etkileyebilir. 2.3.2.2. FLT3 te Tek Amino Asit Mutasyonları Anlamsız nokta mutasyonları FLT3 reseptör kinaz bölgesinde yapısal aktivasyonu sağlayabilirler. En sık aktive edici nokta mutasyonu kinaz bölgesindeki aktivasyon loop 835. pozisyondaki aspartik asitin tirozin ile yer değiştirmesidir. Diğer pozisyonlardaki nokta mutasyonları, örneğin 836 ya da 841, FL-bağımsız aktivasyona neden olmaktadırlar. 60, 61 FLT3-D835 mutasyonu AML vakalarını % 7 sinde görülmekte olup EcoRV restriksiyon bölgesi kaybına neden olduğundan kolaylıkla saptanabilmektedir 62. Aspartat residü birçok RTK alt grubunda korunması şartı ile aktivasyon loop regülasyonu için gereklidir. Bundan başka, bu bölgede reseptörle ilgili c-kit, MET ve RET gibi nokta mutasyonları regüle edilemeyen sinyalleşme ile beraberdir. 63 Aktivasyon mekanizmasıyla ilgili proteinlerle, yer değişikliği sayesinde, aktivasyon loopu açık ATP-bağlı konformasyonuna stabilize olması nedeniyle ilgilidir. 64 2.3.2.3. FLT3 Mutant Sinyalleşme FLT3 reseptor ve ilgili RTKlar arasındaki paralellikler aktivasyon mutasyonunun, kinaz bölgesinin inaktif yapısının idamesi için kritik olan otoinhibitör mekanizmayı bozar. Mutant reseptör efektör proteinleri proliferasyon, yaşam ve blok farklanmayı ligand-bağımsız otofosforilasyon ile aktive eder. Mutant sinyal yolağını tanımlayan moleküller FLT3 ün lösemi patogenezinde rolünün anlaşılmasını sağlar (Şekil 2). 21

Şekil 2. FLT3 ile Đlgili Lösemi Patogenezinde Etkili Yolaklar Proliferatif avantaj sağlayan aberan protein stimulasyonu ilk olarak mutant-flt3 miyeloid lösemi hücrelerinde saptanmıştır. Đn vitro, ITD mutasyonu içeren fare miyeloid hücre serisi faktör-bağımsız proliferasyon ve radyasyonla oluşturulan apoptozise karşı direnç göstermişlerdir. 65 Heriki STAT5 ve Ras yolaklarının aktive oldukları gösterilmiştir. FLT3-ITD transfekte Ba/F3 lenfoid hücre serisinde MAP kinaz yapısal fosforilasyonu saptanmış ve RAS yolunda faktör-bağımsız büyüme ve hücre yaşam şansında rol alması muhtemeldir. 65 Her ne kadar diğer çalışmalar tek başına upregülasyonun proliferasyon indüksiyonu için yetersiz olduğunu gösterse de MAP kinaz inhibisyonunun koloni oluşumunu baskılaması kanıtı bu yolun gerekliliğini desteklemektedir. Artmış Protein kinaz B(Akt) ekspresyonu benzer şekilde hayatta kalma ve proliferasyona katkıda bulunur. Mutant FLT3 te MAP kinaz ve Akt ekspresyon seviyeleri zayıf olarak artsa da, onların farklılığı normal FLT3 aktivasyonunu takiben geçici fosforilasyon yapmaları ile desteklenmektedir. Brandts ve arkadaşları yakın zamanda Akt nin FLT3-ITD BaF3 hücrelerinde Forkhead aile bireylerinde Foxo3α yı fosforile ederek apoptotik sinyali engellediğini öncelikli kanıt olarak doğrulamışlardır. 66 Foxo3α inaktivasyonu Bcl2 ailesinde proapoptotik hedef genlerin transkripsiyonunu engeller. Foxo aile bireylerini içeren benzer yolak BCR- 22