IVD in Vitro Diagnostik kullanım için EL KİTABI Aladin (Sacace)'de End Point analizi (FEP) ile Flüoresan tespitinin ve hrsv (Human respiratory syncytial virus) cdna in nükleik asit amplifikasyonu için hrsv FEP Kullanılan Semboller Liste Numarası 2-8 C/ -20 C de saklayın Lot Numarası Son Kullanma Tarihi Reaktif İçerir VER Versiyon Kullanım Bilgileri Üretici REF TV37-50FEP 50
İSİM hrsv (Human respiratory syncytial virus) FEP GİRİŞ İnsan respiratuar sinsisyal virüs (hrsv veya RSV) Pneumovirus genüsün familyasındandır. Paramyxoviridae familyasının diğer türleri ile birlikte, hrsv tek sarmallı RNA genomunda negatif bir eğilime sahip sarılmış bir virüstür. Bu virüsler 150-200nm çapında sarmal nükleokapsidlere sahiptir. Şekil 1. Respiratuvar sinsisyal virüs (hrsv, RSV) (-)ssrna genomun şematik gösterimi. NC_001781 nolu GenBank dayalıdır. İnsan respiratuvar sinsisyal virüsü (hrsv veya RSV) bebeklerde ve küçük çocuklarda alt solunum yolu enfeksiyonlarına yol açan bir virüstür. RSV, bebeklerde ve çocuklarda, nezle gibi soğuk algınlığı belirtileri ile ortaya çıkar. Bazı premature bebeklerde ya da kronik akciğer hastalığı olan bebeklerde, hrsv ölümcül olabilir. HRSV enfeksiyonu serin aylarında ortaya çıkan salgın bir hastalıktır. Vakaların çoğunluğu 4 yaşın altındaki çocuklarda, özellikle önceden kalp ve akciğer hastalığına sahip bebeklerde ve 6 aydan daha küçük bebeklerde daha şiddetli olarak görülür. KULLANIM AMACI Kit Enterovirus FEP biyolojik materyallerde ve ortamda hrsv RNA in kalitatif tespiti için Fluorescence End-Point (FEP) testidir. RNA örneklerden ekstre edilir, RT-amplifikasyon kullanılarak amplifiye edilir ve hrsv RNA ve IC (Internal Control) için spesifik flüresans reporter boya probları kullanılarak tespit edilir. TEST PRENSİBİ hrsv FEP Test dört temel aşamaya dayanır: örneklerden RNA izolasyonu, RNA nın reverse transkripsiyonu, cdna nın amplifikasyonu ve Fluorescence End-Point (FEP) analizi. KİT İÇERİĞİ Part N 1 Ribo-Sorb : klinik örneklerden RNA izolasyonu; Part N 2 Reverta-L : reverse transkripsiyonu kit; Part N 3 hrsv FEP : Amplifikasyon ve Fluorescence End-Point (FEP) kit; Part N 1 Ribo-Sorb : Lysis Solution, 22,5 ml; Washing Solution, 20 ml; Sorbent, 1,25 ml. RNA-eluent, 5 x 0,5 ml; 50 test için gerekli reaktifler içerir. Part N 2 Reverta-L : RT-G-mix-1, 5 x 0,01 ml; RT-mix, 5 x 0,125 ml; Reverse transcriptase (M-MLV), 0,03 ml; TE-buffer, 1,2 ml. 60 test için gerekli reaktifler içerir. Part N 3 hrsv FEP : PCR-mix-1 hrsv 55 kullanıma hazır tek-doz test tüpleri; PCR-mix-2-Flu, 0,77 ml; PCR-mix-Fon, 0,5 ml; Internal Control RNA (IC RNA), 5 x 0,12 ml; Internal Control cdna (IC cdna), 0,1 ml; Negative Control 1,2 ml; Positive Control hrsv cdna C+, 0,1 ml; DNA-buffer, 0,5 ml;
55 test için gerekli reaktifler içerir. KİT İÇERİĞİNDE BULUNMAYAN GEREKLİ MATERYALLER Zone 1: örnek hazırlama: Biyolojik kabin eppendorf tipi tüpler için masa mikrosantrifüj (RCF max. 16,000 x g); Eppendorf 5415D ya da benzeri 60 C ± 2 C kuru ısı bloğu Vorteks mikser Aerosol bariyerli pipetörler 1,5 ml polipropilen steril tüpler (Sarstedt, QSP, Eppendorf) Tek kullanımlık eldiven, pudrasız Tüp raklar 70% Etanol (% 96 etanol ve saf su ile reaktifin taze hazırlanan karışım) Aseton Buzdolabı Dondurucu Zone 2: RT ve amplifikasyon: Workstation PCR Fluorescence Detector Aladin (Sacace) Aerosol bariyerli pipetörler (0,5-10 μl; 5-40 μl) Tüp rakları UYARILAR VE ÖNLEMLER 1. Lizis Solusyonu, guanidine thiocyanate içerir. Guanidine thiocyanate, solunursa, deri ile temas ederse ya da yutulursa zararlıdır. Asitler ile teması toksik gaz oluşumuna neden olur. (Xn; R: 20/21/22-36/37/38; S: 36/37/39). 2. Örnekler ve reaktifler ile çalışırken tek kullanımlık eldivenler, laboratuar giysileri ve göz koruyucuları kullanın. 3. Ağızla pipetleme yapmayın. 4. Laboratuar çalışma alanında yemek yemeyin, bir şey içmeyin, kozmetik uygulamayın ya da kontak lenslerini ellemeyin. 5. Son kullanma tarihi geçmiş kitleri kullanmayın. 6. Tüm örnekleri ve kullanılmayan reaktifleri yasal düzenlemelere göre yok edin. 7. Örnekler potansiyel enfeksiyon ajanı olarak kabul edilmeli ve biyolojik kabinlerde Biyogüvenlik Seviye 2 ya da diğer uygun biyogüvenlik pratiklerine göre çalışılmalıdır. 8. Dökülen tüm örnekler ya da reaktifleri 0,5% sodyum hipoklorit ya da uygun diğer dezenfektanlar ile temizleyin. 9. Örnekler ve reaktiflerin deri, gözler ve mukoz membranlar ile temasından kaçının. Eğer bu solüsyonlar ile temas ederse bol su ile yıkayın ve doktorunuza başvurun. 10. Material Safety Data Sheets (MSDS) istenildiğinde verilebilir. 11. Bu kit Ribo-Sorb ekstraksiyon kit ile kullanılmak için tasarlanmıştır. Eğer Ribo-Sorb dan başka bir kit ile RNA ekstraksiyonu yapılıyorsa, bu kullanıcı sorumludur. 12. Bu kiti ancak DNA amplifikasyon tekniği bilgisi olan kişiler kullanmalıdır. 13. Laboratuardaki iş akışı Ekstraksiyon alandan başlayıp Amplifikasyon ve Tespit alanlarına doğru tek bir kişinin yönetiminde olmalıdır. Örnekleri, ekipmanları ve reaktifleri bir önceki çalışma alanına geri götürmeyin. SAKLAMA KOŞULLARI Part N 1 Ribo-Sorb 2-8 C de saklanmalıdır. Part N 2 Reverta-L -20 C de saklanmalıdır. Part N 3 hrsv FEP 2-8 C de saklanmalıdır. Kit 2-8 C de gönderilir ama 2-8 C ve -20 C de saklanmalıdır. KARARLILIK hrsv FEP Test kit etiketi üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabil kalır. Ürünün performansı etiket üzerinde yazılı kontrol tarihi ile sağlanacaktır. Işık, ısı ya da neme maruz kalmak bazı kit bileşenlerin raf ömrünü etkileyebilir. Tekrarlanan çözdürme ve bu reaktiflerin dondurulması duyarlılığı azaltabildiği için bu durumdan kaçınılmalıdır.
ÖRNEK SAKLAMA, TOPLAMA VE TRANSPORT hrsv FEP aşağıdaki materyallerden ekstre edilmiş RNA lar ile analiz edilebilir: swablar: nükleaz-free 1,5 ml tüpe swabı ekleyin ve 0,2 ml Transport ortamı ekleyin(bu kit hariç ayrı ayrı sipariş verilebilir). 15-20 saniye boyunca ortamda swabı yavaşça sallayın. doku ( 1,0 gr) cam çubuklar, teflon tokmak, skalpel ya da mekanik homojenizör ile homojenize edilmiş ve 1,0 ml tuzlu su ya da PBS sterilde çözün (1 hacim saline solüsyonuna 1 hacim doku). Kuvvetlice vorteksleyin ve oda ısısında 30 dakika inkübe edin. Supernatantı yeni 1,5 ml tüpe aktarın; Balgam, bronşiyal veya trakeal lavaj aşağıdaki prosedür ile işlem görmelidir*: 1. 5 örnek için NACL solüsyonu hazırlama: 250 mg N-asetil-L-sistin (Sigma, kat. A7250 ya da eşdeğer), 25 ml 4% NaOH, 25 ml 2.94% sodyum sitrat. 2. Biyo güvenlikli bir kabinde, steril bir 50 ml tüp kullanarak 1 hacim NALC solüsyona 1 hacim örnek akleyin (yaklaşık olarak her birine 10 ml ) 15-20 saniye vokteksleyin ve hafifçe sallayarak oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. 3. Santrifüj tüp üzerinde işaretli 50 ml tüpe 0,067M fosfat buffer (ph 6,8) ekleyerek sildirilmiş-dekontamine örnekleri yıkayın ve ters düz ederek karıştırın. 3000g de 15 dakika santrifüjleyin. 4. Dikkatlice supernatantı atın ve yaklaşık 100 µl solüsyon bırakın. Sedimenti tekrar süspanse edin. DNA ekstraksiyonu için süspansiyonu kullanın. *alternatif olarak BD BBL MycoPrep Specimen Digestion/Decontamination Kit önerilir. 12 saatten daha uzun olmamak kaydıyla örnekleri +2-8 C de ya da daha uzun saklamak için 20/80 C de saklayın. Klinik örneklerin transportu, etiyolojik ajanların transportu için ülkesel, federal, lokal ve yasal düzenlemelere göre yapılmalıdır. ÖRNEK VE REAKTİF HAZIRLAMA 1. Lizis Solüsyonu ve Yıkama Solüsyonu (diğerleri +2-8 C de saklanmasına rağmen) buz kristalleri çözülene kadar 60 65 C ye kadar ısıtılır. Negatif Kontrol Ekstraksiyonu için bir tüp içeren 1,5 ml polipropilen tüplere gerekli miktarda hazırlayın. 2. Her bir tüpe 450 μl Lizis Solüsyonu ve 10 µl Internal Kontrol (IC RNA) ekleyin. Pipetleyerek karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. 3. Lizis Solüsyonu ve IC uygun tüplere 100 μl örnek ekleyin. 4. Aşağıdaki gibi Kontrolleri hazırlayın: Cneg işaretli tüpe 100 μl C Negatif Kontrol ekleyin. 5.Tüpleri vorteksleyin ve 5000g de 5 sn santrifüj edin. Eğer örnek tamamen çözülmezse, maksimum hızda (12000-16000 g.) 1 dakika tüpleri tekrar santirifüj edin ve RNA ekstraksiyonu için yeni bir tüp içine supernatantı aktarın. 6. Sorbenti şiddetlice vorteksleyin ve her bir tüpe 25 μl ekleyin. 7. 5-7 saniye vorteksleyin ve tüm tüpleri oda ısısında 10 dakika inkübe edin. Periyodik olarak vorteksleyin. 8. Tüm tüpleri 10000g de 1 dk santrifüj edin ve aerosol bariyerli mikropipet kullanarak pellete zarar vermeden her bir tüpten dikkatlice supernatantı atın. Yeni bir tüpe geçerken pipet ucunu değiştirin. 9. Her bir tüpe 400 μl Yıkama Solusyonu ekleyin. Şiddetlice vorteksleyin ve 10000g de 1 dakika santrifüjleyin ve tıpalı bir aerosol bariyerli uçlu mikropipet kullanarak pellete zarar vermeden her bir tüpten dikkatlice supernatantı atın. Yeni bir tüpe geçerken pipet ucunu değiştirin. 10. Her bir tüpe 500 μl 70% Etanol ekleyin. Şiddetlice vorteksleyin ve 10000g de 1 dakika santrifüjleyin ve tıpalı bir aerosol bariyerli uçlu mikropipet kullanarak pellete zarar vermeden her bir tüpten dikkatlice supernatantı atın. Yeni bir tüpe geçerken pipet ucunu değiştirin. 11. Adım 10 tekrar edin. 12.Her bir tüpe 400 µl Aseton ekleyin. Şiddetlice vorteksleyin ve 10000g de 1 dakika santrifüjleyin ve tıpalı bir aerosol bariyerli uçlu mikropipet kullanarak pellete zarar vermeden her bir tüpten dikkatlice supernatantı atın. Yeni bir tüpe geçerken pipet ucunu değiştirin. 13. 60 C de 10 dakika açık kapakla bütün tüpleri inkübe edin. 14. Pelleti 40 μl RNA-eluent içinde yeniden suspense edin. 60 C de 10 dakika inkübe edin ve periyodik olarak vorteksleyin. Maksimum hızda (12000-16000 g) 2 dakika boyunca tüpleri santrifüjleyin. 15.Supernatant amplifikasyon için hazır RNA içerir. RT-PCR ile aynı günde yapılmalıdır. Eğer çalışılmayacaksa, RNA çökeltisini -80 C de bir aya kadar saklayabilirsiniz. RT VE AMPLİFİKASYON 1) Reaktif Miks hazırlayın: 12 reaksiyon için, RT-mix içeren tüplere 5,0 μl RT-G-mix-1 ekleyin ve en az 5-10 saniye vorteksleyin, kısa süre santrifüjleyin. Bu karışım -20 C de 1 ay boyunca stabildir. Reaksiyon Miks olan tüplere 6 μl M-MLV ekleyin, pipetle karıştırın,3 saniye vorteksleyin, 5-7 saniye santrifüj edin (hazırlandıktan sonra hemen kullanılmalıdır).
(Eğer 12 örnekten daha az test gerekirse, steril bir tüp içine RT-mix ile 10*N μl RT-G-mix-1 ve 0,5*N μl M-MLV her bir numune için ekleyin) 2)Her bir örnek tüpüne 10 μl Reaksiyon Mix ekleyin. 3) Uygun tüplere 10 μl RNA örneği ekleyin (Eğer Ribo-Sorb izolasyon kit RNA ekstraksiyon kiti olarak kullanırsa, ekstre RNA ile bütün tüpleri 2 dakika boyunca maksimum hızda (12000-16000 g) tekrar santrifüj edin ve supernatantı dikkatlice alın. Reaksiyonla inhibe olan sorbent pellete dokunmayın ). Pipet kullanarak dikkatlice karıştırın. 4) Tüpleri termocycler içine yerleştirin ve 37 o С de 30 dakika inkübe edin. 5) Her bir cdna örneğini TE-Buffer ile 1: 2 seyreltin (her bir tüpe 20 μl TE-buffer ekleyin). cdna örnekleri -20 o С de 1 hafta ya da -70 o С de bir yıl saklanabilir. PROTOKOL (Reaksiyon hacmi 25 µl): 1. Örnekler ve kontroller (3 tüp) için gerekli miktarda PCR-mix-1 HRSV tüpleri hazırlayın. 2. Her tüpün içine 7 µl PCR-mix-2 Flu ekleyin. 3. PCR-mix-1-FEP ile 2 tüp hazırlayın ve Fon olarak işaretleyin. Her tüpün balmumu tabakası yüzeyine 17 µl PCRmix-Fon ekleyin. 4. Uygun tüplere cdna den 10 µl ekleyin. 5. Aşağıdaki kontrolleri her bir panel için hazırlayın: PCR Negatif Kontrol işaretli tüpe 10 µl DNA-buffer ekleyin; PCR Poz Kontrol işaretli tüpe 10 µl HRSV cdna C+ ekleyin; IC Pos Kontrol işaretli tüpe 10 µl IC cdna ekleyin. Termalcyclerda aşağıdaki programı başlatın. Sıcaklık 95 º C e ulaştığında, amplifikatörün hücrelerine tüpleri yerleştirin ve devam etmek için düğmeye basın. Termocylere yerleştirmeden önce kısa süre vorteksleyerek (1 3 sn) tüplerin duvarlarından sediment damlaları uzaklaştırılmalıdır. hrsv cdna ın amplifikasyonunda termocylere programlayın. Adım Sıc. Zaman Döngü 0 95 С Duraklat 1 95 С 5 dk 1 95 С 25 sn 2 54 С 40 sn 42 72 С 25 sn 3 72 С 1 dk 1 4 10 С Adım Aladin programlama (Bu kiti kullanmadan önce lütfen Aladin Operating Manueli okuyun). hrsv cdna in tespiti 1. Güç düğmesini açın ve ALA-1 programı başlatın. 2. Ana menü programında Set up ve Test seçin. 3. New düğmesini seçin (sağ üst köşede). 4. Açılan menüden hrsv ismine girin ve OK düğmesini aktive edin. 5. 6. Channels menüsünde FAM ve HEX seçin, IC menüsünde Internal Control (FAM) için kanal seçin. 7. n ve n + alanlarında spesifik DNA tespiti için her bir kanal için sinyal/fon oranı için threshold değerini ekleyin: HEX ve FAM: n- =2.5, n+ =3.0 ve IC/background alanlarında internal kontrol için : Int.Control/Neg =2,5. 8. Negative Control Thresholds (Fon parametreleri) alanında Fon test tüpleri için kabul edilen flüoresans değerini ayarlayın: FAM: = 150; HEX: = 80; 9. Channel attachment penceresi altındaki Add a channel alanına hrsv yazın ve Add a channel basın. Add a channel alanında hrsv seçin ve uygun kanal düğmesini aktifleştirin: hrsv = HEX 10. Bu alanda 555% değerine ayarlayarak Confidential interval seçeneğini bloklayın. 11. Save düğmesini aktive edin. Flüoresans tespiti: 1. Gücü açın ve ALA_1 programı başlatın. 2. ALA_1 programı açın. 3. Yeni bir proje oluşturun. Bunu yapmak için, yeni bir proje oluşturmak için Protocol Create New ya da Open menüsüne gidin. 4. Açılan proje penceresinde yeni proje ayarlamayı seçin. Projenin adını girin, rotor türünü seçin (48 x 0.2), listede uygun testi (hrsv) seçin ve sonrasında Sample kutusunda örnek için bir isim girin.
5. Ctrl+F komutu ile Fon Kontrolü ekleyin. Fon kontroller olarak Fon örnek test tüpleri kullanın. 6. Exit düğmesini aktifleştirerek protokol penceresini kapatın. Protokolü kaydedin. 7. Sample kutusunun konum sütununda kendi numarasına göre Aladin karüseli içine kesinlikle kontrol ve örnek tüplerini aktarın. Tespit işlemini başlatın. Ana menüde Protocol ve sonra Detection seçin veya araç çubuğunda Run butonuna tıklayın. ANALİZİN SONUÇLARI Eğer ekstraksiyonun negatif kontrolü yanında hem amplifikasyonun Negatif kontrolü hem de Pozitif kontrolü geçerse, analiz sonuçları güvenilir olarak kabul edilir. hrsv cdna tespitin kontrol sonuçları Kontrol Kontrol adımları Kanallarda otomatik yorumun sonuçları Yorum HEX (örnek) FAM (IC) C- RNA izolasyonu Neg Poz OK NCA Amplifikasyon nd (failure) - OK C+ A Amplifikasyon Poz - OK C+ IC Amplifikasyon Neg Poz OK hrsv virüs için pozitif örnekler pozitif olarak görünür (HEX kanal). SORUN GİDERME 1. Ekstraksiyonun Negatif Kontrolu için IC (Fam (Green) kanal) sinyal vermez ya da zayıf verir. PCR inhibe olur. Size önerilen RNA ekstraksiyon yöntemini kullandığınızdan ve üreticinin talimatlarını izlediğinizden emin olun. Ekstre edilmiş RNA pipetlenmeden önce maksimum hızda (12000-16000 g) 2 dakika boyunca bütün tüpleri tekrar santrifüj edin ve dikkatlice süpernatantı alın. Reaksiyonda inhibe olan sorbent pellete dokunmayın. Reaktif saklama koşulları talimatlara uygun değildir. Saklama koşullarını kontrol edin. PCR koşulları talimatlara uygun değildir. PCR şartlarını ve protokolde rapor edilmiş flüoresans kanalını IC tespit için seçin. Reaktifleri pipetleme işlemi sırasında örneğe IC eklenmedi. RNA ekstraksiyon prosedürü sırasında dikkat edin. 2. Pozitif kontrol sinyal vermez ya da zayıf verir. PCR koşulları talimatlara uygun değildi. Amplifikasyon protokolunu kontrol edin ve manuel de rapor edilmiş fluoresans kanalını seçin. 3. Negatif Kontrol ekstraksiyonu ile HEX sinyal verir. RNA ekstraksiyon prosedürü sırasında kontaminasyon olabilir. Tüm örneklerin sonuçları geçersizdir. Sodyum hipoklorit ve etanol ile cihazın tüm yüzeyleri dekontamine edin. Ekstraksiyon prosedürü sırasında sadece filtre uçları kullanın. Tüpler arası geçişte uçları değiştirin. Reaktiflerin yeni bir seti ile RNA ekstraksiyonunu tekrar edin. 4. PCR Negatif Kontrolü (DNA-buffer) ile herhangi bir sinyal verir. PCR hazırlık işlemi sırasında kontaminasyon olabilir. Tüm örneklerin sonuçları geçersizdir. Sodyum hipoklorit ve etanol veya özel DNA dekontaminasyon reaktifleri ile cihazın tüm yüzeyleri dekontamine edin. Sonunda Pozitif kontrolü pipetleyin. Reaktiflerin yeni bir seti ile PCR hazırlanmasını tekrar edin. Sacace Biotechnologies Srl 44 Scalabrini, str 22100 Como, Italy