AKUT LÖSEMİLERDE İMMÜNOFENOTİPLEME

AKUT LÖSEMİLERDE İMMÜNOFENOTİPLEME Dr. TÜRKAN PATIROĞLU ERCİYES ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ PEDİATRİK HEMATOLOJİ BD KAYSERİ

Lösemi immünofenotiplemesi MoAb kullanılarak hücreler üzerindeki antijenik yapıların gösterilmesi veya oranlarındaki farklılıkların saptanmasıdır. 1. Hücresel kaynak 2. Tanı ve sınıflandırma 3. MRD tayini 4. Tedaviye yardımcı

Lösemi immünofenotiplemesi Yöntemler İmmünofloresan Flow sitometrik İki renkli Multiparametrik (çok renkli (4,5,7,8,10):Çok renkli analiz ile hücrenin taşıdığı antijenik yapılar hakkında daha detaylı bilgi edinilebilir

Lösemi immünofenotiplemesi MoAb Konjuge olmalı Saklama:uygun şartlarda ve küçük porsiyonlar halinde CD 45: Pan lökosit Ag (+) kontrol: CD45 MoAb u (-) kontrol: izotipik kontrol (nonspesifik bağlanmayı sağlar)

Lösemi immünofenotiplemesi Florokromlar FITC, PE, PC5, PC7,PI, Per Cp, Cy5

Lösemi immünofenotiplemesi Örnekler Tam kan Periferik kan mononükleer hücreleri Kemik iliği Vücut sıvıları (BOS, plevral sıvı) Doku örnekleri (lenf bezi,dalak)

Lösemi immünofenotiplemesi Örnekler Örnekler oda ısısında saklanmalı (18-25 0 C) Fiksasyon sonrası örnekler +4 0 C de saklanabilir Pıhtılaşmış örnekler çalışılmamalı - Tam kan EDTA lı tüplere alınmalı - Mononükleer hücre ayrılarak çalışılacaksa prezervatifsiz heparin (50 ü/ml) kullanılmalı PK örnekleri 6 st, Kİ örnekleri 2 st,sıvı örnekleri 2-6 st, solid doku örnekleri ise 1 st içinde çalışılmalı

Lösemi immünofenotiplemesi Örnek Hazırlama Sorunları CD 13, CD 19, CD 33 zayıf eksprese edildiği için PE veya Cy-5 gibi parlak florokromlar ile boyanmalı CD 45, HLA-DR için FITC ve per Cp gibi daha az parlak olan florokromlar kullanılmalıdır Çalışılacak örnekte en fazla 1x10 /ml hücre olmalı Eritrositler ortamdan uzaklaştırılmalı

Lösemi immünofenotiplemesi Örnek Hazırlama Sorunları Hücre kaybı: Polisteren veya polipropilen tüpler kullanılmalı Yıkama işlemleri azaltılmalı Yıkama solüsyonlarındaki protein miktarı artırılmalı (Ca şelatörü eklenmeli) Yıkamalar oda ısısı yerine + 4 o C de yapılmalı

Lösemi immünofenotiplemesi Analiz Sistem usulüne göre açılıp kapanmalı Cihazların günlük, haftalık, aylık ve yıllık bakımları yapılmalı Her gün kalite kontrolü ve floresan kalibrasyonu yapılmalı Laboratuvarlar eksternal kalite kontrol programına katılmalı Aynı panel içinde hücre sayısı aynı olmalı

Lösemi immünofenotiplemesi Analiz Kapı (gate) içinde en az 2500-5000 hücre olmalı Analiz sıralamasına göre MoAb a yönelik izotipik kontroller kullanılmalı Örnekler lazer ışığı önünden geçerken yapışkan özellikli boyalar nedeni ile cihazda tıkanma olabilir Debris oranı fazla ise analiz ortamından uzaklaştırılmalı

Lösemi immünofenotiplemesi Kan lipidleri yüksek ise yeterince lizis olmaz Debris oranı Kriyoglobulinemi, Retikülositoz Yoğun kemoterapi sonu Debrisi azaltmak için örnekler boyanmadan önce yıkanmalı Debris

Lösemi immünofenotiplemesi Kompenzasyon Ayarları

Lösemi immünofenotiplemesi Analiz (+) veya ( ) kontroller hem lösemik hem de normal hücrelerde eksprese edilir Analizde ilk adım CD 45 (+) kapı alınmasıdır Bu işlem lökositlerin belirlenmesine, platelet ve debrisin dışlanmasına izin verir. Normal (sağda) ve lösemik hücrelerde CD45 ve SS ekspresyonu

Yüzeyel Ag ekspresyonu pozitifliği: % 20 Lösemi immünofenotiplemesi Sitoplazmik ve Nükleer ( intrasellüler) Ag Belirlenmesi Sioplazmik Ag ( MPO, ccd3,ccd79a, TdT) ekspresyonu pozitifliği: % 10

Lösemi İmmünofenotiplemesi

Lösemi İmmünofenotiplemesi İlk Adım Panel

Lösemi İmmünofenotiplemesi İkinci Adım Panel

ALL ve atipik lenfositler

Lösemi immünofenotiplemesi B ALL

T ALL Lösemi immünofenotiplemesi T ALL

Lösemi immünofenotiplemesi

Lösemi immünofenotiplemesi T ALL

Lösemi immünofenotiplemesi AML

Lösemi immünofenotiplemesi AML de immünofenotipleme İmmünofenotipik işaretleyiciler FAB gurup MPO CD34 CD13 CD14 CD15 CD33 CD36 CD61 CD117 CD235a a M0 +/- +/- +/- - +/- +(-) - - +/- - M1 + + +/- - +/- +(-) - - +/- - M2 + + +/- - +/- +(-) - - +/- - M3 + - + - + + - - +/- - M4 + + + +/- + + +/- - +/- - M5 +/- -(+) +/- +/- + + +/- - b +/- - M6 c + +/- + - +/- + + - +/- + M6 d - +/- +/- - +/- + + +/- +/- + M7 - +/- +/- - - +(-) +(-) + +/- -(+) FAB, Fransız-Amerikan-İngiliz sınıflaması; MPO, miyeloperoksidaz;+, pozitif ; -, negatif ; +/-, pozitif veya negatif; + (-), bazen negatif,- (+) bazen pozitif. a CD235a glikoforin A dır. b AML-M5 blastlar nonspesifik olarak trombositler ve gpiiia/iib (CD41a ve CD61) ye bağlanabilir. Bu durum yanlış pozitif ekspresyonla sonuçlanır. c Eritrolösemi alt gurubu d Saf eritroid alt gurubu

My + ALL, Ly + AML ve Gerçek Miks Lösemide İmmünofenotipik Kriterler

Lösemi İmmünofenotiplemesi Bifenotipik lösemi

Lösemi immünofenotiplemesi TdT Bu enzim çekirdek DNA polimerazıdır. İmmatür B ve T lenfositlerde bulunur Periferik kan ve lenfoid dokularda çok az T ALL ama TdT ( ) ise erken timik ALL İnv 16 (p13q22) veya t(8;21)(q22;q22) olan bazı AML li hastalarda da zayıfveyakısmi TdT üretimi olabilir. Beyin omurilik sıvısı, plevra, periton sıvısı, testis veya diğer nonlenfoid dokularda TdT (+) ise lenfositik malignite düşünülür. T ALL li hastaların Kİ de MRD tayini

Lösemi immünofenotiplemesi CD13 Large granüler lenfositler Kİ de normal pre B hücreleri Reaktif matür B hücrelerinde Coranavirüs için bir reseptördür Sitomegalovirüs enfeksiyonunu uyarır Çocuklarda sadece CD13 + ise nöroblastom, Ewing sarkom gibi küçük yuvarlak hücreli tümörlerden ayırım için CD45, cyig, CD138 çalışılmalı

Lösemi İmmünofenotiplemesi CD117 CD34 CD117 Erken protimik T hücreleri T ALL nin %10 undan azında Prekürsör B ALL nin %3 ten daha azında CD34 B ALL nin %70 inde T ALL nin %30 unda

Lösemi immünofenotiplemesi

Lösemi immünofenotiplemesi ALL

Lösemi immünofenotiplemesi AML

Lösemi immünofenotiplemesi ALL Prognoz ilişkisi İyi prognoz CD 10 ekspresyonu CD 45 in düşük yoğunlukta ekspresyonu CD 34 ekspresyonu Kötü prognoz CD 10 ekspresyonu yok CD20 pozitifliği yüksek Erken T ALL de CD1a, CD8 yok ve CD5 zayıfeksprese ediliyorsa, kemoterapiye cevap oranı düşük Miyeloid antijen ekspresyonu prognozu etkilemez

Lösemi immünofenotiplemesi AML Prognoz ilişkisi Prognoza etkisiz Lenfoid Ag ekspresyonu CD34 ekspresyonu FAB M1 ve M2 morfolojisi ile birlikte Kötü prognoz CD7 ekspresyonu CD19 pozitifliği t(8;21) pozitif olan AML ve APL de CD56 ekspresyonu,

Minimal Rezidüel Hastalık (MRD) Lösemiye ait klinik bulgu olmadığı halde tedaviden kaçan ve relapslara neden olan hücrelerin varlığı olarak tanımlanır

Lösemi YÜKSEK RİSK DÜŞÜK RİSK Yetersiz tedavi Hastalık direnci Yoğun tedavi İlaç toksisitesi

Lösemi Remisyon İçin Morfoloji Yeterli mi? Tek bölgeden yapılan kemik iliği aspirasyon yaymaları, total kemik iliğinin çok küçük bir kısmını gösterir Kİ de blast <%5 = 10 10 neoplastik hücre

Lösemi

Akım Sitometrisi ile MRD MRD ANALİZİ İmmünofenotipleme Kantitatif RT PCR Klona özgü Ig ve TCR gen düzenlenmesinin PCR ile tayini

Akım Sitometrisi ile MRD Aberan Ag fenotipleri Kros linage Ag ekspresyonu Asenkronize Ag ekspresyonu Ag lerin overekspresyonu Anormal ışık saçılımı

Akım Sitometrisi ile MRD Asenkronize Ag ekspresyonu : B ALL de T (CD5,CD7) veya miyoloid belirleyiciler ( CD13,CD33) Aşırı Ag ekspresyonu: CD10 Aberan klonun saptanması: 2 farklı grup belirleyici ile B ALL: (CD19,CD45,CD9,CD34 veya CD19,CD45,CD10,CD20) T ALL: Kİ veya kanda çok nadir eksprese edilen belirleyiciler (Tdt, CD2, ccd3,cd5, CD7)

Asenkronize Ag ekspresyonu

Akım Sitometrisi ile MRD

Akım Sitometrisi ile MRD Pre B ALL AIEOP BFM grubu CD 58 (LFA 3: lenfosit fonksiyonu asosiye Ag)

Akım Sitometrisi ile MRD Avantaj ALL de %80 95 uygulanabilir Hızlı: Aynı gün sonuç alınır Sonuçlar kantitatiftir Tedavi düzenlenebilir Örnek genellikle Kİ dir ama tam kan da olabilir Dezavantaj Hematogonlar İmmünofenotipik kaymalar (relapsta değişiklik olabilir) Örneğin yetersiz olması ( indüksiyon sonrası hiposellülarite) Tanı zamanında da immünofenotip çalışılmış olmalı

Kİ de bazen > %5 50 olabilir; Çocuklarda (16 y üzerinde ) Hematolojik bozukluklarda (ITP, Fe eksik anemisi, konj nötropeni, konj eritrosit aplazisi, amegakaryositozis) Gaucher s hst.da Neoplazili hastalarda ( retinoblastom, nöroblastom, ALL remisyonunda) KİT de Akım Sitometrisi ile MRD Hematogon Longcasre AT et al. Blood 1989:73

Akım Sitometrisi ile MRD Athale UH et al. Pediatr Blood Cancer 2016;63:973 982 PEDİATRİC ALL RECOMMEND İNDİCATİON FOR MRD MEASUREMENT

Akım Sitometrisi ile MRD Athale UH et al. Pediatr Blood Cancer 2016;63:973 982 PEDİATRİC AML RECOMMENDED İNDİCATİON FOR MRD MEASUREMENT

Akım Sitometrisi ile MRD 8. gün PK:100000 / mm 3 15. gün Kİ:300000 / mm 3 33.gün:Kİ 10000000/mm 3

Akım Sitometrisi ile MRD İmmünofenotipi Etkileyen Faktörler Lösemik ve normal hücreler arasındaki immünofenotipik farklılığın derecesi Örnekteki hücre sayısı

ALL IC BFM 2002 Non MRD based protocol (coordinated by Jan Stary) MRD as a research question Protocol parallel to AIEOP BFM 2000 (MRD based) MRD d33, week 12 Risk stratification ALL IC BFM 2002 v Risk stratification AIEOP BFM 2000 Prednisone response BCR/ABL, MLL AF4 MRD d33 and w12 64 64

Akım Sitometrisi ile MRD AIEOP BFM grubu Negatif MRD = < 10 4 ile 5 yıllık sağkalım SRG için EFS: %92 IRG için EFS: %77 HRG için EFS: % 50

MRD > %9.8

MRD < %01