DİYABETİK NEFROPATİLİ (EVRE III-IV-V) HASTALARDA OSTEOPROTEGERİN VE RESEPTÖR AKTİVATÖR NÜKLEER KAPPA B LİGAND DEĞİŞİMİ

T.C. TRAKYA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ İÇ HASTALIKLARI ANABİLİM DALI Tez Yöneticisi Doç. Dr. Sibel GÜLDİKEN DİYABETİK NEFROPATİLİ (EVRE III-IV-V) HASTALARDA OSTEOPROTEGERİN VE RESEPTÖR AKTİVATÖR NÜKLEER KAPPA B LİGAND DEĞİŞİMİ (Uzmanlık Tezi) Dr. Çiğdem KUZUGÜDEN SARI EDİRNE-2010

TEŞEKKÜR Uzmanlık eğitimim süresince ve tezimin hazırlanması sırasında büyük emeği olan değerli hocam Doç. Dr. Sibel GÜLDİKEN e, bilimsel konularda yardımlarını gördüğüm Prof. Dr. Muzaffer DEMİR e, Yrd. Doç. Dr. Sedat ÜSTÜNDAĞ a ve İç Hastalıkları Anabilim Dalı ındaki tüm hocalarıma, tüm asistan arkadaşlarıma, Nefroloji, Endokrinoloji ve Metabolizma Hastalıkları Bilim Dalı hemşire ve personelleri ile tüm laboratuvar çalışanlarına saygılarımla teşekkürlerimi sunarım.

İÇİNDEKİLER GİRİŞ VE AMAÇ... 1 GENEL BİLGİLER... 3 DİYABETES MELLİTUS TANIMI VE SINIFLANDIRMASI... 3 DİYABETİK NEFROPATİ... 4 KRONİK BÖBREK HASTALIĞI-KEMİK MİNERAL BOZUKLUĞU... 8 KEMİK DOKU VE OSTEOPROTEGERİN/RANK/RANKL SİSTEMİ... 12 GEREÇ VE YÖNTEMLER... 20 BULGULAR... 24 TARTIŞMA... 35 SONUÇLAR... 42 ÖZET... 44 SUMMARY... 46 KAYNAKLAR... 48 EKLER

SİMGE VE KISALTMALAR ADA AGE ALP DM DNp FGF GFR IL KBH KDIGO NADPH NF-κB OPG PKC PTH RANK RANKL ROÜ SDBH TGF β-1 : American Diabetes Association (Amerikan Diyabet Cemiyeti) : Advanced Glycation End Products : Alkaline Phosphatase (Alkalen Fosfataz) : Diyabetes Mellitus : Diyabetik Nefropati : Fibroblast Growth Faktör : Glomerular Filtration Rate (Glomeruler Filtrasyon Hızı) : İnterlökin : Kronik Böbrek Hastalığı : Kidney Disease: Improving Global Outcomes (Böbrek Hastalıkları: Küresel Sonuçların İyileştirilmesi) : Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate (Nikotinamid Adenin Dinükleotid Fosfat) : Nükleer faktör kappa B : Osteoprotegerin : Protein Kinaz C : Paratiroid Hormon : Reseptör Aktivatör Nükleer Kappa B : Reseptör Aktivatör Nükleer Kappa B Ligand : Radikal Oksijen Ürünleri : Son Dönem Böbrek Hastalığı : Transforming Growth Faktör Beta-1

TNF : Tümör Nekrozis Faktör TNFR : Tümör Nekrozis Faktör Reseptörleri TRAF : Tumor Necrosis Factor Receptor Associated Factor (Tümör Nekrozis Faktör Reseptör İlişkili Faktör) TRAIL : Tumor Necrosis Factor-Related Apoptosis-Inducing Ligand (Tümör Nekrozis Faktör İlişkili Apopitozisi İndükleyen Ligand ÜAA : Üriner Albümin Atılımı ÜPA : Üriner Protein Atılımı VEGF : Vasküler Endotelyal Growth Faktör VKİ : Vücut Kitle İndeksi VYA : Vücut Yüzey Alanı 25-OH vit. D : 25-Hidroksi Vitamin D

GİRİŞ VE AMAÇ Tip 2 Diyabetes Mellitus (DM) günümüzün önemli bir halk sağlığı sorunudur ve insan sağlığına gelecekteki olası olumsuz etkileri açısından tehlike sinyalleri vermektedir. Dünya Sağlık Örgütü verilerine göre, dünya genelinde yaklaşık 170 milyon DM hastası bulunmaktadır. Diyabetiklerin sayısının, 2030 yılına kadar 439 milyona yükseleceği öngörülmektedir (1). Metabolik olumsuz etkilerinin yanı sıra diyabetiklerde, hastalığın süre ve şiddetine bağlı olarak böbrekler başta olmak üzere çeşitli organlarda hasar meydana gelir (2). DM sıklığındaki artış ve diyabetiklerin yaşam süresindeki uzamaya bağlı olarak diyabetik nefropati (DNp) sıklığı da giderek artmaktadır (3). Amerika Birleşik Devletleri (ABD) nde son önem böbrek hastalığı (SDBH) nedenleri arasında DNp yaklaşık % 45 lik oranla birinci sırayı almaktadır (4). Ülkemizde de DNp insidans ve prevalansı giderek artmaktadır. Türk Nefroloji Derneği kayıtlarına göre 1991 yılında SDBH nedenleri arasında % 4.5 lik payı olan DNp, 2003 yılından itibaren birinci sıraya yükselmiştir ve 2008 yılı verilerine göre ilk renal replasman tedavisi olarak hemodiyaliz başlanan ve kronik hemodiyaliz programına alınan hastaların % 30,7 sini diyabetik nefropatili hastalar oluşturmaktadır (5,6). Diyabetik nefropati gelişiminden birçok risk faktörü sorumludur (7). Hipergliseminin yanı sıra genetik yatkınlık, beslenme bozukluğu, sedanter yaşam, obezite, hipertansiyon, dislipidemi ve benzeri risk faktörleri renal bozulmada rol alan faktörlerin başında gelmektedir. Artmış glukoz, enzimatik ve nonenzimatik ürünlerinin yol açtığı oksidatif stres ile oluşan radikal oksijen ürünlerinin (ROÜ) artışı, protein kinaz C (PKC) aktivasyonu, protein ve aminoasitlerin glikasyonu ile oluşan ileri glikozilasyon son ürünleri (advanced glycation end products, AGE) DNp gelişiminde önemli rol almaktadır (8,9). 1

Metabolik kemik hastalığı, kronik böbrek hastalığının (KBH) yaygın bir komplikasyonudur. Üremik kemik hastalığı, mineral metabolizmasına ait geniş spektrumlu hastalıkların bir parçasıdır ve KBH-mineral ve kemik bozukluğu olarak ifade edilir. KBH seyrinde mineral metabolizmasına ait değişiklikler erken dönemlerde meydana gelir ve böbrek fonksiyonlarının azalmasıyla birlikte ilerler (10). KBH-mineral ve kemik bozukluğu, yüksek ve düşük döngülü metabolik kemik hastalığı şeklinde sınıflandırılarak incelenmektedir. Yüksek döngülü kemik hastalığı, sekonder hiperparatirodizm gelişiminin bir sonucudur (11,12). Düşük döngülü metabolik kemik hastalığı oldukça düşük kemik yapım oranı ile karakterizedir. Bazı vakalarda, düşük kemik yapım oranına ek olarak hasarlı kemik mineralizasyonu ile karakterize olan osteomalazi görülmektedir (13). Adinamik kemik hastalığının sıklığı artmakta olup diyabetik nefropatili hastalarda diyaliz öncesi dönemde prevalansının %60 olduğu gösterilmiştir (14,15). Adinamik kemik hastalığının patogenezi tam olarak bilinmemektedir (16). Kemik kütlesi, iskeletin bütünlüğünü ve hareket yeteneğini sağlaması, kaslar için destek ve mineral iyonları için de depo oluşturması bakımından önemlidir. Kemik dokusu, eski dokunun osteoklastlar tarafından yıkılıp, yerine osteoblastlar tarafından yenisinin oluşturulması ile hayat boyu yenilenir (17). 1990 ların ortalarında, kemik yıkımının düzenlenmesinde reseptör aktivatör nükleer kappa B ligand (RANKL)/ reseptör aktivatör nükleer kappa B (RANK)/ Osteoprotegerin (OPG) sisteminin keşfi, kemik şekillenmesinin ve yeniden yapılanmanın nasıl düzenlendiğini anlamamıza büyük katkılar sağlamıştır. Uzun yıllardır osteoblastik stromal hücrelerin osteoklast formasyonunu düzenlediği bilinmektedir. Son yıllarda çeşitli çalışmalarda bu hücrelerin tümör nekrozis faktör (TNF) süper ailesi üyelerini sentez edebildikleri tespit edilmiştir. Bu ailenin üyeleri olan RANKL/RANK sinyalizasyonu; osteoklast oluşumunu, normal kemik şekillenmesini ve yeniden yapılanmasını sağlamakta ve artmış kemik yapım-yıkım hızı ile karakterize olan bir dizi patolojik duruma neden olmaktadır. OPG ise RANKL a bağlanarak RANK a RANKL ın bağlanmasını engellemekte ve kemiğin aşırı yıkımını önlemektedir. Bu nedenle RANKL ın ve OPG nin kemik içerisindeki rölatif konsantrasyonu kemik kütlesinin ve gücünün ana belirleyicisi olmaktadır (18). Bu çalışmada, diyabetik nefropatiye bağlı olarak gelişen metabolik kemik hastalığı hakkında yeni bilgiler elde etmek amacıyla, evre III, evre IV ve evre V diyabetik nefropatili olgularda serum OPG ve RANKL düzeyleri ve bu polipeptidlerin çeşitli klinik ve laboratuvar verileri ile ilişkisinin incelenmesi amaçlanmıştır. 2

GENEL BİLGİLER DİYABETES MELLİTUS TANIMI VE SINIFLANDIRMASI Amerikan Diyabet Cemiyeti (ADA), DM tanı ve sınıflama kriterlerini 1997 yılında yayınlamış ve 2003 yılında yeniden düzenlemiştir. Buna göre, 75 gr oral glukoz tolerans testinde 2. saat glukoz değerinin 200mg/dl olması veya poliüri, polidipsi, glukozüri, ketonüri, açıklanamayan kilo kaybı (polifajinin eşlik ettiği veya etmediği) ve bulanık görme gibi hiperglisemik semptomların varlığında herhangi bir zamanda bakılan plazma glukoz düzeyinin 200 mg/dl bulunması DM olarak tanımlanmaktadır. Ayrıca, 8 saat açlıktan sonra ölçülen sabah kan glukozunun 126 mg/dl olması da tanı için yeterlidir (19). Heterojen bir hastalık olan DM son sınıflamada tip 1, tip 2, gestasyonel diyabet ve diğer spesifik tipler olmak üzere 4 gruba ayrılmıştır (20). Tip 1 DM, genetik yatkınlık ve çevresel etkenlerle pankreas beta hücrelerinin ilerleyici harabiyetine bağlı olarak gelişir. Tüm diyabetli hastaların %10-15 ini tip 1 DM oluşturur. Otoimmün (tip 1A) ve idiyopatik (tip 1B) olmak üzere iki alt grubu vardır. Otoimmün tipinde pankreas beta hücrelerinin çeşitli bileşenlerine karşı otoantikorlar bulunurken, idiyopatik tipinde otoimmünite bulguları yoktur. Çocukluk ve adölesan yaşta başlayan ve klinik olarak hızlı bir şekilde ortaya çıkan tip 1 DM nin bazı hastalarda yıllar süren ve yavaş bir gelişim gösteren şekli LADA (latent autoimmune diabetes in adults) olarak adlandırılır (20). İnsülin direnci ve/veya insülin salgılanma kusuru ile karakterize olan tip 2 DM tüm DM hastalarının yaklaşık %90 ını oluşturur. Hastaların çoğu orta yaşta ve obezdir. Tip 2 DM, heterojen bir hastalıktır. Bu tablo içinde yer alan MODY (maturity onset diabetes of young) hipergliseminin genç yaşta başlaması, ketoz yokluğu, hipergliseminin insülin kullanılmadan 3

düzeltilmesi, diyabetik komplikasyon risk düşüklüğü ve otozomal dominant geçiş gibi özellikler göstermektedir (20). Bunların dışında ilk kez gebelik sırasında ortaya çıkan gestasyonel diyabet ve bilinen bir nedene bağlı sekonder diyabet tipleri de bulunmaktadır. Sekonder diyabet nedenleri arasında pankreas hastalıkları, hipofiz ve sürrenal bez hormon bozuklukları, ilaçlar ve endokrin sistem hastalıkları ile ilişkili genetik sendromlara bağlı gelişen diyabet sayılabilir (20). Endüstriyel ülkelerde prevalansı artan DM nin komplikasyonları da yüksek oranda gelişmektedir. Akut ve kronik komplikasyonlara yol açabilen diyabetin akut komplikasyonları arasında diyabetik ketoasidoz, hiperosmolar koma, hipoglisemi, laktik asidoz sayılabilir. Kronik komplikasyonları ise makro ve mikrovasküler düzeyde incelenir. Makrovasküler komplikasyonlar arasında hipertansiyon, kardiyovasküler ve serebrovasküler hastalıklar ile periferik arter hastalığı yer alır. Mikrovasküler komplikasyonları ise nöropati, retinopati ve nefropati oluşturur. Bunların dışında deri, bağ dokusu, eklem ve sinir sistemi gibi diğer diğer sistemlerle ilgili sorunlar mikrovasküler bozulma ile gelişir (20). DİYABETİK NEFROPATİ Ülkemizde ve dünyada SDBH nedenleri arasında diyabetik nefropati birinci sırada yer almaktadır. Amerika Birleşik Devletleri nde düzenli diyaliz tedavisine giren hastaların %40 ını DM ye bağlı SDBH oluşturmaktadır. Ülkemizde de Türk Nefroloji Derneği 2008 verilerine göre hemodiyaliz hastaları arasında DM, %30,7 ile SDBH nedenleri arasında birinci sırada yer almaktadır (6). Diyabetik nefropati gelişiminde genetik yatkınlık, hiperglisemi süre ve şiddeti, hipertansiyon, renin anjiotensin aldosteron sistemi aktivasyonu ve sigara kullanımı risk faktörleridir (21). Obezite, insülin rezistansı, hiperlipidemi, diyetle yüksek protein alımı, albüminüri varlığı ise prognozu kötüleştirmektedir (22). Diyabetik Nefropati Patogenezi Genetik: Yapılan çalışmalarda tip 1 ve tip 2 diyabetin her iki formunda da DNp nin ailesel kümelenme gösterdiği ortaya konmuştur (23,24). Ailevi yatkınlık, genetik bir bozukluğun varlığını düşündürmekle birlikte, DNp gelişimiyle ilişkilendirilebilecek bir gen açıkça gösterilememiştir. Bazı çalışmalar, anjiotensin konverting enzim geni üzerindeki 4

delesyon ile DNp arasındaki ilişkiye dikkat çekmekte ise de çelişkili sonuçlar da bildirilmiştir (25,26). Hiperglisemi: DM de kronik hiperglisemi sonucu glukozun aracılık ettiği metabolik değişiklikler komplikasyonların gelişmesinde ana hazırlayıcıdır. DNp gelişiminde bu metabolik olayların birbirleriyle etkileşim içinde olduğu anlaşılmıştır. Glukozun etkisiyle yapımı artan ROÜ nün bu metabolik yolların aktivasyonu ve karşılıklı etkileşiminde önemli olduğu anlaşılmıştır (27). Hipergliseminin etkili olduğu metabolik yolaklar aşağıda sunulmaktadır. a-glukozun direkt toksik etkileri (glukotoksisite): Glukoz, hücrelere doğrudan toksik etkide bulunur. Glukozun direkt toksik etkileri arasında hücre çoğalması, hücre dışı matriks birikimine neden olan kollajen, fibronektin, laminin, transforming growth faktör beta-1 (TGF β-1) sentez artışı ve mezangial hücrelerde azalmış heparan sülfat sentezine bağlı proteinüri bulunmaktadır (28). b-polyol yolu aktivasyonu: Böbrekler, lens ve retinaya glukozun geçişi insülinden bağımsızdır (21). Glukoz, nikotinamid adenin dinükleotid fosfat (NADPH) varlığında, aldoz redüktaz enzimi tarafından sorbitole dönüştürülür. Hiperglisemide bu dönüşümün artması ile tüketime bağlı olarak NADPH azalırken sorbitol artar. Sorbitol nikotinamid adenin dinükleotid varlığında, sorbitol dehidrogenaz enzimiyle fruktoza dönüştürülür. Fruktozun non-enzimatik glikozillenmesi sonucu AGE ler oluşur ve doku hasarına neden olur. Ayrıca hücre içinde artan sorbitol etkisiyle miyoinositol ve Na + -K + ATP az (sodyum-potasyum adenozin trifosfataz) aktivitesi azalır. Sodyum hücre içinde birikir, osmoregülasyon bozulur, hücre ödemi ve fonksiyon bozukluğu ortaya çıkar. NADPH, nitrik oksit sentezi ve serbest radikallerin uzaklaştırılmasında rol alan glutatyon yapımında kullanılır. Hiperglisemide NADPH tüketiminin artması ile nitrik oksit yapımı azalır, serbest radikallere bağlı vasküler hasar gelişir (28). c-non enzimatik glikozillenme ve ileri glikozilasyon son ürünleri: Enzim aracılığı olmaksızın aminoasit, lipid ve lipoproteinlerin kendiliğinden indirgenmesiyle ilk basamakta Amadori cisimleri meydana gelir. Daha sonraki basamakta hiperglisemi düzeyine bağlı olarak AGE ler oluşur (29). Artmış AGE oluşumu, diyabetin mikrovasküler komplikasyonlarının patogenezinde önemli rol oynamaktadır (30). 5

İleri glikozilasyon son ürünlerinin DNp deki moleküler mekanizmaları tam aydınlatılamamış olmakla birlikte, yapılan çalışmalarla bazı etkileri ortaya konmuştur: Hücre dışı matriks bağlantılarını etkileyerek sinyal iletilerini bozarlar, Kollajen gibi yapısal proteinlere, geri dönüşümsüz şekilde bağlanarak glomeruler bazal membran ve matriks bileşenlerini bozarlar, Adezyon yapan matriks proteinlerini etkileyerek kapiller geçirgenliği artırır; makrofaj ve mezengiyal hücrelere de bağlanarak bölgeye monositlerin göçüne, matriks artışına ve nitrik oksit yapımının engellenmesine neden olurlar, Kendine özgü reseptörle bağlanır ve nükleer faktör kappa B (NF-κB) yi aktive ederler. Böylelikle çok sayıda sitokin, kimokin ve vazoaktif hormon üretimini uyarırlar, Ayrıca glukoz, fruktoz ve ara ürünler, hedef dokudaki proteinlerin fonksiyonlarını doğrudan etkileyebilirler. d-protein kinaz C aktivasyonu: Serin treonin kinaz grubu olarak bilinen PKC hiperglisemide aktive olarak böbrek hücrelerinde fibronektin, tip IV kollajen, TGF β-1 sentezini arttırır (31). Artan TGF β-1 aracılığıyla matriks protein üretimi artışına bağlı olarak glomeruloskleroz gelişir (32). PKC nin bazı deneysel çalışmalarda podositlerde vasküler endotelyal growth faktör (VEGF) sentezini arttırarak glomeruler geçirgenlik artışı ve albuminüriye, mezangial hücreleri aktive ederek glomeruloskleroza neden olduğu gösterilmiştir (33,34). Oksidatif stres: Diyabetteki vasküler değişiklikler, hücre hasarına neden olan ROÜ ve antioksidan savunma sistemi arasındaki dengenin bozulması sonucu oluşur (35). Bu vasküler değişiklikler diyabetin tüm mikro ve makrovasküler komplikasyonlarından sorumludur (30). Büyüme faktörleri: DNp gelişiminde, büyüme faktörlerinin uygunsuz sentezi merkezi rol oynamaktadır (36). TGF β-1, doku onarımı ile ilgili fizyolojik işlevleri düzenler, hücrelerdeki matriks protein sentezini uyarır, hücre farklılaşması ve çoğalmasını etkiler. Hiperglisemi TGF β-1 sentezini uyararak kollajen yapımını arttırır (37). Fibrozis oluşumunda Tip IV kollajen birikimi önemlidir. Fazla TGF β-1 sentezleyecek şekilde genetik değişikliğe uğratılmış sıçanlarla yapılan çalışmalarda, bu madde ile mezengiyal matriks artışı ve glomerüloskleroz arasındaki ilişki gösterilmiştir (38). VEGF, anjiogenesis ve mikrovasküler 6

geçirgenliği arttıran güçlü bir sitokindir. VEGF artışı ile hiperfiltrasyon, proteinüri ve glomeruler hipertrofi ilişkili bulunmuştur (39). Deneysel diyabet modellerinde trombosit, fibroblast (40) ve konnektif doku (41) kaynaklı büyüme faktörlerinin de DNp patogenezi ile ilişkili olduğu bulunmuştur. Hemodinamik faktörler: Diyabete bağlı renal hasarın gelişimi ve ilerlemesiyle ilgili en erken bulgu hiperfiltrasyon ve intraglomerüler basınç artışına neden olan hemodinamik değişimlerdir (42). Efferent arteriolerde oluşan vazokonstriksiyona kıyasla afferent arteriolerde meydana gelen vazodilatasyon intraglomeruler basıncı arttırır (43). Bu hemodinamik değişiklikler artmış proteinüri ve hızlanmış glomeruloskleroz ile birliktelik gösterir (42). Renin anjiotensin aldosteron sistemi: Diyabetiklerde, böbrek dokusunda hem glomerülde hem de intersitisyumda lokal renin anjiotensin aldosteron sistemi uyarılmıştır (44,45). Hiperglisemi ile artan doku anjiotensin II düzeyleri, oksidatif stres ürünlerinin oluşumu ve endotel hasarına neden olur ve bu süreç vazokonstriksiyon, tromboz, inflamasyon, vasküler yeniden yapılanma, TGF-β 1 aracılıklı hücre dışı matriks birikimi ile sonuçlanır (46). Diyabetik Nefropati Evrelemesi Diyabetik nefropati gelişim süreci 5 evrede incelenmektedir (21): Evre I (hiperfiltrasyon): Glomeruler filtrasyon hızı (GFR) normal değerin %20-40 ı oranında artmıştır. Nefronlarda hipertrofi gelişmiş olup idrarda mikroalbumin saptanmamaktadır. Evre II (sessiz dönem): GFR, hiperfiltrasyon evresine göre azalmış olmakla birlikte halen normalin üzerinde veya normaldir. Glomeruler bazal membranda kalınlaşma ve mezangial matrikste artış vardır. Evre III (gizli nefropati): İdrarla albumin atılımı 30-300 mg/gün arasındadır. GFR yılda yaklaşık 1.1 ml/dk azalır. Tip 2 DM hastalarının çoğu tanı konduğunda bu dönemdedir. Evre IV (aşikar nefropati): Günde 300 mg ı aşan albuminüri ve 500 mg ı aşan proteinüri vardır. Bu evrede GFR yılda 10-12 ml/dk azalır. Hastaların çoğu hipertansiftir. Hipertansiyon varlığı prognozu kötüleştirir. 7

Evre V (son dönem böbrek yetmezliği): Tip 1 DM hastalarının %50 si, tip 2 DM hastalarının ise %20-30 u, 10 yıl içinde evre IV ten V e ilerler (47). Bu dönemde hastaların renal replasman tedavisine gereksinimi vardır. KRONİK BÖBREK HASTALIĞI-KEMİK MİNERAL BOZUKLUĞU Metabolik kemik hastalığı KBH nin yaygın bir komplikasyonudur. Bu klinik çerçeve içerisinde yer alan mineral metabolizmasına ait çeşitli hastalıklar KBH-mineral ve kemik bozukluğu olarak ifade edilir. KBH de rastlanan kemik mineral hastalığı, ABD ulusal böbrek vakfının (KDIGO: Kidney Disease: Improving Global Outcomes) rehberinde; kalsiyum, fosfor, PTH veya vitamin D metabolizmasında bozukluk, kemik yapım-yıkımı, kemik mineralizasyonu, hacmi, lineer büyümesi, kemik gücünde bozukluk veya vasküler ve diğer yumuşak doku kalsifikasyonlarının birisi veya bu bozuklukların kombinasyonlarının varlığı olarak tanımlamaktadır. Renal osteodistrofi (üremik kemik hastalığı), KBH deki kemik morfolojisi değişimlerini ifade eden, kemik biopsisinin histomorfometrisi ile değerlendirilen kemik mineral hastalığının bir komponentidir (10). Kronik Böbrek Hastalığında Kemik-Mineral Metabolizmasındaki Değişimler Kronik böbrek hastalığının ilerlemesi ile birlikte kemik metabolizması da sürekli olarak değişir. GFR 60 ml/dk/1,73m² değerinin altına indiğinde kalsiyum, fosfor, PTH ve D vitamini metabolizmasında değişiklikler başlar (10). Erken evre KBH de, fosfor retansiyonu ile birlikte PTH ve fibroblast growth faktör-23 (FGF-23) düzeyi artar (48). FGF-23 artışı ile osteoblastların olgunlaşması yavaşlar ve mineralizasyon azalır (49). Ayrıca FGF-23, fosforun böbrekten atılımını arttırır, PTH salınımını tetikler. 1α-hidroksilaz enzimi inhibitörü olduğundan kalsitriol eksikliğine ve hipokalsemiye yol açar (50). PTH, kemik döngüsünü arttırarak serum kalsiyum düzeyini normal sınırlarda tutar. Aynı zamanda fosfat atılımını ve kalsitriol aktivitesini artırır. Fosfat, yeni osteoklast oluşumunu ve osteoklastların kemik rezorbsiyonunu engeller (51). Kalsitriol kemikte yeniden yapılanma için çok önemlidir ve bu etkisini vitamin D reseptörü aracılığıyla yapar (52). Erken evre KBH de düşük kemik döngüsü oluşurken ileri dönem KBH de artan PTH yüksek kemik döngüsüne sebep olur (53). Yüksek kemik döngüsü ile hiperparatiroidizmin klasik lezyonları olan değişen derecelerde fibrozis ve artmış kemik yapım hızı (osteitis fibroza kistika) gözlenir. Düşük döngü ile seyreden kemik hastalıkları ise osteomalazi (osteoid yüzeylerin ve kalınlıklarının artması, 8

düşük kemik yapım hızı), adinamik kemik hastalığı (azalmış kemik hücreleri, azalmış osteoid kalınlığı ve düşük kemik yapım hızı), karışık tip kemik hastalığı (artmış osteoid kalınlığı ve fibrosizi ve artmış kemik yapım hızı) olarak sınıflandırılır. Kronik Böbrek Hastalığı nda Metabolik Kemik Hastalığının Patogenezi Kronik böbrek hastalığında yüksek döngülü metabolik kemik hastalığı: Yüksek döngülü kemik hastalığı, sekonder hiperparatirodizmin bir sonucudur. Uzun yıllardır KBH seyri sırasında erken dönemlerde paratiroid bezlerinde hiperplazinin oluştuğu ve serumda PTH seviyelerinin arttığı bilinmektedir (11,12). Paratiroid bezlerinin aşırı aktivitesine yol açan faktörler; hipokalsemi, fosfor birikimi, kalsitriol seviyesindeki azalma, paratiroid bezlerinin büyümesi, PTH a karşı gelişen iskelet direnci ve paratiroid bezindeki intrinsik değişikliklerdir. 1. Fosfor retansiyonunun rolü: Sekonder hiperparatiroidizm patogenezindeki en önemli faktör fosfat birikimidir (54). GFR deki azalmaya bağlı olarak gelişen fosfor birikimi iyonize kalsiyum seviyelerinde geçici azalmalara neden olur. Bu durum PTH sekresyonundaki artışı tetikler. Normal kalsiyum ve fosfor seviyelerinin idamesi yüksek PTH seviyeleri ile sağlanır (55). Fosfor birikiminin hiperparatiroidizm patogenezinde rolü olduğu yapılan çalışmalar ile desteklenmiştir ancak bu etkiyi oluşturan mekanizma tam olarak açıklanamamıştır. Normal kişilerde oral fosfor yüklemesinin, serum fosforunda artışa, iyonize kalsiyum seviyesinde azalmaya ve kan PTH seviyelerinde artışa yol açtığı gösterilmiştir. Bununla birlikte, böbrek yetmezliğinin erken dönemlerinde fosfor yüksekliğinin görülmediği hastalarda PTH nın yüksekliği kuşku uyandırmaktadır (56,57). KBH li birçok hastada hipokalsemi yaygın değildir ve fosfor yüklenmesi sonrasında aralıklı gelişen hipokalseminin gösterilmesinde zorluklar vardır (56,58). Kalsitriol üretiminin fosfor tarafından düzenlendiği, fosfor birikiminin kan kalsitriol seviyelerinde düşüşe yol açtığı gösterilmiştir (59). Fosfor birikimine bağlı olarak 1αhidroksilazın inhibe olması kalsitriol üretiminin azalmasına sebep olur. Deneysel olarak, kan kalsitriol seviyelerindeki düşüşü önlemeye yetecek miktarda kalsitriol uygulanmasının hiperparatiroidizm gelişimini önlediği gösterilmiştir (60). Bu mekanizma, aynı zamanda hiperparatiroidizm gelişiminin ve ilerleyişinin önlenmesinde fosfor kısıtlanmasının önemini ortaya koymaktadır. 9

Hayvan deneylerindeki çalışmalar fosforun kalsiyum veya kalsitriolden bağımsız bir biçimde paratiroid fonksiyonunu etkilediğini göstermiştir. Deneysel olarak ekstrasellüler fosfor konsantrasyonlarındaki değişimlerin, iyonize kalsiyum değişiklikleri olmaksızın PTH sekresyonunda artışa neden olduğu gösterilmiştir (61). Yüksek fosfor konsantrasyonları pottranskripsiyonal olarak PTH sekresyonunda artışa neden olur (62). Bununla beraber yüksek ekstrasellüler fosforun paratiroid dokusunda araşidonik asit üretimini azaltarak PTH sekresyonunu arttırdığı gösterilmiştir (63). Bu sinyal mekanizmasının fosfolipaz A2- araşidonik asit yolağı üzerine sitozolik kalsiyumdaki değişikliklerin bir sonucu olduğu düşünülmektedir. Bununla birlikte, fosforun hangi düzeylerde paratiroid hücrelerde intraselüler kalsiyum düzenlenmesini etkileyebildiği bilinmemektedir. Fosfor aynı zamanda paratiroid büyümesi üzerinde önemli etkilere sahiptir. Yüksek fosfor diyetindeki hayvanlarda paratiroid büyümesinde bir hızlanma olduğu, düşük fosfor diyetinin de paratiroid hiperplazisinden koruduğu gösterilmiştir (64). 2. Azalmış kalsitriol sentezinin rolü: Kalsitriol üretiminin böbrekte olması nedeniyle, böbrek kütlesindeki azalma böbreğin kalsitriol üretme yeteneğinde azalmayla sonuçlanır. KBH seyri sırasında, kalsitriolün sentezindeki azalma nedeniyle sekonder hiperparatiroidizm gelişir (14). Ayrıca fosfor birikimine bağlı olarak 1α-hidroksilazın inhibe olması ve renal yetmezlikte biriken FGF-23 kalsitriol üretiminin azalmasına sebep olur (65). Son yıllarda yapılan çalışmalarda ek bir mekanizma tespit edilmiştir. Başlıca vitamin D deposu olan 25-hidroksi vitamin D (25 OH vit. D), vitamin D-bağlayıcı protein ile dolaşımda taşınmaktadır. Bu protein glomerülden filtre olmakta ve reseptör aracılı bir mekanizma tarafından proksimal tübüle geri alınmaktadır. Aynı mekanizma ile proteine bağlı olarak bulunan 25 OH vit. D de hücre içine alınır (66). KBH nin seyri sırasında azalmış GFR, böbreğin aktif sterol üretimi kabiliyetini sınırlandıracak bir biçimde bu proteinin hücre içine taşınmasında azalmaya yol açmakta, vitamin-d bağlayıcı proteinin idrarda kaybına bağlı olarak da artmış vitamin D eksikliğine sebep olmaktadır (67). Böbrek hastalığı ilerledikçe, kalsitriol aktivitesini sınırlandıran diğer faktörler de oluşur. Bu durum, hedef dokulardaki vitamin D reseptöründeki azalmalardan (68) veya bağlı vitamin D reseptörünün DNA üzerindeki yanıt oluşturucu etkisindeki yetersizlikten kaynaklanır (69). 10

3. Paratiroid bezindeki intrinsik değişikliklerin rolü: Hipokalsemi, paratiroid büyümesi ve PTH sekresyonu üzerine güçlü bir uyarandır. Kalsiyumun etkilerinin kalsiyuma duyarlı reseptörler aracılığı ile olduğu düşünülmektedir. Birçok çalışmada böbrek yetmezliğinde görülen hiperplastik bezlerdeki kalsiyuma duyarlı reseptörlerin azalmış olduğu gösterilmiştir (70,71). Kalsitriol seviyesindeki azalmanın paratiroid anomalileri ile ilişkisi olduğu düşünülmektedir. Kalsitriol, PTH sekresyonunun ana düzenleyicilerindendir ve vitamin D reseptörü paratiroid bezlerinde de ekprese olmaktadır. Kalsitriol, PTH geninin transkripsiyon seviyesindeki etkisi sonucu PTH sekresyonunu in vivo ve in vitro azaltmaktadır (72). Kalsitriol farklı mekanizmalarla da PTH sekresyonunu azaltır. İntestinal kalsiyum absorbiyonunu arttırma yoluyla serum kalsiyumunun arttırılmasına ek olarak, vitamin D reseptöründeki artışlar, kalsiyuma-duyarlı reseptör ekspresyonundaki değişiklikler ve kalsiyumla düzenlenmiş PTH sekresyonunda azalma rol oynamaktadır. Böbrek hastalığında vitamin D reseptörünün hiperplastik paratiroid bezlerinde azaldığı (68) ve kalsitriol verilmesinin paratiroid bezindeki vitamin D ve kalsiyuma duyarlı reseptörlerin sayısında artışa neden olduğu gösterilmiştir (73). 4. PTH aktivitelerine iskelet direnci: PTH nın kalsemik aktivitelerine iskelet direnci olarak bilinen bu fenomenin hiperparatiroidizm, fosfor birikimi, kalsitriol seviyesindeki azalma, PTH reseptörlerinin baskılanması ve PTH parçacıklarının potansiyel aktiviteleri ile ilişkili olduğu çeşitli deneysel çalışmalarda gösterilmiştir (74,75). Kronik böbrek hastalığında düşük döngülü metabolik kemik hastalığı: Düşük döngülü metabolik kemik hastalığı düşük kemik yapım hızı ile karakterizedir. Bazı vakalarda bozulmuş kemik mineralizasyonu ile karakterize olan osteomalazi de görülmektedir. Osteomalazik lezyon, alüminyum birikimine ve daha az yaygınlıkta alüminyum-bazlı fosfor bağlayıcılarının kullanımına bağlı olarak gelişir. Adinamik kemik hastalığı sıklığı giderek artmaktadır ve patogenezi tam olarak bilinmemektedir (16). Kalsiyum içeren fosfor bağlayıcılarının veya etkin vitamin D sterollerinin yanında yüksek-diyalizat kalsiyum konsantrasyonlarının kullanımıyla meydana gelen göreceli bir hipoparatiroidizm durumu ile ilişkili olduğu ileri sürülmektedir. En önemli risk faktörü diyabet olmakla beraber ateroskleroz ve periton diyalizi de diğer risk faktörlerindendir Yaş da önemli bir faktör olup 11

birçok yaşlı hasta, postmenapozoal osteoporoz veya sistemik bir hastalıkla ilişkili osteopeni temelinde düşük kemik döngüsüne sahiptir. (76). Kronik Böbrek Hastalığında Metabolik Kemik Hastalığının Biyokimyasal Değerlendirmesi Renal osteodistrofi tanısında altın standart tetrasiklinle işaretli kemik biyopsisidir. Klinik pratikte kemik biyopsisi invaziv bir yöntem olmasından dolayı istisnai durumlarda kullanılmaktadır. Bu nedenle kemik ve mineral metabolizmasının biyokimyasal değerlendirmesi teşhis ve tedavi için önemlidir. Yaygın olarak kabul edilen klinik pratik rehberlere göre serum kalsiyum, fosfor ve ipth ölçümleri ile KBH da metabolik kemik hastalığı tanısı konularak tedavisi düzenlenir (76). Kemiğin osteoblastik ve osteoklastik aktivitesini gösteren birçok belirteç kullanılmıştır. Osteoblastik aktivitenin değerlendirilmesinde kemik alkalen fosfataz izoenzimi ve osteokalsin, osteoklastik aktivitenin ölçümü için ise tartarat dirençli asit fosfataz, kollajen yıkım ürünleri, kollajen tip I in serum C-terminal telopeptidi kullanılır. Ancak serum PTH ın kemik döngüsü için günümüzde kullanılabilecek en iyi gösterge olduğuna dair ortak görüş mevcuttur (77). Bazı çalışmalarda üremik kemik hastalığının tanısını koymak ve tiplerini belirlemek için ipth ile OPG (78), ipth ile kemik alkalen fosfataz (79) değeri ve ipth ın PTH fragmanına oranı (1-84/7-84) (80) kullanılmış olup daha güvenilir bir ayrım yapılabileceği bildirilmiştir. Ancak henüz kesin bir görüş birliği yoktur. KEMİK DOKU VE OSTEOPROTEGERİN/RANK/RANKL SİSTEM Kemik Biyolojisi Vücutta toplam kalsiyum ve fosfor depolarının çoğunluğu kemikte lokalizedir. Trabeküler (süngerimsi) kemik ağırlıklı olarak uzun kemiklerin epifizlerinde yer alır. Bu bölgenin %15-25 i kalsifiyedir ve kısa süren bir kalsiyum döngüsü oranına sahiptir. Buna karşın, kortikal (kompakt) kemik ise uzun kemiklerin gövdesinde yer almakta olup, %80- %90 ı kalsifiyedir. Kortikal kemik, esas olarak koruyucu ve mekanik bir fonksiyon gösterir. Aylarca süren bir kalsiyum döngü oranına sahiptir. Kemiğin %90 lık kısmını çapraz bağlara sahip tip I kollajen fibrilleri oluşturmaktadır. Kemiğin geri kalan kısmını ise proteoglikanlar ve osteopontin, osteokalsin, osteonektin ve alkalen fosfataz gibi non-kollajen proteinler oluşturmaktadır. Hidroksiapatit kristalleri (Ca 10 (PO4) 6 (OH) 2 ) ise kemiğin ana tuzudur (81). 12

Kemiğin hücresel komponentleri; kemik gelişiminde önemli rol oynayan kartilaj hücreleri, kemik şekillendirici hücreler olan osteoblastlar ve kemik yıkımını sağlayan hücreler olan osteoklastlardan oluşmaktadır. Osteoblastlar kemik iliğinde yerleşmiş progenitör mezenşimal hücrelerden köken alırlar. Progenitör mezenkimal hücreler sırasıyla osteoprogenitör hücrelere, endosteol ya da periosteol progenitör hücrelere ve en sonunda olgun osteoblastlara dönüşürler. Bu farklılaşma yolağının kontrolü erken dönemde kemik morfojenik proteinlerine, transkripsiyon faktörü çekirdek-bağlayıcı faktörü α 1 e (Cbfa1 ya da Runx2), çeşitli hormonlara ve sitokinlere bağlıdır. Kemik şekillenmesi tamamlandığında osteoblastlar ya apopitozise uğrarlar ya da osteosit şeklinde mineralize kemik ile birlikte hapsolmuş sessiz hücreler haline dönüşürler (81). Bu osteositler bir dizi kanalikülle birbirlerine bağlıdırlar. Önceleri osteositlerin önemlerinin az olduğu düşünülse de mekanik yüklenme ve mineralizasyon işaretleriyle ilişkili sinyalleri taşıdıkları açığa kavuşmuştur (82). Osteoklastlar hematopoetik öncü hücrelerden köken alırlar. Bu hücreler kemik dokuda yüksek derecede polarize hale gelen ve indirgenme enzimlerini salarak kemik yıkımına neden olan osteoklast olarak bilinen çok çekirdekli hücreleri oluşturmak amacıyla birleşirler. Osteoklast öncü hücrelerinin biraraya gelmesinin hızlanmasına PTH, sitokinler ve 1,25 (OH) 2 D vitamini önemli katkıda bulunur (81). Kemiğin yeniden şekillenmesi oldukça karışık olup 6 safhada meydana gelmektedir. (1) osteoblastların aktivasyonu (2) osteoklastlar ile kemiğin yıkımı (3) preosteoblast göçü ve farklılaşması (4) osteoblastın matrikse çökmesi (osteoid ya da mineralize olmamış kemik) (5) mineralizasyon (6) sessiz evre Herhangi bir zamanda, kemik yüzeyinin %15-20 si yeniden şekillenmeye uğramaktadır ve bu süreç 3 ila 6 ay sürmektedir (83). Yeniden şekillenme döngüsüne uğrayacak olan kemik parçasının nasıl seçildiği ise tam olarak anlaşılamamıştır. Osteoprotegerin-Reseptör Aktivatör Nükleer Kappa B ve Reseptör Aktivatör Nükleer Kappa B Ligand Sistemi Osteoprotegerin, RANK ve RANKL ın keşfi ve osteoklastojenezisteki rollerinin belirlenmesi kemik biyolojisinin anlaşılmasına çok önemli katkılar sağlamıştır (84). Rodan ve Martin (85) 1981 yılında, kemikte osteoklastların aktivasyonu ve düzenlenmesinin osteoblast 13

veya stromal hücreler tarafından üretilen bölgesel etkili faktörler aracılığıyla düzenlendiğini öne sürdü. Bundan 10 yıl sonra osteoklast uyarılmasının osteoblast hücre yüzeyi ile ilişkili olduğu gösterildi (86). Daha sonra da osteoklastogenezisin uyarılması için osteoklastlarla, osteoblast ve kemik iliği hücreleri arasında bağlantı olması gerektiği savunuldu (87). Daha sonra yapılan incelemelerde bu hücreler arası bağlantının, dolayısı ile osteoklastogenezisin düzenlenmesinin OPG/RANK/RANKL sistemi ile sağlandığı bulundu (88). RANKL preosteoklastların üzerindeki reseptörü RANK a bağlanarak, hücrelerin osteoklastlara dönüşmesini sağlar ve böylece kemik yıkımı gerçekleşir. Osteoprotegerin ise RANKL için yalancı reseptör görevi görür, kemik yıkımını baskılar. Kemik biyolojisinin anlaşılmasına sağladıkları bu temel bakış açısı dışında osteoprotegerin, RANK ve RANKL ın immün sistem, arteryel kalsifikasyon ve pek çok metabolik kemik hastalığı ile de ilgili olabilecekleri bildirilmektedir (84). Osteoprotegerin: Osteoprotegerin (OPG=TR-1=FDCR-1=OCIF=Osteoclast inhibitory factor) 1997 yılında birbirinden farklı iki grup tarafından bulunmuştur. Amgen grubu (88) tarafından sıçanların intestinal cdna sıralama projesi sırasında bulunmuş ve tümör nekroz faktörü reseptörleri (TNFR) süper ailesinin bir üyesi olduğu anlaşılmıştır. Snow Brand Milk grubu (89) ise osteoklast uyarıcı ve baskılayıcı faktörleri araştırırken insan embriyonik fibroblastlarından osteoklast baskılayıcı protein ayrıştırmışlardır. Kısa bir süre sonra cdna sıralaması yapıldığında osteoklast baskılayıcı proteinin OPG ile aynı olduğu görülmüştür (90). Osteoprotegerin başlangıçta 401 amino asit olarak sentezlenen bir polipeptiddir. 21 amino asitlik propeptid kısmı ayrıldıktan sonra 380 amino asitlik olgun protein oluşur. Hücre dışına 60 kda luk monomerik ve 120 kda luk disülfit bağı içeren homodimerik, çözünür bir glikoprotein olarak salgılanır. OPG, TNFR süper ailesinin bir üyesi olup ailenin diğer reseptörlerinden farklı olarak transmembran ve sitoplazmik kısımlar içermez. OPG yedi yapısal bölgeden oluşur. N- terminalinde TNFR-2 ve CD40 ile yakından ilişkili olan ve diğer TNFR ailesinin üyelerinin hücre dışındaki kısımlarının özelliklerine benzer özellik gösteren dört adet sisteinden zengin bölge vardır. OPG nin 1. ve 4. bölgeleri osteoklastojenezi inhibe edici aktiviteye sahiptir. Proteinin 5. ve 6. bölgelerinin bulunduğu C- terminalinde ölüm bölgeleri bulunmaktadır. Bu tip ölüm bölgeleri TNFR-1, DR3, CD95/Fas ve TNF ilişkili apoptozisi indükleyen ligand (TRAIL) gibi apoptozis mediyatörlerinin sitoplazmik bölgesinde bulunur. OPG nin 4., 5. ve 6. bölgelerinin apoptotik sinyalin iletimi ile ilişkili olduğu ve OPG nin TRAIL e bağlanarak TRAIL le indüklenen apoptozisi inhibe 14

edebileceği belirtilmiştir. TRAIL de OPG nin osteoklastogenezis üzerine olan inhibitor etkisini engelleyebilir. Proteinin 7. bölgesinde heparin bağlayan bir kısım bulunur. OPG bir transmembran proteoglikanı olan sindekan-1 e heparin bağlayan bölgesi aracığıyla heparin sülfat yan zincirleri ile bağlanarak hücre içine alınır ve en azından bir kısmı lizozomlar aracılığı ile yıkılır. OPG nin heparin bağlayan bölgesi, RANKL bağlayan bölgesinden uzaktadır ve RANKL bağlanması veya kemik yıkımını inhibe edici etkisi ile ilişkili değildir. RANKL/OPG kompleksinin yıkımının da sindekan-1 e bağlanması aracılığıyla olabileceği belirtilmiştir(91). OPG osteoklastların yaptığı kemik yıkımını baskılar. OPG nin kemik dokudaki biyolojik etkileri RANK/RANKL ın etkisi ile terstir. OPG, RANKL a bağlanarak bir tuzak reseptör gibi fonksiyon görür ve RANK a bağlanmasını engeller. Sonuç olarak osteoklast farklılaşması ve aktivasyonu inhibe olur ve RANKL kemik rezorpsiyonu oluşturamaz (Şekil 1) (88). Tuzak reseptör TGF-β östrojen BMPs sekresyon osteoblast öncü hücre osteoklast öncü hücre Farklılaşma ve aktivasyon farklılaşma ve aktivasyon inhibisyonu olgun osteoblast olgun osteoklast osteoklast apoptozisi Şekil 1. Osteoprotegerin aracılığıyla osteoklast apopitozisi (88) TGF-β: Transforming growth faktör beta, BMPs: Kemik morfojenik protein, OPG: Osteoprotegerin, RANK: Reseptör aktivatör nükleer kappa B, RANKL: Reseptör aktivatör nükleer kappa B ligand, PDGF: Platelet derived growth faktör, IGF-1: İnsülin benzeri büyüme faktörü 1 15

Otozomal resesif geçişli iki juvenil Paget hastasında, OPG nin 100 kilobazlık kısmında homozigot delesyon görülmüştür. Bu hastalarda kemik yıkımının artması, osteopeni ve kırıklar bulunması OPG nin insanlarda da kemik koruyucu rolü olduğunu göstermektedir (92). OPG nin üçüncü ekzonunda inaktive edici delesyonun belirlendiği otozomal resesif geçişli bir kemik hastalığı olan idiopatik hipofosfatazyada görülen uzun kemiklerde deformiteler, kifozis ve artmış kemik yapım-yıkım hızı da insanlarda OPG nin kemik metabolizması ile ilgili önemli rolü olduğunu göstermektedir (93). OPG, osteoblastlar dışında kardiyovasküler sistem, böbrek, karaciğer, dalak, beyin, akciğer, kemik iliği gibi pek çok dokuda ve hematopoetik, immün hücreler tarafından sentezlenir (91). Salgılanması pek çok sitokin, peptid, hormon ve ilaç tarafından düzenlenir. Transforme edici büyüme faktörü-α ve β, interlökin (IL)-1α, IL-18, kemik morfojenik proteinleri ve OPG mrna seviyelerini artıran 17β-östradiol bunlardan birkaçıdır (94). Kemik yıkımını arttırdığı bilinen glukokortikoidler, osteoporoz ve vasküler hastalık oluşturma eğilimi olan siklosporin A, paratiroid hormon, prostaglandin E2 ve fibroblast büyüme faktörü-2 ise OPG sentezini inhibe ederler (95,96). OPG nin sentezi aynı zamanda osteoblastlarda osteoblastik kemik oluşumunu da düzenleyen Wnt/β-katenin sinyali ile de düzenlenmektedir (97). Kemik iliği hücrelerinin sentezlediği OPG nin yaşla azaldığı görülmüştür (98). Kemik yüzeyine uygulanan gerilme kuvveti ise OPG mrna sentezini artırır (99). Bunlar senil osteoporoz ve immobilizasyona bağlı kemik kaybı durumunda OPG nin önemli bir aracı olduğunu göstermektedir. Renal osteodistrofi, romatoid artrit, primer bilier siroz, kemik metastazı olan prostat kanseri, Cushing ve HIV hastalarında OPG seviyelerinde artma, litik kemik lezyonu olan multipl miyelom hastalarında ise OPG seviyelerinde azalma tespit edilmiştir (100). Reseptör aktivatör nükleer kappa B ligand: Kemik kütlesi osteoblast ve osteoklastların birlikte çalışması ile belirlenir. Osteoblastlarda bunu belirleyen temel iki yolak ise RANKL/RANK ve Wnt/β-katenin sistemidir (97). Normal ve patolojik durumlarda kemik yıkımının anahtar mediyatörü olan RANKL, TNF ligand ailesinin bir üyesidir. 40-45 kda luk membrana bağlı hücresel ve 32 kda luk biyolojik olarak aktif, çözünür iki formdan oluşmuş 317 amino asitlik bir peptiddir. Lenf nodları, timus ve akciğerde daha fazla olmak üzere dalak ve kemik iliği gibi dokularda ve osteoblastlarda sentezlenir. RANKL sentezi transkripsiyonel, translasyonel ve posttraslasyonel seviyelerde hormonlar (1,25 (OH) 2 D vitamini), büyüme faktörleri ve peptidler (TGF-β1, fibroblast büyüme faktörü-2 ve PTH ilişkili protein gibi), sitokinler (IL-1β, IL-6, IL-11 ve TNFα gibi) ve glukokortikoidler gibi pek çok faktör 16

tarafından düzenlenir. Osteoblast/stromal hücrelerde RANKL sentezlenmesi, osteoklast oluşumu ve aktivasyonunu uyaran pek çok faktör ile uyarılır. RANKL; öncül ve olgun osteoklastlar, uyarılmış T ve dendritik hücrelerin yüzeyinde bulunan kendine ait reseptörü RANK a bağlanarak bu hücreleri uyarır (Şekil 2) (101). Mezenkimal stromal kök hücre osteoblast öncü hücre osteoklast öncü hücre Hematopoetik kök hücre Farklılaşma ve aktivasyon Olgun osteoklast Şekil 2. Olgun osteoklast oluşum aşamaları (100) OPG: Osteoprotegerin, RANK: Reseptör aktivatör nükleer kappa B, RANKL: Reseptör aktivatör nükleer kappa B ligand, PGE2: Prostaglandin E2, PTH: Paratiroid hormon, TNF-α: Tümör nekrozis faktör α, IL: İnterlökin, 1,25(OH) 2 D 3 : 1,25 dihidroksi vitamin D, M-CSF: Makrofaj-koloni uyarıcı faktör, C-fms: Koloni-uyarıcı faktör 1 reseptör Reseptör aktivatör nükleer kappa B ligandın kemikteki ana görevi osteoklast oluşumunu uyararak ve apoptozun baskılanmasını sağlayarak kemik kaybı ve yıkımını arttırmaktır. Osteoblastlar yanında T hücrelerinden de artmış miktarda RANKL salgılanması artrit ve diğer inflamatuar hastalıklara bağlı kemik kaybında RANKL ın rol oynayabileceğini düşündürmektedir (102,103). Fakat T hücrelerinden salgılanan RANKL, uyarılmış osteoklastlardan c-fos yolu ile kendi salınımını olumsuz etkileyen interferon-β üretimini artırır (104). RANKL ın osteoporotik etkisi yanında immün sistem üzerinde de önemli etkileri vardır (84). Farede meme bezi gelişimi ve laktasyon için gerekli olduğu belirtilmiştir (105). Bazı malign tümör hücrelerinin RANKL yanında RANK da sentezlemesi, tümör hücrelerinin çoğalmasında rol oynayabileceklerini düşündürmektedir (106). Kemik metastazlarının patogenezinde RANKL çeşitli noktalarda etkilidir. RANKL seviyelerindeki artmaya bağlı gelişen artmış kemik yıkımı, tümör hücrelerinin bölünme ve yaşam sürelerini hızlandıran büyüme faktörlerinin salgılanmasına sebep olur (107). Ayrıca, RANKL ın kemiğe metastaz 17

yapan belirli kanser hücreleri için kemoatraktan olduğu ve kemik metastazlarında damarlanmayı uyardığı bildirilmektedir (107,108). OPG/RANKL oranının kemik kütlesini belirleyen esas faktör olduğu belirtilmiştir. Osteoblastlar sentezledikleri RANKL miktarını değiştirebilirler ve RANKL sentezini indükleyen pek çok faktör osteoblastlarda OPG sentezini de düzenler. Genellikle RANKL seviyesindeki artma OPG seviyesindeki azalma ile birliktedir. OPG/RANKL oranını azaltan glukokortikoidler, fibroblast büyüme faktörü-2, PTH (OPG sentezini inhibe ederken RANKL sentezini artırırlar), IL-1β, IL-4, IL-6, IL-11, IL- 17 ve TNFα gibi bazı sitokinler (RANKL sentezini artırır), prostaglandin E2, pek çok mezenkimal transkripsiyon faktörü (cbfa-1, PPAR-gamma) ve 1,25-dihidroksi vitamin D3 gibi pek çok faktör kemik yıkımına sebep olurken, RANKL/OPG oranını artıran östrojen (osteoblastik hücrelerde OPG sentezini artırırken RANKL sentezini inhibe eder) ve TGF-β (OPG sentezini artırır) antirezorptif etki gösterir (84). Reseptör aktivatör nükleer kappa B: Hücre dışı kısmı 28 amino asitlik sinyal peptid olan RANK, 21 amino asitlik kısa transmembran ve geniş sitoplazmik kısımları ile toplam 616 amino asitlik bir transmembran proteinidir (109). Preosteoklastlara RANKL ın bağlanmasını sağlayan tek reseptördür. Osteoklastogenez ve kalsiyum metabolizmasını kontrol eden bu reseptörün; makrofaj/monositik hücreler, T ve B lenfositleri, fibroblastlar, dendritik hücreler, öncül ve olgun osteoklastların yüzeyinde bulunduğu belirlenmiştir (110). RANK protein sentezi meme bezi ve kemik metastazı potansiyeli yüksek iki kanser türü olan meme ve prostat kanserini de kapsayan bazı kanser hücrelerinde de gösterilmiştir (105,106,111). İnsanlarda, günümüze kadar RANKL geninde konjenital hastalığa sebep olan ve RANK delesyonu veya baskılanmasına yol açan mutasyonlar belirlenememiştir (84). Fakat RANK ın aktivasyonu veya OPG nin inhibisyonu yolu ile RANK sinyalinin artmasıyla sonuçlanan RANK ve OPG genindeki mutasyonlar sırası ile ailesel ekspansil osteoliz (112) ve ailesel Paget hastalığında saptanmıştır (92). Ayrca, ailesel Paget hastalığına sahip bazı hastalarda da RANK geninde aktive edici mutasyon saptanması ve bunun RANK aracılığıyla NF-κB sinyalinde artışa ve sonuç olarak osteolize yol açması bu sistemin insanlarda da önemini göstermektedir (112). RANKL ın RANK a bağlanması ile en az yedi hücre içi sinyal yolağı uyarılır. Bunlardan dördü (NF-κB-inhibitörü/NF-κB, c-jun aminoterminal kinaz/aktivatör protein-1, c-myc ve kalsinörin/uyarılmış T hücrelerinin nükleer faktörü c1) doğrudan osteoklastojeneze aracılık eder. Diğer üçü ise osteoklast aktivasyonuna (src ve MKK6/p38/MITF) ve canlılığını sürdürmesine (src ve hücre dışı sinyal-düzenleyici kinaz) 18

aracılık eder (113). RANKL, RANK a bağlandıktan sonra oluşacak sinyallerden ilki TNFR ilişkili faktör (TRAF) lerin RANK ın sitoplazmik kısmındaki kendine özgü bölüme bağlanmasıdır (114). TRAF2, TRAF5 ve TRAF6 hepsi RANK a bağlanmasına rağmen bunlardan sadece TRAF6 nın osteoklastlar için önemli olduğu anlaşılmıştır. Çünkü, sadece TRAF6 nakavt farede osteopetrozis gelişmektedir. TRAF lar aracılığıyla uyarının iletimi için pek çok adaptör molekül RANK a bağlanır. Bunların arasında adaptör moleküller ailesinin bir üyesi olan Grb-2 ilişkili bağlayıcı protein-2, tirozin kalıntılarından fosforlanarak Src homolog-2 bölgelerini de içeren pek çok sinyal molekülünü uyarır. Grb-2 ilişkili bağlayıcı protein-2 nin kaybı osteoklast farklılaşması, kemik rezorpsiyonunun azalması ve sonuçta ciddi osteopetrozis ile sonuçlanır. Bu durum, Grb-2 ilişkili bağlayıcı protein-2 nin RANKL ile uyarılan osteoklastojenezde önemli bir rol oynadığını göstermektedir. RANKL/RANK kompleksi hücre içine alınarak lizozomlarda yıkılır (115). 19

GEREÇ VE YÖNTEMLER Bu çalışma, Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi İç Hastalıkları Anabilim Dalı Endokrinoloji ve Metabolizma Hastalıkları Bilim Dalı ve Nefroloji Bilim Dalı ile Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Merkez Laboratuvar ında (Hematoloji, Biyokimya ve Nükleer Tıp laboratuvarlarında) 2008-2009 yılları arasında uygulandı. Çalışma öncesinde, 08/02/2008 tarihli, TÜTFEK 2008/12 protokol kodlu Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik Kurulu onayı alındı ve çalışma Trakya Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri tarafından 2008/75 nolu araştırma projesi olarak desteklendi (Ek 1). Çalışma, Helsinki Deklerasyon Kararları na uygun olarak yürütüldü ve hastalara sağlıklı kontrol grubuna bilgilendirilmiş gönüllü olur formu imzalatıldı (Ek 2). Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi İç Hastalıkları Ana Bilim Dalı Endokrinoloji ve Metabolizma Hastalıkları Bilim Dalı ve Nefroloji Bilim Dalı nda Amerikan Diyabet Cemiyeti (ADA) kriterlerine uygun olarak tip 2 DM tanısı alan hastalar belirlendi. ADA kriterlerine göre, 75 gr oral glukoz tolerans testinde 2. saat glukoz değerinin 200mg/dl olması veya poliüri, polidipsi, glukozüri, ketonüri, açıklanamayan kilo kaybı (polifajinin eşlik ettiği veya etmediği) ve bulanık görme gibi hiperglisemik semptomların varlığında herhangi bir zamanda bakılan plazma glukoz düzeyinin 200 mg/dl bulunması DM olarak tanımlanmaktadır. Ayrıca, 8 saat açlıktan sonra ölçülen sabah kan glukozunun 126 mg/dl olması da tanı için yeterlidir (19). Tip 2 DM tanısı alan hastalar öykü, fizik muayene, laboratuvar değerlendirmesi, oftalmolojik muayene ile Mogensen sınıflamasına uygun olarak diyabet evrelerine göre sınıflandırıldı ve Evre III-V diyabetik nefropati olarak belirlenen hastalar çalışmaya dahil edildi (21). 20

HASTALARIN ÇALIŞMAYA ALINMA KRİTERLERİ 1.ADA kriterlerine göre Tip 2 DM tanısıyla takip edilen, 40-70 yaş arasında olanlar, 2.Öykü, fizik muayene, laboratuvar değerlendirmesi, oftalmolojik muayene sonuçlarına göre evre III, evre IV ve diyaliz tedavisi uygulanmayan evre V diyabetik nefropatili olgular, 3.D vitamini ve aktif metabolitleri, nonsteroid antiinflamatuar ilaçlar, antikoagülanlar, antiepileptikler, östrojen, androjen ve kalsiyum tuzları kullanmayanlar, 4.Gebelik ve emzirme döneminde olmayanlar çalışmaya dahil edildi. ÇALIŞMA PROTOKOLÜ Çalışma kriterlerine uygun olduğu saptanan ve çalışmaya katılmayı kabul eden hastaların ve sağlıklı kontrol grubunun kilo ve boyları ölçülerek kg/m 2 cinsinden vücut kitle indeksi (VKİ) ve m 2 cinsinden vücut yüzey alanı (VYA) hesaplandı. Bir gece açlık sonrası sabah saat 08:00 da antekubital bölgeden turnike kullanmadan 5cc kan alınarak biyokimya tüplerine konuldu. Alınan kan 10 dakika 2500 devirde santrifüj edilip -80 ºC de derin dondurucuda saklandı. Toplanan 24 saatlik idrar volümü kaydedildi ve 3000 devirde 5 dakika santrifüj edilerek süpernatantlar 2 ml lik ependorfa konularak -80 ºC de derin dondurucuda saklandı. Endojenik kreatinin kullanılarak aşağıdaki formülle GFR bulundu ve bu değer VYA ya göre ml/dk/1.73m 2 olarak hesaplandı. GFR (ml/dakika) = U Cr x 24 saatlik idrar hacmi P Cr x 24 x 60 dakika U Cr : idrardaki kreatinin derişimi P Cr : plazmadaki kreatinin derişimi Düzeltilmiş GFR (ml/dakika/1,73m 2 ) = GFR x 1,73 VYA(m 2 ) Günlük idrarda, mg cinsinden protein (UPA), mg cinsinden albumin (UAA) atılımları hesaplandı. 21

HASTA GRUPLARI Evre III Diyabetik Nefropati Grubu Amerikan Diyabet Cemiyeti kriterlerine (19) uygun olarak tip 2 DM tanısı konulmuş ve öykü, fizik muayene, laboratuar değerlendirmesi, oftalmolojik muayene ile diyabetik retinopati bulgusu saptanmış ve idrarla albumin atılımı 30-300 mg/gün olan, yaşları 42 ile 68 arasında değişen, 9 u kadın, 12 si erkek toplam 21 hastadan oluştu. Evre IV Diyabetik Nefropati Grubu Amerikan Diyabet Cemiyeti kriterlerine (19) uygun olarak tip 2 DM tanısı konulmuş ve öykü, fizik muayene, laboratuar değerlendirmesi, oftalmolojik muayene ile diyabetik retinopati bulgusu saptanmış ve günde 300 mg ı aşan albuminüri ve 500 mg ı aşan proteinürisi olan, yaşları 41 ile 68 arasında değişen, 8 i kadın, 12 si erkek toplam 20 hastadan oluştu. Evre V Diyabetik Nefropati Grubu Amerikan Diyabet Cemiyeti kriterlerine (19) uygun olarak tip 2 DM tanısı konulmuş ve öykü, fizik muayene, laboratuar değerlendirmesi, oftalmolojik muayene ile diyabetik retinopati bulgusu saptanmış ve son dönem böbrek yetmezliği (GFR<15 ml/dk/1,73m 2 ) olan, yaşları 44 ile 67 arasında değişen, 12 si kadın, 8 i erkek toplam 20 hastadan oluştu. Glomeruler Filtrasyon Hızı Değerine Göre Hasta Grupları Kronik böbrek hastalığının ilerlemesi ile birlikte meydana gelen kemik metabolizmasındaki değişiklikleri incelemek için diyabetik nefropatili olgular GFR değeri 60 ml/dk/1,73m 2 ve altında, 60 ml/dk/1,73m 2 üstünde değerlere sahip olan iki gruba ayrıldı. GFR değeri 60 ml/dk/1,73m 2 ve altında olan grupta 22 si kadın, 16 sı erkek olmak üzere toplam 38, GFR değeri 60 ml/dk/1,73m 2 üzerinde olan grupta 7 si kadın, 16 sı erkek olmak üzere toplam 23 hasta yer aldı. Kontrol Grubu 44-69 yaşları arasında, akut veya kronik hastalığı olmayan, D vitamini ve aktif metabolitleri, nonsteroid antiinflamatuar ilaçlar, antikoagülanlar, antiepileptikler, östrojen, androjen ve kalsiyum tuzları dahil olmak üzere herhangi bir nedenle ilaç kullanmayan, gebelik ve emzirme döneminde olmayan 11 i kadın, 9 u erkek toplam 20 sağlıklı bireyden oluşturuldu. 22