T.C. ERCİYES ÜNİVERSİTESİ ECZACILIK FAKÜLTESİ ANJİOJENESİS VE ANTİ-ANJİOJENESİS BİLEŞİKLER. Hazırlayan Meryem TAŞCI

1 T.C. ERCİYES ÜNİVERSİTESİ ECZACILIK FAKÜLTESİ ANJİOJENESİS VE ANTİ-ANJİOJENESİS BİLEŞİKLER Hazırlayan Meryem TAŞCI Danışman Yrd. Doç. Dr. M. Orhan PÜSKÜLLÜ Farmasötik Kimya Anabilim Dalı Bitirme Ödevi MAYIS 2012 KAYSERİ

i T.C. ERCİYES ÜNİVERSİTESİ ECZACILIK FAKÜLTESİ ANJİOJENESİS VE ANTİ-ANJİOJENESİS BİLEŞİKLER Hazırlayan Meryem TAŞCI Danışman Yrd. Doç. Dr. M. Orhan PÜSKÜLLÜ Farmasötik Kimya Anabilim Dalı Bitirme Ödevi MAYIS 2012 KAYSERİ

ii BİLİMSEL ETİĞE UYGUNLUK Bu çalışmadaki tüm bilgilerin, akademik ve etik kurallara uygun bir şekilde elde edildiğini beyan ederim. Aynı zamanda bu kurallar ve davranışların gerektirdiği gibi, bu çalışmanın özünde olmayan tüm materyal ve sonuçları tam olarak aktardığımı ve referans gösterdiğimi belirtirim. Meryem TAŞCI

iii Anjiojenesis ve Anti-Anjiojenesis Bileşikler adlı Bitirme Ödevi, Erciyes Üniversitesi Lisansüstü Tez Önerisi ve Tez Yazma Yönergesi ne uygun olarak hazırlanmış ve Farmasötik Kimya Anabilim Dalı nda BİTİRME ÖDEVİ olarak kabul edilmiştir. Tezi Hazırlayan Meryem TAŞCI Danışman Yrd. Doç. Dr. M. Orhan PÜSKÜLLÜ Farmasötik Kimya Anabilim Dalı Başkanı Yrd. Doç. Dr. M. Orhan PÜSKÜLLÜ ONAY Bu tezin kabulü Eczacılık Fakültesi Dekanlığı nın.././. tarih ve../ sayılı kararı ile onaylanmıştır.././.. Müberra KOŞAR Dekan

iv TEŞEKKÜRLER Tez konumu belirleyen, çalışmalarım süresince her türlü konuda bilgi ve tecrübelerini benimle paylaşan, yardımını, desteğini hiçbir zaman esirgemeyen Sayın Hocam M. Orhan PÜSKÜLLÜ ye, Eczacılık Fakültesine girdiğim andan itibaren bütün bilgi ve deneyimlerini benimle paylaşan ve verdikleri her türlü emek için BÜTÜN HOCALARIMA, Büyük fedakarlıklar göstererek bugünlere gelmemi sağlayan, sevgi ve desteğini hiçbir zaman eksik etmeyen, maddi ve manevi destekleriyle her zaman yanımda olan CANIM ANNEME, BABAMA ve KARDEŞİME, İçtenlikle teşekkür ederim.

v ANJİOJENESİS VE ANTİ-ANJİOJENESİS BİLEŞİKLER Meryem TAŞCI Erciyes Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi Farmasötik Kimya Anabilim Dalı Bitirme Ödevi, Mayıs 2012 Danışman: Yrd. Doç. Dr. M. Orhan PÜSKÜLLÜ ÖZET Anjiojenesis, yeni kapiller oluşumu ile seyreden biyolojik bir süreçtir ve bazı fizyolojik ve patolojik durumlarda ortaya çıkmaktadır. Anjiojenesis pozitif ve negatif düzenleyici aktiviteye sahip moleküller arasındaki net dengeyle kontrol edilir.anjiojenesis oluşturabilme yeteneği muhtemelen tüm dokularda vardır. Anjiojenesis; kadın üreme siklusu, doku tamiri ve yara iyileşmesi dışında yetişkin organizmalarda sıkı kontrol altındadır. Patolojik anjiojenesis ise tümör büyüme ve metastazında, gelişimsel ve iskemik hastalıklarda oluşur. Özellikle tümör hücrelerinde ekstraselüler matriks çok hızlı değişmekte iken sağlıklı hücrelerde ekstraselüler matriks son derece yavaş yapısal değişikliğe uğradığı bilinmektedir. Hipoksi ve henüz tam olarak belirlenmemiş bazı uyaranlar, tümör hücrelerini, enflamasyonda rol alan hücreler ve bağ dokusu hücrelerini uyararak anjiojenesis özelliğini taşıyan bir takım moleküllerin (VEGF, FGF, TGF, PDGF gibi) oluşumuna rol açarlar. Günümüzde mevcut ilaçlar ve kombinasyonları ile kanser kemoterapisi yetersiz kalmakta ve birçok kanser türünde tedavi sağlamamaktadır. Anjiojenesis, kanser önleyici ilaç geliştirme araştırmaları için heyecan ve umut verici alandır. Bu yaklaşım, kanser tedavisinin gelişmesi, yeni hedeflerin ve yaklaşımların çoğalması için yeni bir kapı açmıştır. Bu çalışmada, kanser ile anjiojenesis arasındaki ilişki ve anjiojenesisi önleyen ilaçlar üzerinde durulmuştur. Anahtar Kelimeler: Anjiojenesis, Kanser, Anjiojenesis İnhibitörleri

vi ANGİOGENESİS AND ANTİANGİOGENESİS COMPOUNDS Meryem TAŞCI Erciyes University, Pharmacy Faculty Department of Pharmaceutical Chemistry Final Project, Mayıs 2012 Advisor: Yrd. Doç. Dr. M. Orhan PÜSKÜLLÜ ABSTRACT Angiogenesis is a biological process by which new capillaries are formed and it occurs in some physiological and pathological conditions. Angiogenesis is controlled by the net balance between molecules that have positive and negative regulatory activity. The ability to mount an angiogenic response is probably present in all tissues. It is only induced during the female reproductive cycle, tissue repair and wound healing. Pathological angiogenesis occurs in association with tumor growth and metastasis, developmental disorders and ischemic diseases. In particular, the association of the tumor angiogenesis with the extracellular matrix has been investigated due to the slow structural change in the extracellular matrix of healthy cells unlike the rapid alterations in those of tumor cells. Hypoxia and some other stimuli not well defined, drive tumor, inflammotory and connective tissue cells to generate angiogenic molecules such as VEGF, FGF, TGF-beta, PDGF and others. In present, the chemotherapy with drugs and drug combinations are inefficent and there are no efficent therapy for many type of cancer. Angiogenesis is an exiting and promising area of anti-cancer research. This concept has opened the door to a multitude of new approaches and targets for developing anti- cancer. The relationship between cancer and angiogenesis and the new drugs for inhibition of angiogenesis werw discussed within this rewiew. Keywords: Angiogenesis, Cancer, Angiogenesis inhibitors

vii İÇİNDEKİLER İÇ KAPAK... i BİLİMSEL ETİĞE UYGUNLUK... ii KABUL ONAY... iii TEŞEKKÜRLER... iv ÖZET... v ABSTRACT... vi İÇİNDEKİLER... vii TABLOLAR VE ŞEKİLLER LİSTESİ... ix KISALTMALAR... x 1. GİRİŞ VE AMAÇ... 1 2. GENEL BİLGİLER... 2 2.1.ANJİOJENESİS... 2 2.1.1. Bazal Membranın Proteolitik Enzimler Tarafından Yıkılması... 3 2.1.2. Endotel Hücrelerde Göçme ve Çoğalma... 4 2.1.3. Kapiller Oluşumu ve Damar Olgunlaşması... 4 2.2. TÜMÖR VE ANJİOJENESİS... 5 2.2.1. Mevcut Yöntemlere Rağmen Yeni Yöntemler Aranmasının Nedenleri... 8 2.3. ANJİOJENESİSİ UYARAN VE ÖNLEYEN FAKTÖRLER... 9 2.3.1. Anjiojenesis Aktivatörleri... 10 2.3.1.1. Vasküler Endotelial Büyüme Faktörü (VEGF)... 10 2.3.1.2. Epidermal Büyüme Faktörü (EGF)... 11 2.3.1.3. Fibroblast Büyüme Faktörü (FGF)... 11 2.3.1.4. Trombosit Kaynaklı Büyüme Faktörü (PDGF)... 11 2.3.1.5. Transforme Edici Büyüme Faktörü-β (TGF-β)... 11 2.3.1.6. Tümör Nekroz Faktörü α (TNF-α)... 12 2.3.1.7. Hepatosit Büyüme Faktörü (HGF)... 13

viii 2.3.2. Anjiojenesis İnhibitörleri... 14 2.3.2.1 Anjiojenik faktörlerin inhibisyonu... 15 2.3.2.2. Doğal anti-anjiojenik faktörler... 19 2.3.2.3. Endotel hücrelerinin inaktivasyonu... 22 2.3.2.4. Ekstraselüler matriksi hedef alan tedaviler... 28 2.4. DİĞER SENTETİK ANJİOJENESİS İNHİBİTÖRLERİ... 31 2.4.1. Minosiklin... 31 2.4.2. Östrojen metabolitleri... 31 2.4.3. Medroksiprogesteron... 32 2.4.4. Heparin ve Kortizon... 32 2.4.5. Penisilamin... 33 2.4.6. Roksitromisin ve Klaritromisin... 33 2.5. ANTİ-ANJİOJENİK ETKİYE SAHİP BAZI FONKSİYONEL BESİNLER... 35 2.5.1. Taxol (Paclitaxel)... 35 2.5.2. Red grapes... 35 2.5.3. Salvia mitiorrhiza... 36 2.5.4. Sinomenium acutum... 36 2.5.5. Camellia sinensis... 37 2.5.6. Ganoderma lucidum... 37 2.5.7. Cordyceps militaris... 37 2.5.8. Triptergium wilfordii... 38 2.5.9. Vinca rosea... 38 2.5.10. Soybeans... 38 2.5.11. Camptotheca acuminata... 39 3. TARTIŞMA VE SONUÇ... 41 KAYNAKLAR... 43 ÖZGEÇMİŞ... 51

ix TABLOLAR VE ŞEKİLLER LİSTESİ Şekil 1. Anjiojenesis Oluşumu... 2 Şekil 2. Normal Doku Onarımı ve Tümörde Anjiojenesisi Uyaran Ortak Yollar... 5 Tablo 1. Anjiojenik Faktörler ve Anjiojenesisi Uyaran Faktörler... 9

x KISALTMALAR afgf bfgf EC ECGH ECM EGF GCSF HA HGF HIF-1 IGF-1 IL MMP PDGF PGF TGF-α TGF-β TNF-α TSP-1 TSP-2 VEGF :Asit fibroblast büyüme faktör : Ana fibroblast büyüme faktör : Endotel hücre : Epigallokateşin galat : Ekstraselüler matriks : Epidermal büyüme faktör : Granülosit koloni uyaran faktör : Hiyaluronik asit : Hepatosit büyüme faktör : Hipoksi indükleyici faktörü : İnsülin benzeri büyüme faktörü : İnterlökin : Matriks Metallo Proteaz : Trombosit kaynaklı büyüme faktör : Plasental büyüme faktör : Transforme edici büyüme faktör-α : Transforme edici büyüme faktör-β : Tümör nekroz faktör-α : Trombospondin-1 : Trombospondin-2 : Vasküler endotelial büyüme fakörü

1 1. GİRİŞ VE AMAÇ Kanser, hücrelerin kontrolsüz bir şekilde çoğalması ile karakterize edilen, sonucu bazı türler için maalesef ölümle biten ve bu nedenle de tedavisi için en çok araştırma yapılan ve çok çeşitli yöntemler denenen bir hastalıktır (1). Gelişmiş ülke insanlarının da en önemli sağlık sorunlarının başında kanser ve kanserin tedavisi gelmektedir. Örneğin, Amerikan halkının yaklaşık % 25'inin yaşamları boyunca bir kez herhangi bir kanser tanısıyla karşılaşacakları düşünülmektedir. Dünyada her yıl bir milyon yeni kanser vakası teşhis edilmektedir. Bu hastaların % 25'ten azı tek başına cerrahi ve/veya radyoterapi ile tedavi edilebilmektedir. Geriye kalan hastaların büyük bir bölümüne hastalığın herhangi bir evresinde kemoterapi uygulanmaktadır. Günümüzde kanser hastalarının belli bir bölümünde kanserin tipine de bağlı olmak üzere kemoterapi ile tam tedavi veya uzun bir iyileşme dönemi (remisyon) sağlanabilmektedir. Günümüzde, tek başına cerrahi veya radyasyonla tedavi başarısı % 20 iken, kemoterapi ile tedavi başarısı % 75'lere kadar çıkmıştır. Ancak bütün bu gelişmelere karşın, kardiyovasküler sisteme ait hastalıklardan sonra kanser, hala ölümlerin en sık ikinci nedenidir. Genellikle tümörlerin büyüme hızı erken dönemde yüksektir. Ancak büyümeye devam ettikçe beslenmesini ve oksijen ihtiyacını karşılayacak olan damarsal yapılar aynı hızla gelişmediğinden tümörün büyüme hızı giderek yavaşlar. Bu şekilde malign tümörlerin hem büyüme hızını ve hem de varlıklarını sürdürmelerini sağlayan damarların oluşumunun önlenmesi ve hatta ortadan kaldırılması, son zamanlarda kanser tedavisinde yeni bir yaklaşım olarak anjiojenesis'i ve anti-anjiojenik ilaçların geliştirilmesini gündeme getirmiştir (2). Bu çalışmada, kanser ile anjioojenesis arasındaki ilişki ve anjiojenesisi önleyen ilaçlar üzerinde durulmuştur.

2 2. GENEL BİLGİLER 2.1.ANJİOJENESİS Anjiojenesis; ekstraselüler matriks, çözünme faktörü ve hücreler arasındaki etkileşim sonucu; endoteliyal hücrelerin farklılaşması, göçü ve çoğalması ile seyreden kompleks bir işlemdir (3, 4). İnsanların hayatlarını sürdürebilmeleri; besin ve oksijenin organ ve dokulara taşınmasını bunun yanında dokulardan artık maddelerin uzaklaştırılmasını sağlayan kompleks yapıdaki damar ağına bağlıdır. Damarsal yapının oluştuğu ilk evreye vaskulojenesis denmektedir. Anjiojenesis (Şekil 1) ise damarların oluşmasından önceki evrede endotel hücrelerinin kümelenmesi ile oluşan kapillerlerin dallanması ve genişlemesi ve küçük damarların büyüyüp filizlenmesidir. Kısaca anjiojenesis, yeni damar ağı gelişimi olarak tanımlanmaktadır (5). Şekil 1. Anjiojenesis Oluşumu Anjiojenesis, vücutta doğal olarak ortaya çıkan bir süreç olup, bazı durumlarda patolojik de olabilir. Fizyolojik anjiojenesis; yara iyileşmesi, menstrüel siklus, anne rahmindeki çocuğun gelişimi ve büyümesi ve vasküler endotelial hücrelerin bölünmesi esnasında görülür (6). Patolojik anjiojenesis ise başta tümörler olmak üzere çeşitli kanserlerde, inflamatuar hastalıklarda (artrit, kronik inflamasyon, inflamatuar bağırsak hastalıkları, psöriazis gibi), göz hastalıklarında (proliferatif retinopati), aterosklerozda ve obezitede ortaya çıkmaktadır. Gecikmiş yara iyileşmesinde, koroner arter hastalıklarında, felçte, tek birleşme yeri olmayan kırıklarda, doku ölümü riskine neden olan kan damarlarının

3 büyümesinin yetersizliği, alopecia ve saç kaybı gibi durumlarda yetersiz anjiojenesis söz konusudur. Yetersiz anjiojenesise ise anjiojenesis büyüme faktörlerinin yetersiz üretimi veya anjiojenesis inhibitörlerinin aşırı miktarı neden olur (5, 6). Ekstraselüler matriks ve matriksi çevreleyen hücrelerden salınan pek çok büyüme faktörü, sitokinler ve bunların reseptörleri anjiojenesiste temel rol oynar. Damar endotelini oluşturan endotel hücreleri, anjiojenesis süreci içinde yer alan temel hücrelerdir. Perisitler ile birlikte kapiller damar duvarlarını oluştururlar ve ana damarları; dalları ve kapiller ağı oluşturucu genetik bilgileri içerir. Bu hücreler ortalama 3 yılda bir bölünür (7). Normal koşullarda anjiojenesis, çevresel ve genetik değişimlerin etkisinde olup, endotel hücrelerin proliferasyonu ve aktivasyonunu sağlayan faktörler ile buna karşı gelen antianjiojenik faktörler arasında oluşan bir denge ile sağlanır. Fizyolojik neovaskülarizasyon kendi kendini sınırlayan bir olay olmasına rağmen patolojik anjiojenesis uzun süre devam eder. Anjiojenesis, birçok neoplastik ve non-neoplastik hastalığın ilerlemesinden ve etiyopatojenizden; özellikle solid tümörlerin büyüme ve metastaz yapmasından sorumlu tutulmaktadır. Tümörde hipervaskülarizasyonun başlangıçtaki bir inflamatuar olaya cevap veya tümörün nekrotik ürünlerine bağlı olabileceği ileri sürülmektedir (8). Anjiyojenesis oldukça karmaşık bir mekanizma ile gerçekleşen çok basamaklı bir süreçtir. Bu basamaklar: 1. Bazal membranın proteolitik enzimler tarafından yıkılması 2. Endotel hücre aktivasyonu, proliferasyonu ve göçü 3. Tübül oluşumu ve olgunlaşma, damar stabilizasyonu ve ekstrasellüler matriksin yeniden şekillenmesi olarak sıralanabilir (10). 2.1.1. Bazal Membranın Proteolitik Enzimler Tarafından Yıkılması Anjiojenesis süreci damar endotelini döşeyen kollajen, laminin gibi glikoproteinlerden ve heparin sülfat gibi proteoglikanlardan oluşan bazal membranın proteolitik yıkımı ile başlar (9). Endotel hücreleri göç etmek ve çoğalmak üzere uyarıldığında membran ve

4 hücreler arasında bir bölünme meydana gelir. Normalde, endotel hücreleri yayılma etkisi göstermeyen tek bir tabaka oluştururlar. Ancak anjiojenesis sırasında çoğalıp yayılma gösterirler. Normal, hastalıklı ya da hasarlı dokularda üretilip salgılanan anjiojenik büyüme faktörleri komşu dokulara difüzyon yolu ile geçer. Anjiojenik büyüme faktörleri yakınındaki önceden var olan kan damarlarının endotel hücrelerinde bulunan özgün reseptörlere bağlanırlar. Büyüme faktörleri tarafından aktive edilen proteolitik enzimler bazal membranın ve endotel hücrelerini döşeyen ekstraselüler matriks (ECM) bileşenlerinin yıkımına neden olur. ECM nin enzimatik yıkılımını, endotel hücrelerinin uyarılması ve kapiller filizlenme izler. Endotel hücrelerinin invazyon ve göç süreçleri, plazminojen aktivatör (PA) ve matriks metaloproteinaz (MMP) sisteminin işbirliği içinde aktive olmasını gerektirir. Ürokinaz-tip (upa) ve doku-tip (tpa) plazminojen aktivatörleri plazminojeni plazmine çeviren serin proteazları grubuna aittirler. ECM bileşenlerinin yıkılması ve MMP-1, MMP-3, MMP- 9, elastaz gibi matriks metalloproteinazlarının aktivasyonu da plazminin işlevleri arasındadır (10). 2.1.2. Endotel Hücrelerde Göçme ve Çoğalma Anjiojenik uyarı, proteolitik yıkım ile kısa bir süre sonra endotel hücreleri aktive eder. Endotel hücreleri ekstraselüler matrikse göç eder ve çoğalır (11). 2.1.3. Kapiller Oluşumu ve Damar Olgunlaşması Endotel hücre çoğalmasından sonra ECM bileşenlerinin depolanması ve bir araya getirilmesi için ekstraselüler proteoliz mutlaka lokal olarak inhibe edilmelidir. Kapiller filizlenme oluştuktan sonra yine bu filizlenmenin ucunda yeni oluşmuş ECM de yıkılma ortaya çıkar ve bu sayede daha ileri yayılımı mümkün olur. Bazal membranın yıkılması endotel hücre göçüne ve filiz oluşumuna izin verir. Endotelin yol alması ve uzaması sırasında hücre içi ve hücreler arası boşlukta, sonunda kendilerinden damarların oluştuğu lümenler gelişir. Böylece, ekstraselüler matriks proteolizinin birbirini sırayla izleyen aktivasyon ve inhibisyonları sonucunda kapillerler oluşur. Proteolitik yıkılma ve endotel hücresi göçünden sonra yeni oluşan kapillerler, yeni bazal membranı oluştururlar. Bu nedenle, endotel hücrelerinin yeni kapiller yapılar oluşturabilmeleri için birbirlerine ve ECM e tutunma gereksinimi vardır. Damar olgunlaştıktan ve uygun anjiojenesis ortaya çıktıktan sonra anjiojenik faktörlerde azalma görülürken,

5 anjiojenesis inhibitörlerinde artış gözlenir. Böylece endotel hücreleri sessiz bir hale bürünür ve damarlar kan akımını başlatmaya hazır hale gelmiş olur (10). Bu olayları özetleyecek olursak, fibroblast büyüme faktörü (basic-fgf) ve vasküler endotelial büyüme faktörü (VEGF) gibi büyüme faktörlerinin aktivasyonu, hücrelerin çoğalmasını ve ekstraselüler matriks içine göç etmesini uyarır. Aynı zamanda, büyüme faktörleri tarafından aktive edilen proteolitik enzimler bazal membranın ve endotel hücrelerini döşeyen ECM bileşenlerinin yıkılmasına neden olur. Mitojenik endotel hücreleri kapiller filizleri oluşturur. İntegrinler gibi membran proteinleri de bu süreç içinde yer alır ve endotel hücrelerinin birbirine ve ECM ye tutunmalarına yardımcı olurlar, böylece yeni kapiller oluşur. Büyüme faktörlerinin inhibisyonu veya büyüme faktör inhibitörlerinin varlığı anjiojenesisi azaltır. ECM nin proteolitik yıkımı da inhibe olur ve yeni oluşmuş kapillerler etrafında matriks bileşenleri sentez edilir. Normal doku onarımı ve tümörde anjiojenesisi uyaran ortak yollar Şekil 2 de gösterilmektedir. Şekil 2. Normal Doku Onarımı ve Tümörde Anjiojenesisi Uyaran Ortak Yollar 2.2. TÜMÖR VE ANJİOJENESİS Tümör büyümesini ilgilendiren çok sayıda faktör üç başlık altında toplanabilir: 1. Tümör hücrelerinin büyümesi kinetiği 2. Tümör anjiojenesisi

6 3. Tümör ilerlemesi ve heterojenliği Tümör anjiojenesisi malignite için gerekli bir olaydır (12). İnsanda tümörlerin çoğu uzun süreler (aylar hatta yıllar boyunca) beslenmeden (avascular) sessiz fazda kalırlar. Tümör dokusunun progresyon, metastaz ve invazyonu için gerekli olan oksijen, büyüme faktörü ve besin maddelerinin karşılanabilmesi için yeni damar oluşumunun gerekli olduğu bildirilmektedir. Tümörler yeni damar yapımını gerçekleştiremedikleri takdirde etraflarındaki damarlardan difüzyon ile beslenir ve tümör 100 μm den 200 μm ye büyüdüğünde tek başına difüzyon tümörün oksijenasyonu için yeterli değildir. Bu hacimden sonra çoğalmaları ve metastaz yapabilmeleri için anjiojenesis gereklidir (13). Tümör hücreleri bir veya daha çok pozitif regülatörle uyarıldığında anjiojenik protein ekstravasküler makrikse geçer ve anjiojenesisi başlatır. Tümörün büyümesi sırasında mikrodamarlar, tümöre besin, oksijen ve büyüme faktörleri sağlamak amacıyla sayıca büyük oranda artış gösterirler. Tümör anjiojenesisinin düzenlenmesi normal fizyolojik anjiojenesise göre farklılık göstermektedir. Uyarıcılar ve inhibe ediciler arasındaki dinamik denge bozulmakta, bu dengenin bozulmasında ise tümör ve endotel hücreleri temel bir rol oynamaktadırlar. Bir ya da birden fazla anjiojenik büyüme faktörleri belirgin olarak aşırı eksprese olmadıkça, tümör büyümesinin olmayacağı gösterilmiştir. Anjiojenesisi uyarmak için yalnızca anjiojenik faktörlerin artması yeterli olmayıp, tümörün anjiojenik özellik kazanması için anjiojenesis inhibitörlerinin de azalması gereklidir. Anjiojenesisin tümörün yayılmasındaki rolünün yanı sıra metastazı kolaylaştırdığı varsayımını destekleyici, deneysel ve klinik kanıtlar bulunmaktadır. Metastaz, kanser hücrelerinin köken aldıkları bölgeden vücudun farklı doku ve organlarına yayılmasıdır. Primer tümörün en erken oluşum evresinden itibaren başlar ve zaman içinde tümörün büyümesine paralel olarak büyür. Tümörler histolojik tiplerine göre farklı metastaz gücüne sahiptirler. Pek çok epitel kökenli tümörde tümör hücresinin yayılımı tümörün damarlanmasından kısa bir süre sonra meydana gelmektedir. Bir tümör hücresi metastaz yapabilmek için, damar sistemine girmek, dolaşımda canlı kalabilmek, damar sisteminden dışarı çıkabilmek, hedef organda büyüyebilmek ve anjiojenesisi uyarmak gibi çeşitli bariyerleri aşabilmelidir. Bunu başaran tümör hücreleri hedef organa ulaşarak, hedef organın prekapiller venüllerinde endotel bazal membranına penetre olarak metastatik kolonileri başlatırlar. Deneysel çalışmalarda, yeniden damarlanmadan önce, tümör hücrelerinin nadiren dolaşıma

7 girdikleri gösterilmiştir. Tümör hücresi anjiojenik iken metastaz yaparsa, saptanabilir tümör oluşturma ihtimali daha fazladır. (14) Tümör hücresi başarıyla metastaz yapmış olsa bile hedef organda hemen damarlanmayabilir ve mikroskobik düzeyde kalabilir. Klinik veriler metastatik özelliğin anjiojenesisin şiddetine bağlı olduğunu göstermektedir. Anjiojenesisin tümörlerin büyümesi ile ilgili olduğu konusunda bir destek de fareler ile yapılan genetik çalışmalarla açıklanmıştır. Bu çalışmada bilim adamları, yakın zamanda Idl ve Id3 adlı iki geni eksik olan fareler yarattılar ve bu genlerin eksikliğinin anjiojenesisi engellediğini saptadılar. Anjiojenesis yetisi eksik farelere meme kanseri hücreleri enjekte edildiği zaman, tümör hücrelerinin büyümelerini kısa bir süre devam ettirebildiklerini, ancak bir kaç hafta içinde büyümenin tamamen gerilediğini ve kanser belirtilerinin ortadan kalktığını gösterdiler. Diğer taraftan, normal farelere kanserli meme hücrelerin enjekte edilmesi durumunda birkaç hafta içinde farelerin öldüğünü gözlemlediler (15). Ancak bu anjiojenesis yetisi eksik farelere, akciğer kanserli hücreler enjekte edilmesi durumunda sonuç biraz daha farklı olmuştur. Kanserli hücrelerin normal bir faredeki kanserli hücrelere göre daha yavaş geliştiği ve başka dokulara yayılmadığı gözlenmiştir. Sonuç olarak mutant farenin, normal fareye oranla daha uzun süre yaşayabildiği ortaya konmuştur (16). Bir diğer çalışmada araştırmacılar, deney hayvanlarından alınan kanserli hücreleri, normal bir hayvandan alınan ve cam bir kapta 1-2 hafta kadar canlı tutabilen bir organa aktardıklarında, kanserli hücre kütlelerinin 1-2 mm çapa kadar büyüdüklerini ve büyümelerinin bundan sonra durduğunu gözlemişlerdir. Bu deney sonucunda anjiojenesis olmadan kanserin büyümesinin durduğu saptanmıştır (17). Son yıllarda anjiojenesis üzerinde yapılan çalışmalar kanser tedavisinde de yeni yaklaşımları beraberinde getirmiştir. Anjiojenesis, kanseri önleyici ilaç geliştirme araştırmaları için heyecan ve ümit verici bir alandır. Bu yaklaşım, kanser tedavisinin gelişmesi, yeni hedeflerin ve yaklaşımların çoğalması için yeni bir kapı açmıştır.

8 2.2.1. Mevcut Yöntemlere Rağmen Yeni Yöntemler Aranmasının Nedenleri a-) Mevcut yöntemlerin Eksikliği : Mevcut ilaçlar ve kombinasyonları ile birçok kanser türünde tedavi ya hiç sağlanamamakta, ya da yetersiz kalmaktadır. Sonuçta bu türlerde ölüm oranı oldukça yüksek olmaktadır. b-) Kullanımda olan ilaçların önemli yan etki ve diğer dezavantajları giderilememiştir. Tümörlerde anti-anjiojenik tedavinin ilaç tedavisine veya radyoterapiye göre bazı üstünlükleri vardır. Bunlar ilaçların daha az toksik olması, ilaç direncinin gelişmemesi ve saçın dökülmemesidir. c-) Yeni olguların ve etki mekanizmalarının saptanması ile doğrudan ve daha etkin tedavi uygulamaları umut verici olacaktır. Çünkü kemoterapi ajanları, tümöre ulaşmak için kan damarlarını kullanıyor ve radyasyon da tümörü besleyen oksijen kaynağı hücreleri öldürüyor. Bu nedenle, damar oluşumunu engelleyen tedavinin, kemoterapinin ve radyasyonun etkisini azaltacağı düşünülüyordu. Ancak uzmanlar, bu tedavi yönteminde kemoterapinin dağılımının çok daha etkinleştiğini gösterdiler. Bilim adamları fareler üstündeki araştırmada, anjiojenesis engelleyicilerinin tümörün kan damarlarının çapını genişlettiğini; böylece damarlardaki sızıntının azaldığını; dahası, normal kan damarlarına benzemeye başladıklarını buldular. Bu çalışmalar insanlar üstünde de gerçekleştirilirse, doktorların çok dikkatli olmaları, doğru dozaj ve zamanlamaya karar vermeleri gerekiyor (18). d) Kemoterapi oldukça heterojen yapıdaki kanser hücrelerini hedef alır. Anti-anjiojenik yaklaşımların hedefi ise homojen ve neoplastik olmadığı için daha az dirençli olan endotel hücreleri ve damar duvarına ait diğer yardımcı hücrelerdir. e) Konvansiyonel kemoterapötik ajanların başarısı bütün tümör hücrelerinin öldürülmesine bağlıdır. Anti-anjiojenik ajanlar için bu gerekli değildir. Örneğin, sadece bazal membran hedef alınarak sekonder endotel hasarı oluşturulabilir veya endotel hücreleri için gerekli büyüme faktörleri inhibe edilerek tümörü besleyen damarlar engellenebilir.

9 f) Üç aşamalı olarak tariflenen anjiojenesis mekanizmasının her bir basamağı ayrı ayrı anti-anjiojenik yaklaşımı içinde barındırır. Anti-anjiojenik tedavinin optimizasyonu için spesifik seçenekler sunar (19). Bunların sonucu olarak, anjiojenezisin tam olarak anlaşılması kanserli hastalar için umut kapısı olacak. Ancak tek bir anjiojenesis inhibitörü ile yapılan tedavilerin özellikle kanser hücreleri tarafından oluşturulan çok sayıdaki anjiojenik faktörler ile mücadelede yetersiz kalabileceği düşünülmektedir. Bu nedenle, her şeyden önce uzmanların, kişiye özel kanser tipini belirlemeleri ve en geçerli yolu seçmeleri gerekiyor. 2.3. ANJİOJENESİSİ UYARAN VE ÖNLEYEN FAKTÖRLER Anjiojenesisin düzenlenme evreleri pek çok büyüme faktörünün ve düzenleyici proteinin kontrolü altındadır. Bunlar Tablo 2.1. de özetlenmiştir. Tablo1. Anjiojenik Faktörler ve Anjiojenezisi Uyaran Faktörler Anjiojenik Faktörler Anjiojenesisi Önleyen Faktörler VEGF (Vasküler endotelial büyüme faktör) Trombospondin- 1 PGF (Plasental büyüme faktör) bfgf (Ana fibroblast büyüme faktör) afgf (Asit fibroblast büyüme faktör) IL- 8 (İnterlökin-2, 6, 8) TGF-α (Transforme edici büyüme faktör-α) TGF-β (Transforme edici büyüme faktör-β) Anjiostatin Endostatin Vazostatin Vaskuler endotelial büyüme faktörü inhibitörü Trombosit faktör-4 fragmanı Prolaktin EGF (Epidermal büyüme faktör) İnterlökin (1, 12) HGF (Hepatosit büyüme faktör) TNF-α (Tümör nekroz faktör-α) PDGF (Trombosit kaynaklı büyüme faktör) GCSF (Granülosit koloni uyaran faktör) Proliferinle ilgili protein İnterferon-α-β Anjiopoetin-2 Antitrombin-3 fragmanı IGF-1 (İnsülin benzeri büyüme faktörü) İnterferon ile indüklenebilen protein- 10 HIF-1 (Hipoksi indükleyici faktör) Leptin Kortikosteroidler Prolaktin

10 2.3.1. Anjiojenesis Aktivatörleri Anjiojenesisde birçok ajan rol alır. Bunlar: 1- Tümör hücrelerinden, 2- Monosit, fibroblast gibi ortamdaki diğer hücrelerden 3- Kollajen matriksin yıkımı sonrasında açığa çıkabilirler. Bu ajanlar sinyaller yayarak anjiojenezisi başlatırlar (20). Hipoksi ve henüz tam olarak belirlenememiş bazı uyaranlar, bu ajanları uyarmak suretiyle anjiojenesis özelliği taşıyan bir takım moleküllerin oluşumuna yol açarlar. Anjiojenesis oluşumunda önemli rolleri olan büyüme faktörlerinden afgf, bfgf ve VEGF 1980 li yıllarda izole edilmiştir. Bu faktörler ve diğer faktörlerin elde edilmesi ile sonraki yıllarda miyokard infarktüsü ve alt bacak ekstremitelerinde görülen iskemik hastalıkların tedavisinde anjiojenesisi stimüle eden değişik büyüme faktörlerinin kullanılması için çalışılmıştır. 2.3.1.1. Vasküler Endotelial Büyüme Faktörü (VEGF) VEGF, VEGF homodimerik, heparin-bağlayıcı glikoprotein yapısında bir molekül olup çeşitli alt grupları tanımlanmıştır. VEGF A, B, C, D, E ya da aminoasit sayılarına göre VEGF121, VEGF165, VEGF189, VEGF206 ve VEGF145 gibi izoformları bulunmaktadır. VEGF biyolojik aktivitesini temel olarak üç reseptörü ile gerçekleştirir. Tirozin kinaz yapısında olan bu reseptörleri VEGF-R1 (flt-1), VEGF-R2 (flk-1/kdr) ve VEGF-R3 (flt-4) olarak sıralanabilir. Bunlardan VEGF-R1 ve R2 endotel hücreleri üzerinde iken VEGF-R3 lenf damarları üzerinde bulunmaktadır. VEGF reseptörlerinin aktivasyonu; fosfolipaz-c, fosfoinositol-3 kinaz gibi bir dizi hücre içi sinyal iletim proteinlerini fosforile ederek endotel hücrelerinin proliferasyon, migrasyon, ve diferansiyasyonunu sağlar. Nitric oxide (NO) ise anjiojenesisin VEGF bağımlı bir mediyatörüdür. Ayrıca düşük glikoz seviyesi, oksidatif stres ve özellikle hipoksik ortamda düzeyi hızla artan HIF-1, VEGF salınımında etkili rol oynamaktadır. VEGF, anjiojenesisin endotel hücrelerde göçme ve çoğalma aşamasındaki en etkili anjiojenik faktördür. VEGF'nin post-natal damarlanma, yara iyileşmesi, kanser, romatoid artrit, retinada yeni damarlanma ve kalp-damar hastalıkları dahil olmak üzere çok sayıdaki

11 patofizyolojik durumda önemlidir. VEGF, başlangıçta damar geçirgenliğini artıran bir faktör olarak tanımlanmıştır. Endotel hücrelerinin çok sayıdaki biyolojik fonksiyonunu, sitokin sentezi ve salınımı, trombolitik ve pıhtılaşma yollarında yer alan moleküllerin ekspresyonu ve düz kas hücre hiperplazisini düzenler. Ayrıca hücre dışı matriks yıkımından sorumlu olan matriks metalloproteazlar ile urokinaz ve doku tipi plazminojen aktivatörlerinin salınımını da uyarır. Böylelikle invazyon ve metastazı da kolaylaştırır (21, 22). 2.3.1.2. Epidermal Büyüme Faktörü (EGF) Polipeptit yapılı olup birçok dokuda bulunur ve trombosit degranülasyonu sırasında salınır. Epitel hücreler, endotel ve fibroblastlar için kemotaktiktir. Anjiojenezisi ve kollajenaz aktivitesini uyarır (21). 2.3.1.3. Fibroblast Büyüme Faktörü (FGF) Heparine bağlanan anjiojenik proteindir. Mezenkimal hücreler için mitojendir. Endotel proliferasyonu ve motiliteyi arttırarak neovaskülarizasyonu hızlandırarak anjiojenesiste etkilidir. Ayrıca heparinin etkilerini güçlendirmek, kollajen sentezini uyararak, yaranın kontraksiyonunu ve epitelizasyonu sağlamak ve fibronektin ve proteoglikan sentezini uyararak adhezyonu kolaylaştırmak gibi etkileri vardır (21). 2.3.1.4. Trombosit Kaynaklı Büyüme Faktörü (PDGF) Trombositlerin alfa granülleri içinde bulunur. Tümörler, endotel hücreler, makrofajlar, düz kas hücreleri ve trombositler PDGF benzeri büyüme faktörleri salgılarlar. Makrofajlar ve lökositlerin kemotaksisini uyarır. Fibroblast ve düz kas hücrelerinde hem kemotaksis hem mitogenezi uyarır. Kollajen ve fibronektin sentezini uyarır; ayrıca kollajenaz aktivitesini arttırır. Ayrıca Timidin fosforilaz etkisi gösterir ve timidini timine defosforilleyerek serbest radikal oluşumunu artırmak süretiyle anjiojenesis genlerini aktive eder (21). 2.3.1.5. Transforme Edici Büyüme Faktörü-β (TGF-β) Trombositler, makrofajlar, lenfositler, kemik, böbrek gibi farklı dokulardan izole edilmiştir. Trombositlerin alfa granülleri içinde yoğun miktarda bulunur, hasarlanan

12 bölgeye degranülasyonla salınır. Düşük dozda anjiojenik, yüksek dozda anti-anjiojenik özellikler gösterir. Monositleri uyararak FGF, PDGF, TNF-α, IL-1 gibi büyüme faktörlerinin salınımını sağlar. Makrofajlar için kemotaktiktir; fibroblast kemotaksisi ve proliferasyonunu uyarır. Kollajen sentezini uyarırken, diğer taraftan kollajenazı aktive eden faktörlerin etkisini azaltır. Fibroblastlarda fibronektin ve proteoglikan sentezini uyararak yara kontraksiyonunda rol oynar. Matriksin yeniden şekillenmesinde görev yapar. Ayrıca epitelyal hücre proliferasyonunu uyarır. Tümör anjiojenesisindeki rolünü endotel hücreleri üzerindeki kemotaktik etkisi ile gerçekleştirir. Bunu Tenascin gibi endotel hücrelerinin yapışmasını ve göçünü sağlayan matriks proteinlerinin yapımını artırarak gerçekleştirir. Bu sayede tümör hücrelerinin invazyon ve metastazına da olanak sağlamaktadır. Ayrıca VEGF ve VEGF reseptörlerinin ekspresyonunu da uyararak anjiojenesiste proliferatif aşamada da rol alır (21). 2.3.1.6. Tümör Nekroz Faktörü α (TNF-α) Endotoksik şokta yer alır. Ateş yükseltici özelliği bulunur. Düşük dozda endotelyal hücre çoğalmasını ve tübül oluşumunu sağlarken, yüksek dozda zıt etki gösterir. Proenflamatuar özellikleri ile in vivo ortamda yeni damar oluşumuna yol açar. α Ve β olmak üzere iki tipi vardır. α Tip; TNFα (kaşektin), β tip; TNF β (lenfokin) olarak bilinir. TNF-α, makrofajlar ve bazı diğer hücreler tarafından üretilir. TNF-β ise T hücre lenfositleri tarafından üretilir. İnterlökin-1 (IL-1) ile birçok özellik paylaşmaktadır. TNF, IL-1 ile birlikte ya da ayrı ayrı sistemik enflamasyonu tetiklemekte ve bununla ilgili ateş gibi belirtilerin ortaya çıkmasına neden olmaktadır. Gram-negatif bakterilerin hücre duvarı yapısında bulunan ve aynızamanda bir endotoksin olan lipopolisakkarid (LPS), TNFα üretimini tetikler. Ayrıca TNF, nötrofil ve monositler için kemotaktiktir ve nötrofil aktivitesini arttırır (21). TNF'nin lokal konsantrasyonunun artması, bakteriyel enfeksiyonlarla ilişkili olan belirtilere neden olur (septik şok, ateş, kas ağrısı, uyuşukluk, baş ağrısı, mide bulantısı ve enflamasyon). Hipotalamusta, kortikotropin salgılatıcı hormon (CRH) salınımını uyararak hipotalamus hipofiz adrenal aksını uyarır, iştahı baskılar, ateşe neden olur. Karaciğerde, akut faz yanıtını uyarır ve kanda C-reaktif proteinin artmasına neden olur. Nötrofilleri çeker ve migrasyon için endotel hücrelerine yapışmalarına yardım eder. Makrofajlarda, fagositozu ve IL-1, oksidanlar, enflamasyon lipidleri ve prostaglandin

13 E2 üretimini uyarır. Diğer hücrelerde insülin direncini arttırır. Düşük dozda endotelyal hücre çoğalmasını ve tübül oluşumunu sağlarken, yüksek dozda zıt etki gösterir. Proinflamatuar özellikleri ile in vivo ortamda yeni damar oluşumuna yol açar (21). 2.3.1.7. Hepatosit Büyüme Faktörü (HGF) HGF; endotel hücrelerinde proliferasyon ve migrasyonda rol alır. Etkisini transmembran tirozin kinaza yüksek afinite ile bağlanarak gerçekleştirir (21). Bu moleküller arasından iki tanesi, tümör yaşamı için özellikle önem taşır. Bunlar, Vasküler Endotelial Büyüme Faktörü (VEGF) ve ana Fibroblast Büyüme Faktörü (bfgf)'dür. Bu iki molekül tarafından harekete geçen endotelial hücreler ilk önce Matriks Metallo Proteinaz (MMP) (çinko endopeptidazların bir üyesi olan enzimler) yapısını oluşturur ki, bu degredatif enzimlerin özel bir sınıfını oluşturmaktadır. Bu enzimler daha sonra çevre doku içinde serbest kalırlar. MMP'ler kan damarı hücrelerinin dışındaki yapıyı bozarlar. Bu bozulma endotelial hücrelerin göç etmesinin izni gibidir. Endotelial hücreler kendilerini çevreleyen dokuya göç etmeye başladıkları anda bölünmeye de başlarlar. Çok geçmeden bu endotelial hücreler içi boş tüpler şeklinde organize olmaya başlarlar ve yavaş yavaş yeni kan damarları ağını oluştururlar (22). Anjiojenesis ile ilgili son çalışmalardan birinde nikotinin [Formül 1] anjiojenik etkili olduğu ve özellikle diyabetik kişilerde yara iyileşmesini hızlandırdığı gösterilmiştir. Diyabetes mellituslu hastalarda kollateral damarların oluşumunda bir bozukluğun olduğu da bildirildiği için bu bilgi üzerinde daha ileri çalışmaların yapılması çok daha faydalı sonuçlar doğurabilir. Nikotinin tümörlerde de anjiojenesisi stimüle ettiği bildirilmiştir. Tümörlerde yeni damarların oluşması ile metastaz daha da hızlı gelişebilir ve dolayısıyla nikotin kanseri teşvik ettiğinden daha erken ölüme neden olabilir (23). Formül 1

14 2.3.2. Anjiojenesis İnhibitörleri Anjiojenik faktörler ile anti-anjiojenik faktörler arasındaki denge tümör dokusu gibi hızla çoğalan hücrelerin bulunduğu ortamda hücrelerin çoğalması ve yaşam sürelerinin uzaması için temel unsur teşkil eden anjiojenesis lehine bozulmaktadır. Anjiyogenezis inhibitörlerinin varlığından ilk olarak 1970 lerde bahsedilmiştir. Ancak 10 yıl kadar sonra anjiojenesis molekülleri tanımlanmıştır. Protamin ve platelet faktör 4, 1980 lerde ilk çalışılalan anjiojenesis inhibitörleri olmuştur. Ardından, anjiostatik steroidler, 1985 yılında ise fumagillin ve sentetik analogları ve sonra da interferonun anjiojenesis inhibitör etkisi keşfedilmiştir. Şimdiye kadar 40 dan fazla anjiojenesis inhibitörü bildirilmiştir (24). İlaç geliştirme çalışmaları açısından anjiojenesis farklı mekanizmaları ile etkili ve tedavi açısından oldukça farklı ilaç gruplarının geliştirme olasılıklarını gündeme getirmiştir. Bu noktada değişik stratejiler öne sürülmüştür. Bunlar; 1-Anjiojenik faktörlerin inhibisyonu 2-Doğal anti-anjiojenik faktörlerin uygulanması 3-Endotel hücrelerinin inaktivasyonu 4-Yeni damarların hücre dışı matriks ile etkileşimini bozacak moleküllerin uygulanması (matriks metalloproteinaz inhibitörleri) şeklinde özetlenebilir (25). İlk çalışmalarda anjiojenesisin sadece kanser, artrit ve psöriasis için önemli olduğu ileri sürülmüşken son yıllarda özellikle aşırı, yetersiz veya bozuk anjiojenesisin çok sayıda hastalığın patojenezinde rol oynadığı belirlenmiştir. Bu nedenle anjiojenesisi önleyici veya başlatıcı faktörlerle tedaviler önem kazanmıştır. Ancak tek bir anjiojenesis inhibitörü ile yapılan tedavilerin özellikle kanser hücreleri tarafından oluşturulan çok sayıdaki anjiojenik faktörler ile mücadelede yetersiz kalabileceği düşünülmektedir. Bu nedenle gelecek yıllarda anjiojenik hastalıkların moleküler temellerinin daha iyi belirlenmesi yeni tedavi modellerinin geliştirilmesi açısından önemli olabilecektir. Şu an anjiojenesisi önlemeye yönelik olarak geliştirilmeye çalışılan ve üzerinde en çok araştırma yapılan ilaç grupları arasında yer alan anti-kanserojenler ve anti-romatoid bileşikler yer almaktadır (26).

15 2.3.2.1 Anjiojenik faktörlerin inhibisyonu Tümörler, anjiojenik faktörlerin üretimiyle karakterize dokular olduklarından, bunların ekspresyonunun ya da etkilerinin inhibisyonu tümör anjiojenesisinin baskılanmasında indirek ancak etkili bir yaklaşımdır. Öncelikli hedefler içinde en çok tercih edilenler VEGF ve VEGF reseptörleridir. A) Anti VEGF stratejileri VEGF in endotel hücreleri üzerinde bulunan transmembran tirozin kinaz reseptörlerine bağlanması ile tetiklenen sinyal yolu birçok seviyede farklı açılardan inhibe edilerek VEGF nin etkinliği önlenebilmektedir. Bu mekanizmaları; a) Monoklonal antikorlar b) VEGFR inhibitörleri c) VEGFR inhibitörleri olarak 3 grupta toplayabiliriz. a)vegf e yönelik monoklonal antikorlar Bevacizumab (Avastin) Bevacizumab [Formül 2], anti-anjiojenik ve anti-tümör etkinliği olan yapay olarak elde edilmiş rekombinant insan monoklonal VEGF antikorudur. Faz I çalışmalarında kemoterapi ile birlikte kullanıldığında serum VEGF seviyelerini ölçülemeyecek seviyelere kadar düşürdüğü ve farklı tümörlerde büyümeyi inhibe ettiği bulunmuştur. Ayrıca yakın zamanda yapılmış randomize faz III çalışmasında metastatik kolorektal kanserli hastalarda geleneksel tedaviye kıyasla klasik IFL tedavisiyle kombine edildiğinde hastalarda yaşam süresinin önemli derecede arttığı, tümör progresyonunda ciddi azalmanın olduğu ve tromboembolik komplikasyonda herhangi bir artış olmadığı tespit edilmiştir (27).

16 Formül 2 VEGF-trap Faz I çalışmaları devam eden ve monoklonal antikorlara göre VEGF e olan affinitesi çok daha yüksek olan spesifik VEGF antogonistidir. Cilt altı uygulanışı ise bir diğer önemli avantajıdır (27). b)vegf reseptörlerine yönelik tedaviler VEGF sistemi aynı zamanda monoklonal antikorlarla yada spesifik tirozin kinaz inhibitörleri aracılığıyla VEGF nin reseptörleri hedef alınarak da inhibe edilebilir. Bunlar anjiojenesisde direk veya indirek olarak rol alan VEGFR-1 (flt-1), VEGFR-2 (Flk-1), Tie-1 ve Tie-2 gibi reseptörleri hedef alan küçük moleküllerdir. Bunların içinde ise en önemlisi, özellikle tümör dokusunda endotel hücre proliferasyonu ve kemotaksisinden sorumlu olan Flk-1 (VEGFR-2) dir (28). SU5416 (Semaxanib) SU5416 [Formül 3], klinik olarak test edilmiş ilk VEGF reseptör tirozin kinaz inhibitörüdür ve molekül ağırlığım küçüktür. Parenteral uygulanan SU5416, VEGFR- 2 yi inhibe eder. Kısa yarılanma ömrü, aktif plazma konsantrasyonu için sık aralıklarla kullanılması, ve özellikle gemcitabine/cisplatin kemoterapisi ile kombine kullanımda ortaya çıkan pulmoner emboli, miyokardiyal enfarktüs ve serebrovasküler olay geliştirmesi kullanımını kısıtlamaktadır (28). Kanser tedavisinde etkili olan en güçlü bileşikler arsında yer almaktadır. Yapılan birçok çalışmayla epidermal karsinom, fibrosarkom, gliom, akciğer kanseri, meme kanseri ve prostat kanseri gibi kanserlerde anjiojenesisi inhibe ederek tümör kitlesinde belirgin küçülme sağladığı gösterilmiştir (29).

17 Formül 3 CAI Karboksiamido-triazol (CAI) [Formül 4]; sentetik bileşiklerden olup, in vitro migrasyon inhibiyonu ve sinyal transdüksiyon yolakları inhibiyonu yapmaktadır. Kalsiyum mobilizasyon inhibitörü etkisi sonucu proliferasyonu inhibe etmektedir ve birçok insan tümör hücrelerinin proliferayonu ve invaziv durumunu durdurmaktadır. Ayrıca over kanserlerinde autokrin motility factor le uyarılan hücre motilitesini ve hücre adhezyonunu geri dönüşümlü olarak inhibe etmektedir (30). Formül 4 SU6668 SU6668 [Formül 5]; VEGF, bfgf ve PDGF reseptörlerini inhibe eden oral kullanımlı anti-anjiojenik ajandır. Günde tek dozluk uygulamalar hastalar tarafından tolere edilebilirken doz arttıkça nefes darlığı, göğüs ağrısı ve perikardiyal effüzyona sebep olabilmektedir (31). Formül 5

18 STI-571 (Gleevec, Imatinib) STI-571 [Formül 6], tümör hücrelerinde ve tümördeki hiperplastik kapillerin endotelial hücrelerinde PDGF-b ekspresyonu; bütün gliom hücre serilerinde ve PDGFa reseptörü alt ünitelerinin aşırı ekspresyonu gözlenir. STI-571, 2-fenilaminopirimidin sınıfına ait bir tirozin kinaz inhibitörüdür. Özellikle Abl onkoproteini ve anjiojenik bir büyüme faktörü olan PDGF reseptörlerine karşı etkinliği yüksektir. STI-571 in PDGF ligandları ve reseptörlerinin ortaya koyduğu otokrin-stimülasyonu inhibe ederek intrakranial insan glioblastoma implantlarında gelişimi engellediği gösterilmiştir. Beyin tümörlerinde ve anjiojenesiste rol oynayan birçok büyüme faktörü reseptörlerinin tirozin kinaz ailesinden oluşu Gleevec gibi tirozin kinaz inhibitörlerini klinik denemelere taşımıştır (32). SU11248 (Sunitinib) Formül 6 SU11248 [Formül 7], geniş spektrumlu oral tirozin kinaz inhibitörüdür ve VEGF, PDGF, c-kit ile Flt-3 kinaz aktivitesini inhibe eder (33). Formül 7 PTK787/ZK22854; Oral VEGFR-1 ve VEGFR 2 reseptör inhibitörüdür. Ataksia, vertigo, hipertansiyon ve venöz tromboembolizm görülen yan etkileridir. Hepatik metastazı olan kolorektal

19 kanserli hastalarda kan akımını belirgin azalttığı gözlemlenmiştir. Kombine faz II ve III çalışmaları sürmektedir (34). ZD6474 (Vandetanib) ZD6474 [Formül 8]; hem VEGF hem EGF reseptör tirozin kinaz inhibitörüdür. Kullanımı sırasında diyare ve cilt kızarıklığı görülmesi özellikle EGF reseptörlerinin yaygın olarak bloke edildiğini göstermektedir (34). Formül 8 CP-547,632 Selektif VEGFR-2 tirozin kinaz inhibitörüdür. Faz I çalışmaları sevindirici farmakokinetik sonuçlar vermektedir (35). 2.3.2.2. Doğal anti-anjiojenik faktörler AnjiojeneSisin vücutta endojen inhibitörleri vardır ve bazılarının potent oldukları anlaşılmış ve yapıları izole edilmiştir. Bu potent inhibitör ajanlardan Trombospondin, Anjiyostatin, Endostatin ve İnterferonlar gibi birçoğu tedavide kullanılmaktadır (36). Trombospondin-1 Endojen olarak üretilen bir endotel hücre inhibitörüdür. Oldukça büyük bir protein olmasına rağmen TSP-1 in anti-anjiojenik etkisi proteinin N-terminal kısmında bulunur. İn vitro olarak endotel hücre proliferasyonunu ve in vivo olarak kornea anjiojenesisini inhibe ettiği gösterilmiştir. Trombospondinin birçok farklı dokudaki endotel hücrelerin proliferasyonunu durdurduğu ve endotel hücreleri arasındaki ilişkiyi istikrasızlaştırdığı görülmüştür. TSP 1 ve TSP-2 hipoksi ve onkogenlerle modüle edilen anti-anjiojenik proteinlerdir; özellikle TSP 1 ekspresyonu tümör evresi ile ters orantılıdır. İn vitro ve in vivo olarak TSP-1 hareketsiz damarlara yakın konumludur, aktif olarak gelişen damar

20 filizlerinde ise bulunmaz. TSP-1 promotör bölgesi, aynı zamanda bir transkripsiyon faktörü olan p53 tümör baskılayıcı proteinin hedef bölgelerindendir; p53 proteini TSP- 1 sentezini regüle ederek anjiojenesisi durdurur. Kanser mekanizmasında; özellikle gliom gelişiminde görülen p53 kayıplarının sıklığı göz önünde bulundurulduğunda bu bulgu oldukça anlamlıdır. TSP-2 hasarı, tümör farklılaşması veya proliferasyona değil apoptozun anlamlı şekilde azalmasına yol açar. TSP-2 ekspresyon vektörüyle transfekte tümör hücrelerinin VEGF gibi güçlü anjiojenik faktörlerin salgılanıyor olmasına rağmen tümör damar yoğunluğunun ve boyutlarının anlamlı şekilde azaldığı; hatta TSP- 2 nin TSP-1 den daha güçlü bir anti-anjiojenik faktör olabileceği gösterilmiştir (36) Anjiyostatin Primer tümör hücrelerinin ürettiği bir protein olan plazminojenin 38 kdal luk internal parçasının özgül olarak endotel hücre proliferasyonunu inhibe ettiği gösterilmiş ve bu molekül anjiyostatin olarak isimlendirilmiştir. Anjiyostatin, akciğer karsinomlu farelerin serum ve idrarlarından pürifiye edilmiştir. Rekombinan anjiyostatin ise yakın zamanda Esherichia coli den elde edilmiştir. Toksik olmayan anjiyostatin sistemik olarak verildiğinde tümör gelişimini çok güçlü şekilde inhibe eder. Metastatik ve primer tümörlerin proliferasyon ve apoptoz dengelerini sağlayarak tümörü sessiz durumda tutar. Anjiyostatinin tümör mikrodamarlarındaki endotel hücre proliferasyonunu baskılayarak değil; endotel hücrelerinde ve endotel prekürsör hücrelerinde apoptozu indükleyerek aktivitesini ortaya koyduğunu gösteren çalışmalar da vardır. Ayrıca anjiyostatinin endotel migrasyonu, invazyon ve tüp oluşumunu inhibe ettiği in vitro olarak gösterilmiştir. Anti-anjiojenik ve anti-tümör aktivitesini bfgf ve VEGF gibi anjiojenik büyüme faktörlerini baskılayarak ortaya koyuyor olabileceğine dair bulgular vardır. Fare modelinde sıçan ve insan orijinli subkutanöz ve intraserebral gliomlar anjiyostatinin sistemik uygulanması ile başarılı şekilde tedavi edilmiştir (36). Endostatin Kolajen XVIII karboksi terminalinde Ala-His bağının elastaz kesimiyle oluşan 184 aminoasitlik bir peptiddir. Oluşum evresindeki tümörde total gerilemeyi sağlayan en güçlü molekül gibi görünmektedir. Endostatinin, anjiyostatine benzer etkileri vardir. Spesifik olarak endotel proliferasyonunu, migrasyonunu ve tüp formasyonunu inhibe ettiği ve endotel hücrelerinde apoptozu indüklediği görülmüştür. Endostatinin bir

21 anjiojenik faktör olan upa (ürokinaz-tip plazminojen aktivatörü) ve PAI-1 (plazminojen aktivatör inhibitörü-1) seviyesini düşürerek aktivite gösterdiği; fokal adezyonu bozarak hücre iskelet yapısını değiştirdiği belirlenmiştir. Anjiyostatinin değil ancak endostatinin proliferatif endotel hücrelerde erken cevap genleri, hücre döngüsü ve apoptoz inhibitör genlerini, mitojenle aktive olan protein kinazları, fokal adhezyon kinazları, endotel gelişimiyle ilgili Gprotein reseptörlerini ve hücrenin yapısal komponentlerini baskıladığı gösterilmiştir. Endostatin üreten hücrelerin immün-izolasyonlu sodyum alginat kapsüllerinde sistemik olarak verilmesinin ardından beyin tümörü gelişiminin %35 azaldığı, çevre dokuya invazyonun inhibe edildiği, total vasküler yoğunluğun %67.6, perfüzyonun %67, damar çapının %37 azaldığı saptanmıştır. Anjiyostatin ve endostatin beraber uygulandıklarında tümör gerilemesinde sinerjistik etkinin oluşması bu iki molekülün moleküler hedeflerinin farklı olduğunu gösterir (36). İnterferonlar İmmünomodulator, antiviral, ve anti-anjiojenik özellikleri olan doğal sitokin ailesidir. VEGF ve bfgf nin üretimini engellemektedir. Anjiojenesisi, endotel hücreleri üzerinde antimitotik ve antimigratuar etkiyle birlikte parankimden bfgf salınımını önleyerek bloke ederler. Anti-anjiojenik aktiviteleri interferonun anti-anjiojenik olduğunun keşfinin ardından, ilk kez hayat kurtarıcı olarak 1988 lerde 7 yaşındaki pulmoner hemanjiyomalı bir çocukta başarıyla kullanılmıştır. Bir çalışmada, interferon ile tedavi edilen 20 hastanın 18 inde ilerlemiş hemanjiyomada gerileme tespit edilmiştir. Ayrıca Kaposi sarkomunda da etkili oldukları bilinmektedir (36). Platelet Faktör 4 Platelet Faktör-4 [Formül 9]; anti-anjiojenik aktivitesi, anjiojenesis inhibitörü olduğu gösterilen fakat toksik etkileri nedeniyle hayvan çalışmaları ve klinik denemeleri engellenen protamin molekülüyle benzer şekilde heparini nötralize ettiğinin fark edilmesiyle ortaya çıkmıştır. İn vitro ortamda rekombinant insan PF4 ü spesifik olarak endotel proliferasyonunu ve migrasyonunu inhibe eder (37).

22 Formül 9 Diğer endojen anjiojenesis inhibitörleri arasında ise maspin, angiopoietin, protamin, retinoik asit ve de özellikle farklı bir etkiyle anjiojenesisi inhibe eden endojen matriks metalloproteaz inhibitörleri (TIMP) sayılabilir. Fizyolojik MMP inhibitörleri arasında TIMP-1ve TIMP-2 en önemlileridir. Özellikle TIMP-1 ın gerek rekombinant gerekse cdna sının genetik olarak transfüzyonu yoluyla Faz III çalışmalarında kullanılmasına başlanmıştır (36). 2.3.2.3. Endotel hücrelerinin inaktivasyonu Anjiojenesis inhibitörlerinin endotel hücreleri üzerinden etki etmelerinin bazı avantajları vardır. Bunlar; 1) Direkt tümör hücrelerini hedefleyen ilaçlara karşı gelişen sıklıkta direnç oluşmaz. Tümör hücrelerinin tersine endotel hücreleri genetik olarak stabil, diploid ve homojendirler. Spontan mutasyonlar nadirdir ve tedavilerin süresi uzayabilir. 2) Tümör endotel hücreleri, normal endotel hücrelerinden 50-100 kat daha hızlı bölünürler. Aktive olmuş endotel hücrelerinin üzerinde aktive olmamış endotel hücrelerinin üzerinde olmayan markerlar bulunur. 3) Yetişkinlerde anjiojonesis normal olarak sınırlıdır. Bundan dolayı anti-anjiojenik ilaçlara bağlı yan etkilerin çok az görülmesi beklenmektedir. 4) Tümör hücrelerinin aksine endotel hücrelerine kan dolaşımı ile ulaşılması daha kolaydır. 5) Çok sayıda tümör hücresi tek bir mikro damara bağlıdır. Birkaç mikro damarı tahrip edilmesi anti-tümör etkiyi daha da kuvvetlendirir (38).

23 Fumagillin Aspergillus Fumigatus tan elde edilen sentetik bir mantar anoloğu olan Fumagillin [Formül 10] bir antibiyotik türevidir. İn vitro ortamda DNA sentezini inhibe ederek endotel proliferasyonunu ve kapiller benzeri tüp oluşumunu engeller. Hayvan modeli çalışmalarında Fumagillin'in anjiojenesisi inhibe ederek tümörün büyümesini baskıladığı göterilmiştir. Fumagillin in sentetik analoğu olan TNP-470 [Formül 11], fumagilinden daha etkin, daha az toksik özelliği olan ve anjiojenesis inhibitörleri içinde belki de en geniş spektrumlu olandır. Pikomolar konsantrasyonlarda prolifere olmuş endotel hücrelerini inhibe ederken, 100-10.000 kat yüksek konsantrasyonlarda pek çok tümör hücresinin büyümesini de inhibe eder. Yapılan incelemeler de TNP-470 sistemik olarak verildiğinde implante edilmiş gliomlarda anjiojenesisin azaltılarak büyümenin durdurulduğu, intrakranial gliomların inhibe olduğu ve hastaların yaşam süresinin uzadığı gözlenmiştir. Anjiyostatin gibi spesifik bir inhibitör olmamasına rağmen, endotel hücrelerine karşı oldukça selektif bir anjiojenesis inhibitörüdür (39). Formül 10 Formül 11 Talidomit Talidomit [Formül 12], hem immün modulatuar hem de anti-anjiojenik aktivitesi vardır. 1950'lerde cüzzam tedavisinde oldukça yaygın kullanılmakta iken daha sonra hamile kadınlarda antiemetik olarak özellikle ilk aylarda kullanılması sonucu teratojenitiye yol açması bakımından kullanımı yasaklanmıştır. Bu ilaç hamile kadınların kullanımına uygun olmamakla birlikte, endotel hücrelerin yeni kan damarları oluşturmasını engellemesi hamile olmayan kanser hastaları için uygun bir ilaç olarak yeniden kullanımını gündeme getirmiştir (42). Talidomit günümüzde anti-anjiojenik bir ajan olarak faz III aşamasında kullanılmaktadır. VEGF, bfgf, TNF-α, COX-2 ve ekstraselüler matriks hedef aldığı yapılardır. Yüsek doz kemoterapi sonrasında relaps