İmmünohematolojik Testler. Dr. İshak Özel TEKİN ZKÜ Tıp Fakültesi İmmünoloji A.D.

İmmünohematolojik Testler Dr. İshak Özel TEKİN ZKÜ Tıp Fakültesi İmmünoloji A.D.

Clin Chem Lab Med 2010;48(8):1053 1054 Pasqualepaolo Pagliaro

İmmünolog lamba cini

Đmmünohematolojik Testler Kan gruplama Çapraz Karşılaştırma Antikor tarama Antikor tanımlama

Serolojik testler: Ag-Ab birleşmesi tepkimelerinin görülebilir, gözlemlenebilir, ölçülebilir hale getirilmesi temelli tanısal yöntemlerdir.

Aglutinasyon

Hemaglutinasyon

Eritrosit Serolojisi Hemaglutinasyon - Lam (slide) - Tüp - Jel Santrifügasyon - Mikroplak yöntemleri

Eritrosit Serolojisi RIA EIA PCR Moleküler baskılama Çoklu analit ölçümleri.

Karl Landsteiner 1900 yılında ABO kan gruplarını tanımlaması kan transfüzyonlarında dönüm noktasıdır

İmmünohematolojik testlerin geliştirilmesi Landsteiner ın ilk bulgularıyla doğrudan ilgilidir -Eritrositlerin farklı bireylerin serum/plazması ile aglutinasyonu -Bireylerin kanında diğer kan gruplarındaki eritrositleri kümelendiren doğal antikorların varlığı

Eritrosit Transfüzyonu

Plazma Transfüzyonu

Biyolojide Redüksiyonizm Karmaşık sistemlerin basit bileşenleri içinde analizi

Eritrositlere İmmün Yanıt Allojenik eritrositlerin yıkımı Otolog eritrositlerin yıkımı Fetal ve yenidoğan eritrositlerin yıkımı Transplant dokularının yıkımı

ABO Kan Grup Sistemi ABO sistemi iki özellik nedeniyle farklıdır. Serumda aglutinin varlığı ABH ag leri bir çok dokuda ve sekresyonlarda bulunur. Serumda antikor gösterilme prensibine dayanan karşıt gruplamanın yapıldığı tek kan grup sistemidir.

ABO-Rh Direkt Gruplama Numune Hazırlanması ( % 0,8 lik Eritrosit Süspansiyonu ) 0,5 ml. Diluent-I (1 basım) 50 µl Tam Kan veya 25 µl sediment İnkübasyon 18-25 C de 5-10 Dakika Numune Dağıtılması Her mikrotüpe 25 µl % 0.8 lik Eritrosit Süspansiyonu Santrifüj 10 Dakika Değerlendirme

ABO Karşıt Gruplama Test Hücrelerinin Hazırlanması ( A1, A2, B, 0,I,II ) Hücreler resüspanse edilerek oda ısısına getirilir Hücrelerin Dağıtılması Her mikrotüpe 50 µl etiketine uyan test hücresi pipetlenir. Hasta Serumunun Dağıtılması Her mikrotüpe 50 µl hasta serumu veya plazması pipetlenir. İnkübasyon 18-25 C de 5-10 Dakika Santrifüj 10 Dakika Değerlendirme

ABO Karşıt Gruplama Type A1 cells B cells O + + A 0 + B + 0 AB 0 0

ISBT Kan Gruplama Sistemleri Adı Kısaltma ABO ABO MNS MNS P P Rh RH Lutheran LU Kell KEL Lewis LE Duffy FY KiddJ K Diego DI Cartwright YT XG XG Scianna SC Dombrock DO Colton CO Landsteiner-Wiener LW Chido/Rodgers CH/RG Hh H Kx XK Gerbich GE Cromer CROM Knops KN Indian IN Ok OK Raph RAPH JMH JMH

Antikor Tarama - Tanımlama Antikor Tarama Testi Eritrosit antijenlerine karşı antikor olup olmadığını saptamak için yapılır Antikor Tanımlama Testi Varolan antikorun hangi kan grup sistemi ile ilişkili olduğunu ve hangi eritrosit antijenine karşı geliştiğini saptamak için yapılır

Antikor Tarama Klinik önemi olan antikorlar mutlaka araştırılmalı Klinik önem Antikorun 37 o C de reaktif olması Hemoliz yapması Eritrosit yaşam süresini azaltması

DAT Direkt Coombs Testi

Reaksiyon güçlendiriciler A H G (Anti Human Globülin)

Tüpte DAT

DAT ++++ +++ ++ + - - ++++ +++ ++ + - - Hasta Eritrosit Süspansiyonu Hazırlanması ( % 0,8 lik Eritrosit Süspansiyonu ) 1 ml. Diluent-II (2 basım) 10 µl Hasta Kanı Numune Dağıtılması Her mikrotüpe 50 µl % 0.8 lik Eritrosit Süspansiyonu Santrifüj 10 Dakika Değerlendirme 37

DAT POZİTİFLİK Eritrosit antijenlerine karşı oluşmuş otoantikorların komplemanla birlikte veya tek başına eritrosit yüzeyini kaplaması Transfüzyon sonrası alıcı antikorların donör eritrosit yüzeyini kaplaması Verici plazmasındaki antikorların alıcı eritrositlerin yüzeyini kaplaması

DAT 39

Antikor Tarama

Hücreler Fenotipik yapısı (tercihan homozigot) 2 veya 3 farklı donörden alınmış test hücreleri tarama, daha fazla sayıda test hücreleri ise tanımlama testlerinde kullanılmalıdır.

IAT 1 2 3 1 damla hücre + 2 damla hasta serumu

ANTİKOR TARAMA (IAT-ET) I II III I II III ++++ +++ ++ + - - Test Hücrelerinin Hazırlanması ( I, II, III ) Hücreler resüspanse edilerek oda ısısına getirilir I II III I II III Test Hücrelerinin Hazırlanması ( IP, IIP, IIIP ) Hücreler resüspanse edilerek oda ısısına getirilir Dağıtım 50 µl etiketine uyan test hücresi 25 µl hasta serumu veya plazma İnkübasyon 37 C de 15 Dakika Santrifüj 10 Dakika Değerlendirme Test hücreleri ekindeki tablo değerlendirmede kullanılır. Hücre ve tablonun Lot numarası aynı olmalıdır.

ANTİKOR TARAMA - CA I II III I II III * * ++++ +++ ++ + - - I II III I II III Test Hücrelerinin Hazırlanması ( I, II, III ) Hücreler resüspanse edilerek oda ısısına getirilir Dağıtım 50 µl etiketine uyan test hücresi 25 µl hasta serumu veya plazma İnkübasyon 4 C de 15 Dakika Santrifüj 10 Dakika * Normal Hücre ve Nacl / Enzym / Cold Aglutinin Kartı Kullanılır Değerlendirme Test hücreleri ekindeki tablo değerlendirmede kullanılır. Hücre ve tablonun Lot numarası aynı olmalıdır.

IAT Etkileyen Faktörler İnkübasyon süresi ve sıcaklık ph İyonik konsantrasyon Antikorun afinite sabiti Antijen ve antikor oranı

İnkübasyon Süresi ve Sıcaklık Aglütinasyonun ilk safhasında veya sensitizasyon fazını etkiler Klinik olarak önemli antikorlar, genellikle 30-37 C arasında reaksiyona girer Çoğu antikorlar, tuz ve albuminli test ortamları kullanıldığı takdirde ortalama 30 dakikalık bir inkübasyon süresi gerektirir Zayıf antikorlar için sürenin uzatılması gerekebilir

ph 6.8-7.2 fizyolojik ph uygundur

İyonik Güç Serum fizyolojikli ortamda Na+ (negatif yük etrafında) Cl- (pozitif yük etrafında) iyonları antikor ve antijenin etrafında kümelenir Zıt yüklü moleküller arasındaki çekme gücü azalınca antikorun antijenle bir araya gelmesi engellenir Düşük iyon gücüne sahip solüsyonlar (LISS) kullanıldığında ortamdaki iyon sayısı azalır, pozitif ve negatif yükler ortaya çıkar LISS inkübasyon süresini kısaltır (37 C de 10-15 dakika)

Antikorun Afinitesi Afinite, eritrositin herhangi bir antikora karşı özgül olarak sahip olduğu karakteristik bağlanma özelliğidir Genelde denge sabiti ne kadar yüksekse antijen antikor reaksiyonunun duyarlanma fazında antikorların birleşmesi o kadar yüksektir

Antijen-Antikor Oranı Reaksiyon hızı, ortamdaki antikor miktarı ve eritrosit antijenlerinin sayısına bağlıdır Antikor miktarını artırmak, test duyarlılığını artırabilir. Nadiren, önemli antikor fazlası prozon fenomeninin oluşmasına neden olur.

Test Hücreleri

Tüpte Antikor Tanımlama 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 damla hücre + 2 damla hasta serumu

ANTİKOR TANIMLAMA - IAT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 ++++ +++ ++ + - - ++++ +++ ++ + - Test Hücrelerinin Hazırlanması ( 11 li Normal Panel Hücresi ) Hücreler resüspanse edilerek oda ısısına getirilir 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Dağıtım 50 µl etiketine uyan test hücresi 25 µl hasta serumu veya plazma İnkübasyon 37 C de 15 Dakika Santrifüj 10 Dakika Değerlendirme Test hücreleri ekindeki tablo değerlendirmede kullanılır. Hücre ve tablonun Lot numarası aynı olmalıdır.

ANTİKOR TANIMLAMA ET 1 2 3 4 5 6 ++++ +++ ++ + - - 7 8 9 10 11 Adı Soyadı Tarih ++++ +++ ++ + - Test Hücrelerinin Hazırlanması ( 11 li Enzimli Panel Hücresi ) Hücreler resüspanse edilerek oda ısısına getirilir 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Dağıtım 50 µl etiketine uyan test hücresi 25 µl hasta serumu veya plazma İnkübasyon 37 C de 15 Dakika Santrifüj 10 Dakika Değerlendirme Test hücreleri ekindeki tablo değerlendirmede kullanılır. Hücre ve tablonun Lot numarası aynı olmalıdır.

ANTİKOR TANIMLAMA CA 1 2 3 4 5 6 ++++ +++ ++ + - - 7 8 9 10 11 Adı Soyadı Tarih ++++ +++ ++ + - * Test Hücrelerinin Hazırlanması ( 11 li Normal Panel Hücresi ) Hücreler resüspanse edilerek oda ısısına getirilir 1 2 3 4 5 6 * 7 8 9 10 11 Dağıtım 50 µl etiketine uyan test hücresi 25 µl hasta serumu veya plazma İnkübasyon 4 C de 15 Dakika Santrifüj 10 Dakika * Normal Hücre ve Nacl / Enzym / Cold Aglutinin Kartı Kullanılır Değerlendirme Test hücreleri ekindeki tablo değerlendirmede kullanılır. Hücre ve tablonun Lot numarası aynı olmalıdır.

Değerlendirme

Antikor Tanımlama Anti-E

Elüsyon Eritrosite bağlı antikorların ayrıştırılıp tanımlanmasına yönelik Isı ile Kimyasal yollar ile

Çapraz Karşılaştırma ABO ve Rh sistemleri dışında bulunan kan grupları nedeniyle önemli Kan transfüzyonu öncesi yapılması gerekir Lewis; Lea - Le - Leb MN; M - N - S - s - U P; P1 - P2 - p Luteren; Lua - Lub Kell; K - k Duffy; Fya - Fyb İi; İ - i

Çapraz Karşılaştırma Aglutinasyon yok ~ uyumlu Aglutinasyon ~ uyumsuz Verici Eritrositi Hasta Serumu

Çapraz Karşılaştırma Hasta Eritrosit Süspansiyonu Hazırlanması ( % 0,8 lik Eritrosit Süspansiyonu ) 1 ml. Diluent-II (2 basım) 10 µl Hasta Kanı Dağıtım A B D Enz. AHG AHG Donör E.S. 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl - İnkübasyon 37 C de 15 Dakika Santrifüj 10 Dakika Değerlendirme Donör Eritrosit Süspansiyonu Hazırlanması ( % 0,8 lik Eritrosit Süspansiyonu ) 1 ml. Diluent-II (2 basım) 10 µl Donör Kanı Hasta E.S. 50 µl 50 µl 50 µl - - 50 µl Hasta Serumu - - - 25 µl 25 µl 25 µl Diluent-I 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl - -

Çapraz Karşılaştırma

Çapraz Karşılaştırma ABO Rh uygun kan % 98 uyum Antikor tarama -tanımlama Çapraz karşılaştırma % 2 ek uygunluk

Elektronik Çapraz Karşılaştırma

Ölçülebilir olanı ölç, ölçülemeyeni ölçülebilir hale getir. Galileo Galilei

Genomics Proteomics Glucomics

Genotip Belirleme Fetal kan gruplarının belirlenmesi (YDHH) Otoantikor varlığı (DAT+) Yakın dönemde çoklu kan transfüzyonu Nadir ve zayıf antijen eksprese edenler Hasta ya da vericide antijen gösterilemediğinde Antijen negatif kan tiplerinde, çıplak ve yeni allel tanımlamada Antikor tanımlama için verici tiplendirmede

PCR-SSP PCR-RFLP Taqman

"lab on a chip"

SNP Saptama Sistemleri

Technology Acceptance Model (TAM) Algılanan Kullanışlılık Dış Değişkenler Kullanıma Karşı Tutum Kullanım Niyeti Gerçek sistem kullanımı Algılanan Kullanım Kolaylığı Davis, F. D., Bagozzi, R. P., and Warshaw, P. R. "User Acceptance of Computer Technology: A Comparison of Two Theoretical Models," Management Science, 35, 1989, 982-1003.

Performans beklentisi Efor beklentisi Sosyal etki Unified Theory of Acceptance and Use of Technology (UTAUT) Kullanım niyeti Kullanım davranışı Kolaylaştırılmış Şartlar Cinsiyet Yaş Deneyim Gönüllü kullanım Venkatesh, V., Morris, M.G., Davis, F.D., and Davis, G.B. User Acceptance of Information Technology: Toward a Unified View, MIS Quarterly, 27, 2003, 425-478

Çoklu Analiz Sistemleri

Birçok biyobelirteç ve hücre içi sinyal sisteminin çoklu saptanması avantajı Antijen ya da antikorlar ELISA daki gibi bir zemine sabitlenirse planar array, mikrokürelere sabitlenirse Süspansiyon ya da bead array olarak adlandırılırlar. Planar Array Bead Array

Array Dizi Nesnelerin sistematik düzenlenmesi Genellikle satır ve sütünlar kullanılır

Planar Array Avantaj:Kompleks setler oluşturabilmek Problem: -Antijen üç boyutlu yapısının bozulabilmesi -Sterik engellenme

Bead Array Avantaj:Esneklik (Cihaz,taşıyıcı küre ) Sterik engellenme sorunu yok Problem:?

Antikor Temelli Protein Array 1.Plak ya da membrana sabitlenmiş antikor arrayde çözünür örneğin inkübasyonu 1 2 3 4 5 6 2. Aynı antijen setine özgül işaretli çözünür antikor eklenmesi 1 2 3 4 5 6 Veri seti 3. Kantitatif sinyal oluşumu 1 2 3 4 5 6

Multipleks Kitlerin Tek örnekte 20 den fazla analitin eş zamanlı ölçümü Aynı anda 20 den fazla analitin bireysel karşılaştırılması Sadece 25 µl örnek hacmiyle 20 den fazla analit ölçümü Geniş standart aralığı 96-çukurlu plak ya da tüplerde kolay uygulama Flow cytometry ve özel Luminex cihazlarda ortak kullanım Avantajları

Mikroküreler

1. Antikor kaplı küre 2. Antikor analiti tutar 3. Floresan işaretli raportör antikora bağlanan analite bağlanır Laser A 4. Küre ve raportör laser ışıkla sayılır Laser B

Kırmızı lazer küreyi okur Yeşil lazer hedef miktarını belirler

Yazılım analizi anında gerçekleştirir 1 saatten az sürede 10000 adet sonuç analizlenir.

Teknolojik Değişim im Serolojide teknolojiye paralel ilerlemeler: Multipleks ve paralel analizler Test tüpleri Mikrokuyucuklar Mikroaray Mikroküre temelli xmap

Akan Hücre Ölçer

Ön açı saçılımı PMT Işık kaynağı Floresan PMT Geniş açı saçılımı PMT Örnek girişi Floresan PMT Floresan PMT Emisyon Filtre blok Emisyon Filtre blok Oynar Ayna Mikroskop objektifi Mikroskop objektifi Uyarım filtre bloğu Oynar Ayna3 Oküler Oküler

Side Scatter (SSC) 90 sapma ~ Hücre yapıları Laser Y Forward Scatter (FSC) < 10 sapma ~ hücre büyüklüğü Floresan ve antijen yoğunluğu

Aynı anda kaç parametre çalışabilirsiniz?

60 parametreye ne dersiniz? Florokromlar ve ilişkili sorunlar da olmasa

Dr. Olga Ornatsky Dr. Scott D. Tanner CyTOF

Mass Cytometry

CyTOF Inductively Coupled Plasma Time-of-Flight Mass Spectrometer (ICP-TOF MS) -Kompleks matrikslerden stabil izotopların kantitatif ölçümü

CyTOF kütle sitometri şematik gösterimi Analytical Chemistry, Vol. 81, No. 16, August 15, 2009

Antikora metal içeren polimer takılması O. Ornatsky et al. / Journal of Immunological Methods 361 (2010) 1 20

KG1a (A) and Ramos (B) hücre serilerinin Mass Cytometry analizi (Flow-jo yazılımı ile) O. Ornatsky et al. / Journal of Immunological Methods 361 (2010) 1 20

Konjugat kullanmadan özgül antikor varlığını nasıl gösteririz?

AFM Atomik Kuvvet Mikroskopu

Moleküler Baskılama

Ağı nereye atacağınızı bilmeniz dileğiyle