Virüslere Karşı İmmün Yanıt Enfeksiyon İmmünolojisi Kursu Doç. Dr. Uluhan Sili Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Enfeksiyon Hast. ve Klin. Mikro. AD 1.11.2017
Anlatım Planı Virüslere karşı oluşan immün yanıtın entegre sunumu virüslerin dünyası antijen- APC- T lenfosit (responder-effector) ilişkileri doğal- adaptif immünite ilişkisi Hücresel adoptif immünoterapi antijene spesifik sitotoksik T-lenfosit (CTL) soylarının üretimi klinik denemeler
Hayvanlar Alemi Virüslerinin Sınıflandırılması
zorunlu hücre içi patojen bizimle/ bizde yaşayan hayat formlarının en basiti hepsi sonuçta konaklar arasında yayılabilmek için naif konakta enfeksiyon oluşturmayı ve çoğalmayı amaçlar konağı ile beraber evrimleşen virüsler: herpes virüsleri kazara (incidental) insanları enfekte eden virüsler: hemorajik ateş virüsleri, Batı Nil virüsü Ya HIV gibi bağışıklığın başarısız olduğu bir virüse benzer bir virüs bir de daha kolay örneğin solunumsal yolla yayılırsa ne yaparız? İmmünologlardan beklenen bağışıklığın farklı etmenlerinin nasıl birlikte çalıştıklarını anlamak ve doğadan daha iyi yaratıcı çözümler bulmak
Viral Patogenez
Tipik Bir Akut Enfeksiyon
Enfeksiyon Etmenlerine Karşı İmmün Yanıt
Antiviral Yanıt
Antiviral İmmün Yanıt Süreci
Doğal ve Adaptif Bağışıklık
Virüsle enfekte olan hücreler antiviral protein interferonu üretirler
Toll-like Receptors (TLR)
Lenfoid Dokuların Vücuttaki Dağılımı
Adaptif immün yanıtı dendritik hücreler başlatır
Dendritik hücrelerin (DC) periferik lenfoid dokuda etkin antijen sunucu hücreye (APC) dönüşmesi
Naif T lenfositlerin etkinleşmesi için 3 farklı sinyal gerekir
Effector T lenfositlerin enfekte hücreleri tanıması için kostimülasyona gerek yoktur
T lenfositlerin antijeni tanıması MHC kısıtlıdır
Majör Histokompatibilite Sınıf I Molekülünün Yapısı
Peptid- MHC Sınıf I Molekülü Bağlantı Noktaları
T hücre reseptörü MHC-peptid kompleksini tanır
CD8+ Sitotoksik T Lenfositler
T hücrelerinin merkezi ve çepersel hafıza hücrelerine dönüşmesini CCR7 kemokin reseptör ekspresyonu belirler
CD4 + T yardımcı hücreler (THL) hafıza CD8 + CTL lerin hem oluşması hem de idamesi için gereklidir
Virüslerin İmmün Yanıttan Kaçış Mekanizmaları Mekanizma Hümoral yanıt Antikordan saklanma Antijenik varyasyon İnterferon Yapımını durdurma Etkisini durdurma İmmün hücre fonksiyonu DC fonksiyonunu bozma Lenfosit fonksiyonunu bozma İmmunosupresif faktörler Antijen Sunumunu Bozma MHC-1 ekspresyonunu azaltma Enflamasyonun inhibisyonu Sitokinleri durdurma Viral Örnekler Latent enfeksiyon (herpes virüsler, retrovirüsler), hücreden hücreye geçiş (HSV, VZV, HIV) Enfeksiyon sonrası genetik değişiklikler (lentivirüsler, HIV), influenza (drift/shift) İnhibisyon (HBV), IL-10 analoğu ile bloklama (EBV) dsrna ile IFN indüksiyonunu bloklama IFN-ß indüksiyonu CD8 leri bloklama (HSV), CD4 leri öldürme ve makrofajları bozma (HIV), NK/T ve B hücreleri suprese etme (kızamık) CD4 THL lerin BCRF-1 ile supresyonu (EBV) Adenovirüs, CMV, HSV IL-1 veya TNF etkisini bloklama (poxvirüsleri, adenovirüsler)
Virüslere Özgül Sitotoksik T Lenfosit (CTL) Soyları İle Adoptif İmmünoterapi CTL ler ile adoptif immunoterapi 1. Donör lenfosit transfüzyonu 2. Klonal antijene özgül CTL transfüzyonu 3. Polyklonal antijene özgül CTL transfüzyonu 4. CAR-T hücreleri ile kanser tedavisi Allojenik KİT sonrası gelişen CMV hastalığından korumak için CMV ye özgül CTL soyu oluşturulması Sili U et al. 2003, Leen AM et al. 2006, Sili U et al. 2012
In vitro Yaklaşımın Avantajları T lenfositlerinin fenotip ve fonksiyonları tedavi öncesi belirlenebilir Anti-tümör/viral aktivite gösterilebilir Gerektiğinde ilave infüzyonlar yapılabilir Marker genler kullanılarak CTL lerin in vivo kalıcılığı ve fonksiyonu gözlenebilir Suicide tip genler aktarılarak bir yan etki görüldüğünde CTL ler ortadan kaldırılabilir Fonksiyonel genler aktarılarak CTL lerin in vivo etkinliği arttırılabilir
Sitomegalovirus http://www.biografix.de/
Adoptif İmmünoterapi için İdeal CTL Soyu Üretimi İdeal CTL Soyu poliklonal pek çok epitop tanımalı CD8 + CTL ler ve CD4 + THL lar birlikte İdeal CTL Metodu yeterli sayıda hücre (10 9 ) güvenilir, kolay uygulanabilir ve cgmp-onaylanabilir özel HLA tipi gereksinimi olmamalı bütün antijen
CMV ye Özgül CTL ve THL Aktivasyonu Ad-GFPpp65 CTL MHC-sınıf I GFPpp65 Aj işleme/sunma MHC-sınıf II
Dendritik Hücreler (DC) Kullanılarak pp65 ye Özgül T Lenfosit Soylarının Çoğaltılması DC Stimulator S:R ratio +IL-2 +IL-2 PBMC responder CTL soyu Gün 0 Gün 8 Gün 17 Gün 25 CMV spesifik? Allo reaktif?
T Lenfositlerini Çalışma Metodları tetramer CTL IFN- hedef IFN- Flow-sitometri ile ICCS ve tetramer analizi ELISPOT Chromium-51 Salınım testi
Dendritik Hücrelerin Adenoviral Transdüksiyonu- I Negative Ad5 GFPpp65 500 moi Ad5f35 GFPpp65 1 moi 10 moi 100 moi
GFP GFP GFP Dendritik Hücrelerin Adenoviral Transdüksiyonu- II olgunlaşmamış olgun neg neg Ad5GFP Ad5GFPpp65 0.3 0.9 70 20 HLA-DR 0.4 0.1 66 18 lineage 0.9 0.3 62 19 CD83 3 88 MOI 500 46±12% 26±12%
pp65 sentezleyen DC ler CMV ye özgül CTL leri aktive ederler Gün 0 Gün 7 Ad5 GFPpp65 Ad5 GFP 1.8% 56% 0.8% CD8 tetramer
CTL kümeleri
IFN Salgılayan T Lenfositlerin Artan Oranı Gün 0 Gün 8 Gün 17 1:1 LCL*pp65 1:2 1:4 1:8 1:1 LCL*GFP pp65-spesifik oran = 0.08 0.33 37.87 1:2 1:4 1:8
CMV Spesifik Sitolitik Aktivite % specific lysis 40 35 30 25 20 15 10 5 auto + CMV auto + mock allo + CMV 0-5 2.5:1 5:1 10:1 20:1 40:1 CTL/hedef hücre oranları
CMV Spesifik MHC-I Kısıtlı Sitolitik Aktivite % specific lysis 40 35 30 25 20 15 10 5 0 auto + CMV mock isotype anti-i anti-ii
Hücre sayısı Antijen Spesifik T Lenfositlerin Çoğaltılması 1.0E+10 100 A2 B7 1.0E+09 1.0E+08 number hücre sayısı of cells 1.0E+10 % tetramer + CD8 + 10 242832364044485256 1.0E+07 1.0E+09 1.0E+08 1 24 28 32 36 40 44 48 52 56 1.0E+07 gün
CD69 pp65 e Özgül CD4 + THL Aktivitesi 1.5 1.4 Vacc-lacZ 6.2 11.2 Vacc-pp65 7.4 12.7 Vacc-pp65 + anti-i 2.1 3.1 Vacc-pp65 + anti-ii IL-2 IFN-
Ad5f35pp65 1:40-1:60 1:4-1:6 1:4 1:4 Gün 0 Gün 9 Gün 17 Gün 25 +IL-2 PBMC zenginleştirme çoğaltma CTL soyu Poliklonal Birden fazla epitopu tanıyan CD8 + ve CD4 + karışık Yeterli sayıda hücre üreten
Relative CD8 + T cell number Hafıza CD8 + T Lenfositlerin Oluşumu Naïve Memory Effector (CTL) expansion contraction stabilization 0 8 15 30 60 Days post infection Kaech SM et al., 2002
tetramer Sınırlayıcı S:R (1:60) oranında bile hafıza CD8 + T hücreleri çoğalır FC104O02.069 d1 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 FC108O02.101 CFSE CFSE d4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 U101102.003 CFSE d8 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 CFSE
İlk Çoğalma Döngüsünde IL-2 ve IFN Üretimi 6000 5000 IFN- IL-2 pg/ml pg/ml 4000 3000 2000 1000 0 160 140 120 100 80 60 40 20 0 0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10 days exp. 1 exp. 2 exp. 1 exp. 2
CD8 Uyarılmış Hafıza CD8 + T Lenfositlerin Çoğalması IL-2 Bağımlı FC127U03.041 d9 23% R5 R4 R3 R2 Isotype 1 g/ml R6 10 0 10 1 FC127U03.044 10 2 10 3 10 4 CFSE 1.3% R5 R4 R3 R2 CFSE Anti IL-2 1 g/ml R6 10 0 10 1 FC127U03.046 10 2 10 3 10 4 CFSE 1.1% R5 R4 R3 R2 Anti IL-2R 1 g/ml R6 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 CFSE
Effector CTL çoğalması APC fazlalığına ve ekzojen IL-2 ye bağımlı S to R D0 D3 D6 D1 1 to 10 -sınırlayıcı- 10 to 1 -fazla- 10 to 1 + IL-2
SONUÇ Hafıza sınırlayıcı APC 7-10 bölünme otokrin IL-2 Effector fazla APC 7-10 bölünme ekzojen IL-2 ye bağımlı İki alt grup; farklılaşmasının sonunda (terminal) ve çoğalmaya eğilimli (proliferative)
Klinik Deneme Planı (2004) Donör bulunması Kök Hücre Transplantasyonu Donör LCL lerin üretilmesi 4-6 hafta Donör CMV-CTL lerin üretilmesi 4-6 hafta aktivasyon çoğaltma güvenilirlik ve etkinlik testleri GCV profilaksisi CTL infüzyonu Geç CMV gün -30 0 30 90 120 150
15 hastanın 14 ünde EBV, CMV ve adenovirüse karşı CTL soyu üretilebildi; 1 hastada EBV ve CMV ye karşı etkinlik vardı. 11 allojenik KİT hastasına transfüzyon yapıldı. Hiçbirinde GvHD veya toksisite gözlenmedi.
Virüslere özgül lenfosit yanıtının adoptif aktarımı
Peptid dizini (epitop kütüphanesi) 15 aa uzunlukta, birbirleriyle 11 aa örtüşen peptid dizinleri Olası tüm CD4 ve CD8 epitoplarının kapsanması Viral antijen Sili U et al. HCV-specific lymphocyte responses in individuals with positive anti-hcv but negative HCV-RNA. J Clin Virol. 2015 Jun;67:73-7.
İlginiz İçin Teşekkürler! Doç. Dr. Uluhan Sili Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Enfeksiyon Hast. ve Klin. Mikro. AD uluhan@hotmail.com
Shaping the Antiviral Response
Adaptif İmmün Yanıtı Dendritik Hücreler Başlatır
Courtesy of Malcolm Brenner, 2004 MODEL: Can failure of chrec to fully activate T cells be overcome by expressing target antigen on optimal APC? Autologous EBV-LCL B7-1, 2 B7-H3 41BBL OX-40L CD58, CD59 LFA-1 EBV antigen on MHC T cell ALL blast
Lineage of Memory CD8 + T cells Subset model +Ag Effector Naive Memory Linear model +Ag (no Ag) Naive Effector Memory
Adoptive Immunotherapy and Memory T cells CTL lines- derived from resting memory T cells After infusion; effector functions- elimination of antigen memory functions- persistence, protection The persistence of memory Salvador Dali, 1931