MEDİKAL BÖBREK BİYOPSİ KILAVUZU

Transkript

1 MEDİKAL BÖBREK BİYOPSİ KILAVUZU

2 Nefropatoloji çalışma grubu 2010 İçindekiler Giriş 2 A- Renal Doku Örneklenmesi, Dokunun gönderilmesi, Dokunun takibi 2 1. Biopsi istem kâğıdında doldurulması zorunlu olan bilgiler 2

3 2. Doku örneklenmesi, doku boyutu, yeterlilik kriterleri 2 3. Dokunun Gönderilmesi 3 4. Böbrek biyopsisinin ele alınması, fiksasyon ve kesit 4 5. Boyama 7 B- İmmunflöresan, immunhistokimya ve elektron mikroskobi için öneriler 8 1. İmmünofloresan - immunhistokimya 8 2. Elektron mikroskobi 8 C- Renal biyopsinin sistematik değerlendirmesi ve raporlama için öneriler 9 D- Böbrek biyopsisinde saptanabilecek glomerüler hasar paternleri ve hastalıklar 10 E- Böbrek biyopsisinde saptanabilecek tübülointerstisyel hasar ve hastalıklar 11 Ek 1- Böbrek biyopsisi değerlendirme için öneriler Nativ öbrek biopsisi Transplant böbrek biopsisi 13 Ek 2- Avrupa Nefropatoloji çalışma grubunca önerilen teknik yöntemler 15 Ek 3- Nativ Böbrek Biyopsi Formu 18 Ek 4- Transplant Böbrek Biyopsi Formu 19 Kaynaklar 20

4 Giriş Patoloji Dernekleri Federasyonu, Nefropatoloji Çalışma grubu medikal amaçlı nativ ve transplant böbrek biopsilerinin standart şekilde değerlendirilmesi için doku örneklerinin ayrılması, takibi, kesitler ve boyamalar için gerekli basamakları ve değerlendirme raporunun gerekli içeriklerini (Ek 1) aşağıdaki gibi önermektedir. Bu önerilerde Avrupa Nefropatoloji çalışma grubu kaynakları da yer almaktadır (Ek 2). Bu amaçla ilgili kliniklerin yeterli bilgi içeren biopsi istem formları ile biopsilerini göndermeleri gerekmektedir (Ek 3 ve Ek 4). A- Renal Doku Örneklenmesi, Dokunun gönderilmesi, Dokunun takibi 1. Biopsi istem kâğıdında doldurulması zorunlu olan bilgiler İdrar: Proteinüri Hematüri

5 Lökositüri Silendirüri Serum: Üre Kreatinin Kolesterol Total protein Kreatinin klirens C3-C4 ANA ANCA Anti-GBM HBV HCV Sistemik: Hipertansiyon varlığı ı Diyabet varlığı Sistemik hastalık varlığı Viral Hepatit varlığı 2. Doku örneklenmesi, doku boyutu, yeterlilik kriterleri

6 Yeterlilik için tercih edilen en az 1 cm uzunluğunda iki kor biyopsidir. Böbrek biyopsilerinin gauge iğne ile alınması önerilir. Biyopsi yapılan iğne kalınlığı dramatik olarak elde edilecek olan biyopsinin kalitesini etkiler. 18 ve 19 gauge iğneler oldukça küçük, ince örneklerin alınmasına neden olur ve sıklıkla damarların varlığı bu örneklerde izlenemez. Biyopsi iğnesinden doku nazikçe çıkarılmalıdır. Ezilme artefaktını önlemek için forseps kullanılmaz. İğne içinden biyopsi çıkarılırken çekilip uzatılmaz. Baskı uygulanmadan doku serum fizyolojik ile ıslatılmış gazlı bez üzerine çıkarılır. Örnekleme yapılacak lokalisazyonda yeterlilik açısından önemlidir. Subkapsüler kortikal bölgeden alınan biyopsilerde yaşlanma, hipertansiyon ve diğer nonspesifik skarlanma nedenlerine bağlı olarak global sklerozis varlığı çok olacaktır ve böbreğin bütününe göre yüksek sayıda global sklerotik glomerül izlenecektir. FSGS de en erken olarak jukstamedüller glomerüller segmental sklerozis ile tutulum gösterdiğinden dolayı optimal değerlendirme için bu bölgenin de biyopsi kapsamı içinde olması gereklidir. Işık mikroskopik incelemede fokal lezyonları %95 in üzerinde doğru olarak saptamak için en az 25 glomerüle ihtiyaç vardır. Biyopsinin tanı için yeterlilik kriterleri tanıya göre değişir. Amiloidoz tanısı için medülla yeterlidir, membranöz glomerülonefritte immunflöresan (İF) ve ışık mikroskobide (IM) birer glomerül yetebilir. Ancak SLE ve İgA gibi hastalıklarda İF

7 de bir glomerül yeterli iken, IM de glomerül sayısının fazlalığı daha fazla prognostik bilgi verir. Fokal segmental skleroz tanısı için glomerül sayısının çok olması histopatolojik bulgunun yakalanma şansını artırır. Transplant böbrek biopsilerinde Banff klasifikasyonu biyopsi yeterlilik kriterlerini tanımlamıştır. Bu tanımlamalar çalışmaların standardizasyonu için gereklidir, hasta bazında az sayıda glomerül ile her biyopsi ipuçları verebilir. ESP nefropatoloji çalışma grubu çalışılan patolojiye göre biopsi yeterlilik kriterlerini aşağıdaki gibi tanımlamıştır. İncelenen patoloji En az kortikal En az glomerül sayısı boyut Glomerüler yumak > 2 (mm) > 5

8 Tübülo interstisyel lezyonlar > 3 (mm) > 8 Sklerotik glomerül (% tüm glomerüle oran) > 5 (mm) > 13 Kresentler (% tüm glomerüle oran) > 5 (mm) > 15 Transplant biyopsileri için Banff kriterlerinde tanımlanan yeterlilik Yetersiz: 1 6 glomerül, arter yok Optimal: > 15 glomerül, 2 arter* *Not Transplantın ilk 6 ayında ne kadar çok renal doku incelenirse glomerulit ve endoteliti saptamak açısından o kadar önemlidir. Nativ böbrek biyopsilerinde yeterlilik Optimal örnek boyutu: >5mm2 >15 glomerüle denk gelen* *Not; Çocukluk çağı nefrotik sendromlarda FSGS in ekarte edilebilmesi için çok sayıda glomerülün incelenmesi önemlidir. Eğer kesitlerde 15 taneden az glomerül izleniyorsa mevcut glomerüllerin çok sayıda seri kesitleri incelenmelidir. Not: Biyopsi örnekleri yeterlilik kriterlerine uymasa bile tün örnekler ayrıntılı olarak değerlendirilmeli ve tek glomerül dahi olsa değerlendirme yapılmalıdır. Çünkü tek glomerül ile bile eğer demostratif bulgular izleniyorsa tanı koymak mümkün olacaktır. Örneğin IF ile tek bir glomerülde IgA nefriti tanısı verilebilir. Yada kresent izlenen bir glomerül hastalık açısından fikir verir. Hiç glomerül dahi olmayan vakalarda amiloid tanısı veya tübülointerstisyel bulguları vermek açısından yararlı olacaktır. 3. Dokunun Gönderilmesi Alınan biyopsinin ayrılması ve gönderilmesi çeşitli faktörlere göre değişkenlik gösterir 1-Biyopsinin nativ böbrek yada transplant böbreğe ait olması 2-Klinik problem 3-Biopsinin alındığı lokal hastahane - değerlendirme yada konsültasyon için uzak merkez hastahane Lokal hastahane için yapılacak işlemler: Biyopsinin fikse edilmeden taze olarak gönderilmesi uygundur. EM, LM ve IF için biyopsinin ayrılması patolojide yapılacaktır. Doku nazikçe ezilmeden ve çekiştirip uzatmadan biyopsi iğnesinden çıkarılır ve serum fizyolojik ile ıslatılmış gazlı bez ya da filtre kâğıt üzerine konularak petri kap içinde gönderilir. Doku eğer kuru gazlı bez içinde ya da normal su ile ıslatılmış gazlı bez içinde gönderilirse desiccation artefaktı ve ozmotik hasar gelişir. Doku soğuk salin içinde gönderilirse donma artefaktı gelişir.

9 Transport sıvısı içinde ya da PBS (+40C) içinde de gönderilebilir. Tespit edilmeden gönderilecek taze doku soğuk zincir bozulmadan, beklemeden 15 dakika içinde patolojiye gönderilmelidir. Uzak hastahane için yapılacak işlemler*: Biyopsi fikse edilmeden taze olarak lokal hastanenin patoloji bölümüne gönderilir (yukarıdaki basamaklara uygun şekilde). Biyopsi EM, IM ve IF için lokal hastanenin patoloji bölümünde uygun olarak parçalara ayrılır. IF için ayrılan parça Michel s fiksatif içinde (modified Michel s fixative-zeus medium) veya McCoy (RPMI) gibi transport solusyonları içinde gönderilebilir. Transport solusyonu ile gelen materyaller tampon solusyon ile yıkanmalıdır Transport mediumu olmayanlar IF için ayırdıkları parçadan frozen kesit aldıktan sonra bu kesitleri kapalı mapeler içinde kuru buz dolu buzluklar içinde

10 gönderebilir. EM için ayrılan parçalar %2-3 gluteraldehit (+40C) veya %1-4 paraformaldehit içinde gönderilmelidir. IM için ayrılan parçalar ise %10 tamponlanmış formalin içinde gönderilmelidir. *Not: Biopsi ayrılması, takibi ve gönderilmesi için lokal ve uzak hastane yapılacak işlemler konusunda karşılıklı protokol oluşturulmalıdır. 4. Böbrek biyopsisinin ele alınması, fiksasyon ve kesit Tespit olmamış taze olarak tampon solusyonu içinde gönderilen böbrek biyopsisi gelir gelmez diseksiyon mikroskobu altında parçalara ayrılarak IF, EM ve IM için örnekler elde edilir. İmmunflöresan mikroskobi Tampon solusyondaki böbrek biyopsi örneğini dikkatlice şişeden çıkarın, dokuyu zedelemeden bir lam üzerine alın. Materyali lam üzerinde düzeltin. Kurumaması için üzerine tampon solusyondan birkaç damla damlatın veya üzerini kaplayın. Diseksiyon mikroskobu altında dokuyu inceleyin. Diseksiyon mikroskobu olmadığında iyi bir büyüteç yada ışık mikroskobunu bu amaçla kullanabiliriniz (deneyim gerektirir). Diseksiyon mikroskobu altında öncelikle glomerül içeren korteks ile glomerülsüz medullayı ayırmaya çalışın. Varsa yağ ve bağ doku parçalarını da ayırın. Medüllayı tanımak herzaman daha kolaydır. Medüller tüpler çizgiler şeklinde görülür, daha beyazdır, korteks ise glomerüller (kanlı küçük toplar veya yumaklar, boşluklar veya kabarık yumaklar, kabarıklıklar olarak görülür) (Resim 1) ve farklı nitelikteki kortikal tüplerden oluşur. Kronik tübülo-interstisyel değişiklikler ve kresentik glomerülonefrit varsa glomerüller zorlukla seçilebilir ya da ayırt edilemeyebilir.

11

12

13 Resim 1: Disseksiyon mikroskobu altında böbrek biyopsi görünümü. (a) Renal korteks. Glomerüller yuvarlak kırmızı alanlar olarak izlenir. (Doku tampon sıvısı ile ıslatılmalı, bazen knsız boşluklar gibi görülebilir) (b) Renal medulla. Kırmızımsı damarlanma ile uyumlu alanlar izlenir. Direkt glomerüler inceleme yapılamayan yerlerde biyopsiyi ayırmak için standart önerilen protokol uygulanır (Resim 2). Bu yöntemde biyopsinin iki ucundan parça EM için ayrılır. Diğer kalan biyopsiler IM

14 ve IF için karşılıklı olarak eşitlenecek şekilde ayrılır. (Resim 2). Resim 2: Diyagram disseksiyon mikroskobu olmayan labratuvarlarda renal biyopsi korunun IF, EM ve IM için parçalara ayrılmasını göstermektedir. Biyopsinin iki ucu kesilerek EM için ayrılır. Diğer kalan doku aşağıdaki gibi kesilerek IF ve IM için ayrılır. Biyopsi örneği çok küçük ise hastalığın klinik önemi göz önünde bulundurularak doku değerlendirilir. Böyle durumlarda dokunun İF incelenmesi önemli ise İF tercih edilmelidir. (İF inceleme anti-gbm hastalığı ve İgA nefropatileri için daha çok gereklidir. Tek bir glomerülün İF incelenmesi nefrotik sendromlu hastalarda tanıya gitmekte yardımcı olabilir İmmunfloresan (İF) inceleme aksi belirtilmedikçe ve doku uygun ise tüm native böbrek biopsi olgularında rutin olarak yapılmalıdır. İmmunfluoresan inceleme için dokunun büyüklüğüne göre biyopsinin bir ucundaki korteksten 2-5 mm parça, keskin bir bistürü ile ayrılır (Genelde 3 glomerül içeren doku içerecek

15 şekilde) Bu sırada doku zedelenmemeli ve ezilmemelidir. Forseps kullanılmamalı, doku sıkıştırılmamalıdır. Biyopsiler genelde iki ayrı kor olarak gelir. İmmunoflöresan inceleme parçası çok glomerül içeren kordan ayrılmalıdır. Korlardan biri az glomerül içeriyor veya medülla ise biyopsi korlarının ayrı ayrı takip edilmesi iyi olabilir, aksi halde tek bloklama yapılabilir. Ancak tercih edilen her korun ayrı ayrı bloklanmasıdır. İmmun fluoresan inceleme parçası frozen cihazında direkt olarak dondurulabilir. Dondurma bloğuna yeterli miktar dondurma jeli seviye oluşturmak amacıyla konur, jel dondurulur. Daha sonra üzeri lama sürtülerek düzleştirilir. İF için ayrılan böbrek materyali bunun üzerine düzgünce yatırıldıktan sonra üzerine tekrar birkaç damla dondurma jeli eklenir, kapanması sağlanır. Dokuyu dondurmanın ani ve tercihen -50 derecenin altına olması önemlidir. Bu nedenle olanak varsa ani dondurma sağlayan sıvı azot, karbon dioksit jel kullanılmalıdır. IF için alınan parçalardan frozen kesit alınarak boyanır ve hemen boyamayı takiben değerlendirilir. Elekton mikroskobi Aynı şekilde EM incelemesi için biyopsinin bir ucundaki korteksten 3 glomerül içeren doku temiz bistüri ile kesilerek EM için ayrılır ve parça %2-3 gluteraldehit veya %1-4 paraformaldehit içine konur. EM için ayrılan parça EM labratuvarına gönderilir. Beklemesi gerekiyorsa + 4 derecede saklanır. Işık Mikroskobi IF ve EM dokularını ayırdıktan sonra arta kalan doku örneklerinin tümü %10 tamponlanmış formalin içine alınır ve tesbit edildikten sonra düzgün olarak biyopsiler kasete konulur rutin inceleme için takibe girer. Biyopsiler düzeltilerek (çizgisel) kasetlere konmalı ve 1.5 cmden uzun örnekler ikiye bölünmelidir. Küçük korteks alanı içeren büyük biyopsilerde veya korteksin kesitte kaybolabileceği düşünülen olgularda korteks ayrı blok olarak takip edilmelidir. Korlardan biri az glomerül içeriyor veya medülla ise örneklerin ayrı ayrı takip edilmesi uygun olabilir. Takip işlemi için kısa ve uzun takip protokolleri uygulanabilir. Doku bu işlemden sonra bloklanır. Gömme işlemi sırasında antijeniteyi korumak için 60 derecenin üstüne çıkılmamalıdır. Dokular 2-3 µm kalınlığında kesilmeli, Her lama 2 3 kesit alınmalı ve tüm kesitlerin kalınlıkları hep aynı incelikte olmalıdır. İdeal olarak kesit alınması ve incelenmesi önerilir. Kesitler slaytlara alınırken kesme sırasına göre alınmalıdır (lamlar numaralandırılmalıdır).

16 Kesit alma işlemi sırasında ek olarak boyasız 3 kesit alınmalıdır. Bu işlem kesit gerektiği zaman gereksiz doku kaybını önleyecektir. İmmunhistokimyasal inceleme olanağı varsa 1-3 lam arası boş kesit bu işlem içinde alınabilir. 5. Boyamalar Böbrek biopsileri farklı seviyelere ait rutin hematoksilen eozin yanı sıra periodik asit-schiff (PAS), Masson trikrom, Jones metanamine silver, Kongo red boyamaların incelenmesi ile raporlanır. Gereğinde opsiyonel diğer boyama teknikleri uygulanır. Rutin boyamalar H&E: Rutin olarak en az 3 ayrı seviye ve lam önerilmektedir. Periodik asit-schiff (PAS) boyası. Glomerül, tübül bazal membranlarını ve mezangial matriksi gösterir. Proksimal tübüllerin fırçamsı kenarı, Tomm Horsfall proteinleri ve tübüllerdeki protein damlacıkları veya hyalin materyallerde pozitif boyanır. Masson trikrom tekniği. Glomerül bazal membran, interstisyum, protein depozitleri ortaya koymak için uygulanır. Fibrotik ve sklerotik alanları belirler.

17 Gümüşleme tekniği (Jones metanamine silver). Glomerül ve tübül bazal membranlarını gösterir. Glomerül bazal membran değişiklikleri, reduplikasyon, spike gibi değişiklikleri gösterir. Kollaps alanlarında yardımcıdır. PASM: PAS boyasına ek PASM yapılması da önerilmektedir. Kongo Red: Ülkemizde amiloid insidansı FMF nedeni ile yüksek olduğundan tüm örneklere rutin olarak yapılması önerilir. (Diğer kesitlerden farklı olarak kesitler kalın tercihan 8 16 mikron alınmalıdır) Opsiyonel boyamalar Von Kossa (kalsifikasyonlar için) Asid-fuchsin: protein boyası, immün depositleri göstermek için kullanılabilir Orange G boyası: protein boyası, immün depositleri göstermek için kullanılabilir PTAH: fibrin ve benzeri birikimler için Demir boyası B- İmmunflöresan, immunhistokimya ve elektron mikroskobi için öneriler İmmunflöresan incelemede direkt yöntem ve taze doku kullanılmaktadır. Olanak olmadığında parafin kesitler ve immunhistokimyadan yardım alınabilir (Ek 2). 1. İmmünofloresan - immunohistokimya- Glomerüler hastalıkların büyük bölümü immunkompleksler aracılıklıdır. İmmünfluoresans inceleme ile değişik tipteki immünglobülinler, antijenler, kompleman fragmanları, fibrinle ilişkili proteinler ve hücre yüzey belirleyicileri gösterilebilir. Rutin olarak immunoglobulinler (IgG, IgM, IgA), kompleman faktörleri (C1q, C3, C4), kappa ve lambda hafif zincirlerine karşı işaretli antikorlar kullanılarak, direkt yöntemle flöresan mikroskopta birikimlerin varlığı değerlendirilir. Birikim yeri ve paterni ile birikim şiddeti raporlarda belirtilir. İmmunflöresan inceleme yapılamadığı koşullarda immunhistokimyasal inceleme yardımı alınabilir. Endikasyonlu transplant böbrek biopsilerinde (proteinüri, hematüri, rekürrens

18 kuşkusu) ve 6 aydan sonrasında immunflöresan inceleme rutin uygulanmalıdır. Tüm transplant biyopsilerinde C4d biyopsilere rutin boyanmalıdır. Aşağıdaki hastalıkların tanısı için immunflöresan inceleme şarttır. Hafif zincir birliktelikli hastalıklar AL amiloid Monoklonal immunglobülin depo hastalıkları Hafif zincir depo hastalığı IgA nefropati/hsp IgM nefropati C1q nefropati Antiglomerül bazal membran hastalığı 2. Elektron mikroskopi Elektron mikroskobu (EM) ışık ve flöresan mikroskobik incelemede ortaya konamayan glomerüler lezyonların ince detayını anlamak için gerekli bir yöntemdir.

19 Nativ böbrek biyopsilerinin hepsine mümkünse rutin EM yapılması önerilir. Özellikle çocukluk çağı böbrek lezyonlarına rutin olarak yapılması gereklidir. Transplant biyopsileri için her zaman EM için örnek ayırmak önemlidir (proteinüri veya şüpheli ışık mikroskopisi için). Transplant biyopsilerinde primer hastalığın rekürensini ekarte etmek için ilk 6 ay EM yapılması önerilir ancak 6 aydan sonra her zaman yapılması lazımdır. EM labratuvarı olmayan merkezler diğer merkezlere gönderebilirler. EM ile glomerüler yapıda, bazal membranlar, hücreler ve mezangial matriks özellikleri değerlendirilir. GBM kalınlığı ve konturu, interpozisyonu gibi özellikleri daha iyi değerlendirilir. Glomerül yapısındaki endotel, mezangial ve visseral epitel hücrelerde dejeneratif değişiklikler, birikimler ve inklüzyonlar ile epitel hücreleri ayaksı çıkıntıları değerlendirilir. Elektron yoğun birikimlerin kesin lokalizasyonu (subendotelyal, subepitelyal, intramebranöz, birikim özellikleri granüler (ince, kaba), horgüç ve dağılımı raporlanır. Benzer şekilde tübüler ve vasküler değişikliklerde değerlendirilir. Aşağıdaki hastalıklarda elektron mikroskobu olmadan kesin tanı konulamaz. Fibriller glomerülopati/ immuntaktoid GN Nail-patella sendromu Lipoprotein glomerülopati Dens deposit hastalığı (Tip II MPGN) Alport sendromu İnce glomerüler bazal membran nefropatisi Kollagenofibrotik glomerülopati

20 C- Renal biyopsinin sistematik değerlendirmesi ve raporlama için öneriler Avrupa nefropatoloji grubununda belirtiği gibi bir renal biyopsiyi sistematik olarak değerlendirirken aşağıdakilerin uygulanması yerinde olur. a. Klinik istem kağıdını okumadan biyopsiyi değerlendirmeye başlayın, klinik bilgiler biopsiyi değerlendirmenizi etkileyebilir. Ön değerlendirme yaptıktan sonra klinik bilgiyi okuyunuz. b. Öncelikle küçük büyütmede PAS ve Mason trikrom boyamalarını tarayın ve böbreğin farklı alanlarındaki (glomerül, damarlar, tubulointerstisyel alan) lezyonların fokal veya diffüz olup olmadığını ve en çok hangi alanın etkilendiğini tanımlayın. Biyopsiye ilk bakışta, küçük büyütmede atrofiyi öncelikle değerlendirmek, problemin kronik ya da tümüyle akut ya da kronik zeminde akut tablo olup olmadığını anlamak için kolay bir başlangıç olabilir. c. Glomerülleri ve arterleri sayın, sklerotik glomerül ve arter sayısını belirle. d. Her glomerülü büyük büyütme altında tek tek incele. Glomerüler lezyonları tarifle.

21 e. Arteriolleri sistematik olarak tarayın. Glomerüllerin yarısı kadar arteriol bulmalısınız, deneyim ile bu sayı glomerül sayısına kadar artabilir. f. Normal böbrek biyopsisinde juxta-glomerular apparatus belirsizdir. Eğer glomerüllerin %20 sinden fazlasında juxta-glomerular apparatus belirgin olarak izleniyorsa en azında hafif hipertrofiden bahsedilmelidir. g. Biyopside en azından bir adet (iki tane olması tercih edilir) interlobular arter kesitinin olması önemlidir. Bu özellike transplant biyopsilerinde önemlidir. Lezyonlar arterleri fokal olarak tutukları için tüm kesitlerin incelenmesi şarttır. h. Arterde izlenen lezyonları tarifleyin. i. Örnekler 1. Elastozis ile birliktelik gösteren/ göstermeyen intimal fibrozis 2. Proliferasyon, nekroz, infiltrasyon 3. Damar lümeninin daralması i. Tübülointerstisyel alanı inceleyin bulgu varsa belirleyin ve raporlayın. i. Ödem, fibrozis (fibrozis tipini tarifle, diffüz, fokal, yama şeklinde), ii. tübüler atrofi, iii. interstisyel sellüler infiltrasyon, iv. tübüler epitelyal değişiklikler, nekroz j. Her kompartmanı gösteren üç morfolojik tanı olmalı k. Tanıyı primer olarak morfolojik bulgulara dayandır. Daha sonra klinik bilgiyi oku ve tanını klinik tanı ile karşılaştır. Eğer tanın tüm klinik sorulara yanıt veriyorsa vakanı raporla. Eğer tanın klinik bulgular ile çelişiyorsa biyopsiyi yeniden değerlendir. Gerekirse klinik doktorundan ek bilgi iste.

22 D- Böbrek biyopsisinde saptanabilecek glomerüler hasar paternleri ve hastalıklar Işık mikroskobunda anormal özellik yok. Glomerüler hastalık yok Işık mikroskobu bulgusu olmayan glomerüler hastalık var Minimal lezyon hastalığı, İnce bazal membran hastalığı) Hafif veya erken dönem glomerüler hastalıklar Lupus nefriti, İgA nefropatisi, C1q nefropatisi, membranöz glomerülonefrit, amiloidoz, Alport sendromu GBM kalınlaşması-hipersellülarite ve mesanjial genişleme olmadan

23 Membranöz glomerülopati (primer veya sekonder) Trombotik mikroanjiopati genişlemiş subendotelial zon ile Pre-eklamsi/eklamsi endotelyal şişme ile Fibriller glomerülonefrit predominant kapiller duvar birikimleri ile GBM kalınlaşması-az veya hipersellülarite olmayan mezangial genişleme Diyabetik glomerüloskleroz diffüz form Sekonder membranöz glomerülonefrit- mezangial immün birikim ile Amiloidoz Monoklonal immunglobülin depo hastalıkları Fibriller glomerülonefrit Dense-deposit hastalığı (Tip II MPGN) Focal ve segmental glomerüler skleroz-hipersellülarite olmadan Fokal ve segmental glomerüloskleroz (primer- sekonder) Fokal glomerülonefritlerin kronik sklerotik fazı Herediter nefrit (Alport sendromu) Mezangial veya endokapiller hipersellülarite Fokal veya diffüz mesangioparoliferatif glomerülonefrit Fokal veya diffüz endokapiller proliferatif glomerülonefrit Akut diffüz proliferatif postenfeksiyöz glomerülonefrit Membranoproliferatif glomerülonefrit (tip I, II, ve III) Ekstra kapiller hipersellülarite ANCA pozitif kresentik glomerülonefrit (İF de immunglobülin birikimi yok) İmmun kompleks kresentik glomerülonefrit (İF de granüler immünglobülin)

24 Anti-GBM kresentik glomerülonefrit (İF de lineer immunglobülin) Fokal segmental glomerülosklerozun kollapsing varyantı (HIV nefropati dahil) Membranoproliferatif lobüler ve nodüler patern Membranoproliferatif glomerülonefrit (tip I, II, ve III) Diyabetik glomerüloskleroz nodüler mesangial genişleme ile (KW nodülleri) Monoklonal immunoglobulin depo hastalığı; nodüler glomerülosklerozla Trombotik mikroanjiopati Fibriller glomerülonefrit İmmüntaktoid glomerülopati İleri derecede diffüz global glomerüler skleroz Son dönem glomerüler hastalık Son dönem vasküler hastalık Son dönem tübülo-interstisyel hastalık

25 E- Böbrek biyopsisinde saptanabilecek tübülointerstisyel hasar ve hastalıklar Işık mikroskobunda anormal bulgu yok İnterstisyel hastalık yok Işık mikroskobik bulgu olmadan interstisyel hastalık (hiperkalsemi gibi) Hafif veya erken interstsiyel hastalık (erken hidronefroz gibi) Ödem ile interstisyel genişleme Akut tübüler nekroz (ATN) Renal ven trombozu

26 Nefrotik sendrom (minimal değişiklik hastalığı gibi) Akut glomerülonefrit (akut lupus nefriti, post streptokokkal glomerülonefrit) Trombotik mikroanjiopati (hemolitik üremik sendrom) Hücre dışı eozinofilik materyal ile interstisyel genişleme Kongo red negatif, trikrom pozitif Glomerüler, Vasküler ve tübüler hastalığın progresyonu Orak hücre hastalığı Sickle cell disease Radyasyon nefriti Kongo kırmızısı pozitif Amiloidoz Lökositler ile interstisyel genişleme Maligniteler Lenfoma, Lösemi, Post transplant lenfoproliferatif hastalık İnterstisyel nefritler İnfeksiyoz (akut piyelonefrit), İlaçların oluşturduğu, İdiopatik Lenfoplazmositik Kronik tübülointerstsiyel nefrit, aktif sistemik lupus eritematozus, vaskülit, HIV birliktelikli nefropati, İlaçların oluşturduğu, İnfeksiyonlar, anti tübüler bazal membran (anti TBM) hastalığı, myelom böbreği (kast nefropati) Eozinofillerle İlaçların oluşturduğu, Vaskülitler, SLE Granülamatöz- köpüklü makrofajlarla Tüberküloz, Sarkoidoz, İlaçların oluşturduğu, Ksantogranülamatöz pyelonefrit, Malakoplaki, İdiyopatik İnterstisyel köpük hücreleri

27 Herediter nefrit (Alport sendromu) Yoğun ve uzamış protein/lipidüri veya nefrotik sendrom (membranöz glomerülonefrit) İnterstisyel hemoraji Akut rejeksiyon Bowman kapsül rüptürlü şiddetli glomerülonefrit Malign hipertansiyon Vaskülit- özellikle medüller anjiit Neoplastik hücrelerle interstisyel genişleme Lenfoma, lösemi, primer renal karsinomalar, metastazlar Kristaller ve mineral depozitleri Nefrokalsinoz (kalsiyum karbonat) Akut renal yetmezlik (kalsiyum okzalat) Ürik asit (gut) Kolesterol ( membranöz glomerülonefrit gibi nefrotik sendromlu glomerüler hastalıklar) Ek 1- Böbrek biyopsisi değerlendirme için öneriler

28 1- NATİV BÖBREK BİOPSİLER İÇİN DEĞERLENDİRME Makroskobik değerlendirme Blok No: I: Toplam... cm boyunda dokudur....parça doku ışık mikroskopi için ayrılıp formalinde fiksasyona alındı...parça doku elektron mikroskopi için gluteraldehit fiksasyonuna alındı.. parça doku PBS içinde IF için ayrıldı. Işık Mikroskobik İnceleme Glomerüller: Toplam glomerul sayısı:... Global sklerotik glomerül (PAS ve PAMS ile) sayısı.: Segmental sklerotik glomerul (PAS ve PAMS ile) sayısı: Nekroz bulunan glomerul sayısı:. Ekstrakapiller proliferasyon bulunan glomerul sayısı: (PAS ve PAMS ile değerlendirilmiştir) (fibröz, fibrosellüler, sellüler) Bazal membranlar (PAS, PAMS ve MassonsTrichrome ile değerlendirilmiştir):

29 Mezangial matriks:. Mesangial sellülerite: Endokapiller Proliferasyon: Polinükleer lökosit : Kapiller luplar: Birikimler; Amiloidozis (Kongo Kırmızısı ile polarize ışıkta birefringence): Kortikal tubulo-interstisyum: İnterstisyel enflamasyon ve enflamasyon türü : İnterstisyel fibrozis:(masson's trichrome ile değerlendirilmiştir) Tubuler atrofi (PAS ve PAMS ile değerlendirilmiştir): Tubuler cast yapıları: Tübüler hasarlanma ve rejenerasyon bulguları: Tiroidizasyon: Kalsifikasyon: Vasküler Yapılar: Afferent arterioller: Arterler: Varsa medülla ve özellikleri: İnterstisyel enflamasyon ve inflamasyon türü: İnterstisyel fibrozis: Tubuler atrofi: Tubuler cast yapıları: Tiroidizasyon: Kalsifikasyon: Direkt immunflöresan inceleme bulguları: birikim yeri ve boyanma şiddeti Immunglobülinler: IgG, IgA, IgM: Komplemanlar: C3, C1q, C4: Hafif Zincirler: Kappa, Lambda: Fibrinojen: Albumin: Elektron mikroskobik inceleme bulguları Sonuç varsa direct tanı ile korele edilip bulgular yazılır, Parça ayrıldı ise sonuç için aşağıdaki not eklenir. NOT: Elektron Mikroskopik inceleme sonucu daha sonra bildirileceğinden tanı bulgulara göre tekrar yorumlanabilecektir.

30 2- Böbrek Transplant Biyopsisi Rapor Formu KLİNİK BİLGİ: Biyopsi yapılma saati: Kullanılan solüsyon: Patoloji Laboratuarına teslim saati: MAKROSKOPİK İNCELEME: Blok No: I: Toplam cm boyunda ve mm çapında dokulardır. parça ışık mikroskopi için parça immünfloresan inceleme için ve parça elektron mikroskopi için ayrıldı. MİKROSKOPİK İNCELEME: KORTİKAL ALAN:

31 GLOMERULLER: Toplam glomerul sayısı:.. Global sklerotik glomerul: yok, var adet Segmental sklerotik glomerul: yok, var adet Nekroz bulunan glomerul: yok, var adet Ekstrakapiller proliferasyon bulunan glomerul: yok, var.adet Bazal membranlar: normal Hafif derecede kalınlaşmış Kalınlaşmış Belirgin şekilde kalınlaşmış Çift kontur (tren rayı görünümü) Mezangial matriks: normal Genişlemiş Noduler eozinofilik materyal birikimi Mesangial sellülerite: yok hafif, orta, şiddetli Segmental glomerülit: (> 1 glomerüler kapillerde lökosit infiltrasyonu ile parsiyel veya komplet oklüzyon ve endotel şişmesi) yok, var adet Kapiller luplar: açık, kapalı TÜBÜLER ve İNTERSTİSYEL ALAN: İnterstisyel enflamasyon: yok hafif, orta, şiddetli Enflamasyon türü: Polinükleer lökosit, lenfosit, eozinofil, plazma hücresi İnterstisyel fibrozis: yok, hafif, orta, şiddetli Tubuler atrofi: yok, hafif, orta, şiddetli Tübüler hasarlanma bulguları: yok, var, fırçamsı kenar kaybı, nekroz bulguları (karyolizis,vb), rejeneratif atipi, mitoz, dilate tübüller Tübüler lenfosit sayısı: Tubuler cast yapıları: yok, var Tiroidizasyon: yok, var Kalsifikasyon: yok, var VASKÜLER YAPILAR: Afferent arterioller: normal, çeperi hafif kalınlaşmış, çeperi belirgin şekilde kalınlaşmış Arteriollerde noduler hyalen materyal birikimi ve medya tabakasının bulunmaması: yok, var -sadece 1 damarda -birden çok damarda -Tüm damar çeperinde İki ya da daha fazla medya tabakası bulunan arter: yok, var Arterler: normal, çeperi hafif kalınlaşmış, çeperi belirgin şekilde kalınlaşmış Endotelialit: yok, var Arterial fibrinoid nekroz: yok, var İç elastik membranda tabakalaşma ile fibröz intimal kalınlaşma: İç elastik membranda tabakalaşma olmaksızın fibröz intimal kalınlaşma ile kronik

32 arteriopati olması: var, yok Peritübüler kapillerit: - PTK lerin % 10 dan azında yangı var (PTK0) - PTK lerin > %10 kapillerit (hücre sayısı 3-4) (PTK1) - PTK lerin > %10 kapillerit (hücre sayısı 5-10) (PTK2) - PTK lerin > %10 kapillerit (hücre sayısı > 10) (PTK3) MEDULLER ALAN: İnterstisyel enflamasyon: yok hafif, orta, şiddetli Enflamasyon türü: Polinükleer lökosit, lenfosit, eozinofil, plazma hücresi İnterstisyel fibrozis: yok hafif, orta, şiddetli Tubuler atrofi: yok hafif, orta, şiddetli Tubuler hasarlanma bulguları: yok, var, fırçamsı kenar kaybı, nekroz bulguları (karyolizis,vb), rejeneratif atipi, mitoz, dilate tübüller Tubuler tıkaç yapıları: yok, var Tiroidizasyon: yok, var Kalsifikasyon: yok, var Tüm alanlarda viral inkluzyon cismi: var, yok Amiloidozis (Kongo Kırmızısı ile polarize ışıkta birefringence): negatif, pozitif Akut/Aktif Antikor Aracılı Red: (tanı için 3 kriterde bulunmal, histopatolojik incelemede 2 ölçüt değerlendirilmiştir.) var, yok Akut doku zedelenmesinin histolojik (1 /daha fazlası) kanıtı - Mikrovasküler inflamasyon (g>0 ve/veya ptk>0) var, yok - İntimal/transmural arterit (v>0) var, yok - Akut trombotik mikroanjiyopati (diğer nedenlere bağlı olmayan) var, yok - Akut tübüler zedelenme (diğer nedenlere bağlı olmayan) var, yok Yakın zamanda vasküler endotelin Ab ile reaksiyona girdiğinin kanıtları (en az 1 i olmalı) - PTK de lineer C4d boyanması (C4d>0 İHK) - En azından orta düzeyde mikrovasküler inflamasyon (g + PTK > 2) - Dokuda gen transkripsiyonunun artmış expresyonu endotel zedelenmesini gösterir (ENDAT): Değerlendirme yapılamadı (olanak varsa yapılmalıdır) 3. Serolojik olarak DSA varlığı Kronik Aktif Antikor Aracılı Red (tanı için 3 kriterde bulunmalı, histopatolojik incelemede 2 ölçüt değerlendirilmiştir.) var, yok 1. Kronik doku zedelenmesinin morfolojik kanıtı (1/fazlası) - Transplant glomerülopati (TG) > 0 (kronik trombotik mikroanjiyopati bulgusu yok) - PTK bazal membranda ciddi tabakalanma (EM) - Arteriyel intimal fibrozis (Tx vaskülopati) 2. Yakın zamanda vasküler endotelin Ab ile reaksiyona girdiğinin kanıtları (en az 1 i olmalı) - PTK de lineer C4d boyanması (C4d>0 İHK) - En azından orta düzeyde mikrovasküler inflamasyon (g + PTK > 2)

33 - Dokuda gen transkripsiyonunun artmış expresyonu endotel zedelenmesini gösterir (ENDAT) Değerlendirme yapılamadı (olanak varsa yapılmalıdır) 3. Serolojik olarak DSA varlığı Rejeksiyon kanıtı bulunmaksızın C4d boyanması (tanı için 3 özellik de bulunmalı) var, yok 1. PTK de lineer C4d boyanması (C4d>0 İHK) var, yok 2. g=0, PTK=0, cg=0 (ışık mikroskopi ve varsa EM), v=0, PTK bazal membran tabakalanması yok, akut tübüler zedelenme yok var, yok 3. Akut hücresel rejeksiyon yok (Tip 1, 2 veya borderline) var, yok Kronik diğer değişiklikler ve Kronik antikor aracılı red bulguları değerlendirmesi: : I- Başka neden saptanamayan skleroz, interstisyel fibrozis, tübüler atrofi bulunması II- Kronik antikor aracılı red: 1- Aşağıdakilerden bir ya da fazlası olmalı: - Transplant glomerulopati:yok,var - Peritübüler kapiller bazal membranlarında ve glomerüllerde çoklu tabakalanma (>6 tabaka olması): (Elektron mikroskopi incelemesi sonrası bildirilecektir): yok,var (değerlendirilebiliyorsa sayısı: ) - Peritübüler kapillerlerin kaybı ve interstisyel fibrozis: var, yok - İç elastik membranda tabakalaşma olmaksızın fibröz intimal kalınlaşma ile kronik arteriopati olması: var, yok 2- Peritübüler kapillerlerde diffüz C4d pozitifliği: var, yok III- Kalsinörin inhibitör toksisitesi: var, yok - Ağ tarzında fibrozis:yok, var - Arteriollerde nodüler hyalen materyal birikimi ve media tabakası kaybı: -sadece 1 damarda -birden çok damarda -Tüm damar çeperinde IV- Hipertansif böbrek hastalığı (Arterde elastik katmanda tabakalanma var): yok, var V- Polyama Tubulointerstisyel nefriti: var, yok - Sadece bazal membranlardan oluşan tübüller: yok, var - Tübül bazal membranlarında özellikle IgG ya da diğer immünglobulin birikimi: yok, var VI- Yıkanmaya bağlı değişiklikler: Genişlemiş toplayıcı duktuslar, Tamm-Horsfall proteini dolu lenfatikler, rüptüre tübüller ya da granulomlar: yok, var Makrofaj Düzeyi: (CAMPATH1 kullanan hastalarda: lenfosite dayalı değerlendirmeler, CD52 antikoru olan bu etkenin T ve B hücre azlığına yol açması nedeniyle makrofaj düzeyleri belirlenerek yorum yapılmalıdır) TOR inhibitör nefrotoksisitesi: Akut tübüler hasarlanma, tübül lümenlerinde keratin pozitif tıkaçlar ve makrofajlar, trombotik mikroangiopati, segmental skleroz yapabilir.

34 ELEKTRON MİKROSKOPİ: GLOMERULLER: Bowman Kapsülü: normal, kalınlaşmış Ekstakapiller proliferasyon: var, yok Podositler: Pedisellerde silinme, füzyon, mikrovillus oluşumu izlendi. Bazal membranlar: Normal, kalınlaşmış, madde birikimi var duplikasyon var kollaps alanları var tabakalanma var çift kontür var Bazal membran kalınlığı: Endotelyal hücreler: Subendotelyal alanda madde birikimi:var, yok Mezangial alan: sellülerite artışı var yok, madde birikimi var yok, (tanımlama...) Fibriler materyal birikiminde fibrillerin çapı: Elektron dens pepozit: yok, subepitelyal ince granüler, intraepitelyal granüler, subendotelyal, kurdela benzeri membran boyunca, mezangial Peritübüler kapillerler: Bazal membranlarında artmış lamellasyon izlendi, izlenmedi (tabaka sayısı...) Banff Skorlaması: Glomerulit (g): 0,1,2,3 İnterstisyel enflamasyon (i): 0,1,2,3 İntimal arterit (v): 0,1,2,3 Tubulit (t): 0,1,2,3 Arteriolar hyalin (ah): 0,1,2,3 Kronik glomerular değişiklik (cg): 0,1,2,3 Mezangial matriks artışı (mm): 0,1,2,3 İnterstisyel fibrozis (ci): 0,1,2,3 Tubuler atrofi (ct): 0,1,2,3 Vasküler intimal sklerozis (cv): 0,1,2,3 İnternal elastik laminası bulunan arter sayısı: Diğer Bulgular: TANI: Normal Antikor aracılı rejeksiyon Borderline değişiklik (i0-2, t0-2, v0)

35 Akut rejeksiyon Tip 1A (i1-3, t2,v0) Akut rejeksiyon Tip 1B (i2-3, t3,v0) Akut rejeksiyon Tip 2A (i1-3, t0-3,v1) Akut rejeksiyon Tip 2B (i1-3, t0-3,v2) Akut rejeksiyon Tip 3 (i1-3, t0-3,v3) Akut/aktif antikor aracılı red Kronik Aktif Antikor Aracılı Red Rejeksiyon kanıtı bulunmaksızın C4d boyanması Kronik diğer değişiklikler (açıklayınız..) Siklosporin toksisitesi ile uyumlu bulgular Akut tübüler nekroz ile uyumlu bulgular Viral enfeksiyon ile uyumlu bulgular Diğer tani DIREK IMMÜNFLORESAN İNCELEME: Birikim alanlarını belirtiniz IgG: negatif, +, ++, +++, ++++ IgA: negatif, +, ++, +++, ++++ IgM: negatif, +, ++, +++, ++++ C3c: negatif, +, ++, +++, ++++ Arter duvarlarında C3/immünglobulin birikimi: yok, var C1q: negatif, +, ++, +++, ++++ C4d: peritübüler kapillerlerde negatif, + (>%50 biyopsi alanı PTK lineer+) Kappa: negatif, +, ++, +++, ++++ Lambda: negatif, +, ++, +++, ++++ Fibrinojen: negatif, +, ++, +++, ++++ Albumin: negatif, +, ++, +++, ++++ HİSTOKİMYA: Periodic acid Schiff (PAS), Masson s trichrome (MT), periodic acid methanemine silver (PAMS), Kongo kırmızısı. IMMÜNHİSTOKİMYA: C4d var, yok (>%10 bitopsi alanı PTK+) SV40 var, yok, CMV var, yok. AÇIKLAMA: Patolojik değerlendirmese Banff 2013 toplantısında belirlenen ölçütler ve güncellenen sınıflamalar kullanılmıştır. Kaynak: Haas M, Sis B, Racusen LC, et al; Banff meeting report writing committee. Banff 2013 meeting report: inclusion of c4d-negative antibody-mediated rejection and antibody-associated arterial lesions. Am J Transplant Feb;14(2): SNOMED: DİKKAT 2013 değişiklikler: İntimal arterit ile ilgili Glomerülit tanımlaması değişti Allograft glomerülopati tanımlaması değişti AAR tanısı ayrıntılandırıldı.

36 *İzole intimal arterit (v),tübülointerstisyel yangı olmasa da t2/t3 T hücreli rejeksiyon olarak rapor edilmeli Hatta bazen isole v lerin antikor aracılı rejeksiyonu / mixt AAR/T hücreli rejeksiyonu temsil edebileceği!!! *Glomerulit «g» tanımlaması revize edildi Segmental glomerülit > 1 glomerüler kapillerde lökosit infiltrasyonu ile parsiyel veya komplet oklüzyon ve endotel şişmesi Ama g0, g1, g2, g3 derecelendirmesinde değişiklik olmadı. G0: Glomerülit yok G1: > %25 in altında glomerülde glomerülit var G2: %25-75 glomerülde segmental/global glomerülit var G3: > %75 glomerülde glomerülit var Allograft glomerülopati (cg) tanımlanması: Daha önce 1 glomerülde kapiller loopların > %10 çift kontür cg te ise > 1 kapillerde çift kontür cg1 oldu. Cg0: GBM da çift kontür yok (ışık ve EM de) Cg1a:Işık mikroskopide GBM de çift kontür yok. Ama EM de en az 3 kapillerde (inkomplet / sirkümferansiyal) çift kontür + endotelyal şişme + ve /veya subendotelyal elektrolüsent genişleme Cg1b: nonsklerotik glomerülde 1 veya daha fazla kapiller duvarda, ışık mikroskopta çift kontür var EM ne zaman gerekli? Elde bu olanak yoksa zorunlu değil Varsa: - Sensitize bireylerde - PostTx herhangi bir zamanda Antidonör Ab + saptanmış ise - Önceki Bx de C4d +/glomerülitis/ptkitis var ise - 6 ayın üzerindeki tüm Tx da AYRICA: Mikrovasküler inflamasyon denilmeden önce rekküren/de novo glomerülonefrit ekarte edilmeli C4d (-) olsa da akut-aktif/aktif kronik AAR tanısı verilebilir ama en azından orta derecede mikrovasküler inflamasyon (g + PTK > 2) / moleküler kanıt

37 Ek 2- Avrupa Nefropatoloji çalışma grubunca önerilen teknik yöntemler İmmunofloresan İncelemeler Frozen kesit doku hazırlığı 1. Dokuyu dondurmanın ani ve tercihen -50 derecenin altına olması önemlidir. Eğer yavaş donarsa donma artefaktları görüntüyü şiddetle bozar. Bu nedenle ani dondurma özelliği olan

38 frozen cihazı ya da ani dondurma sağlayan karbon dioksit jet gibi maddeler kullanılmalıdır. 2. poly-l-lysine kaplı camlara 5 mikron kalınlığında kesit alın 3. Havada kurut Poly-L-Lysine kaplı slayt hazırlığı Poly-L-Lysine, Hydrobromide (Sigma, Product No: P1524) 600 slayt için: 50 ug/ml in 10 mm Tris buffer ph 7.4 (total 1.5 L) Slaytların kaplanması: 1. Slaytları 24 saat boyunca deterjan ile temizle (Extran MA O1, E. Merck) 2. Slaytlerı 30 dk boyunca sıcak su ile temizle daha sonra 3 saat soğuk su ile temizle 3. Slaytları demineralize su ile temizle 4. Slaytları 10 dakika boyunca Poly-L-Lysine içine koy 5. Slaytları oda sıcaklığında kurut, oda sıcaklığında kutuları içinde tozlanmadan depola Kullanılmayan slaytların depolanması: Hemen boyanmayan slaytlar plastik kaplar içine konularak -70 de saklanabilir. Bu şekilde korunan slaytlar 10 yıl boyunca antijenitesini kaybetmeden kullanılabilir. Kullanmak için slaytlar soğuktan alınarak oda sıcaklığında ısınması sağlanır. Üstündeki plastik kap tüm buharlaşmış sıvı damlaları kaybolduktan sonra açılır. Direkt İmmunofloresan boyama 1. Kesitler oda sıcaklığına getirildikten sonra 30 dakika boyunca kurutulur. 2. Kesitler soğuk (aseton kullanılabilir) PBS-Tween20 (0.1%) ile 5 dakika oda sıcaklığında yıkanır 3. Üzerindeki fazla PBS alınır 4. Kesitlerin üzerine 100µl dilue edilmiş antikor damlatılır ve nemli chamber içinde oda sıcaklığında 30 dakaika boyunca inkübe edilir. 5. PBS ile yıkanır 6. Kesitler soğuk PBS-Tween20 (0.1%) ile 5 dakika oda sıcaklığında yıkanır (2x) 7. Gliserjel Floresan kapaması ile kapatılır. (Dako, Code S3023) İndirekt İmmunofloresan boyama

39 1. Kesitler oda sıcaklığına getirildikten sonra 30 dakika boyunca kurutulur.. 2. Kesitler soğuk PBS-Tween20 (0.1%) ile 5 dakika oda sıcaklığında yıkanır 3. Üzerindeki fazla PBS alınır 4. Kesitlerin üzerine 100µl dilue edilmiş antikor damlatılır ve nemli chamber içinde oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edilir. 5. PBS ile yıkanır 6. Kesitler soğuk PBS-Tween20 (0.1%) ile 5 dakika oda sıcaklığında yıkanır (2x) 7. Sekonder antikor olarak 100µl dilue Goat anti-mouse IgG(H+L)-Alexa Fluor488 (Molecular Probes, A-11029) eklenir ve nemli chamber içinde oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir. 8. PBS ile yıkanır 9. Kesitler soğuk PBS-Tween20 (0.1%) ile 5 dakika oda sıcaklığında yıkanır (2x) 10. Floresan kapaması ile kapatılır. (Dako, Code S3023) Parafin kesitlerde immünofloresan 1. Deparafinisazyon yapınız

40 2. Kesitleri 30 dk ılık (370C) TRIS (ph 7.6, 0.5 M) buffer içinde bekletiniz 3. Enzim pretreatment (Pronase*) 370C de 60dk uygulanmalı 4. Kesitleri 30 dk soğuk TRIS buffer (ph 7.6, 0.5 M) içinde bekletiniz 5. Kesitleri 5 dk PBS / 0.1% Tween 20 içinde yıkayınız 6. Antikor inkübasyonu oda sıcaklığında nemli chamber içinde 60dk yapılmalı 7. PBS ile iki kere kesitleri 5 dk yıkayınız. 8. Gelvatol-Gallat ile kapayınız NOT: İmmunfloresan boyamalar formalin fikse dokuda da yapılabilmekle birlikte donmuş kesitlerde çok daha başarılı sonuçlar elde edildiği için öncelikle bu yöntem yeğlenmelidir. *Solusyon: Pronase (Roche Cat. No ) TRIS (ph 7.6, 0.5 M) içinde çözünüz. Konsantrasyon: 100 ml de 75 mg pronase Pronase bir kaç kez kullanılabilir ancak 2 haftadan uzun bekletilmemelidir. Renal biyopsiler için ABC Elite (Parafin kesitler) 1. Deparafinisazyon sonrası PBS içine koyunuz 2. Su banyosu (37 C) içinde kesitlere pronase 0.1% uygulayın dk 3. Enzim reaksiyonunu soğuk buffer ile durdurun (TRIS buffer 0.5 M, ph 7.6) 4 C buzdolabında 30 dk 4. H2O2 methanol treatment 30 dk (100 ml methanol içine 1ml H2O2 (30%) koy) (endojen peroksidaz blokajı için) 5. PBS ile yıkayınız (2 x10 dk) 6. Kesitleri milk powder içine koyunuz 90 dk (Skim milk powder ( 4% in PBS) 7. Kesit üzerindeki milk powder-pbs dökülecek ancak çalkalanmayacak yıkanmayacak 8. Nemli chamber içinde primer Ab ile inkubasyon +4 C buzdolabında gece boyunca 9. Antikoru uygulayınız, TRIS 0.5 M (ph 7.6) /PBS (1: 10) ile yıkayın (2 x 5dk) 10. Sekonder biotinylated link antikorunu uygulayın 30dk 11. Avidin-Biotin-Enzyme Complex (ABC ELITE Standard) ile 30dk inkübe ediniz. 12. TRIS buffer ile yıkayın (2 x 5dk) 13. TRIS buffer (0.05 M, ph7.6) ile yıka (20dk) 14. DAB chromogen ile inkübasyon yapınız 6dk 15. PBS ile yıkayın 2 x 5dk

41 16. Kesitleri osmiumtetroxyd (reaksiyon kontrastını artırmak için) içine koyun 2dk 17. PBS ile yıkayın 2 x 5dk 18. Harris hematoxylin ile boyayınız 4dk 19. Destile su ile yıkayın 20. HCl-alcohol 0.5% 4x daldır çıkarın 21. Musluk suyu ile yıkayın ve mavileşmesine bakın 10dk 22. Slaytları temizleyin (osmium) 23. Musluk suyu ile yıkayın 5-10 dk 24. Alkollerden geçirin, xylol ile şeffaflaştırınız (3 kere) 25. kapatın Solüsyonlar Pronase 0.5 gr pronase (Sigma Protease E Type XIV No. P-5147) 500 ml TRIS 0.5 M (ph 7.6)

42 Osmium tetroksid stok solüsyonu 50 ml nanopur suyu kaynatın 1 gr OsO4 (Simec, içine kat Soğutun ve süzün 100 ml PBS için 6 ml stok solüsyonu kullanınız Link Sigma-Aldrich Co.: Ek 3- Nativ Böbrek Biyopsi Formu Dr Adı: Gönderen Bölüm: Hastanın Adı Soyadı: Yaş Cinsiyet

43 Klinik Bilgi Biyopsi tarihi: Klinik tanı: Böbrek hastalığının başlangıç tarihi: Aile hikayesi Var Yok varsa tanımla... Hastalığın seyri: Akut Kronik Bilinmiyor Renal yetmezlik: Hızlı seyirli Akut Kronik yok Klinik semptomlar: Üremi Ödem Anemi Hemoptizi Artralji Ateş Flank ağrı Hematüri Mikro Makro Proteinüri Hipertansiyon: Var Yok İlaçla kontrol altında Kan basıncı:.../... mmhg Diğer hastalıklar / DM tip 1 DM tip 2, DM başlangıç tarihi:...(y) Durum Malignite Romatizmal hastalık ilaç bağımlılığı

44 Bakteryal enfeksiyon Viral enfeksiyon Hamilelik Diğer notlar:.. Tedavi: Diyaliz Plazmaferez kortikosteroid Immünosüpresyon NSAID Diuretik ACE-inhibitör Beta-blokör Lipid düşürücü ilaçlar Diğer: Boy:... cm, Kilo:... kg Laboratuar Bulguları Serum / Kan Platelet: Düşük Yüksek Normal kreatinin:... mg/dl veya... µmol/l, Protein:... g/dl, Albumin:... g/dl, Kolesterol:... mg/dl veya... mmol/l Kreatinin klirens:... ml/min, ANCA: C (PR3) P (MPO) negatif Bakılmadı ANA: pozitif

45 negatif Bakılmadı Anti-ds DNA: pozitif negatif Bakılmadı ENA: pozitif negatif Bakılmadı; Notlar:... Anti-GMB: pozitif negatif Bakılmadı Kompleman: C3: Düşük normal Bakılmadı, C4: Düşük normal Bakılmadı Kryoglobülin: pozitif Negatif Bakılmadı Notlar:... nfeksiyonlar: Hepatit B Hepatit C HIV EBV CMV Diğer, tanımla... İdrar Volüm:... ml/24h, Anüri Oligüri Normal

46 Poliüri Proteinüri:... g/24h veya... g/g Creatinine,... mg/mmol Creatinine Microalbuminüri / / + / ++ / +++ no Sediment: Makroskopik Hematüri Mikroskopik Hematüri Eritrosit silendirleri Lökosit bakteri Renal boyut: Sağ... cm / Sol... cm Ek 4-Transplant Böbrek Biyopsi Formu

47 Dr Adı Soyadı: Gönderen Bölüm: Hastanın Adı Soyadı: Yaş Cinsiyet Biyopsinin geliş tarihi Önceki biyopsiler Transplant sayısı 1, 2, 3, 4, 5 Transplant Tarihleri... /... / Verici Özellikleri... Biyopsi endikasyonu 0. Sıfır-saat biyopsi 1. Tanı 2. Rutin kontrol 3. Protokol biyopsi 4. Nefrektomi 5. Otopsi İmmünsüpresyon Steroid Rapamycin

48 OKT3 AZA CyA ATG/ALG MMF FK-506/Tacrolimus diğer Biyopsi öncesi rejeksiyon tedavisi var yok Varsa tanımla Steroids Plazmaferez OKT3 diğer ALG/ATG Kan basıncı (mmhg):... /... Proteinüri +, ++, g/gün... mg/mmol kreatinin Biyopsi zamanı diyaliz tedavisi var yok Biyopsi zamanı veya 1 ay içinde enfeksiyon varlığı 1. Polyoma

49 var, yok 2. CMV var, yok 3. Herpes var, yok.. 4. Hepatitis B var, yok Hepatit C var, yok 5. Diğer virüsler, tanımla var, yok 6. Bakteri var, yok 7. Mantar var, yok.. 8. Uriner enfeksiyon var, yok... Renal arter stenozu var yok

50 Uriner yollarda obstrüksiyon var yok Lenfosel var yok

51 Kaynaklar Nefropatolojide temel kaynak kitaplar 1. Heptinstalls Pathology of the Kidney. 7th ed. Jennette JC, D agati VD, Olson JL, Silva FG, eds. Wolters Kluwer; Nefropatoloji Böbrek Hastalıkları ve Böbrek Transplantasyon Patolojisi Sarıoğlu S. Nobel Tıp Kitabevi Handbook of Renal Biopsy Pathology. 2nd ed. Howie AJ. New York, NY: Springer; Diagnostic Atlas of Renal Pathology. Fogo AB, Kashgarian M. Philadelphia, PA: Elsevier Saunders; Fundamentals of Renal Pathology. Fogo A, Bruijn JA, Cohen AH, Colvin RB, Jennette JC eds. Springer; 1st ed Renal biopsinin değerlendirilmesi için kaynaklar 1. Walker PD, Cavallo T, Bonsib SM; Ad Hoc Committee on Renal Biopsy Guidelines of

52 the Renal Pathology Society. Practice guidelines for the renal biopsy. Mod Pathol Dec;17(12): Walker PD. The renal biopsy. Arch Pathol Lab Med Feb;133(2): Furness PN. Acp. Best practice no 160. Renal biopsy specimens. J Clin Pathol Jun;53(6): Amann K, Haas CS. What you should know about the work-up of a renal biopsy. Nephrol Dial Transplant May;21(5): Glomerüler ve sistemik böbrek hastalıklarının sınıflandırılmasına yönelik kaynaklar: 1- D'Agati VD, Fogo AB, Bruijn JA, Jennette JC. Pathologic classification of focal segmental glomerulosclerosis: a working proposal. Am J Kidney Dis Feb;43(2): Weening JJ, D'Agati VD, Schwartz MM, Seshan SV, Alpers CE, Appel GB, Balow JE, Bruijn JA, Cook T, Ferrario F, Fogo AB, Ginzler EM, Hebert L, Hill G, Hill P, Jennette JC, Kong NC, Lesavre P, Lockshin M, Looi LM, Makino H, Moura LA, Nagata M; International Society of Nephrology Working Group on the Classification of Lupus Nephritis; Renal Pathology Society Working Group on the Classification of Lupus Nephritis. The classification of glomerulonephritis in systemic lupus erythematosus revisited. Kidney Int Feb;65(2): Working Group of the International IgA Nephropathy Network and the Renal Pathology Society, Roberts IS, Cook HT, Troyanov S, Alpers CE, Amore A, Barratt J, Berthoux F, Bonsib S, Bruijn JA, Cattran DC, Coppo R, D'Agati V, D'Amico G, Emancipator S, Emma F, Feehally J, Ferrario F, Fervenza FC, Florquin S, Fogo A, Geddes CC, Groene HJ, Haas M, Herzenberg AM, Hill PA, Hogg RJ, Hsu SI, Jennette JC, Joh K, Julian BA, Kawamura T, Lai FM, Li LS, Li PK, Liu ZH, Mackinnon B, Mezzano S, Schena FP, Tomino Y, Walker PD, Wang H, Weening JJ, Yoshikawa N, Zhang H. The Oxford classification of IgA nephropathy: pathology definitions, correlations, and reproducibility. Kidney Int Sep;76(5): Berden AE, Ferrario F, Hagen EC, Jayne DR, Jennette JC, Joh K, Neumann I, NoëlLH, Pusey CD, Waldherr R, Bruijn JA, Bajema IM. Histopathologic classification of ANCA-associated glomerulonephritis. J Am Soc Nephrol Oct;21(10): Nefropatoloji Dernekler; RPS- Renal Pathology HomePage ; TND- Türk Nefroloji Derneği ; ISN- International Society of Nephrology ; ASN- American Society of Nephrology; Avrupa nefropatoloji çalışma grubu Patoloji dernekleri federasyonu nefropatoloji çalışma grubu (üyelik gerektirir; tüm uzmanlara açıktır)