KOD.MİK.PR.02 YAYIN TRH. KASIM 2011 REV. TRH. EYLÜL 2012 REV. NO.1 SAYFA NO.1/14 1. AMAÇ: Moleküler mikrobiyoloji laboratuvarında yürütülen faaliyetleri tanımlamak. 2. KAPSAM: Bu talimat, Moleküler mikrobiyoloji Laboratuvarını kapsar 3. TANIMLAR: 4. İŞLEM: 4.1. Doktor tarafından istenen tahliller servislerde bilgisayara işlenir. Bilgisayardan her tetkik grubuna uygun barkotlar basılarak uygun tüplerin ve numune kaplarının üzerine yapıştırılır. Barkotlanmış tüplere ve numune kaplarına örnekler alındıktan sonra laboratuvara tüpler pnömatik sistem yoluyla ve/ veya bir personel aracılığıyla, diğer numuneler ise bir personel aracılığıyla olmak üzere gönderilir. 4.2. Hastanın sorumlu hekimi tarafından istenen tetkikler servis sekreterleri tarafından sisteme girilir. Hastane otomasyon sistemine tetkik girişleri yapıldıktan sonra barkotları basılır ve tetkik gruplarına göre uygun tüplerin üzerine yapıştırılır. Numuneler YÖN.TL.29 (Numune alma ve transfer talimatı) na göre alınır. Barkotlanmış tüplere alınan numuneler pnömatik sistem veya taşıma kaplarına yerleştirilmiş olarak personel aracılığıyla laboratuvara gönderilir. 4.3. Laboratuvara gönderilen örneklerin Numune Kabul Birimi nde laboratuvara kabul işlemi yapılır. Kabulü yapılan numuneler laboratuvar çalışanları tarafından alınarak moleküler mikrobiyoloji laboratuvarına teslim edilir. Örnekler teslim alındıktan sonra LAB.TL.01 (Laboratuvar numune kabul ve ret kriterleri talimatı) na göre numunelerin tüp kabulünü veya reddini yapılır. Reddedilen numuneler LAB.FR.10 (Laboratuvar Tekrarlanan Test Kayıt Formu) na işlenir. Ayrıca reddedilen numunelerin aylık değerlendirmesi Mikrobiyoloji Uzmanı tarafından yapılarak LAB.FR.04 (Laboratuvar Aylık Preanalitik Hata Değerlendirme Formu) na işlenir. 4.4. Testler çalışıldıktan sonra sonuçlar Mikrobiyoloji uzmanı tarafından değerlendirilir. Değerlendirme sonrasında uygun olan test sonuçları otomasyon sistemine aktarılır. Sistemdeki sonuçların onayı mesai saatleri içerisinde Mikrobiyoloji uzmanı tarafından yapılır. Uzmanın olmadığı durumlarda idarece belirlenerek yetkilendirilmiş kişi onay yapabilir. 4.5. Sonuçlar onaylandıktan sonra bildirilmesi gereken panik değerler varsa laboratuvar
teknisyenleri veya uzmanlarınca T BT 065 (Panik Değer Bildirim Talimatı) na göre ilgili servis ve polikliniklere bildirim yapılır. LAB.FR.06 (Panik değer bildirim formu) doldurulur. 4.6. Sonuçlar onaylandıktan sonra ilgili servis veya poliklinikten hastane otomasyon sistemi aracılığıyla sonuçlar görülebilir veya yazıcıdan çıktıları alınabilir. 4.7. Laboratuvarda çalışılan tetkiklerin dış kalite kontrolleri yılda 2 kez olmak üzere yapılarak sonuçları Mikrobiyoloji uzmanı tarafından değerlendirilir. Değerlendirme sonuçları LAB.FR.12 (Dış kalite kontrol değerlendirme formu) na işlenir. 4.8. Analitik ve postanalitik hatalar aylık olarak laboratuvar uzmanları tarafından değerlendirilerek F BT 132 (Laboratuvar Analitik Hata Değerlendirme Formu) na ve LAB.FR.03 (Laboratuvar Postanalitik Hata Değerlendirme Formu) na işlenir. 4.9. Cihazların temizlik ve bakımları periyotlara göre günlük, haftalık, aylık veya yıllık olarak ilgili firmalar tarafından ve/veya laboratuvar teknisyenleri tarafından yapılır. Tüm kit ve sarf malzemelerin miatları kontrol edilerek LAB.FR.29 (kit miat takip formu) na kaydedilir. 4.10. Tıbbi cihazların kalibrasyonları YÖN.TL.07 (izleme ve ölçme cihazlarının kontrolü talimatı) na göre yapılır. 4.11. Mikrobiyoloji uzmanı tarafından nöbet ve çalışma çizelgeleri hazırlanır. 4.12. İlaç ve sarf malzeme ihtiyacı için, hastane eczanesinden otomasyon üzerinden istem yapılan malzeme ve ilaçlar görevli personelce getirilir. 4.13. Kırtasiye ve malzeme ihtiyacında istem defteri Mikrobiyoloji uzmanı tarafından doldurulup ilgili müdür yardımcısına onaylattırılır. Gerekli malzemeler görevli personel tarafından depodan alınır. 4.14. Laboratuvar temizliği LAB.TL.03 (Laboratuvar Temizlik, Dezenfeksiyon ve Sterilizasyon Talimatı ve Kayıtları LAB.FR.25 (laboratuvar temizlik takip formu) na işlenir. 4.15. Hasta ve çalışanlarla ilgili güvenlik tedbirleri LAB.TL.02(Laboratuvar Güvenliği Talimatı) na göre alınır. Laboratuvar çalışanları koruyucu ekipmanları YÖN.TL.20 (Koruyucu Ekipman Kullanım Talimatı) na göre kullanırlar. Herhangi bir yaralanma veya kaza durumunda YÖN.TL.38 (Personel Yaralanmaları Takip Talimatı) na göre hareket edilir. 4.16. Laboratuvarın ve buzdolaplarının sıcaklık ve nem takipleri yapılarak YÖN.FR.26 (Isı ve nem takip formu) na işlenir. 4.17. Laboratuvarda ATK TL.01(tıbbi atık-çöp toplama hizmeti talimatı) na göre tıbbi atıklar kırmızı
poşete, iğne uçları ve kesici atıklar tıbbi atık kutularına, şişe-kâğıt gibi geri dönüşebilen atıklar mavi poşete (geri dönüşümlü atıklar), evsel atıklar siyah poşette toplanır. Atık miktarları ATK.FR.08 (atık takip formu) na kaydedilir. 4.18. Tehlikeli maddelerin kullanımı STK.TL.04(tehlikeli maddelerin kullanımı, atık kontrolü ve transferi talimatı) na göre gerçekleştirilir. STK.LS.01 (tehlikeli kimyasallar listesi) kullanım alanında bulundurulur. 4.19. Serviste tamir ve onarım gereken cihazlar var ise TSY.FR.02 (Arıza Bildirim Formu) düzenlenerek teknik hizmetlere bildirilir. Ayrıca laboratuvar hizmet alımı cihazlarında meydana gelen arıza durumlarında LAB.FR.01 (Laboratuvar arıza bildirim formu) doldularak bildirim yapılır. 4.20. TEST ÇALIŞMA PROSEDÜRLERİ 4.20.1. HBV DNA test prosedürü 4.20.1.1. Test, kandan DNA İzolasyonu yapılması ve PCR olmak üzere 2 aşamadan oluşmaktadır: 4.20.1.1.1. DNA İzolasyonu; 4.20.1.1.1.1. Çalışmaya başlamadan 15-20 dk. önce izolasyon cihazı açılarak UV lambası aktif hale getirilir. UV açıkken cihazın kapağının açık olmamasına dikkat edilmelidir. 4.20.1.1.1.2. (-20 C) de muhafaza edilen proteinaz K, carrier RNA ve HBV internal kontrol oda ısısına gelmesi için buzdolabından çıkarılır. 4.20.1.1.1.3. 1,5 ml lik steril ependorflar spora dizilerek üzerine örnek numaraları yazılır ve her bir ependorfa sırasıyla; 20μl proteinaz K, 10μl carrier RNA, 5μl internal kontrol eklenerek pipetaj yapılır, homojen bir karışım elde edildikten sonra üzerine 400 μl hasta serumu eklenir. 4.20.1.1.1.4. Hazırlanan örnekler izolasyon cihazına yerleştirilir. Cihazda ependorflar için uygun olan bölümün 1.sırasına (üst) kapaksız ependorflar, 3.sırasına uçlar ve 4.(alt) sırasına ise steril kapaklı ependorflar dizilir. 4.20.1.1.1.5. DNA izolasyonu için gerekli kimyasalları içeren hazır kartuş (201 kodlu) da takıldıktan sonra cihazın kapağı kapatılıp çalıştırılır. 4.20.1.1.1.6. Cihaz çalıştırılırken kartuş kodu olarak 201, örnek hacmi olarak 400 μl ve elde edilecek izole DNA hacmi olarak da 60 µl seçilir. Toplam 56 dk süren bu aşamadan sonra cihaz kapatılıp kapaklı ependorflarda bulunan DNA lar diğer aşamaya kadar mutlaka (-20 o C) de saklanır.
4.20.1.1.2. PCR ın hazırlanması; 4.20.1.1.2.1. Real Time PCR kiti aşağıda belirtilen bütün solüsyonları içermektedir. Bu aşamada kit oda ısısına gelmesi için buzdolabından çıkarılır. Oda ısısına geldikten sonra her bir hasta için tabloda belirtilen miktarlarda PCR karışımı hazırlanır; dh 2 O PCR Miks Detection Miks 1 Detection Miks 2 Örnek DNA Toplam Hacim 5 μl 12,5 μl 1,4 μl 1,1 μl 5 μl 25 μl 4.20.1.1.2.2. Çalışmada dört standart ve bir negatif kontrol (NK) kullanılmaktadır. Bu nedenle standartları ve negatif kontrolü hasta gibi düşünüp ona göre PCR miks hazırlanır. Örneğin 1 hasta varsa,4 standart ve 1 negatif kontrol ile birlikte toplam 6 hastalık miks hazırlanır. 4.20.1.1.2.3. Çalışılacak hasta sayısı ile tabloda belirtilen miktarlar (örnek DNA hariç) çarpılıp hazırlanarak elde edilen miks, standartlar ve negatif kontrol de dahil olmak üzere tüm ependorflara 20 şer μl olarak dağıtılır. 4.20.1.1.2.4. Bu karışımın üzerine son olarak ilk 4 ependorfa sırasıyla standartlar (S1, S2, S3, S4) 5 er μl olacak şekilde eklenir, hasta ependorflarına da yine 5 μl DNA eklenir. Bu işlem steril kabin içerisinde yapılmalıdır. 4.20.1.1.2.5. Negatif Kontrolün hazırlanması; Kontaminasyon riskini önlemek açısından NK diğer örneklerden ayrı olarak hazırlanmalıdır. 20 μl lik karışımın üzerine 5μl dh 2 O ve 1μl HBV internal kontrol eklenip tüpün ağzı kapatılmalıdır. 4.20.1.1.2.6. Sırasıyla standartlar, hastalar ve son olarak NK Real time PCR cihazına dizilerek kapak kapatılır ve bilgisayardan FDS programı açılarak cihaz çalıştırılır. Cihaz çalıştırılırken şu aşamalar izlenir; 4.20.1.1.2.6.1. Yeni bir deney dosyası açarak kanal 1 ve kanal 3 seçilip onaylanır. Kanal 1 standart HBV,kanal 3 ise kontrol ic olacak şekilde seçilir. 4.20.1.1.2.6.2. İlk 4 standart olacak şekilde seçilir ve sırasıyla standartlara 1.000.000, 100.000, 5.000 ve 100 olacak şekilde değerler girilip onaylanır.
4.20.1.1.2.6.3. Standarttan sonraki bölüm hasta olarak seçilir hasta bilgisi girilip onaylanır. 4.20.1.1.2.6.4. Ayarlar kısmından negatif eşik kısmı açılıp kantitatif değer 2, kalitatif değer 38 olarak seçilip onaylanır. 4.20.1.1.2.6.5. Son olarak gen amplifikasyonu kısmı tıklanıp aç denilince çıkan programlar arasından HBV seçilerek deney başlatılır. 4.20.1.1.2.6.6. Çıkan sonuçlar IU/ml cinsinden belirtilir. 4.20.2. HCV RNA Test prosedürü 4.20.2.1. Test, kandan RNA İzolasyonu ve PCR olmak üzere 2 aşamadan oluşmaktadır. 4.20.2.1.1. RNA İzolasyonu; 4.20.2.1.1.1. Çalışmaya başlamadan 15-20 dk. Önce izolasyon cihazı açılarak UV lambası aktif hale getirilir. UV açıkken cihazın kapağının açık olmamasına dikkat edilmelidir. 4.20.2.1.1.2. (-20 C) de muhafaza edilen proteinaz K,carrier RNA ve HCV internal kontrol oda ısısına gelmesi için buzdolabından çıkarılır. 4.20.2.1.1.3. 1,5 ml lik steril ependorflar spora dizilerek üzerine örnek numaraları yazılır ve her bir ependorfa sırasıyla; 20μl proteinaz K, 10μl carrier RNA, 5μl internal kontrol eklenerek pipetaj yapılır, homojen bir karışım elde edildikten sonra üzerine 400 μl hasta serumu eklenir. 4.20.2.1.1.4. Hazırlanan örnekler izolasyon cihazına yerleştirilir. Cihazda ependorflar için uygun olan bölümün 1.sırasına (üst) kapaksız ependorflar, 3.sırasına uçlar ve 4. (alt ) kısmına ise steril kapaklı ependorflar dizilir. 4.20.2.1.1.5. RNA izolasyonu için gerekli kimyasalları içeren hazır kartuş (201 kodlu) da takıldıktan sonra cihazın kapağı kapatılıp çalıştırılır. 4.20.2.1.1.6. Cihaz çalıştırılırken kartuş kodu olarak 201, örnek hacmi olarak 400 μl ve elde edilecek izole DNA hacmi olarak da 60 µl seçilir. Toplam 56 dk süren bu aşamadan sonra cihaz kapatılıp kapaklı ependorflarda bulunan RNA lar diğer aşamaya kadar mutlaka (-20 o C) de saklanır. 4.20.2.1.2. PCR ın hazırlanması; 4.20.1.2.1. Real Time PCR kiti aşağıda belirtilen bütün solüsyonları içermektedir. Bu aşamada kit oda ısısına gelmesi için buzdolabından çıkarılır. Oda ısısına geldikten sonra her bir hasta için tabloda belirtilen miktarlarda PCR karışımı hazırlanır; dh 2 O PCR Miks 4,25 μl 12,5 μl
RT Miks 0,25 µl Detection Miks 1 1,5 μl Detection Miks 2 1,5 μl Örnek RNA 5 μl Toplam Hacim 25 μl 4.20.2.1.2.2. Çalışmada dört standart ve bir negatif kontrol (NK) kullanılmaktadır. Bu nedenle standartları ve negatif kontrolü hasta gibi düşünüp ona göre PCR miks hazırlanır. Örneğin 1 hasta varsa,4 standart ve 1 negatif kontrol ile birlikte toplam 6 hastalık miks hazırlanır. 4.20.2.1.2.3. Çalışılacak hasta sayısı ile tabloda belirtilen miktarlar (örnek RNA hariç) çarpılıp hazırlanarak elde edilen miks, standartlar ve negatif kontrol de dahil olmak üzere tüm ependorflara 20 şer μl olarak dağıtılır. 4.20.2.1.2.4. Bu karışımın üzerine son olarak ilk 4 ependorfa sırasıyla standartlar (S1, S2, S3, S4) 5 er μl olacak şekilde eklenir, hasta ependorflarına da yine 5 μl RNA eklenir. Bu işlem steril kabin içerisinde yapılmalıdır. 4.20.2.1.2.5. Negatif Kontrolün hazırlanması; Kontaminasyon riskini önlemek açısından NK diğer örneklerden ayrı olarak hazırlanmalıdır. 20 μl lik karışımın üzerine 5μl dh₂o ve 1μl HCV internal kontrol eklenip tüpün ağzı kapatılmalıdır. 4.20.2.1.2.6. Sırasıyla standartlar, hastalar ve son olarak NK Real time PCR cihazına dizilerek kapak kapatılır ve bilgisayardan FDS programı açılarak cihaz çalıştırılır. Cihaz çalıştırılırken şu aşamalar izlenir; 4.20.2.1.2.6.1. Yeni bir deney dosyası açarak kanal 1 ve kanal 3 seçilip onaylanır. Kanal 1 standart HCV,kanal 3 ise kontrol ic olacak şekilde seçilir. 4.20.2.1.2.6.2. İlk 4 standart olacak şekilde seçilir ve sırasıyla standartlara 1.000.000, 100.000, 20.000 ve 5000 olacak şekilde değerler girilip onaylanır. 4.20.2.1.2.6.3. Standarttan sonraki bölüm hasta olarak seçilir hasta bilgisi girilip onaylanır. 4.20.2.1.2.6.4. Ayarlar kısmından negatif eşik kısmı açılıp kantitatif değer 2, kalitatif değer 38 olarak seçilip onaylanır. 4.20.2.1.2.6.5. Son olarak gen amplifikasyonu kısmı tıklanıp aç denilince çıkan programlar arasından HCV seçilerek deney başlatılır.
4.20.2.1.2.6.6. Çıkan sonuçlar IU/ml cinsinden belirtilir. 4.20.3. RSV RNA Test prosedürü 4.20.3.1. Test, Transport Medium içerisinde saklanan örnekten (nazofaringeal sürüntü) RNA İZOLASYONU ve PCR olmak üzere 2 aşamadan oluşmaktadır. 4.20.3.1.1. RNA İzolasyonu; 4.20.3.1.1.1. Çalışmaya başlamadan 15-20 dk. Önce izolasyon cihazı açılarak UV lambası aktif hale getirilir. UV açıkken cihazın kapağının açık olmamasına dikkat edilmelidir. 4.20.3.1.1.2. (-20 C) de muhafaza edilen proteinaz K,carrier RNA ve Transport Medium (RSV tüpü) oda ısısına gelmesi için buzdolabından çıkarılır. 4.20.3.1.1.3. 1,5 ml lik steril ependorflar spora dizilerek üzerine örnek numaraları yazılır ve her bir ependorfa sırasıyla; 20μl proteinaz K, 10μl carrier RNA eklenerek pipetaj yapılır, homojen bir karışım elde edildikten sonra üzerine 400 μl hasta serumu eklenir. 4.20.3.1.1.4. Hazırlanan örnekler izolasyon cihazına yerleştirilir. Cihazda ependorflar için uygun olan bölümün 1.sırasına (üst) kapaksız ependorflar, 3.sırasına uçlar ve 4. (alt ) kısmına ise steril kapaklı ependorflar dizilir. 4.20.3.1.1.5. RNA izolasyonu için gerekli kimyasalları içeren hazır kartuş (201 kodlu) da takıldıktan sonra cihazın kapağı kapatılıp çalıştırılır. 4.20.3.1.1.6. Cihaz çalıştırılırken kartuş kodu olarak 201, örnek hacmi olarak 400 μl ve elde edilecek izole RNA hacmi olarak da 60 µl seçilir. Toplam 56 dk süren bu aşamadan sonra cihaz kapatılıp kapaklı ependorflarda bulunan RNA lar diğer aşamaya kadar mutlaka (-20 o C) de saklanır. 4.20.3.1.2. PCR ın hazırlanması; 4.20.3.1.2.1. Real Time PCR kiti aşağıda belirtilen bütün solüsyonları içermektedir. Bu aşamada kit oda ısısına gelmesi için buzdolabından çıkarılır. Oda ısısına geldikten sonra her bir hasta için tabloda belirtilen miktarlarda PCR karışımı hazırlanır; dh 2 O SYBR PCR Miks 2,25 μl 12,5 μl RT Miks 0,25 µl Detection Miks 1 Toplam Hacim 5 μl 20 μl 4.20.3.1.2.2. Çalışmada pozitif ve negatif kontrol kullanılmaktadır. Bu nedenle pozitif ve negatif
kontrolü hasta gibi düşünüp ona göre PCR miks hazırlanır. Örneğin 1 hasta varsa,1 PK ve 1 NK ile birlikte toplam 3 hastalık miks hazırlanır. 4.20.3.1.2.3. Çalışılacak hasta sayısı ile tabloda belirtilen miktarlar (örnek RNA hariç) çarpılıp hazırlanarak elde edilen miks, standartlar ve negatif kontrol de dahil olmak üzere tüm ependorflara 20 şer μl olarak dağıtılır. 4.20.3.1.2.4. Bu karışımın üzerine son olarak 5μl pozitif kontrol, hasta ependorflarına da yine 5 μl RNA eklenir. Bu işlem steril kabin içerisinde yapılmalıdır. 4.20.3.1.2.5. Negatif Kontrolün hazırlanması; Kontaminasyon riskini önlemek açısından NK diğer örneklerden ayrı olarak hazırlanmalıdır. 20 μl lik karışımın üzerine 5μl dh₂o eklenip tüpün ağzı kapatılmalıdır. 4.20.3.1.2.6. Sırasıyla hastalar, PK ve son olarak NK Real time PCR cihazına dizilerek kapak kapatılır ve bilgisayardan FDS programı açılarak cihaz çalıştırılır. Cihaz çalıştırılırken şu aşamalar izlenir; 4.20.3.1.2.6.1. Yeni bir deney dosyası açarak kanal 1 seçilip onaylanır. Kanal 1 standart RSV olacak şekilde seçilir. 4.20.3.1.2.6.2. Hasta bilgisi girilip onaylanır. 4.20.3.1.2.6.3. Ayarlar kısmından negatif eşik kısmı açılıp kantitatif değer 2 olarak seçilip onaylanır. 4.20.3.1.2.6.4. Son olarak gen amplifikasyonu kısmı tıklanıp aç denilince çıkan programlar arasından RSV seçilerek deney başlatılır. 4.20.4. HSV DNA Test prosedürü 4.20.4.1. Test, DNA İZOLASYONU ve PCR olmak üzere 2 aşamadan oluşmaktadır. 4.20.4.1.1. DNA İzolasyonu; 4.20.4.1.1.1. Çalışmaya başlamadan 15-20 dk. Önce izolasyon cihazı açılarak UV lambası aktif hale getirilir. UV açıkken cihazın kapağının açık olmamasına dikkat edilmelidir. 4.20.4.1.1.2. (-20 C) de muhafaza edilen proteinaz K,carrier RNA oda ısısına gelmesi için buzdolabından çıkarılır. 4.20.4.1.1.3. 1,5 ml lik steril ependorflar spora dizilerek üzerine örnek numaraları yazılır ve her bir ependorfa sırasıyla; 20μl proteinaz K, 10μl carrier RNA eklenerek pipetaj yapılır, homojen bir karışım elde edildikten sonra üzerine 400 μl BOS örneği eklenir. 4.20.4.1.1.4. Hazırlanan örnekler izolasyon cihazına yerleştirilir. Cihazda ependorflar için uygun olan
bölümün 1.sırasına (üst) kapaksız ependorflar, 3.sırasına uçlar ve 4. (alt ) kısmına ise steril kapaklı ependorflar dizilir. 4.20.4.1.1.5. DNA izolasyonu için gerekli kimyasalları içeren hazır kartuş (201 kodlu) da takıldıktan sonra cihazın kapağı kapatılıp çalıştırılır. 4.20.4.1.1.6. Cihaz çalıştırılırken kartuş kodu olarak 201, örnek hacmi olarak 400 μl ve elde edilecek izole DNA hacmi olarak da 60 µl seçilir. Toplam 56 dk süren bu aşamadan sonra cihaz kapatılıp kapaklı ependorflarda bulunan DNA lar diğer aşamaya kadar mutlaka (-20 o C) de saklanır. 4.20.4.1.2. PCR ın hazırlanması; 4.20.4.1.2.1. Real Time PCR kiti aşağıda belirtilen bütün solüsyonları içermektedir. Bu aşamada kit oda ısısına gelmesi için buzdolabından çıkarılır. Oda ısısına geldikten sonra her bir hasta için tabloda belirtilen miktarlarda PCR karışımı hazırlanır; Probe PCRMiks 12,5 μl Detection Miks 1 dh 2 O Örnek DNA / NK / PK Toplam hacim 1,5 μl 4.20.4.1.2.2. Çalışmada NK olarak PCR grade dh 2 O kullanılmaktadır. Bu nedenle negatif kontrolü hasta 1 μl 10 μl 25 μl gibi düşünüp ona göre PCR miks hazırlanır. Örneğin 1 hasta varsa 1 NK ile birlikte toplam 2 hastalık miks hazırlanır. 4.20.4.1.2.3. Yukarıda verilen miktarlar 1 örnek için olup daha fazla sayıda çalışılacak ise örnek sayısı ile çarpılır. Çalışılacak hasta sayısı ile tabloda belirtilen miktarlar (örnek DNA hariç) çarpılıp hazırlanarak elde edilen miks, negatif kontrol de dahil olmak üzere tüm ependorflara 20 şer μl olarak dağıtılır. 4.20.4.1.2.4. Bu karışımın üzerine son olarak hasta ependorflarına 5 μl RNA eklenir. Bu işlem steril kabin içerisinde yapılmalıdır. 4.20.4.1.2.5. Negatif Kontrolün hazırlanması; Kontaminasyon riskini önlemek açısından NK diğer örneklerden ayrı olarak hazırlanmalıdır. 4.20.4.1.2.6. Sırasıyla hastalar ve NK Real time PCR cihazına dizilerek kapak kapatılır ve bilgisayardan FDS programı açılarak cihaz çalıştırılır. Cihaz çalıştırılırken şu aşamalar izlenir;
4.20.4.1.2.6.1. Yeni bir deney dosyası açarak kanal 1 seçilip onaylanır. Kanal 1 standart HSV olacak şekilde seçilir. 4.20.4.1.2.6.2. Hasta bilgisi girilip onaylanır. 4.20.4.1.2.6.3. Ayarlar kısmından negatif eşik kısmı açılıp kantitatif değer 2 olarak seçilip onaylanır. 4.20.4.1.2.6.4. Son olarak gen amplifikasyonu kısmı tıklanıp aç denilince çıkan programlar arasından HSV seçilerek deney başlatılır. 4.20.5. HCV genotiplendirme test prosedürü 4.20.5.1. Genotip çalışılacak hastanın mutlaka önceden HCV RNA sının çalışılıp sonucunun pozitif olması gerekmektedir. Test, RNA İZOLASYONU ve PCR olmak üzere 2 aşamadan oluşmaktadır. 4.20.5.1.1. RNA İzolasyonu; 4.20.5.1.1.1. Çalışmaya başlamadan 15-20 dk. önce izolasyon cihazı açılarak UV lambası aktif hale getirilir. UV açıkken cihazın kapağının açık olmamasına dikkat edilmelidir. 4.20.5.1.1.2. (-20 C) de muhafaza edilen proteinaz K,carrier RNA oda ısısına gelmesi için buzdolabından çıkarılır. 4.20.5.1.1.3. 1,5 ml lik steril ependorflar spora dizilerek üzerine örnek numaraları yazılır ve her bir ependorfa sırasıyla; 20μl proteinaz K, 10μl carrier RNA eklenerek pipetaj yapılır, homojen bir karışım elde edildikten sonra üzerine 400 μl hasta serumu eklenir. 4.20.5.1.1.4. Hazırlanan örnekler izolasyon cihazına yerleştirilir. Cihazda ependorflar için uygun olan bölümün 1.sırasına (üst) kapaksız ependorflar, 3.sırasına uçlar ve 4. (alt ) kısmına ise steril kapaklı ependorflar dizilir. 4.20.5.1.1.5. RNA izolasyonu için gerekli kimyasalları içeren hazır kartuş (201 kodlu) da takıldıktan sonra cihazın kapağı kapatılıp çalıştırılır. 4.20.5.1.1.6. Cihaz çalıştırılırken kartuş kodu olarak 201, örnek hacmi olarak 400 μl ve elde edilecek izole DNA hacmi olarak da 60 µl seçilir. Toplam 56 dk süren bu aşamadan sonra cihaz kapatılıp kapaklı ependorflarda bulunan RNA lar diğer aşamaya kadar mutlaka (-20 o C) de saklanır. 4.20.5.1.2. PCR ın hazırlanması; 4.20.1.2.1. En sık rastlanılan 3 HCV Genotipi olup, genotip kiti 3 ayrı detection miksi içerir. Her bir hasta için 3 karışım sırayla hazırlanır ve her karışım için ayrı bir NK payı eklenir. Real Time PCR kiti aşağıda belirtilen bütün solüsyonları içermektedir. Bu aşamada kit oda ısısına gelmesi için buzdolabından çıkarılır. Oda ısısına geldikten sonra her bir hasta için tabloda belirtilen miktarlarda PCR
karışımı hazırlanır; KARIŞIM 1; PCR Miks RT Miks Detection Miks 1 12,5 μl 0,25 μl 2,25 μl KARIŞIM 2; PCR Miks RT Miks Detection Miks 2 12,5 μl 0,25 μl 2,25 μl KARIŞIM 3; PCR Miks 12,5 μl RT Miks 0,25 μl Detection Miks 3 2,25 μl 4.20.5.1.2.2. Miksler hasta sayısı ve negatif kontrol de hesaba katılarak hazırlanır. Karışım steril PCR tüplerine dağıtılır ve üzerine 10 ar μl örnek RNA sı eklenir. Bu işlem steril kabin içerisinde yapılmalıdır. 4.20.5.1.2.3. Yukarıda verilen miktarlar 1 örnek için olup daha fazla sayıda çalışılacak ise örnek sayısı ile çarpılır. 4.20.5.1.2.4. Negatif Kontrolün hazırlanması; Kontaminasyon riskini önlemek açısından NK diğer örneklerden ayrı olarak hazırlanmalıdır. Negatif kontrole de PCR grade (su) eklenir. 4.20.5.1.2.5. Hasta sayısına göre tüplerin yerleştirilmesi de önemlidir. Hazırlanan tüpler tabloda gösterildiği gibi FDS plate e yerleştirilir; 1.hasta karışım 1 1.hasta karışım 2 1.hasta karışım 3 1.karışım negatif kontrol 2.hasta karışım 1 2.hasta karışım2 2.hasta karışım 3 2.karışım negatif kontrol 3.hasta karışım 1 3.hasta karışım 3 3.hasta karışım 3 3.karışım negatif kontrol 4.20.5.1.2.6.1. Yeni bir deney dosyası açarak kanal 1 seçilip onaylanır. 4.20.5.1.2.6.2. Hasta bilgisi girilip onaylanır. 4.20.5.1.2.6.3. Ayarlar kısmından negatif eşik kısmı açılıp kantitatif değer 2 olarak seçilip onaylanır. 4.20.5.1.2.6.4. Son olarak gen amplifikasyonu kısmı tıklanıp aç denilince çıkan programlar arasından
HCV GENOTİPLENDİRME seçilerek deney başlatılır. 4.20.5.2. HCV genotiplendirme sonuçlarının değerlendirilmesi: 4.20.5.2.1. Karışım 1 ile genotip 1 varlığına bakılır. 1. Kanalda (FAM) artış varsa hasta genotip 1 demektir. 4.20.5.2.2. Karışım 2 ile genotip 3 varlığına bakılır. 1. kanalda artış varsa hasta genotip 3 demektir. 4.20.5.2.3. Karışım 3 ile genotip 2 ve 4 varlığına bakılır.1.kanalda artış varsa hasta genotip 2, 3.kanalda artış varsa hasta genotip 4 anlamına gelir. 4.20.6. VRE DNA Test prosedürü 4.20.6.1. Transport besiyeri içinde gelen rektal swab kit içerisindeki sample buffer tüpüne kırılır ve 60 sn vortekslenir. 4.20.6.2. Sample buffer içindeki süspansiyondan 50 μl alınarak (her örnek için) lizis tüplerine transfer edilir. 4.20.6.3. Beş (5 dk.) Boyunca yüksek hızda vortekslendikten sonra 10 sn lik hızlı santrifüj yapılır. 4.20.6.4. Daha sonra 95 C de 2 dk boyunca inkübe edilir. İnkübasyondan sonra örnekler buz kalıbına alınır. 4.20.6.5. Bu arada çalışma için gerekli reaktifler sulandırılır: Master Miks tüpüne 225 μl dilüent Pozitif kontrol tüpüne 225 μl sample buffer eklenerek sulandırılır. 4.20.6.6. Soğutucu blok üzerine örnek sayısına göre smart cycler tüpleri dizilir (NK ve PK da hesaplanır). Sulandırılan master miks 25 μl olarak tüplere dağıtılır. 4.20.6.7. Smart cycler tüplerine 3 er μl lizat eklenir (lizis tüpündeki süspansiyondan). PK ve NK da eklenip kapakları kapatıldıktan sonra santrifüj yapılır. 4.20.6.8. Smart Cycler cihazindaki kuyucuklara numuneler yerleştirilir. 4.20.6.9. Create Run seçeneği tıklanıp yeni deney dosyası oluşturulur ve kullanılan kit ile ilgili lot numarası ve hasta sayısı belirtildikten sonra hasta bilgileri girilir. 4.20.6.10. Start Run seçeneği tıklanarak deney başlatılır. 4.20.7. M. tuberculosis DNA (tüberküloz) çalışma prensibi 4.20.7.1. Test, DNA İZOLASYONU ve PCR olmak üzere 2 aşamadan oluşmaktadır.
4.20.7.1.1. DNA İzolasyonu; 4.20.7.1.1.1. Çalışılacak örnek mide özsuyu, balgam, BOS veya diğer vücut sıvıları (plevral vb.) olmalıdır. 4.20.7.1.1.2. Gelen örnek steril bir ependorfa alınır ve 8000 rpm de santrifüj edilir. Daha sonra üst kısımda oluşan süpernatant kısım pipet yardımıyla alınıp atılır(dipte pellet oluşumu çok önemlidir). 4.20.7.1.1.3. Pelletin üzerine 200 µl lizozim eklenir ve 37 C de 30 dakika boyunca inkübe edilir ( yarım saatlik inkübasyonda her 5 dakikada bir vorteks yapılarak pelletin iyice çözülmesi sağlanır ). 4.20.7.1.1.4. İnkübasyondan sonra karışımın üzerine 4 µl RNAse eklenir ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletilir. 4.20.7.1.1.5. Karışım iyice pipetlendikten sonra üzerine 40 µl Proteinaz-K eklenir ve vortekslenir. 4.20.7.1.1.6. Karışımı Mag16 kapaksız tüpe alınarak üzerine 5 µl internal kontrol eklenir ve cihaz 502 koduyla çalıştırılır. 4.20.7.1.2. PCR ın hazırlanması; dh 2 0 4,4 PCR Miks 12,5 Detection miks 1 1,4 Detection miks 2 1,4 İnternal Kontrol 0,3 4.20.7.1.2.1. Yukarıda verilen miktarlar örnek sayısı ile çarpılır ( pozitif ve negatif kontrol de unutulmamalıdır). 4.20.7.1.2.2. Negatif kontrolün hazırlanması; 20 µl lik PCR karışımının üzerine 5 µl su ve 1 µl internal kontrol eklenir. 4.20.7.1.2.3. Pozitif kontrolün hazırlanması; 20 µl lik PCR karışımının üzerine 5 µl PK ve 1 µl internal kontrol eklenir. 4.20.7.1.2.4. Diğer örneklere de 5 er µl hasta DNA sı eklenir ve örnekler cihaza yerleştirilip FDS programı çalıştırılır. 4.21. Tüm testlerin, test içi Pozitif Kontrol (PK), Negatif Kontrol (NK), standartlar veya internal kontrol olmak üzere kontrolleri her çalışma öncesinde ve çalışma esnasında çalışılır. 4.22. HBV DNA ve HCV RNA testleri için yılda 2 kez olmak üzere eksternal kalite kontrol çalışmaları
yapılır. 4.23. Sonuç değerlendirme ve onay 4.23.1. Sonuçlanmış olan tetkikler Mikrobiyoloji uzmanı tarafından değerlendirilir. Tüm test basamakları valid ise sonuçların otomasyona girilmesi için onay verir. 4.23.2. Sonuçlanmış olan tetkiklerin otomasyon üzerinden ilgili laboratuvar uzmanınca onayı yapılır. Uzmanın olmadığı durumlarda idarece belirlenerek yetkilendirilmiş kişi onay yapabilir. 5. SORUMLULUK: Bu talimatın uygulanmasından moleküler mikrobiyoloji laboratuvarında çalışan laboratuvar teknisyenleri ve Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji uzmanı sorumludur. 6. EKLER: 6.1. ATK.FR.08 (atık takip formu) 6.2.YÖN.FR.49 (Laboratuvar istem formu) 6.3.LAB.FR.10 (Laboratuvar Tekrarlanan Test Kayıt Formu) 6.4.LAB.FR.04 (Laboratuvar Aylık Preanalitik Hata Değerlendirme Formu) 6.5.LAB.FR.06 (Panik değer bildirim formu). 6.6.LAB.FR.12 (Dış kalite kontrol değerlendirme formu) 6.7.LAB.FR.02 (Laboratuvar Analitik Hata Değerlendirme Formu) 6.8.LAB.FR.25 (laboratuvar temizlik takip formu) 6.9.LAB.FR.03 (Laboratuvar Postanalitik Hata değerlendirme formu) 6.10. YÖN.FR.26 (Isı ve nem takip formu) 6.11.LAB.FR.01 (Laboratuvar arıza bildirim formu) 6.12.YÖN.FR.78 (kit miat takip formu) HAZIRLAYAN:MİKROBİYOLOJİ VE KLİNİK MİKROBİYOLOJİ UZMANI KONTROL EDEN:KALİTE YÖNETİM DİREKTÖRÜ ONAYLAYAN:BAŞHEKİM