IV. ULUSAL KAN MERKEZLERİ VE TRANSFÜZYON KONGRESİ KAN GRUPLAMADA KARŞILA ILAŞILAN ILAN SORUNLAR Dr. Meral SÖNMEZOS NMEZOĞLU Yeditepe Üniversitesi Hastanesi Transfüzyon Merkezi
KAN GRUP TERMİNOLOJ NOLOJİSİ Sistem (Tek gen loküsünde allel ile kodlanan antijen spesifisitesi-29) Koleksiyon (Serolojik, genetik, biyokimyasal temel) Seri (bilinen seri ve koleksiyonlara girmemiş en az iki antijen bildirimi-700 seri düşük insidans, 901 seri yüksek insidans) Page 2
Major kan grup sistemleri Page 3
Diğer kan grup sistemleri Page 4
ABO Kan Grup Sistemi ABO sistemi transfüzyonla ilişkili olarak en önemli kan grup sistemidir. ABO tanımlamada güçlükler ve yanlış yorumlama hasta hayatına mal olabilir. ABO ve H iki ayrı sistem, biyokimyasal ve fenotipik düzeyde yakın ilişkili ABO geni kromozom 9 üzerinde lokalize Page 5
ABO Kan Grup Sistemi (2) A ve B ABH genleri kan grup antijeni değil, transferaz isimli enzimleri kodlar. A antijeni: terminal KH; N-asetil-galaktozamin B antijeni: terminal KH; galaktoz O antijeni yok: O geni A ve B yokluğunda nonfonksiyone transferaz üretir. Page 6
Tip 2 Prekürs rsör r Zincir Page 7
H Antijen Oluşumu umu Page 8
A Antijen Oluşumu umu Page 9
B Antijen Oluşumu umu Page 10
ABO alleller Page 11
ABO Kan Grup SistemS stemi Genotip p (Gen) Fenotip p (Kan( grubu) Eritrositte antijen Plazmada antikor A 1 A 1, A 1 A 2 A 1 (23-25%) 25%) A 1, (H) anti-b, anti-h A 2 A 2, A 2 O A 2 (6-10%) A 2, (H) Anti-B, anti-a 1 BB, BO B(8-17%) B,(H) Anti-A/A A/A 1 A 1 B A 1 B(3%) A,A 1,B Anti-H A 2 B A 2 B(1%) A,B,H Anti-A 1 O,O O(43-50%) H Anti-A, A,-A 1,-B H,h Oh Bombay None Anti-A, A,-A 1,-B, B,-H Page 12 12
ABO Kan Gruplama ABO kan gruplaması iki şekilde yapılır: Eritrositler A ve/veya B antijenlerinin varlığına göre tiplendirilir: forward (doğrudan) gruplama Serum/plazma anti-a ve/veya anti-b antikorlarının varlığı veya yokluğu için test edilir: revers (dolaylı) gruplama Page 13
ABO Kan Gruplama Forward Gruplama Yıkanmış hücrelerle Test: Monoklonal Anti-A Monoklonal Anti-B Inert kontrol Aglütination pozitif sonuç Reverse Gruplama Plazma/serum test: Bilinen A 1 hücreleri Bilinen B hücreleri Bilinen O hücreleri? Bilinen A 2 hücreler Reaksiyonlar forward dan daha zayıf Page 14 ABO & Rh(D) 14
Yöntemler 1. Hemaglütinasyon a. Lam (Slide) Yöntemi b. Tüp Yöntemi c. Jel Santrifügasyon Yöntemi d. Mikroplak Yöntemi 2. RİA (Radio immun assay) 3. EİA (Enzim immun assay) 4. PCR, (polimerase chain reaction) Page 15
Kan Gruplama Testler iki kişi tarafından ayrı ayrı çalışılır ve ayrı kayıt yapılır. Sonuçlar uyumlu çıkarsa hasta kaydına girilir. Varsa eski kayıtlarla karşılaştırılır RhD negatif sonuçlar mutlaka tekrar çalışılır. Page 16
Page 17
Forward ve Reverse gruplama Patient Anti-A Anti-B A 1 Cells B Cells 1 4+ 1+ 0 4+ 2 0 4+ 1+ 0 3 4+ 4+ 1+ 0 4 0 3+ 0 0 Page 18
Page 19
Page 20
Rh Kan grubu ABO dan sonra 2. önemli kan grup sistemi İki Rh geni RHD ve RHCE RHD..D antijeni RHCE 4 antijen kombinasyonu ce, Ce, ce, CE Allel genler D+ RHD + RHCE D-.silinmiş RHCE Page 21
Rh kan grup sistemi Page 22 1940da by Landsteiner & Wiener tarafından bulundu. En komplex eritrosit antijen sistemi; kromozom 1 üzerinde lokalize Eritrosit yüzeyinde bulunur-membrana entegre primer antijen bulunursa Rh (+) Serumda doğal antikoru bulunmaz Immün antikor (IgG) oluşur
Rh Kan Gruplama Farklı teknikler Tüp, Mikroplak, Jel teknolojisi, Otomasyon İki anti-d kullanılır Negatif sonuçlar doğrulanır Hücreler DAT pozitif bulunursa yorumlanır Page 23
Page 24
Page 25
Eritrosit Tiplendirmede Sorunlar Zayıf reaktan veya eksik antijenler 1. A ve B Subgrupları 2. Bazı hastalıklara bağlı antihen ekspresyonunda değişiklikler 3. Kimerizm Beklenmedik antijen reaksiyonları 1. Rulo formasyonu (globulin düzeyi yüksekliği) 2. Antikor kaplı eritrositler (+ DAT) 3. Poliaglütinasyon Page 26 4. Kazanılmış B antijeni
GÜÇLÜKLER Forward gruplama sonucu revers testle uyumsuz çıktığında İki ayrı kişinin yaptığı test sonuçları aynı olmadığında Test sonucu hastanın daha önceki sonuçlarıyla uyuşmadığında Kanı stoğa koyma! Kesin sonuç çıkana kadar kullanma! Page 27
Hatalar
Teknik Hatalar Kayıt hataları Tüpler yanlış etiketli Hasta yanlış tanımlı Kayıtların yanlış yorumlanması Kayıt transferinde hata Bilgisayara aktarırken hata Reajan veya ekipman hataları SKT geçmiş reajan kullanımı Kalibre olmayan santrifüj kullanma Kontamine veya hemolizli reajan kullanma Saklama ısılarına uymama (yanlış ısı?) İşlem hataları Reajan eklenmemesi Üretici talimatlarına uymama RBC süspansiyonlarının uygunsuz konsantrasyonları Hücre kümelerinin aglütinasyon değerlendirmesi öncesi resüspanse edilmemesi Page 29
Pıhtılaşma yetersizlikleri Pıhtılaşmayan Serum : Düşük platelet sayısı Antikoagulan tedavisi (Heparin, Aspirin, etc) Faktör yetersizlikleri Test öncesi tam olarak puhtılaşmayan serum aglüinasyonu taklit eden fibrin kümeleri oluşturmaya eğilimlidir Pıhtı oluşturmak için seruma Trombin eklenebilir veya, EDTA lı tüpler kullanılabilir Page 30
Kontamin tamine örnek veya reajanlar Örnek kontaminasyonu Tüpte mikrobiyal üreme Reajan kontaminasyonu Bakteriyel üreme bulutlu, renk değişikliği yapan görünüme neden olur.. Bu reajan kullanılmaz! Diğer reajanlarla kontamine reajanlar (dağıtımda tüp kenarlarına dokunulmaz) Tuzlu su düzenli değiştirilir Page 31
Ekipman sorunları Rutin bakım yapılmalıdır (günlük, haftalık, aylık, vs) Cihaz kalibrasyonları yapılmalıdır (santrifüj, termometre, zaman ayarlayıcı) Kalibre olmayan santrifüjler hatalı sonuçlara yol açabilir Page 32
Hemoliz Santrifüjden sonra serumda tespit edilir (kırmızı) Dökümente edilmelidir Neden olabilecekleri: Kompleman bağlama Anti-A, anti-b, anti-h, ve anti-le a Bakteriyel kontaminasyon Kırmızı süpernatan Page 33
ABO uyumsuzlukları
ABO Uyumsuzluğu RBC lerle ilgili sorunlar Zayıf reaktan/eksik antijenler Extra antijenler Karışık alan reaksiyonları Serum la ilgili sorunlar Zayıf reaktan/eksik antikorlar Extra antikorlar Page 35
Grouping Forward Reverse Missing/Weak Extra Mixed Field Missing/Weak Extra A/B Subgroup Acquired B O Transfusion Young Elderly Immunocompromised Cold Autoantibody Disease (cancer) B(A) Phenotype Bone Marrow Transplant Cold Alloantibody Rouleaux May cause all + reactions Rouleaux Anti-A 1 Page 36
FORWARD (DOĞRUDAN) GRUPLAMADA GÜÇG ÜÇLÜKLER
Eritrositle İlgili Problemler ler ABO forward gruplamada beklenmedik reaksiyonlar iki grupta görülebilir; zayıf veya eksik reaktivite ekstra reaktivite Karışık alan reaksiyonları Page 38
Forward Gruplama: Eksik veya Zayıf antijenler ABO Subgrupları Hastalık (lösemi, Hodgkin hastalığı) Anti-A Anti-B A1 hücre B hücre 0 0 0 4+ O grubu A Grubu Forward ve reverse uyuşmuyor, (eksik antijen..) Page 39
A Subgruplar ları (veya B) A subgrupları tüm popülasyonda az oranda (B subgrupları daha nadir) Bu subgrupların eritrosit yüzeyinde daha az antijen bölgesi vardır Sonuçta daha zayıf (eksik) reaksiyon verirler Çözüm: A subgrupları için Anti-A 1, Anti-H, ve anti- A,B ile test edilir Page 40
A1 ve A2 Eritrositler ve Antijenler Page 41 A1 Eritrosit Kan grup A determinant sayısı A 1 810.000-1.170.000 A 2 160.000-440.000 A 3 40.600-118.000 Ax 7.500-10.500 A end 2.100-2.700 A m 100-1.900 A el 100-1.400 A y 100-1.900 A2 Eritrosit
A subgrupları Page 42
Forward Gruplama lama: Extra Antijen enler Kazanılmış B B(A) fenotip Rulo Poliaglutinasyon Wharton s Jelly Anti-A Anti-B A1 B 4+ 1+ 0 4+ Page 43 ÖRNEK
Kazanılm lmış B Fenotipi A 1 grubu kişilerde görülür: Alt GI yol hastalığı Kolon/rektum kanseri Intestinal obstrüksiyonu Gram negatif septisemi (örn. E. coli) Page 44
Kazanılm lmış B Bakteriler (E. coli) deasetile eden enzim ile A KH etkiler. A Grubu Kişi Kazan.B Fenotipi Bakteriyel enzim asetil grubunu koparır N-acetyl galactosamine Galactozamin D- galactose (Grup B) a benzer Page 45
Kazanılm lmış B de Çözüm Hastanın tanılarını gözden geçir: İnfeksiyon? Bazı üreticilerin anti-b reajanları kazanılmış B ile reaksiyon vermez Hasta serumunu kendi RBC leri ile test edilir. Hastanın kendi anti-b si eritrositler üzerindeki kazanılmış B antijeni ile reaksiyon vermez (otolog test Page 46
B(A) fenotipi Kazanılmış B ye benzer Hasta B Grubu ve belirgin extra A antijeni var B geni, H antijenine az miktarda A KH ı transfer eder Bazan belirli anti-a reajanları bu az miktardaki A antijenini tespit eder Çözüm: Başka üretici anti-a reajanı ile test tekrar edilir Page 47
extra antijen enlerin diğer nedenleri Poliagglütinasyon Kan grubu ne olursa olsun eritrositler human antiserumla agglütinasyon verir Bakteriyel enfeksiyona bağlı.. Saklı T antijen ekspresyonu antiserumla reaksiyon verir Rulo extra serum proteinleri Wharton Jeli Kordon kanında bulunan bağ dokusu kaynaklı jelatinöz substans yalancı aglütinasyon verebilir. (Hatırlatma: kordon kanında sadece forward gruplama yapılır) RBC yıka veya yeni kan örneği Page 48
Forward Gruplama lama:karışık k Alan Aglutinasyonu İki farklı hücre popülasyonundan kaynaklanır Aglütine olmamış hücre zemininde aglütinatlar vardır O grubu transfüze edilmiş tüm gruplarda Kemik iliği/kök hücre alıcılarında A 3 fenotipinde Anti-A Anti-B A1 Cells B Cells 0 2+ mf 4+ 0 Page 49
Forward Gruplama lama:kar Karışık k Alan Aglutinasyonu Page 50 Mixed Field Agglutination (Post transfusion) ~ (ABO Testing) Can be seen in A, B and AB individuals who have received O units. The antisera reacts with the patient s RBCs, but not with the transfused O cells. ~ (Antibody screen) Can also be seen post transfusion if a person makes an antibody to antigen on donor cells; antibody agglutinates with donor cell, but not their on cells.
Reverse Gruplamada Sorunlar
Reverse Gruplama Reverse gruplamayı etkileyen Eksik veya zayıf antikorlar Extra antikorlar Page 52
Reverse Gruplama lama: Eksik veya Zayıf antikorlar Yenidoğanlar Antikor oluşturmazlar (birkaç ay sonra 5 yaş pik) Yaşlılar Antikor aktivitesi zayıflar Hipogammaglobulinemi Az yada hiç antikor üretimi yok (örn. immunokompromize) Reverse gruplamada hiç aglütinasyon yoktur Page 53
Zayıf f veya eksik antikorda çözüm Hastanın yaşı, tanısı Antikor reaksiyonunu artırmak için serum testini 15 dk inkübe et (Oda ısısı) Negatif ise otokontrol ile beraber mini-cold panel yap ve antikor reaktivitesini artır Page 54
Reverse Gruplama lama:extra Antikorlar Soğuk antikorlar (allo- veya auto-) Soğuk antikorlar anti-i, H, M, N, P, Lewis içerebilir Rulo A 2 veya A 2 B kişilerde Anti-A 1 Page 55
Soğuk antikorlar Reverse gruplamada extra antikorlar gibi görünür Alloantikorlar yabancı eritositlere karşı gelişir Otoantikorlar kendi eritrositlerine karşı gelişir. Soğuk reaktif antikorlar oda ısısında ve daha düşük ısıda RBC lerle reaksiyon verir. Otokontrol pozitiftir. Çözüm: Tüp 37 ye ısıtılır ve yıkanır, agglütinasyon dağılır IgM bağları 2-ME ile de dağılır. Page 56
Rulo Hem extra antijen hem de extra antikorlarla oluşabilir para dizisi görünümü Artmış serum proteinine bağlı olarak (globulinler) agglütinasyon görünümü verir. SF ile güçlü reaksiyon, 37 C de zayıf reaksiyon, AHG fazında hiç aglütinasyon yok Görüldüğü hastalıklar: Multiple meloma Waldenstrom s macroglobulinemia (WM) Hydroxyethyl starch (HES), dextran, vs Page 57
Rulo çözümü Proteinler uzaklaştırılır! forward gruplamada sorun varsa, hücreler yıkanır ve test tekrarlanır reverse gruplamada sorun varsa, serum fizyolojik tekniği uygula Hücreler (reajan) and serum (hasta) santrifüj edilir antijen ve antikor reaksiyonu aranır (varsa) Serum ayrılır eş volümde SF eklenir (hücreleri ayırır) Tüp karıştırılır, santrifüj edilir ve tekrar incelenir (makro ve mikro) Page 58
Anti-A 1 Bazan A 2 (veya A 2 B) kişiler anti-a 1 antikor üretir A 2 (veya A 2 B) kişiler A 1 kişilerden daha az antijenik bölgeye sahip Antikor genellikle doğal oluşan IgM A 1 hücrelerle reaksiyon, A 2 hücrelerle yok Page 59 Anti-A 1 hastada + A 1 hücre + A 2 hücre AGLÜTİNASYON AGLÜTİNASYON YOK
anti-a 1 uyumsuzluk çözümü 2 basamak: Hasta RBC lerini Anti-A 1 lektin ile tiplendir Reverse gruplamayı A 1 yerine A 2 hücrelerle tekrar et Her iki sonuçta aglütinasyon olmamalı Anti-A Anti-B A1 Cells B Cells 4+ 0 2+ 4+ Page 60
Diğer er Bombay fenotipi (çok NADİR) hh geçişi ile Bu kişilerde hiç ABO antijeni yok, doğal oluşan anti- A, anti-b, anti-a,b, ve anti-h oluşturmazlar Temel olarak forward reaksiyon yok, Çözüm: anti-h lektin ile test (Bombay da H yok ve reaksiyon vermez) Page 61
ABO rutin n testi NE YAPILIR? 1. Eritrositler serum fizyolojikle 3-4x yıkanır ve tüm testler tekrar edilir, antikorlar için test edilir 2. Anti-A1 ve anti-a kullanılarak A subgrupları için test yapılır 3. Anormal antikorları tespit için hücre panelleri kullanılır Page 62
Problemi bulmak Forward gruplama (RBC) Reverse gruplama (serum) Her iki gruplamayı karşılaştır (Forward & Reverse ) Reversde <+2, forwardda <+3 reaksiyonlarda +4 C, 37 C de tekrar Normalden zayıf reaksiyon? Eksik veya ekstra reaksiyon? Page 63
ABO Uyumsuzluğunda unda çözüm Hastanın öyküsü : Yaş Yakın zamanda transplantasyon Yakın zamanda transfüzyon Hastanın aldığı tedaviler Diğer. Page 64
Rh D ekspresyonunda farklılıklar klar D-Pozitif - çoğunluk konvansiyonel D-Negatif - 15%-17% European Ancestry Page 65 3%-7% Afrikalı, 0.5%-1% Asyalı Zayıf D - önceden Du ( 0.2%-1%) DAT testi ile tespit edilir Genel bilgi - anti-d oluşturmaz DEL - D negatif olarak gruplanır, anti-d adsorb ve elüsyonu Çoğu Asyalıda C+ Parsiyel D Önceden mosaic D-pozitif olarak gruplanır(bazıları AHG/IAT test gerektirir) anti-d - yapar missing RhD protein ile D epitopları Rhce proteinleri üzerinde
Rh D ekspresyonunda farklılıklar klar Zayıf D D+ kişilerde yaklaşık 10.000-33.000 antijenik bölge Zayıf D de 200-10.000 (kantitatif varyasyon) Parsiyel D Kalitatif varyasyon Farklı epitoplarda mozaik, 1 veya birkaç epitop eksik Monoklonal antikorlarla tespit edilebilir Page 66
Rh D ekspresyonunda farklılıklar klar Hem zayıf, hem parsiyel moleküler düzeyde tanımlanabilir Rh proteinlerinde aminoasit değişikliklerini kodlayan nükleotid mutasyonları D varyantların sık nedenidir. Substitüsyon transmembranöz veya intrasellüler zayıf D? Substitüsyon ekstrasellüler parsiyel D? Page 67
Rh gruplama Page 68
Ulusal Kan ve Kan ürünleri Rehberi F2.1.6 Grup Uyumsuzluklarına yaklaşım g.tek bir anti-d miyarı kullanılarak zayıf reaktivite saptandığında hastabuna dayanılarak RhD (+) kabul edilmemelidir. İki ayrı monoklonal anti-d miyarı kullanılarak (IgG ve IgM) belirgin D + sonuç almadıkça hastanın D (-) olarak kabul edilmesi daha güvenlidir D gruplaması yapılan hastalarda kategori D-VI saptayan miyarlar kullanılmamalıdır. Bu gruplar anti-d üretir Bağışçıda kategori D-VI saptayan miyarlar kullanılmalıdır Parsiyel D hastalar RhD negatif Parsiyel D bağışçı RhD pozitif Page 69
Ulusal Kan ve Kan ürünleri Rehberi F2.1.6 Grup Uyumsuzluklarına yaklaşım b) A ve B grup varyantların saptanmasında anti-ab, lektin A1, lektin-h, A2 hücresi, ve anti-a ve anti-b ile absorbsiyon, elüsyon çalışmalarının faydası vardır. Zayıf A, B antijenlerin saptanması zordur ve bu yüzden bu hastaların transfüzyonunda O grubu eritrositlerin kullanılması daha uygundur. Page 70
Page 71 DİKKATİNİZ İÇİN TEŞEKK EKKÜR R EDERİM