SOLİD ORGAN TRANSPLANTASYONUNDA VIRTUAL CROSS-MATCH UYGULAMASI PROF.DR.MAHMUT ÇARİN TIGED- 15 NİSAN 2010 BODRUM

Patel ve Terasaki, N Engl J Med 1969; 280:735-739 Significance of the positive crossmatch test in kidney transplantation Nakil öncesi, donöre özgü antikor (DSA) tespitinde komplemana bağlı sitotoksisite (CDC-XM) testi altın standart olmuştur. Hiperakut antikor aracılı rejeksiyon

Humoral Theory of Transplantation Paul I. Terasaki HİPERAKUT REJEKSİYON AKUT REJEKSİYON KRONİK REJEKSİYON ANTİKOR HUMORAL TEORİNİN SONUÇLARI VE ÖNERİLER ANTİKOR VARLIĞI ANTİKORLARIN ETKİSİ ANTİKOR ÖZELLİĞİ ANTİKOR SAPTANMASI DESTEKLEYİCİ YAYINLAR Am J Transplant 2003 Jun 3(6): 665-73

Eğer HLA antikorları rejeksiyona neden oluyorsa rejeksiyondan önce saptanmalıdır. Grefti fonksiyone olan hastaların %30 unda antikor vardır ancak bu durum Humoral Teori yi çürütmez. Çünkü teori hasarın ilerleyici olduğunu ve antikor varsa bir gün mutlaka organ yetmezliği olacağını savunmaktadır. P. Terasaki; 2003

Antikor endotele bağlanır ve bir hasar döngüsü oluşturur ancak onarım aylar, yıllar boyunca sürebilir. Damar intimasındaki kalınlaşma yavaş seyirlidir ve ilerleyicidir. Kısaca hasar onarımdan daha hızlıdır.

Anti-HLA Antikor Spesifikliği Greft rejeksiyonunda serumda saptanan antikorlar çoğunlukla donöre karşı değildir. Çünkü rejeksiyon sırasında donöre yönlenmiş antikorların greft tarafından absorbe edildiği düşünülmektedir. Lee ve Ceppellini

C.Süsal, G.Opelz

CDC-XM, nakil sonrası saatler/günler içerisinde meydana gelen ve allogreft rejeksiyonu ile greft kaybı açısından artmış risk ile ilişkili olan düşük seviyedeki DSA ları tespit etmek için yeterli hassasiyete sahip değildir. Gebel HM et al. Am J Transplant, 2003

Daha hassas olan flow sitometri cross-match (FC-XM), bir çok nakil merkezinde DSA tespitinde kullanılan hücre tabanlı mevcut en iyi test olarak kabul edilmektedir. Anlamlı olmayan antikorların, hücre yüzeyine özgül olmayan bağlanmaları nedeniyle yanlış pozitif sonuçlar ortaya çıkabilir!!!!!! Wen R et al. Kidney Int, 2006

Anti-HLA antikor tespitinde, tek HLA molekülleri ile kaplı solid faz immün (SFI) testlerin kullanıma girmesi sınıf I ve II antijenlerine karşı yönlenmiş HLA antikorlarının tespitinde özgüllüğü ve hassasiyeti artırmıştır. Amico et al. Curr Op Immunol, 2009

Hassasiyet Boncuk tabanlı florometrik testler > kolorimetrik ELISA (Single antigen flow-beads, Luminex) Luminex yöntemi; ELISA ile tespit edilen antikorlardan 2 kat daha fazla sıklıkta antikor tespit eder. Zachary et al. Human Immunol, 2009

Bu yeni teknikler; cross-match sonuçlarının doğru bir şekilde öngörülmesini sağlama potansiyeline sahiptir. VIRTUAL CROSS-MATCH BİR ÖNGÖRÜDÜR Alıcının önceden karakterize edilmiş antikor spesifitelerine dayanarak, nihai cross-match sonuçlarının tahmin edilmesidir.

V Virtual cross-match (vxm) terimi kullanıma yeni girmiş olmasına rağmen, uzun süredir uygulamada olan bir yaklaşımdır. Preliminer cross-match ve hiperimmün plaklar Eurotransplant + UNOS Kabul edilebilir uyumsuzluklar (Acceptable mismatches) Kabul edilemeyen uyumsuzluklar (Unacceptable mismatches)

Kabul edilebilir uyumsuzluk yaklaşımı (Acceptable mismatch-eurotransplant) Bir hastanın (özellikle yüksek oranda sensitize hastaların) hiç HLA antikoru oluşturmadığı HLA antijenlerinin belirlenmesidir. Eurotransplant ta HLA-A, -B, -C, -DR, -DQ lokusları için kabul edilebilir uyumsuzluklar belirlenmektedir.

Bir hasta serumu, 50 donör hücresiyle yapılan bir PRA testinde 2 donör hücresi ile negatif reaksiyon vermiştir. Kabul edilebilir uyumsuz antijenler A2, A11, B7, B39, CW4

Kabul edilebilir uyumsuzluk yaklaşımı X Yüksek oranda sensitize hastalar: PRA %80-85 VIRTUAL PRA Hastaların gerçek PRA yüzdelerinin popülasyondaki HLA allel frekansına göre belirlenmesi Doxiadis IIN, Claas FHJ.Current Opinion Org Transplant, 2009

Kabul edilebilir uyumsuzluk yaklaşımı Bir hastanın anti-hla antikoru geliştirdiği allellerin gen frekanslarının bilinmesi ile geleneksel PRA değerinden daha doğru bir şekilde anti-hla reaktivitesini yansıtan gerçek (virtual) PRA yüzdesi hesaplanabilmektedir. Gerçek PRA hesaplama Programına http://eurotransplant.nl/cms/index.php adresinden erişilebilmektedir.

Kabul edilebilir uyumsuzluk yaklaşımı http://eurotransplant.nl/cms/index.php

Kabul edilebilir uyumsuzluk yaklaşımı Gerçek PRA değerleri %85 ve üstü olan hastaların nakil olabilme ihtimalleri kabul edilebilir uyumsuzluk programına dahil edilmeleri ile anlamlı derecede artmıştır. Bu hastaların %60 ı programa dahil olduktan sonraki 2 yıl içerisinde nakil olmuşlardır. Claas FHJ and Doxiadis IIN.Curr Op Immunol, 2009

Kabul edilebilir uyumsuzluk yaklaşımı Anti-HLA antikor spesifiteleri geniş kapsamlı laboratuar çalışmaları ile belirlenmiş, gerçek PRA yüzdeleri hesaplanmış ve kabul edilebilir uyumsuzlukları tanımlanmış ve nakil olmuş olan yüksek oranda sensitize hastalarda yalnızca kısa dönem değil uzun dönem sonuçların da mükemmel olduğu bildirilmiştir.

Kabul edilemeyen antijenler (Unacceptable mismatch-unos) Transplantasyon için kontraendikasyondur. İmmünolojik risk seviyesi çok yüksektir. Bu antijenlere bağlı risk değerlendirmesinde pek çok faktör rol oynar. Zachary et al. Curr Op Organ Transpl, 2008

Riski etkileyen faktörler Uygulanan transplant protokolü Hasta ile ilgili özellikler Donör ile ilgili özellikler

Riski etkileyen faktörler

Nakil öncesi dönemde DSA varlığı veya nakil sonrası DSA gelişimi antikor aracılı rejeksiyon için anlamlı bir risk faktörüdür. DSA varlığı/kabul edilemeyen antijenlerin belirlenmesi basit bir EVET/HAYIR cevabı değildir. Tambur et al.am J Transpl, 2009

Kabul edilemeyen antijenleri tanımlama kriterleri

VIRTUAL CROSS-MATCH Tek antijen boncuklar kullanılarak yapılan HLA- antikor testlerinden elde edilen ayrıntılı HLA spesifitelerinin, potansiyel bir donörün HLA doku tipi ile karşılaştırılarak, bu donörle yapılacak nihai cross-match sonucunun öngörülmesine VIRTUAL CROSS-MATCH denir.

Hasta doku tiplemesi HLA-A, -B, -C, -DR, -DRw, -DQ, -DP Antikor tarama negatif pozitif PRA 0 Sensitize değil Luminex/Flow tek antijen boncuklar HLA-A, -B, -C, -DR, -DRw, -DQ, -DP Donör HLA tiplemesi HLA-A, -B, -C, -DR, -DRw, -DQ, -DP Kabul edilemeyen antijenlerin belirlenmesi VIRTUAL CROSS MATCH

VIRTUAL CROSS-MATCH AKTÜEL CDC-XM --------------vxm Bunun sebebi, CDC-XM in hassasiyet ve özgüllüğünün, vxm için kullanılan antikor testlerininkinden düşük olmasıdır. KORELASYON OLDUKÇA KÖTÜDÜR Vaidya S et al. Transplantation, 2006 Nikaein A et al. Transplantation 2009

VIRTUAL CROSS-MATCH AKTÜEL FC-XM --------------vxm Bunun sebebi, FC-XM in hassasiyet ve özgüllüğünün, vxm için kullanılan antikor testlerininkine benzer olmasıdır. KORELASYON >%85 Vaidya S et al. Transplantation, 2006 Nikaein A et al. Transplantation 2009

vxm in prediktif değeri Negatif Prediktif Değer %91.1 Pozitif Prediktif Değer %94.8 Tambur et al.am J Transpl, 2009

Tek antijen boncuklarla tespit edilen antikorların gücünün klinik anlamlılık ile ilişki olduğu belirtilmiştir. Tanımlanan bir HLA antikorunun gücü XM in önemli bir göstergesidir.

Antikorların gücünün belirlenmesi Ortalama floresan yoğunluğu=mean Floresence Intensity (MFI) Bir antikorun gücünü belirlemede iki analiz tipi vardır: Anti-HLA antikorunu tanımlayan tek bir antijen boncuğunun MFI sı DSA MFI sının pozitif kontrol MFI sı ile bölünmesi sonucu oluşan oran Morris GP et al. Hum Immunol, 2010

MFI<2000 ya da MFI oranı <0.2 olan zayıf reaksiyon veren DSA lar pozitif XM ile sonuçlanmaz ve transplantasyon için kontraendikasyon olmayabilir. Ancak, bu testlerdeki cut-off değerler için standart bir uygulama yoktur. Her laboratuar kendi internal kalite kontrol testleri ve test içi kontrollerle en uygun cut-off değeri belirlemelidir. Morris GP et al. Hum Immunol, 2010

Ortalama Floresan Yoğunluğuna (MFI) göre kabul edilemeyen antijenlerin belirlenmesi

Negatif vxm in prediktif değeri Negatif vxm, erken antikor aracılı rejeksiyon açısından çok düşük bir risk ile ilişkilidir ancak, bu risk sıfır değildir. Amico P et al. Curr Opi Organ Transpl, 2009

Yanlış negatif vxm sebepleri 1) vxm, HLA antikorları ile sınırlı olduğundan donöre özgü HLA dışı antikorlar atlanabilir.

Yanlış negatif vxm sebepleri HLA dışı pek çok antikor; Endotelyal hücre antikorları MICA- antikorları Glutatyon S transferaz antikorları Anjiotensin reseptör antikorları Minor HLA antikorları erken allogreft rejeksiyonu ve/veya antikor aracılı rejeksiyon ile ilişkili bulunmuştur.

Yanlış negatif vxm sebepleri Ancak, HLA dışı antikorlara bağlı erken AMR insidansı oldukça düşüktür ve mevcut testlerle bu olayları nakil öncesi dönemde öngörmek oldukça zordur.

Yanlış negatif vxm sebepleri 2) Donörün HLA doku tiplemesinin tam olmamasına bağlı olarak yanlış negatif vxm sonucu elde edilebilir.

Yanlış negatif vxm sebepleri Mevcut tek antijen boncuk panelleri, HLA-A, -B, -Cw, -DRB1, -DRB3-5, -DQB ve -DP lokuslarına ait en yaygın HLA allellerini içerse de, kadavra donörlerinin HLA tiplemesi tüm lokusları içermez.

Yanlış negatif vxm sebepleri Bu sebeple, bir kadavra donörün tam HLA tiplemesi yapılana dek, potansiyel HLA-DSA ların tümü doğru bir şekilde belirlenemeyeceği için vxm sınırlı kapasitede olacaktır.

27 MART 2010, İSTANBUL TIP FAKÜLTESİ KADAVRA DONÖR DOKU GRUBU A*24, A*25 B*18, B*35 DRB1*11, DRB1*13 1A 1B 1DR UYUM NAKİL ADAYI (G.T) DOKU GRUBU A2, A24 B18, B51 DRB1*11

27 MART 2010, İSTANBUL TIP FAKÜLTESİ NAKİL ADAYI (G.T): 2002 yılından beri SDBY hastası Periton diyalizi 2 ünite kan transfüzyonu Sınıf I PRA (-); Sınıf II PRA (+): DQ5, DQ9 FC-XM: T(-) B(+)

27 MART 2010, İSTANBUL TIP FAKÜLTESİ KADAVRA DONÖR DQB1 TİPLEMESİ DQB1*03, DQB1*06 DSA YOKTUR!!!!!!!EKSTRA DQ TİPLEMESİ İÇİN 3 SAAT KAYBEDİLMİŞTİR!!! NAKİL ADAYI (G.T) ANTİ-HLA ANTİKORU ANTI-DQ5, DQ9

Yanlış negatif vxm sebepleri 3) vxm, alıcının donördeki bir HLA allelinin, spesifik bir epitopuna karşı DSA sının olması ve bu epitopun tek antijen boncuk panelinde olmaması nedeniyle negatif olabilir.

Yanlış negatif vxm sebepleri Bu durum, teorik olarak mümkün olsa da, pratikte pek mümkün değildir. Tek antijen boncuk panelleri, serolojik olarak tanımlanmış tüm A, B, C, DR, DQ ve DP antijenlerinin en prevalan allellerini içermektedir.

Yanlış negatif vxm sebepleri 4) Serumdaki IgM antikorları ve bilinmeyen bazı maddeler IgG antikorlarının tek antijen boncuklarla tespitini engelleyebilir.

Pozitif vxm in prediktif değeri Pozitif bir vxm in prediktif değeri indüksiyon tedavileri almamış hastalarda değerlendirilmelidir. Bu kurala uygun olarak yapılmış olan yalnızca 3 retrospektif çalışma vardır.

Pozitif vxm in prediktif değeri Antikor aracılı rejeksiyon insidansı, tek antijen boncuk testleriyle HLA-DSA tespit edilen hastalarda anlamlı olarak yüksektir. Çok düşük seviyelerdeki DSA lar bile antikor aracılı rejeksiyon açısından bir risk faktörü olabilirler

Pozitif vxm in prediktif değeri Tek antijen boncuklarla tespit edilen HLA-DSA varlığına rağmen CDC-XM veya FC-XM ile negatif veren hastalarda transplantasyon ile ilişkili kesin riski belirleyebilmek için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır.

NEDEN, tek antijen boncuk testleri ile tespit edilen tüm DSA lar, antikor aracılı rejeksiyon ve kötü allogreft sağkalım ile ilişkili değildir?

Yanlış pozitif vxm sebepleri 1) Tek antijen boncuk test tekniği ile ilgili sorunlar Üretim esnasında denatüre edilen HLA moleküllerinde in vivo olarak var olmayan epitopların ortaya çıkması ve DSA nın bu epitoplara bağlanması. Bu DSA lar patojenik değildir.

Yanlış pozitif vxm sebepleri 2) Tek antijen boncuklar tarafından tespit edilen HLA-DSA lar, in vivo da gerçekten de donörün HLA moleküllerine bağlanırlar ancak klinik anlamlılıkları sınırlıdır. Bu sebeple, HLA-DSA ların klinik etkilerini öngörecek olan özelliklerini tanımlamak çok önemlidir.

DSA ların klinik anlamlılığı Bazı çalışmalar, HLA-DSA nın miktarı klinik sonlanım ile ilişkilidir derken başka iki çalışma bunu doğrulamamıştır. Başka 2 çalışmada da sensitizasyonun yolunun (hamilelik, kan transfüzonu, tx) antikor aracılı rejeksiyon gelişimi ve şiddeti ile ilişkili olmadığı bildirilmiştir. Üç çalışma ise DSA nın sınıf I ya da II olmasının prediktif olmadığını bildirilmiştir.

DSA ların klinik anlamlılığı Bu sebeple, şu anda mevcut olan solid faz immün testler ya da FC- XM ile DSA miktarının tespiti ve antikor sınıfı ve sensitize edici olayların tipine bakarak HLA DSA nın klinik önemini öngörmek zordur.

DSA ların klinik anlamlılığı Pek çok çalışma, HLA-DSA ların komplemanı aktive etme kapasitesinin DSA nın klinik etkileri açısından önemli bir faktör olduğunu göstermektedir. HLA-DSA ların kompleman aktivasyonlarını ölçen in vitro testler, klinik ilişkiyi tanımlamada anlamlı olabilir. Bohmig GA et al. Curr Opin Organ Transplant, 2008

DSA ların klinik anlamlılığı Nakil sonrası dönemde artmış HLA-DSA üretimi antikor aracılı rejeksiyon gelişimi ile ilişkilidir. Bu bulgu, alloantikor üreten hücrelerin hafıza yanıtının aktivasyon ve büyüklüğünün, sonradan ortaya çıkacak sonuçlar için anahtar bileşen olduğunu düşündürmektedir. Günümüzde hafıza yanıtının ortaya çıkışını ve gücünü öngörebilecek böyle bir test yoktur. Burns JM et al. Am J Transplant, 2008 Stegall MD et al. Am J Transplant, 2009

DSA ların klinik anlamlılığı Donör endotelyal hücrelerinin koruyucu faktörlerinin tanımlanması, HLA-DSA nın klinik anlamlılığını açıklamaya yardımcı olacaktır. Çok düşük düzeydeki sınıf I spesifik antikorların, endotelyal hücrelerde koruyucu olabilecek sağkalım sinyallerini tetiklediği gösterilmiştir. Bu durum koruyucu bir etki ya da akomodasyon ile sonuçlanabilir. Zachary A et al. Tissue Antigens, 2007

Donöre özgü HLA antikorlarının klinik etkilerini değiştirebilecek potansiyel patojenik faktörler Humoral hafıza yanıtının büyüklüğü ve devamlılığı Kompleman Hafıza T-hücresi Plazma hücresi Anti-HLA antikorları Hafıza B-hücresi HLA ekspresyon yoğunluğu Donör-HLA HLA-DSA nın hedef epitopa bağlanma gücü HLA-DSA nın komplemanı aktive etme kapasitesi Endotelyal hücrelerin koruyucu özellikleri

Virtual cross-match, nakil öncesi risk tahmini ve organ dağıtımında oldukça faydalı bir araçtır.

SONUÇ vxm in doğruluğu büyük oranda, doğru ve eksiksiz donör HLA tiplemesine ve anti-hla antikor analizlerinin detaylı bir şekilde yapılmasına bağlıdır.

Nakil öncesi risk tahmini ile organ dağıtımı (özellikle yüksek oranda sensitize hastalar için) daha hızlı bir hale gelmiştir.

Virtual cross-match uygulaması sayesinde, pre-liminer cross-match ihtiyacı ortadan kalkmış ve kadavra çalışmalarında ekstra 3 saat kazanılmıştır.

Teknik olarak, tek antijen boncuklarla antikor tespitindeki yanlış pozitiflikler elenmelidir. (denatüre HLA molekülleri) Biyolojik olarak, DSA nın patojenik özelliklerinin tanımlanması gereklidir. hedeflenmiş HLA epitoplarına karşı reaktivitenin gücü, yeniden karşılaşma ile oluşan güçlü ve kalıcı hafıza yanıtı, komplemanı aktive etme kapasitesi

Yapmamıza imkan hasıl olan işleri yapmazsak, tarih bizi tenkit eder. 1928 (Hakkı Tarık Us, Ayın Tarihi, Atatürk ün Vefatları, N : 60, 1938, S. 150)