Özgür Başal ORTOPEDİDE RAT MODELLERİ Ortopedi ve travmatoloji alanında yapılan deneysel çalışmalar artarak devam etmektedir. Kas-iskelet sisteminde tasarlanabilecek yüzlerce model bulunmaktadır. Bu bölümde çalışmaların en çok yoğunlaştığı konular ve güncel literatür paylaşılmıştır. ROTATOR MANŞET YARALANMA VE TAMİR MODELİ Aseptik cerrahi şartlar altında gerekli arıtım ve örtüm uygulanır. Omuz çevresi traşı uygulandıktan sonra betadin/klorheksidin ile boyanır. Saha ortası delikli örtüyle veya dreyp ile örtülür. Örtüm esnasında ratın solunumu baskılanmamalı ve aspire edeceği sıvılardan korunmalıdır. Supraspinatus tendonu görüncek şekilde cerrahi bir açılım sağlamak için kraniolateral uzanımlı 2 cmlik bir inzisyon tercih edilir. Öncelikle deltoid kas akromiona yapışma yerinden posterior, lateral ve anterior demetleriyle birlikte split kaldırılır ve distale sıyırılır. Akromion, korakoid ve klavikula tarafından oluşturulan kemik ark içinde supraspinatus tendonu görülür. Supraspinatus proksimal humerusta tüberkulum majusa yapışmaktadır. Akromion üzerine konulacak askı sütürü ile supraspinatus kası daha da net görülebilir. Kol dış rotasyondayken daha iyi bir açılım sağlanır. Tüberkulum majusa yapışma yerinin hemen üzerinden 3.0/4.0 sütür ile tendon tespit edildikten sonra keskince insersiyodan ayırılır. Tamir için uygun pozisyonda açılan delikten sutur ile tüberkulum majusa dikilir[1]. TİBİA/FEMUR KIRIĞI MODELİ Yaştan bağımsız kırık modeli oluşturabilmek için yetişkin ratlar tercih edilmelidir. Tibia veya femura kemiği 3 nokta prensibine göre elle veya düzenekte kırılır. Bending ( bükücü) kuvvetlerle oluşturulan kırık anestezi altında yapılır. Dijital röntgenle ratlar anestezi altındayken hafif bir deplasmanın olduğu teyit edilir. Kırık modeli kızak sitemi içeren giyotin benzeri bir düzenekle de yapılabilir. Standart 500 gr ağırlık bulunan kızak rat femuru için 35 cm deni tibia için 25 cm den bırakılması kırık modeli için yeterli olur. Eğer segmenter kırık modeli oluşturulacaksa tibia ekspoze edil- 212 DERMAN MEDICAL PUBLISHING
dikten sonra 0.8 mm K teli intramedüller olarak yerleştirilir. Belirlenen 3 noktadan eşit aralıklarla 2 mmlik osteotom yardımıyla kontrollü manuel kırık oluşturulur[2,3]. Kırık iyileşme modellerinde kafa travmasının pozitif mekanizması açıklanamamıştır. Bu konuda yapılan araştırmalar için travmatik beyin hasarı oluşturmak için bazı yöntemler tarif edilmiştir[4]. DİZ OSTEOARTRİT MODELİ 1. Teknik: Ratların dizlerine patella üst polünden başlayıp tüberositas tibiaya kadar longitudinal insizyon yapılır. Daha sonra medial parapatellar ile artrotomi uygulanır. Patella laterale devrilerek ön çapraz bağ makroskopik olarak görülür ve deneysel osteoartrit modeli oluşturmak amacı ile eksize edilir. Eksizyon sonrası ön çekmece testi yapılarak işlem doğrulanır. Cerrahi tedavi sonrasında ratların dizlerine herhangi bir tespit uygulanmaz ve serbest dolaşımlarına izin verilir. 2. Teknik: Ratların medial menisküslerine yapılacak tek taraflı radial yırtık tekniğidir. Hızla gelişen kıkırdak hasarı ve dejeneratif değişiklikler osteofit oluşumu ile sonuçlanır. Septik artrit gelişme- Şekil 1. Rat iskelet sistemi radyografik değerlendirmesi mesi için dikkatli olunmalıdır. 3. Teknik: Başka bir teknik ise diz içine verilen 0.2 ml %1 lik formolin veya iodoasetat enjeksiyonu olarak tarif edilir. Hızlıca kartilaj hasarı oluşturulabilir. OSTEOPOROZ MODELİ Birçok deneysel çalışma ratlarda osteopeni ve osteoporoz indüksiyonunu tarif etmiştir. Kemik kütle kaybı ratın cinsiyetine göre, uygulanan metoda göre farklılık gösterir. Bu kemik kaybının kortikal veya spongioz kemikten olmasına göre de farklılık gösterir. Ratlar ortalama 2.5 ayda seksüel maturiteye ulaşır. İskelet maturitesi ise 10 ayın sonunda tamamlanır. Eğer iskelet sistemi immatür ratlar tercih edilirse kemik kütlesi yetersiz kalabilir. Endokrin, nutisyon, çevre faktörlerinin kemik kütlesine etki ettiği bilinmelidir. Postmenapozal ve immobilizasyon osteoporozu çalışmalarında matur ratlar tercih edilmelidir. 1. Teknik: Postmenapozal osteoporoz modeli; Overyektomi uygulanan dişi ratlarda kolaylıkla osteoporoz modeli geliştirilebilir. Overyektomi sonrası 14. gün ilk olarak tibia proksimal metafizinde, 30. gün femur boynunda ve 60. gün lomber vertebra cisimlerinde osteoporoz saptanır. Overyektomi sonrası distal tibia metafizinde, uzun 213 DERMAN MEDICAL PUBLISHING
kemik epifizlerinde ve kaudal vertebralarda kemik kaybı görülmez. 2. Teknik: İmmobilizasyon osteoporoz modeli; Bu o ekstremiteyi atellemek, tendonunu kesmek, sinir hasarı oluşturmak, spinal kord kesisi gibi değişik şekillerde olabilir. İmmobilizasyon sonrası tibia diafizinde anlamlı değişiklikler 42. günden sonra görülür[5]. Oluşturulan osteoporoz modeli dansitometre veya biyometrik/biyomekanik testlere tabi tutulabilir. 3. Östrojen reseptör antagonisti verilmesi; 4. Ekstremite denervasyon modeli (Tibial siniri keserek immobilizasyon) FEMUR BAŞI OSTEONEKROZ MODELİ 1. Cerrahi teknikle oluşturulmuş femur başı osteonekroz modeli: Sıçanlara 100 mg/ kg ketamin-hcl ve 10 mg/ kg ksilazin ile anestezi uygulanır. Cerrahiden önce lokal/sistemik gentamisin veya sefazolin profilaksisi uygulanır. Deri tıraşı, yerel antisepsi ve steril kapama sonrası, torakanter major üzerinden femura doğru 2 cm uzunlamasına bir kesi yapılır. Gluteus superfisialisin lifleri bölünerek splint ayırtedilir. Gluteus mediusa tespit sutur konularak torakanter majora yapışma yerinden disseke edilir. Bacak dış rotasyona alınarak eklem kapsülü görülür. Anterolateral eklem kapsülüne ulaşılarak 11 numara bistüri ile kapsül sirküler olarak kesilir. Bacak traksiyondayken eklem içindeki ligamentum teres femoris kesilir ve femur başı disloke edilir. 11 numara bistüri kullanarak femur boynunda periost ve kemik çevresinde sirküler inzisyonlar oluşturulur. Eklem kapsülünün femur boynuna yapışan lifleri 1 mm aralıklarla bistüri ile kemik çevresinden sıyrılır. Femur boynuna sıkıca bağlanan bir ip (vicryl # 0; Ethicon, Somerville, NJ) yardımıyla sol femur başı epifiz besleyen assenden damarların akımı bozuması amaçlanır. Femur başının yerine redüksiyonunu takiben, eklem kapsülü ve gluteus medius kası # 2-0 Vicril ile dikilir. Cilt,# 3-0 ipek ile kapatılır. 3 hafta sonunda osteonekroz net olarak izlenir. Üçüncü hafta sonunda aynı cerrahi prosedürlerle eklem açılıp femur boynundaki bağlanan sutur çıkarılır. Bundan sonraki aşamada hipoteze uygun model uygulanır. Şekil 2. Femur başı osteonekrozu için cerrahi model, disseke edilmiş femur başı 214 DERMAN MEDICAL PUBLISHING
2. Steroidle indüklenmiş femur başı osteonekroz modeli: Kortikosteroid kullanımına bağlı osteonekroz birçok kemikte gösterilmiştir. Hidroksiprednizon > Haftada 2 kez 24.5 mg/kg intraperitoneal toplam 6 hafta verilir. Metilprednizolon> tek doz 20 mg/kg im. uygulanır. Prednizolon + Lipopolisakkarit iv (kuyruk venleriyle) haftada tek doz 3 hafta uygulanması ile femur başı osteonekroz oluşturulabildiği düşünülmektedir. Fakat kortikostreoid ile indükleme modelinde Başarı %30-50 arasında olduğu düşünülmektedir. Rat gruplarının yüksek tutulması önemlidir. Bazı kliniklerde aynı yöntemlerle başarısız olunması nedeniyle planlama öncesi pilot çalışma önerilir. LEGG-CALVE-PERTHES MODELİ Yukarıda bahsedilen osteonekroz modelinin iskelet sistemi halen immatür olan ortalama 6 aylık ratlar üzerinde yapılan modelidir. Norman ve ark. tarafondan tarif edilen modelde 6 aylık ratlarda metafiz ve epifiz arasındaki damarlarda anastomozun henüz gelişmemiştir[6]. Kapsül yukarıdaki tarif edilen şekilde açılır, ligamentum teres kesilir, femur boynundaki periost hasarlandırılır. Fakat femur boyunu sütür ligasyon uygulanmaz. Histolojik olarak post-operatif 5. günde nekrotik kemik görülmeye başlar. Artiküler kartilajın dejeneratif değişiklikleri 21. günden itibaren saptanabilir. 42. günde femur başı düzleşmiştir[6]. GELİŞİMSEL KALÇA DİSPLAZİSİ MODELİ 1. Kundaklama Modeli: Yenidoğan ratlarda doğumun ilk 5 günü veya 2. beş gününde kundaklama tekniği ile gelişen subluksasyon/dislokasyon modeli tarif edilmiştir. Bu teknikte kalça adduksiyon ve diz ekstansiyondayken cerrahi bant/flaster yardımıyla tespit edilir. Günde 30 dk bant çözülerek minör kalça ve diz hareketi verilir. Gelişen subluksasyon/dislokasyon modeli radyografi ile teyit edilir. SEPTİK ARTRİT MODELİ Klinikte gördüğümüz septik artritler, genellikle direkt bulaşma ile değil septik emboliler sonucu oluşan artritlerdir. Bu nedenle bakterilerin sistemik verildiği modeller önerilmektedir. 1. Bakterinin sistemik verilmesi Farelerde spontan artrit yapan S aureus LS-1 suşunun (107cfu/ml) kuyruk veninden verilmesi ile diz ekleminde septik artrit oluşturulur. 2. Bakterinin lokal verilmesi OSTEOMİYELİT MODELİ Deney hayvanlarında osteomiyelit oluşturmak için lokal kemik hasarı yapmak şarttır. Bu amaçla kemik içine sklerozan madde enjekte etmek, yüksek devirli burr kullanmak gibi yöntemler tanımlanmıştır. a. Osteomiyelit oluşturmak için tibianın metafizer bölgesine iğne ucu ile pencere açılır. b. Kemikte lokal hasar yapmak için intramedüller boşluğa 50 μl sklerozan madde verililir. Lokal hasar oluþturduktan sonra bakterinin (genellikle S. aureus) verilmesi konusunda farklı uygulamalar vardır: 1. Bakterinin sistemik (iv) verilmesi (sepsis riski vardır) 215 DERMAN MEDICAL PUBLISHING
2. Bakterinin lokal verilmesi 3. İmplant-yabancı cisim ilişkili model a) Önceden kolonize edilmiş implant-yabancı cisim b) Steril implant-yabancı cisim Deneyde kullanılacak mikroorganizmanın klinikte osteomiyelit nedeniyle yatan bir hastadan izole edilmesi ve belli bir ATCC suşu ile karşılaştırılarak metisilin duyarlılığının ortaya konması gerekir. Ya da virülansı, biofilm yapma özelliği vs bilinen bir ATCC suşu kullanılabilir. Bu tekniklerin birçok modifikasyonu olmakla birlikte en sık kullanılan rat modeli; Zak modeli (rat): Tibiaya intramedüller Na moruat enjeksiyonunu takiben S. aureus verilmesi ve bonevax ile deliğin kapatılmasıdır. KEMİK DEFEKT İYİLEŞME MODELİ Kritik kemik defekt modeli olarak tarif edilen bu teknik kaynamaya etki eden faktörlerin değerlendirilmesi için tasarlanmıştır. Rat femurunda kritik 6 mm defekt oluşturulması esasına dayanır. Bu defekt polietilen plak ve serklajlar yardımıyla sabitlenir. Yapılan bir çalışmada 12 haftalık süre sonunda radyolojik, tomografik, histomorfometrik ve biyomekanik testler uygulanmıştır[7]. HETEROTOPİK OSSİFİKASYON (HO) MODELİ Bu modelin oluşturulmasında öncelikle kemik ve kas üzerinde işlem yapılması gerekir. Yapılan bir araştırmada rat femur medullası 1-2 mm çaplarla oyulmuş ve bu esnada kaslarda hasara uğratılmıştır. Özellikle intramedüller çivileme ve kalça cerrahilerinin popüler olduğu günümüzde heterotopik ossifikasyon da sorun haline gelmektedir. Kas hasarı oluşturulan modellerde daha yüksek oranda HO görülür[8]. ELEKTROMAGNETİK ALAN (EMA) MODELİ Bu konuda EM dalga boylarının kemik kaynaması üzerine etkileri araştırılmıştır. Sabit bir mesafeden (ortalama 1.5 mt) ratlar üzerine etki eden 50 Hz, 900 MHz, 1800 MHz dalga boylarının rat kırık modelinde kaynamaya olan etkisi incelenmiştir[9,10]. Atay ve ark. 900-1800 MHz dalga boyunun yani cep telefonu dalgalarının kemik kaynaması üzerine olumsuz etkisinden bahsetmiştir. MHz dalga sıklığının artması dalga boyunun kısalmasına sebep olur yani 1GHz dagla 30 cm etki mesafesine sahipken 3GHz dalga sıklığı 10 cm etkiye sahiptir. Wireless modemlerin yaydığı 2.4 GHz dalgalar 12 cm dalga boyuna sahiptir. Kaynaklar 1. Ersen A, Demirhan M, Atalar AC, Kapicioglu M, Baysal G. Platelet-rich plasma for enhancing surgical rotator cuff repair: evaluation and comparison of two application methods in a rat model. Archives of orthopaedic and trauma surgery 2014;134(3):405-11. 2. Halici M, Oner M, Guney A, Canoz O, Narin F, Halici C. Melatonin promotes fracture healing in the rat model. Eklem hastaliklari ve cerrahisi = Joint diseases & related surgery 2010;21(3):172-7. 3. Akcal MA, Poyanli O, Unay K, Esenkaya I, Gokcen B, Firatligil AS. Effect of N-butyl cyanoacrylate on fracture healing in segmental rat tibia fracture model. Journal of orthopaedic surgery and research 2014;9:76. 4. Ozan F, Yildiz H, Bora OA, Pekedis M, Ay Coskun G, Gore O. The effect of head trauma on fracture healing: biomechanical testing and finite element analysis. Acta orthopaedica et traumatologica turcica 2010;44(4):313-21. 5. Lelovas PP, Xanthos TT, Thoma SE, Lyritis GP, Dontas IA. The laboratory rat as an animal model for osteoporosis research. Comparative medicine 2008;58(5):424. 6. Norman D, Reis D, Zinman C, Misselevich I, Boss JH. Vascular deprivation-induced necrosis of the femoral head of the rat. An experimental model of avascular osteonecrosis in the skeletally immature individual or Legg-Perthes disease. Int J Exp Pathol 1998;79(3):173-81. 7. Virk MS, Alaee F, Tang H, Ominsky MS, Ke HZ, Lieberman JR. Systemic administration of sclerostin antibody enhan- 216 DERMAN MEDICAL PUBLISHING
ces bone repair in a critical-sized femoral defect in a rat model. The Journal of bone and joint surgery American volume 2013;95(8):694-701. 8. Anthonissen J, Ossendorf C, Hock JL, Steffen CT, Goetz H, Hofmann A et al. The role of muscular trauma in the development of heterotopic ossification after hip surgery: An animal-model study in rats. Injury 2015, DOI: 10.1016/j.injury.2015.11.019 9. Aslan A, Atay T, Gulle K, Kirdemir V, Ozden A, Comlekci S et al. Effect of 900MHz electromagnetic fields emitted from cellular phones on fracture healing: an experimental study on rats. Acta orthopaedica et traumatologica turcica 2013;47(4):273-80. 10. Atalay Y, Gunes N, Guner MD, Akpolat V, Celik MS, Guner R. Pentoxifylline and electromagnetic field improved bone fracture healing in rats. Drug Des Devel Ther 2015;9:5195-201. 217 DERMAN MEDICAL PUBLISHING