JĐNEKOLOJĐK MALĐGNĐTELERDE DOKU FAKTÖR YOLU ĐNHĐBĐTÖR (TFPI) DÜZEYLERĐ

T. C. SĞLIK BKNLIĞI HSEKĐ EĞĐTĐM VE RŞTIRM HSTNESĐ KDIN HSTLIKLRI VE DOĞUM KLĐNĐĞĐ KLĐNĐK ŞEFĐ OP. DR. HMET ÇETĐN JĐNEKOLOJĐK MLĐGNĐTELERDE DOKU FKTÖR YOLU ĐNHĐBĐTÖR (TFPI) DÜZEYLERĐ (Uzmanlık tezi) Dr.Mukadder Tayhan ĐSTNBUL-2005

ĐÇĐNDEKĐLER TEŞEKKÜR...3 GĐRĐŞ...4 GENEL BĐLGĐLER...5 MTERYL VE METOD...34 BULGULR...37 TRTIŞM...51 SONUÇ...56 KYNKLR...57 EK...74 2

TEŞEKKÜR Tüm uzmanlık eğitimim boyunca, bilgi ve deneyimlerini, saygı, sevgi ve hoşgörü çerçevesinde bizlere aktaran değerli hocalarım klinik şefi Op. Dr. hmet ÇETĐN, klinik şefi Prof. Dr. Murat YYL, klinik şef muavini Op. Dr. Hüsnü GÖRGEN e, Tezimin hazırlanma aşamasında her türlü desteği veren Op. Dr. Pınar ÇĐLESĐZ e, istatistiklerin hazırlanmasında yardımlarından dolayı Op. Dr. Murat PĐ ye, eleştri ve katkılarından dolayı Op. Dr. Hüsnü GÖRGEN e, Biokimya laboratuvar şef muavini Dr. Macit KOLDŞ a, Dr. Hatice SEVL a Cerrahi eğitimimiz süresince, bu mesleğin her türlü incelik ve güzelliğini bizlere öğreten Op.Dr. Murat KIRY, Op.Dr. hmet LĐOSMNOĞLU, Op.Dr. Emine KLLĐ, Op.Dr. Murat ERGĐNBŞ, Op.Dr. Murat SEMĐZ, Op.Dr. Banu Dane, Op.Dr. Cem Dane, Op.Dr. Đbrahim TEMĐZ, Op. Dr. ysen ERYÜZ, Op.Dr. Kadri TEZEL, Op.Dr. Feride MĐMROĞLU, Op.Dr. Derya ÖZTÜRK e, Günün her saatini büyük özverilerle paylaştığım asistan arkadaşlarıma, dört yıl boyunca uyumla çalıştığım dönem arkadaşlarım Dr.Selda ve Dr.Salih e, Hayatımın her aşamasında benden hiçbir desteği esirgemeyen aileme saygı ve sevgiyle... 3

GĐRĐŞ Kanser hastalıklarında, hiperkoagülasyon ve trombotik komplikasyonların görülme oranı artmıştır. Tromboz, malignitenin sık bir komplikasyonu olup, kanser hastalarındaki ölümlerin ikinci en sık nedenidir. Uzun yıllardır kanser hastalarındaki koagülasyon sistem aktivasyonu ilgi kaynağı olmuştur. Son yıllarda bu aktivasyonun kanser gelişiminde özellikle de metastaz gelişiminde rol aldığı olasılığı araştırılmaktadır. Kanser hücreleri, koagülasyon sistemini aktive eden Doku faktör / Tissue faktör (TF) ve Faktör X aktivatör gibi faktörlerin salınımını arttırırlar. Bu koagülasyon aktivasyonu, Doku Faktör Yolu Đnhibitörü / Tissue Faktör Pathway Inhibitör (TFPI), Protein C, Protein S, ntitrombin III gibi doğal antikoagülan mekanizmalarla inhibe edilir. Son zamanlarda yapılan birçok çalışmada, kolon, meme, akciğer ve hematolojik malignitelerde TFPI düzeyleri araştırılmış, solid tümörlerde TFPI artışı gösterilmiştir. ncak jinekolojik tümörlere spesifik bir çalışma yapılmamıştır, bu noktadan hareketle biz bu çalışmada; jinekolojik malign ve benign tümörlerde, plazma TFPI aktivitesi ve koagülasyon aktivasyon belirteçlerinden D-dimer düzeylerini, TFPI nın malign-benign ayırımındaki yerini incelemeyi amaçladık. 4

GENEL BĐLGĐLER KN KOGÜLSYON MEKNĐZMSI Kan koagülasyonu ile ilgili ilk teori 19. yüzyılda Paul Morawitz in deneyimlerini yayınlaması ile ortaya çıkmıştır. Morawitz koagülasyonun dört faktör arasındaki etkileşim ile oluştuğu teorisini ortaya atmıştır. Bu faktörlerin üç tanesi plazmada olup, protrombin, kalsiyum iyonları ve fibrinojendir. Fakat dördüncü faktör olan trombokinaz (bu gün tromboplastin veya tissue factor (TF) olarak bilinir) ise trombosit ve lökositlerde bulunur. Kan yabancı bir doku veya yüzey ile temas ettiğinde trombosit ve lökositler agregasyon oluşturur ve TF salınımına neden olur. TF ile protrombin etkileşimi kalsiyum iyonlarının da ortamda bulunması ile trombin formasyonuna yol açar. Trombin ise fibrinojenin pıhtının iskeletini oluşturacak olan fibrine dönüşümünü sağlar. Hasarlanmış doku hücreleri TF nin ikinci kaynağı olup, yara yerinde kanın daha hızlı pıhtılaşmasına neden olur (1,2). Yüzyılın ortalarında diğerlerine ilave olarak yeni bir faktör keşfedildi. Pıhtılaşma mekanizmasının başlangıcının en azından iki yol ile meydana geldiği fikri ortaya atıldı. Birinci yol Morawitz tarafından ortaya konulan TF aracılıklı yol olup doku hasarı sonrası organizmanın kanamaya karşı savunması, ikinci yol ise; in vitro olarak kanın cam gibi negatif yüklü yüzey ile karşılaştığında plazma 5

proteini F XIII (Hageman faktörü) aracılığı ile gerçekleşen yol olarak tanımlandı (3). 1955 yılında Oxford lu araştırmacılar tarafından trombin oluşumunun iki ayrı yol teorisi (birincisi ekstrensek yol olup TF bağımlıdır diğer yol ise intrensek yoldur ve TF bağımsızdır) geliştirildi (4). Bu teoriye göre Ekstrensek yol basit bir reaksiyon olup, Ca iyonları varlığında, faktör VII nin, TF ile etkileşime girerek, faktör X u aktif formuna dönüştürmesi ile karakterizedir. Đntrensek sistem daha komplekstir. 1964 yılında tanımlanmış olup beşli yükseltgenme reaksiyonları zinciridir. Bu yolda enzimin etkileyerek aktive ettiği substrat bir sonraki substrat için aktif enzim olarak rol oynar: Yüzeyin aktiflediği faktör XII, faktör XI i aktive eder. Faktör Xia, faktör IX u aktive eder. Faktör IXa faktör VIII i aktifler. Son olarak da faktör VIIIa, faktör X u aktif formuna dönüştürür (Şekil 1) (5,6). 6

Şekil 1: Ekstrensek ve intrensek yolları gösteren normal koagülasyon mekanizması (YMK: Yüksek molekül ağırlıklı kininojen, PK: Prekallikrein, FL: Fosfolipid) 7

Koagülasyon kaskadı, endotel hasarı veya aktivasyonu ile kan akımına subendotelyal doku faktörünün sentez ve salınımı ile başlar. Koagülasyon iki faza ayrılabilir: Başlangıç ve üretim fazları (7). Başlangıç fazı; az miktarda trombin meydana gelmesi ile karakterize düşük hızlı olan bu fazda, trombositlerin kısmen aktivasyonu ve FV ve FVIII prokoagülanların proteolizi meydana gelir (8). TF salgılayan hücrelerin FVII/FVIIa kompleksi ile karşılaşması ile başlar (Şekil 2). Faktör VIIa kofaktörü olan TF yokluğunda substratları olan FIX ve X üzerinde oldukça zayıf etki gösterir. TF nin FVII ye bağlanması ile hızla aktif formu olan FVIIa ya dönüşür. Oluşan TF/FVIIa kompleksi FIX ve X u aktif formları olan FIXa ve FXa ya dönüştürür. FXa ve FVa trombin oluşumuna yol açar. Başlangıçta eser miktarda üretime ilave olarak FV ve FVIII faktörlerinin aktifleşmesi ile daha fazla trombin üretilir. Üretim fazı; trombin üretiminin meydana geldiği fazdır. Bu fazın karakteristiği yüksek hızda protrombin dönüşümü ve fibrin pıhtısı oluşmasını sağlayan bu kofaktörlerin geri aktivasyonudur. Büyük, 300 kilodalton (kda) ağırlığında, nonproteolitik, multidominan bir protein olan FIIIa, fosfolipid yüzeyde maksimum üretimi sağlamak için enzim (FIXa), substrat (FXa) kompleksinin oluşumunu sağlar. FXa aynı zamanda fosfolipid yüzeylerde bulunan etkili üretim için protrombini düzenleyen FVa ile de bir kompleks oluşturur. 8

Son olarak terminasyon fazında trombin üretimi Protein C ve Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI) yoluyla bitirilir ve aktif haldeki serin proteazlar ntitrombin III tarafından inhibe edilir (9). Şekil 2: Koagülasyon yolunun şematik gösterilmesi 9

KOGÜLSYON KSKDININ REGÜLSYONU Eğer FVII nin TF ile bağlanması koagülasyon kaskadının başlangıcı ise FVII nasıl aktive olmaktadır? Net olarak bilinen bir şey FVII nin TF ile kompleks oluşturması halinde proteolize daha duyarlı olmasıdır. Dolaşımdaki FVII nin %1 i aktif form olan FVIIa dır (10). TF, damar hasarı oluştuğunda dolaşımdaki FVII/FVIIa kompleksi ile bağlı form oluşturur. TF primer olarak bu proteinlerin plazma konsantrasyonları ile sınırlandırılır. Başlangıç fazının majör regülatörü TFPI dır. Koagülasyon yolunda oluşan trombin aynı zamanda antikoagülan yolu başlatabilir. Endotel hücrelerinin yüzeyinde bulunan ikinci bir reseptör olan trombomodülin (TM), antikoagülan yolda önemli bir role sahiptir. TM, TF tarafından başlatılmış koagülasyon basamaklarında trombine bağlanır ve allosterik bir mekanizma ile substrat özgünlüğünü bozar. Trombin-TM kompleksinin substratı Protein C olup Trombin-TM tarafından ktif Protein C ye (PC) dönüştürülür. PC substratı olan Protein S ile kompleks yaparak FVa ve FVIIIa yı inaktive eder. Protein C ve S eksikliğinin insanlarda tromboza eğilimle ilgili olduğu anlaşıldığından beri bu olay önemli bir in vivo antikoagülan yolu olarak nitelendirilmiştir (11,12). Trombin-TM kompleksi, trombinle aktive edilen fibrinoliz inhibitörüdür (TFI). TFI plazminojenin fibrine bağlanmasını inhibe ederek fibrinolizi engeller. Trombin-TM kompleksi iki amaca hizmet eder: negatif feed back etki ile fibrin ve trombin yığılmasını 10

engeller ve plazmin aktivasyonunu inhibe eden, pıhtı lizisini geri döndüren TFI yı aktive ederek fibrin birikimini engeller. FIXa-FVIIIa kompleksi FVIIIa nın inaktivasyonu ile regüle olan bir sistemdir. Bu regülasyon FIXa, FXa, trombin veya PC tarafından proteolitik ayrılma ile gerçekleşir. FIXa direkt olarak antitrombin (T) tarafından inhibe edilir. FXa-FVa kompleksinin aktivitesinin düzenlenmesi, FVa nın PC ile inaktivasyonu ve FXa nın T tarafından inhibisyonu yolu ile olur. Trombin, heparin varlığında T tarafından inaktive edilir. T nin fonksiyonel yetmezliği venöz tromboz gelişimi riskindeki artış ile ilişkilidir (13). T, FIXa ve FXa gibi aktif koagülasyon proteazlarının tamamını temizleyen önemli bir faktördür. FVIIa, T tarafından inhibe edilmemesine rağmen, TF ye bağlı halde iken heparin varlığında T tarafından inhibisyonu 33 kat artar. Bu da T nin, TF- FVIIa kompleksini inhibe etmede önemli bir faktör olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte fizyolojik T konsantrasyonlarında yapılan çalışmalarda T nin reaksiyonun başlangıç aşamasında hiçbir rolü olmadığını göstermiştir (14). 11

TĐSSUE FKTÖR ( TF/ DOKU FKTÖRÜ ) Tissue Faktör (TF), (aynı zamanda tromboplastin ve CD 142 olarak da bilinir) 47 kda ağırlığında bir transmembran hücre yüzey glikoproteinidir ve in vivo koagülasyon sisteminin temel başlatıcısıdır (15). Koagülasyonun başlangıç fazı prokoagülan TF nin, kanda eser miktarda bulunan FVIIa ile karşılaması ile meydana gelir. Endotel hasarı, sistemik (endotoksemi ve sepsis) ve lokal proinflamasyon durumlarında TF nin damara salınması ile başlar(10). FVIIa-TF kompleksi, Faktör IX (FIX) ve FX un aktif formlara dönüşmesini sağlar. FIXa ve FXa ise trombin üretimi ve fibrin formasyonuna yol açar. TF, vaskülarize dokulardan, plasenta, beyin, kalp ve akciğer gibi ekstravasküler alanlardan salınır. Damar duvarındaki TF predominant olarak adventisya ve media tabakasında lokalizedir. Damar duvarı çevresindeki birçok hücre tipi, adventisyal fibroblastlar, düz kas hücreleri, keratinositler, astroglia, kalpteki miyosit hücreleri TF salınımı yapar (16,17). Bu hücre spesifik TF salınımı, dolaşım sisteminin bütünlüğü bozulduğunda, koagülasyon sistemini aktive etmeye hazır şekilde koruyucu prokoagülan özellik gösterir. Böylece endotel bariyeri bozulduğunda veya aktive monosit yüzeyinde TF salınımı olduğunda kana TF geçişi olur. ncak sağlıklı kişilerde de tam kanda TF aktivitesi vardır (18). TF salınımı, endotelyum ve monositlerde in vitro koşullarda endotoksin, sitokinler ve forbol esterleri tarafından, bu hücreler TF salınımı yapmasalarda indüklenebilir (19,20). Đn vivo şartlarda TF salınımının 12

indüklenmesi, endotel ve monosit aktivasyonu sırasında bir seri değişikliğin bir parçası olarak gelişir ve ateroskleroz (21), dissemine intravasküler koagülopati (DIC), malignite (22) ve ksenograftların hiperakut rejeksiyonu gibi trombozisin birçok patogenezine dahil olur (23). TF nin ateromatöz plaklardaki makrofajlardan güçlü salınımı, miyokard infarktüsünü takiben gelişen plak rüptürü ile kana karıştığı zaman patolojik intravasküler trombozise neden olur. Vasküler inflamatuar hücrelerde olduğu gibi peritümör inflamatuar makrofaj ve fibroblastlarda TF salınımı, ekstravasküler tümör fibrin birikimiyle alakalıdır. Endotelyal hücre aktivasyonu trombomodülin ve heparan sülfatın, normalde T ve TFPI nın da olduğu proteoglikanlar tarafından tutulan birçok antikoagülan molekülün, hücre yüzeyinden kaybıyla, hızlı salınımlarını izleyen bir olaydır. TF, birçok dokuda anormal durumlarda inflamatuar cevap modülatörü olarak görev yapmaktadır (24). TF nin patolojik salınımı makrofaj derivesi köpük hücreleri, aterosklerotik hücrelerdeki düz kas hücreleri, kanser hücreleri, septik durumlarda monosit hücreleri nadir olarak da damar düz kas hücreleri ve yanındaki mezenkimal hücrelerde görülür (26). TF başlıca normal damarlarda adventisyada yerleşmiş olup, damar hasarı ile salınmaya başlar. TF salınımı gram negatif sepsis, ateroskleroz ve kanser gibi değişik patolojik durumlarda indüklenir ve ölümcül fibrin depolanması ve tromboza yol açar (27). Bu bölümde bazı hastalıkların etiyolojisinde TF nin rolü ile ilgili bilgiler sunulacaktır. 13

SEPSĐS VE ĐNFLMSYON Sepsis, enfeksiyona verilen sistemik cevap sonucu gelişen inflamasyon ve koagülasyonla karakterize klinik bir tablodur. Đnflamatuar yanıt, tek bir organ bozukluğundan multipl organ yetmezliği ve sonuçta ölüme kadar değişik formlarda meydana gelebilir. Gram negatif bakteriler ile oluşturulan deneysel sepsislerde, inflamatuar yanıtın pek çok basamağında TF salınımının, prokoagülan TF nin ve TF/FVIIa kompleksinin arttığı gösterilmiştir. Neisseria Menengitis sepsisi olan hastalarda monositler TF salınımını arttırır ve TF düzeyleri hastalığın ciddiyeti ve ölümcüllüğü ile orantılıdır (25). Bu gözlemler TF/FVIIa tarafından başlatılan koagülasyon kaskadının, sepsisin ilerlemesinde en önemli itici olduğunu göstermektedir (28). TEROSKLEROZ Stabil ve anstabil koroner hastalığı olan hastalarda dolaşımdaki monositlerde ve aterosklerotik plaklarda TF düzeylerinde artış saptanmıştır (26). Đnsan koroner aterektomi spesmenlerinde aktif plaklarda TF varlığı gösterilmiştir (29). Sonuçta TF ileri arterosklerotik plaklarda yüksek yoğunluktadır ve damar yüzeyi hasarına karşı gelişen trombotik cevap ile ilişkilidir (30). 14

TF VE KNSER Hiperkoagülabilitenin kanser hastalarındaki ölüm nedenlerinin en sık ikisi olan metastaz ve derin ven trombozuna yol açtığı düşünülmektedir (31). Bulgular kan koagülasyon sistemi aktivasyonunun hematojen tümör progresyonu ve tümör anjiogenezinin regülasyonunu kolaylaştırdığı görüşünü desteklemektedir (32,33). Bu hipotezlerin merkezindeki örnek TF olup, koagülasyon sisteminin ve anjiogenezin başlatıcısıdır ve tümör devamlılığını sağlar. TF pıhtılaşma bağımlı-bağımsız mekanizmalarla tümör anjiogenezini sağlar. TF ve ngiogenesis; bir tümörün 1-2 mm. lik boyuta ulaşabilmesi ve durağan halden viabl bir tümöre ilerleyebilmesi için, anjiogenezis olarak adlandırılan yeni kapillerden, yeni damarların oluşumunun indüklenmesi gerekir. njiogenik değişimlerin olması için, normalde endotelyal hücrelerin doğasında bulunan proanjiogenik ve antianjiogenik faktörler arasındaki dengenin değişmesi gerekir. TF bu dengeyi, proanjiogenik peptid; vasküler endotelyal growth faktör (VEGF) ve antianjiogenik peptid; trombospondini içeren anahtar faktörleri regüle ederek ayarlar (34). Đnsan melanom ve meme doku kültürlerinde TF ve VEGF seviyeleri arasında güçlü bir korelasyon gösterilmiştir. Đn situ analizlerde insan akciğer ve meme kanser spesmenlerinde bu iki faktörün birlikte lokalizasyonu tanımlanmıştır (40). Yüksek TF ve VEGF üreten melanoma hücresi immün defektif farelere inoküle edildiğinde, in vivo olarak, yüksek vaskülariteye sahip tümörler büyümüştür. Zıt olarak düşük TF ve 15

VEGF üreten melanom hücrelerinin inokülasyonu ile relatif olarak avasküler tümörler oluşmuştur (44). TF nin indüklediği anjiogenezde, hem koagülasyon bağımlı hem de koagülasyon bağımsız yollar ileri sürülmüştür. Koagülasyon kaskadının başlangıcı, trombin oluşumu ve sonuçta trombosit aktivasyonu ve fibrin depolanmasının da TF reseptörlerinin aktivasyonu ile oluştuğu gösterilmiştir. Pek çok çalışma tümör progresyonunda aktif trombositlerin rolünden bahsetmektedir (35,36). Tümör hücreleri ile agregat oluşturan aktive trombositler tümör hücrelerinin immün sisteme karşı korunmasını sağlar. Kapiller yatakta tümör embolilerinin oluşması, tümör embolilerinin ekstravazasyonunu oluşturur, ek olarak aktive trombositler, tümör ve endotel hücrelerinin proliferasyon ve migrasyonunu arttıran VEGF gibi depolanmış büyüme faktörlerinin salınımını sağlar. Pıhtıdaki fibrin matriks aynı zamanda yeni kan damarları formasyonuna yol açan bir iskelet ortamı sağlar. Fibrin aynı zamanda hem TF, hem de proanjiogenik sitokinlerden interlökin 8 gibi sitokinlerin salınımını arttırır (37). njiogenezisin koagülasyon bağımlı yolunda, vasküler endotelyal hücreler, trombositler, düz kas hücreleri gibi iyi bilinen mitojenlere ilave olarak trombin de tümör anjiogenezini stimüle eder. Fibrin pıhtıları aynı zamanda monositlerden interlökin 6 ve 8 sekresyonunu indükleyen VEGF içerir (38). Trombin, tümör hücreleri ve tümörle ilişkili vasküler endotelyal hücrelerde proteaz aktive eden G proteini çift reseptörleri 1-4 ü ( PRS 1-4) bağlıyor gibi 16

gözükmektedir. Bu da pıhtı formasyonu ve tümör büyümesi arasındaki siklusun bir düzenleyicisidir. Son zamanlardaki bir çalışmada TF aktivitesinin, VEGF nin indüklediği trombositlerin, endotelyal hücrelere adezyonunda da gerekli olduğuna işaret edilmektedir (39). njiogenezisin koagülasyondan bağımsız mekanizması, TF nin stoplazmik kuyruğunun primer aracılığı ile açıklanmaktadır. TF; 219 aminoasitlik ekstraselüler alandan oluşmuş bir membran bağlı reseptördür. 29 aminoasitlik hidrofobik transmembran alan ve 21 aminoasidlik intraselüler kuyruğu vardır. Đntraselüler alan reseptör sinyaline işaret eden 3 serin fosforil alanı içerir. TF nin hem bağımlı hem de bağımsız stoplazmik alanlardaki farklı sinyal mekanizmaları gösterilmiştir. TF; Sp1, p1 ve NF-KB gibi transkripsiyon faktörlerinin hücre aktivasyonundan sonra hızlıca TF transkripsiyonunu, pıhtılaşmadan bağımsız arttırması dolayısıyla acil erken bir gen olarak sınıflandırılır. VEGF belki de pek çok tümörde TF ile ko-lokalizasyonu nedeni ile aynı yol ile regüle edilir (40). TF nin ekstraselüler kısmı FVIIa ya bağlanmak için bir temeldir ve koagülasyonu başlatır, sonuçta hemostaz bağımsız sinyaller; 1- PRS kısmının aktivasyonu, 2- Đntrasellüler kalsiyum mobilizasyonu 3- Mitojen aktive edici protein kinaz (MPK) yolunun aktivasyonu 4- Erken büyüme geni 1 (egr-1) gibi bazı genlerin trankripsiyonu (41,42,43) şeklindedir (Şekil 3). 17

Şekil 3: Pıhtı formasyonu ve tümör büyümesi arasındaki ilişki (39). 18

Glioma, meme kanseri, kolorektal kanser, prostat kanseri, lösemi gibi birçok insan tümörlerinde atipik TF salınımı mevcuttur (46,47). TF uygun stimülasyon ile monosit ve endotel gibi hücrelerden de üretilirken (48,49), kanser prokoagülan salınımı malign fenotiple ilişkilidir (50,51). Tümör hücrelerinin kendileri, monosit, makrofaj veya endotelyal hücreler gibi konak hücreleri ile birlikte TF salınımını arttırır (52,53). Tümör veya konak hücrelerinin prokoagülan salınımının bir sonucu olarak, lokal trombin üretimi, trombosit aktivasyonu ve peritümör fibrin formasyonu meydana gelebilir. Böylece tümör veya konakçı hücre yüzeyinde oluşan TF, tümör-konakçı etkileşiminde, pıhtılaşma aktivasyonunu başlatmada, majör mediyatördür. Meme kanser hücrelerinin çevresindeki vasküler hücrelerde TF tanımlanması malign fenotiple koreledir. Bu da göstermiştir ki; TF kanserde anjiogenezisi başlatıcı bir belirteçtir (54). Son zamanlarda TF nin anjiogenezdeki etkilerinin tümör metastazındaki rolü ile ilişkili olabileceği yönünde çalışmalar yapılmaktadır. Birçok deneysel çalışmada, TF nin metastaz gelişimindeki olası etkileri gösterilmeye çalışılmıştır. Bu çalışmalar göstermiştir ki, tümör hücre membranının TF si önemli miktarda hematojen metastazın etkinliğini arttırır (55). Bu etki ekstraselüler alanda aktif TF / FVIIa kompleksi TF stoplazmik alanla birlikte bu karmaşık oluşumu (hematojen tümör yayılımı) desteklemek için çalışırlar (56). TF nin varlığı, in vivo koşullarda metastaz potansiyelini bariz bir şekilde arttırır. TF nin anti-tf monoklonal antikoruyla inhibisyonu, insan 19

melanomunun (M24met), akciğer metastazını bariz bir şekilde düşürmüştür (45). TF mini geni transfekte edilmiş Çin hemster ovaryum (CHO) hücrelerinin metastatik potansiyelleri üzerine yapılan çalışmalarda, TF salınımı yapan CHO hücreleri, normal olanlara göre çok daha fazla akciğer metastazı yapmıştır (56). TF HEDEFLĐ TERPÖTĐK YKLŞIMLR TF alanındaki en ümit verici gelişmeler, bu reseptörlerin kansere karşı tedavi amaçlı kullanılmasıdır. Etkin ve düşük toksisiteli kanser tedavisi için hedeflenen; bir molekülün normal dokuyu değil, patolojik dokuyu hedeflemesidir. TF kesinlikle bu kriterlere uygun bir moleküldür. TF salınım düzeyi tümörün invaziv ve metastatik potansiyeli ile koreledir (46). Böylece tümörle ilişkili hücrelerde, direk kanser tedavisinde, TF, hedef haline gelmektedir. TFPI ve rnpc2 (rekombinant nematod antikoagülan protein C2), TF-FVIIa komplex inhibitörleri, farelerde primer ve metastatik tümör gelişimini sınırlamaktadır (57). lternatif olarak tümör destrüksiyonu ve enfarktı tümör damarlarında koagülasyonu başlatan TF ve FVII nin girişi ile başarılabilinir (58). Bu moleküller damar duvarına geçtiği zaman koagülasyonu başlatarak tümörün kan desteğini oklüzyona uğratacak bir trombüse neden olur. Böylece TF nin hem tümör gelişimini hem de tümörle ilgili anjiogenezisi in vivo olarak inhibe eden bir terapötik ajan olduğu gösterilmiş olur (59). 20

Bir TF hedefli antikor çalışmasında tümör dokusunda selektif olarak trombozu arttırdığı görülmüştür (60). Yüksek dozlarda, farelerin %30 unda tümörün tamamen eradike edildiği görülmüştür. Bazılarında nüks tümör izlense de düşük toksisite nedeniyle doz arttırlması mümkün olabilmiştir (94). Kanser kemoterapisinde tümör ilişkili angiogenezi hedefleyen antianjiogenezis tedavisinde doz kısıtlayıcı durum patolojik trombüslerdir. Son zamanlardaki raporlar, anti-anjiogenezis ajanları ile tedavi edilen kanser hastalarında hem arteryel hem de venöz trombüs oluşumundaki yüksek insidansa karşı dikkatli olunması gerektiğini göstermiştir (61,62,63). Bu hastaların trombotik komplikasyonlara karşı dikkatli monitörizasyonu ve profilaktik olarak düşük molekül ağırlıklı heparin kullanılması düşünülmektedir. Normal plazmada koagülasyon faktörlerini nötralize eden doğal inhibitörler vardır. Bunların başlıcaları Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI), Protein C, Protein S, ntitrombin III tür. 21

DOKU FKTÖR YOLU ĐNHĐBĐTÖRÜ/ TISSUE FKTOR PTHWY INHIBITOR (TFPI) YPI VE BĐYOLOJĐ 40 yıldan daha fazladır, TF ilişkili koagülasyonu inhibe eden endojen inhibitör, deneyler ile gösterilse de, sadece son 10 yıldır biyolojisi ve elde edilmesi yeniden ilgi alanı olmuştur. 1985 yılında Kalifornia Üniversitesi Samuel Rapaport Laboratuvarında Sanders ve arkadaşları tarafından TF/FVIIa katalitik kompleksini FX varlığında inhibe eden plazma lipoprotein fraksiyonu içeriği rapor ettiler (64). Bu araştırma şimdilerde TFPI olarak adlandırılan inhibitörle ilgili yeni araştırmaların yapılmasını kışkırtmıştır. TFPI nın yapısı peptid segmentler ile çevrili 3 Kunitz tip alandan oluşan modüler bir proteindir. Birbiri sıra tekrarlayan elementler; birinci Kunitz alanı (K1) tarafından takip edilen N-terminal asit bölgeler, bir bağlayıcı bölge, ikinci bir Kunitz alanı (K2), ikinci bir bağlayıcı bölge; üçüncü Kunitz alanı (K3) ve C terminal temel alan. K1 alanı FVIIa nın TF ile kompleks oluşturmasını inhibe ederken, K2 alanı FXa yı inhibe eder. K3 için direkt bir proteaz inhibisyon fonksiyonu gösterilmemiştir, bununla beraber TFPI nın C terminal bölgesi 22

koagülasyonun hızlı fizyolojik inhibisyonu için gereklidir ve düz kas hücre proliferasyonunun inhibisyonunda rol alır. C terminal bölgenin TFPI nın hücre yüzeyine bağlanmasında önemli role sahip olduğu görülmektedir (65) (Şekil 4). Şekil 4: TFPI nın yapısı ( Broze GJ Jr. TFPI. Thromb and haemost 1995). TFPI, FXa yı direkt inhibe eder ve FXa bağımlı FVIIa-TF katalitik kompleks oluşumunun feed-back inhibisyonunu düzenler (66). FVIIa-TF kompleksinin koagülasyon başlangıcından sorumludur, TFPI aracılıklı feedback inhibisyon teorisine göre; kalıcı hemostaz için FVIII-FIX ve FXI in güçlendirilmiş prokoagülan etkileri gereklidir (67). TFPI, FVIIa ya FXa dan 23

daha yavaş bağlanır. FXa-TFPI kompleksi FVIIa-TF nin güçlü bir inhibitörüdür. Bu etkileşimler sonucu dörtlü bir inhibitör kompleks olan FXa-TFPI-FVIIa-TF formasyonu gelişir. Bu bilgiler TFPI nın mekanizmasını 2 basamak olarak gösterir. 1.Basamakta; TFPI, FXa ya bağlanır, FXa-TFPI kompleksi, FVIIa-TF kompleksine bağlanarak aktivitesini tamamen bloke eder (Şekil 5) (68). Şekil 5: F VIIa/ TF kompleksinin TFPI tarafından inhibisyonu ( 106). 24

TFPI nın plazma konsantrasyonları düşüktür. Dolaşan TFPI nın bir kısmı LDL, HDL, lipoprotein(a) gibi lipoproteinlere bağlıdır (69,70). Plazmadaki predominant TFPI formu 34-41 kda ağırlığındadır, fakat daha az bulunan formlar yüksek moleküler kütlede ortaya çıkar (71). Büyüklüğündeki bu heterojenite, kısmen, TFPI ve po II arasındaki karışık disülfit komplekslerinin oluşumunun sonucu olabilir. TFPI nın major formu LDL ye bağlı olup 34 kda ağırlığında moleküler ağırlığa sahiptir, tam uzunluğa sahip TFPI nın distal kısmından yoksundur ve 3 Kunitz tipin çoğunluğunu oluşturur. 41 kda formu, HDL ile dolaşır, TFPI nın karboksi terminal köklü formuna benzer. 3 Kunitz alanında, apoprotein II ile disülfit bağlı sisteinli bir kalıntı içerir (72). TFPI nın lipoproteinlerle ilişki mekanizması henüz bilinmemektedir. Plazma TFPI sının geniş karboksi terminal kökü lipoproteinlere bağlıdır. Tam uzunluktaki TFPI nın lipoproteinler ile bağı in vitro olarak yüksek sodyum klorür konsantrasyonlarında geri döndürülmüş olması iyonik bir etkileşimin göstergesidir. Zıt olarak, endojen TFPI nın plazma lipoproteinlerine bağlanması sadece üre, deterjan gibi denatüre edici ajanlar ile geri döndürülebilir olması, hidrofobik bir etkileşimin göstergesidir (73). Mikst disülfid kompleks, TFPI nın karboksi terminal kökünün 3 Kunitz alanı ve apolipoprotein II arasında yerleşmiştir. TFPI nın HDL ye bağlanmasında rol alır. Fakat non-apoprotein II bağları ve lipoproteinlere bağlı plazma TFPI formlarının etkileşimlerini açıklamaz. 25

TFPI seviyelerinin sağlıklı bireylerdeki değeri 0.7-1.4 Ü/ml. dir (118). Normal fizyolojik koşullarda TFPI nın ana sentez yeri damar endotelidir (75). Normal insan dokularının immünohistokimyasal analizlerinde TFPI, mikrovasküler endotel ve megakaryositlerde tespit edilmiştir. Farklı organ endotellerindeki TFPI gen ekspresyonu olasılıkla organın fizyolojik durumuna göre değişmektedir (76). En yüksek TFPI mrn sı insan akciğer ve kalbinde saptanmış olup (76), bu bulgu fare deneyleri ile de desteklenmiştir (77). z miktarda TFPI monosit, makrofaj, akciğer fibroblastları, vasküler düz kas hücreleri, larengeal skuamoz epitel hücreleri, astrositler, mezotel hücreleri, mezenkimal hücreler tarafından da sentezlenir (65). Đnsan fetusunda TFPI, endotel ve karaciğer dışında akciğer, böbrek ve barsak epitelinde de sentezlenir. yrıca TFPI plasentada sito ve sinsityotrofoblastlar tarafından fazla miktarlarda sentezlenir, plasental kan akımının devamlılığını sağlar (78). TFPI salınımı pekçok hücre tipinde değişik inflamatuvar uyarana yanıt olarak düzenlenir. Not olarak; normal kültür koşullarında vasküler endotel hücreleri tarafından TFPI sentezlenir. Hücrelerin serum ile uyarılması durumunda TFPI sentezinde hafifçe artış olmaktadır (79). Kısa bir stres uygulanması halinde, insan endotel hücrelerinde, TFPI sekresyonunda 2 kat artış tespit edilmiştir. Ek olarak trombin, vasküler endotelden sellüler TFPI salınımını arttırır, plazma ve eş zamanlı epitelyal hücre yüzeyinde TFPI düzeylerinde artışa neden olur (75). 26

TFPI organizmada üç havuzda dağılır. %80-85 i endotel hücre yüzeyi ile ilişkilidir, %10 u dolaşımda lipoproteinlere bağlı ve az miktarda serbest olarak bulunur, ve %3 ü trombositlerde bulunur (80). Endotel glikozaminoglikanlara bağlı olan formu en güçlü antikoagülan özelliğe sahiptir. Đntravenöz heparin uygulaması sonrası endotele bağlı TFPI salınımı olur ve plazma TFPI konsantrasyonu 2-4 kat artar. Bu gözlem belki de heparinin antikoagülan etkisini açıklamaktadır (81). TFPI düzeyleri gebelik ve doğumun erken evresinde artar ve yenidoğanda erişkinden daha düşük düzeydedir. Normal siklik hormonal durum TFPI düzeylerini etkilemez, bununla birlikte oral kontraseptif alan kadınların bir kısmında (%25 i) düşük seviyeler tespit edilmiştir (82). Diğer koagülasyon inhibitörleri ile kıyaslandığında, sadece yüksek TFPI düzeyleri yaşlılarda subklinik kardiyovasküler hastalıkla ilişkili olup, artmış düzeyler endotel hasarının iyi bir göstergesidir (83). TEROSKLEROZ, RTERYEL TROMBOZ terosklerotik plak yırtılmaları, anstabil angina ve myokard enfarktüslerine yol açan akut, lokal trombozlara neden olur. Plak yırtılmaları, dolaşımda monosit-makrofaj TF sinin artışı ile mural trombüse yol açar. Ek olarak TFPI, endotel hücreleri, makrofaj ve vasküler düz kas hücrelerinde TF ile birlikte yer alır ve muhtemelen aterosklerotik plaklarda TF indüklediği trombüs oluşumunu regüle eder (84). Rüptüre aterosklerotik plaklardaki trombüs 27

formasyonu, heparin ve aspirine dirençlidir ve birçok çalışma tarafından TF nin indüklediği arteryel trombozda rekombinant TFPI nın faydalı etkileri gösterilmiştir (85). bendschein ve arkadaşları, koroner arter hasarlı köpek modelinde, rekombinant TFPI kullanarak yaptıkları çalışmalarında, fibrinolizi takiben TFPI nın koroner akımın devamlılığında rolü olduğunu göstermiştir (86). DERĐN VEN TROMBOZU (DVT) VE NTĐFOSFOLĐPĐD NTĐKOR SENDROMU Genel olarak DVT de plazma TFPI düzeylerinde değişiklik bulunamamıştır. Đlginç olarak kombine oral konraseptif kullanan kadınlarda, TFPI düzeylerinde ciddi bir düşüş bulunmuştur ve bu gruptaki artmış tromboz riskinin altında yatan potansiyel neden budur (82). ntifosfolipid sendrom (PS) hem arteryel hem de venöz trombozlarla ilişkili olup bu sendromda serbest TFPI ve monosit TFPI düzeylerinde artış saptanmıştır. ynı zamanda PS li hastalarda yüksek plazma TFPI düzeyleri bulunmuştur (87). Benzer olarak başka bir çalışmada, plazma TFPI aktivitesi ve antijen seviyeleri intravenöz heparin enjeksiyonundan önce ve sonra yüksek olarak bulunmuştur; TFPI nın antikoagülan aktivitesi, güçlü lupus antikoagülanları varlığında inhibe edilmiştir. Bu otörler artmış TFPI düzeylerinin, artmış prokoagülan TF aktivitesine bir cevap olabileceğini göstermiştir (88). Đndükte DVT li tavşanlarda rekombinant TFPI ile düşük molekül ağırlıklı heparini karşılaştıran bir çalışmada tedavide rekombinant TFPI nın 28

düşük molekül ağırlıklı heparin kadar etkili olduğu bulunmuştur (89). Đlginç olarak DVT profilaksisinde pnömatik kompresyonun etkisi endotelden dolaşıma TFPI salgılanmasından dolayıdır (90). DVT nin primer patofizyolojik mekanizması, venöz endotel hasarından çok staz olduğu için, DVT tedavisinde ilk seçenek TF nin inhibisyonu olmamalıdır. Heparin tedavisinin komplikasyonlarının oluşması halinde alternatif bir rejim olarak kullanılabilir (116). SEPSĐS VE DĐSSEMĐNE ĐNTRVSKÜLER KOGÜLOPTĐ (DIC) TFPI akut faz reaktanı değildir (117). Endotoksemi, endotel ve monositlerde TF salınımına yol açarak tüketim koagülopatisine yol açar. DIC te serbest TFPI antijeni, TFPI aktivitesi ve Xa-TFPI kompleksi düzeylerinde dikkate değer bir değişiklik oluşur. ncak bu değerlerin ölçümü, klinik DIC te tanısal amaçlı değildir. Creasey ve arkadaşları; E.Coli sepsisli primat modellerinde rekombinant TFPI uygulanmasıyla intravasküler koagulasyon, şok ve mortalitede anlamlı bir düşüş göstermişlerdir (91). Rekombinant TFPI nın antienflamatuar etkisini açıklamaya çalışan bir çalışmada; endotoksinlerin, bir hücre yüzey reseptörü olan CD14 e bağlanmalarını engelleme yoluyla etki edebileceği savunulmuştur (92). 29

TFPI VE MLĐGNĐTE Koagülasyon bozuklukları maligniteye bağlı ölümlerin en sık sebeplerinden biridir. Kan koagülasyon aktivasyon sistemi ile malignite arasındaki ilişki 1865 lere dayanmaktadır. Prof. rmand Trousseau, bugün hiperkoagülopati olarak adlandırılan, kanserle klinik venöz tromboembolizm gelişiminin korelasyonuna değinmiştir (94). Trousseau sendromu, malignitelerde tekrarlayan tromboembolik epizodlar ve kronik düşük dereceli intravasküler koagülasyon olarak bilinen bir komplikasyondur (95,96). Trousseau sendromunun kökenini, dolaşımda tümör hücre TF sinin sürekli bulunmasına dayandıran hipotezler vardır (97,98). Hiperkoagülasyon, kanser hastalarında 2 önemli klinik duruma sebebiyet verir; venöz tromboembolizm ve metastaz. Venöz tromboembolizm: Tromboz malignitenin sık bir komplikasyonu olup kanser ölümlerinin ikinci önemli nedenidir. Kanser hastalarındaki tromboembolizm sıklığı, kanserin tipine ve kanser terapisi gibi diğer risk faktörlerine göre değişir (99). Birçok patogenetik mekanizma malignitelerde pıhtılaşma aktivasyonunu başlatabilir. Genel faktörler; paraprotein üretimi, inflamatuar reaksiyon, nekroz ve hemodinamik bozukluklar gibi akut faz cevabı iken, spesifik faktörler; tümör veya konak hücrenin prokoagülan özelliği olarak belirtilebilir (100). 30

Metastaz: Hemostatik faktörler ve malignite arasındaki bağlantıyı gösterebilecek ilk ipuçları, mevcut hemostatik faktörleri ve tümör hücrelerinin ko-lokalizasyonlarını in vivo olarak gösteren çalışmalardan gelmiştir(101). Malign hücreler, TF, FXa yı direkt aktive eden sistein proteaz gibi prokoagülanları salgılar. Tümör hücreleri, monosit-makrofaj ve endotel hücreleri gibi konakçı hücrelerden TF salınımını arttırırlar. Bu, tümör etrafında fibrin formasyonunu meydana getirebilir. Fibrinin, çoğu tümörde, stromanın önemli bir komponenti olduğu gösterilmiştir. Sıklıkla yara zemininde gözlenen tümör stromasının bu ve diğer önemli özellikleri (anjiogenezis, inflamatuar infiltratlar) tümör stromasının erken dönem yara stromasıyla karşılaştırılabileceğini gösterir (102). Yara iyileşmesine analog olarak tümör stromasındaki ilk fibrin birikimi zamanla yerini daha matür, kollajen içeren bağ dokusuna bırakır (103,104). Fakat bu incelemeler, tümör büyümesinde fibrinin görevinin anlaşılmasını sağlayacak bir mekanizma bulamamıştır. Eğer fibrinin tümör stroması gelişiminde, yara stroması oluşumundaki görevine analog bir işlevi varsa, fibrinin tümör stroması gelişiminde, hücre adezyonunu sağlamaktan daha ileri işlevlerinin olabileceği tahmin edilebilir. Đn vitro çalışmalar, üretilen endotel hücrelerinin fibrinojene adhere olduklarını ve daha yüksek fibrinojen konsantrasyonlarına sahip matrikslere göç ettiklerini göstermiştir. Tümör stromasındaki fibrin, malign hücrelerin gelişimini sağlayabilecek anjiogenezise yardımcı olabilir. Fakat fibrinojen ve plazminojenden yoksun farelerde yapılan son çalışmalar, ne fibrinin ne de plazmine bağımlı fibrinin düşüşünün yara 31

zemininde erken anjiogenezis ve granülasyon dokusu oluşumunda gerekli olmadıklarını göstermiştir (105). Bu nedenle, bu faktörlerin tümör stroması oluşumundaki olası kritik rolü hala meçhuldür. Tümör-konakçı etkileşiminde pıhtı aktivasyonunun esas uyarıcısı TF dir. TF, malign fenotiple ilişkili olup anjiogenezin başlangıcında bir belirteçtir. Bu hiperkoagülabilite durumuna rağmen TFPI düzeyleri solid tümörlü hastalarda artmıştır (93). TFPI nın yüksek plazma düzeyleri, başlıca iki farklı hastalık durumunda (fulminan DIC ve sepsis) rapor edilse de, ileri evre kolon ve pankreas kanserli hastalarda yüksek TFPI düzeyleri bulunmuştur. TFPI malign hastalıkların ilerlemesi ile ilişkili olarak yükselse de diğer koagülasyon inhibitörleri malign hastalığın ilerlemesi ile azalır (107-108). mirkhosravi ve arkadaşları, B16 melanomunda deneysel olarak TFPI nın akciğer metastazını inhibe edici etkisini rapor etmişlerdir. TFPI çalışması, iki temele dayanıyordu. Direkt olarak; B16 melanom hücreleri TFPI salgılayan taşıyıcıyla enfekte edilip farelere enjekte edilmiş ve indirekt olarak; tümör enjeksiyonundan önce rekombinant TFPI veya TFPI geni enjekte edilmiş, bütün olgularda metastaz yaklaşık % 80 azalmıştır. Hem serbest dolaşan hem de tümör hücresi ile ilişkili TFPI hematojen metastazda önemli bir rol oynuyor gözükmektedir (109). Tümör enjeksiyonundan hemen önce rekombinant TFPI uygulanması hem tümör hücrelerinin neden olduğu akut trombositopeniyi hem de uzun vadede akciğer metastazını azaltır. 32

Pıhtılaşma sistem aktivasyonunun, deneysel metastazı arttırıcı yönündeki yeni bulguları, TF yolunun aynı zamanda anjiogenez üzerinde etkisi olduğunu göstermiştir. Gözlemler TFPI düzey artışının primer tümör büyümesini değiştirmediğini ve böylece anjiogenez blokajında TFPI aktivitesinin esas role sahip olmadığı tartışmasını başlatmıştır (100). Bu bulgular tümörün cerrahi çıkarılmasını takiben yayılması gibi akut durumlarda, rekombinant TFPI nın anti-metastatik bir ajan olarak kullanılabileceğini önermektedir (109). rtmış TFPI düzeyleri, hastanın biyolojisinden çok koagülasyon aktivitesinin derecesiyle ilişkilidir. Karsinom hücreleri çevre dokuyu istila ederek metastaz yapar. Fibrin formasyonu tümör invazyonuna karşı bir savunma mekanizması olarak gözükmektedir. Kanser hücreleri, TFPI üretimini arttırarak konaktaki koagülasyonu inhibe eder. Endotel hücrelerinden TFPI üretimi kanser hücrelerinin kendisi, aktif monositler veya stroma hücrelerinden salınan sitokinler tarafından uyarılabilir. Karsinom hücreleri tarafından üretilen TNF alfa ve interlökin 1 in TFPI sentezini uyardığına dair çalışmalar mevcuttur (110). Solid tümörlü hastalarda yüksek TFPI düzeyleri, muhtemelen fibrin formasyonunu azaltır ancak patogenetik mekanizma bilinmemektedir. 33

MTERYL VE METOD Çalışmaya 2004 Ocak - 2004 Temmuz tarihleri arasında, Kadın hastalıkları ve doğum servisinde opere edilmek üzere yatırılan 59 jinekolojik tümörü bulunan olgu dahil edildi. Operasyon öncesi olguların kesin patolojisi bilinmemekle birlikte, 44 hastada adneksiyel patoloji, 10 hastada uterin patoloji, 4 hastada servikal patoloji ve 1 hastada da vulvar patoloji mevcuttu. Kontrol grubu olarak, herhangi bir sistemik ve jinekolojik problemi olmayan 14 olgu dahil edildi. Çalışmaya antikoagülan ve oral kontraseptif kullanan veya organ yetmezliği olan hastalar dahil edilmedi. Hastaların patolojilerine yönelik operasyon yapıldıktan sonra kesin patolojik tanılarına ulaşıldı. Kan örneklemesi: Çalışmaya dahil edilen 14 kontrol grubundan ve 59 jinekolojik tümörü olan olgudan operasyondan önce, ön koldan venöz olarak, sodyum sitratlı tüpe 5 cc kan alındı. Kan örnekleri bekletilmeden 3000 devirde, 10 dakika santrifüj edilerek plazması ayrıldı. Plazma plastik tüplere konarak analiz aşamasına kadar 20 C de dondurularak saklandı. Ölçüm aşamasında dondurulmuş plazmalar, hızlıca 37 C de eritilerek işleme hazır hale getirildi. 34

TFPI aktivite ölçümleri: Dondurularak saklanan plazma örneklerinin TFPI aktiviteleri, ctichrome TFPI aktivite assay kiti ile ölçüldü (Product no: 848, merican diagnostica inc.). ctichrome TFPI aktivite assay kiti plazmada TF/FVIIa kompleksine inhibitör etki göstererek etki eden TFPI yı kromojenik olarak ölçer. Prensip: Test, TFPI nın, TF/FVIIa kompleksinin, FX u, FXa ya aktive eden katalitik aktivitesinin inhibisyon yeteneğini ölçer. TF/FVIIa ve FX ile numunenin inkübasyonundan sonra TF/FVIIa nın rezidüel aktivitesi, sadece ölçüm sırasında üretilen FXa tarafından parçalanan ve yüksek derecede spesifiklik gösteren kromojenik bir substrat kullanılarak ölçülür. Oluşan paranitroanilinin absorbansı 405 nanometrede okunur ve firma tarafından kit ile birlikte sağlanan, değeri bilinen TFPI aktivite düzeyleri ile standart eğriler oluşturularak karşılaştırılır. Prosedür: -20 µl dilüe edilmiş referans plazması, test örnekleri ve TFPI standartları mikrokuyucuklara eklenir. -20µl TF/FVIIa kompleksi mikrokuyucuklara eklenir. -Mikrokuyucuklar kapatılır, 37 C de 30 dakika inkübe edilir. -Karışıma 20µl insan FX eklenir, 37 C de 15 dakika inkübe edilir. -20 µl. EDT, sonrasında 20 µl SPECTROZYME FXa ilave edilir. 35

Reaksiyon SPECTROZYME FXa eklendikten hemen sonra başlar, reaksiyon devam ederken solüsyon sarıya döner, 405 nm. de solüsyonların absorbansı okunur, her 5 dakikada bir renk değişimi monitorize edilir, 50 µl. glasial asetik asit her bir kuyucuğa eklenip, 25. dakikada reaksiyon durdurulur. D-Dimer: Sigma diagnostic auto D-Dimer kiti kullanılarak polystrone mikropartikül aglütinasyon ölçümü yöntemiyle, Sigma melung 200 cihazında kantitatif D-Dimer ölçümleri yapıldı. Đstatistiksel naliz: Malign-benign, kontrol-benign olguların TFPI ve D- dimer düzey ortalamalarının karşılaştırılmasında bağımsız iki grubun standart t testi, malign, metastatik-nonmetastatik grupların TFPI ve D-Dimer düzeylerinin karşılaştırılmasında Mann-Whitney U testi kullanıldı. Bütün istatistiksel analizler Windows altında çalışan SPSS 11 (Inc, Chicago, IL) programı kullanılarak yapıldı. 36

BULGULR Çalışmaya alınan 73 olgunun 32 tanesi malign tümöre, 27 tanesi benign tümöre sahipti. Kontrol grubu olarak alınan 14 olguda tanı almış herhangi bir jinekolojik patoloji yoktu. 32 malign olgunun 17 si over, 10 u endometriyum, 4 ü serviks ve 1 i de vulva kanseri idi (Tablo 1). Tablo 1: Olgu sayılarının gruplara göre dağılımı Gruplar Olgu Sayısı Benign 27 Malign 32 Over 17 Endometriyum 10 Serviks 4 Vulva 1 Kontrol 14 Olgular gruplara göre ayrıldığında serum TFPI düzeyleri, benign grupta, 0,040 Ü/ml ile 0,178 Ü/ml (ortalama 0,081 Ü/ml); malign grupta, 0,091 Ü/ml ile 37

0,181 Ü/ml (ortalama 0,116 Ü/ml) ve kontrol grubunda 0,029 Ü/ml ile 0,120 Ü/ml (ortalama 0,074 Ü/ml) düzeyleri arasında tespit edildi. Malign olguların TFPI düzeyleri ortalamaları, benign olguların TFPI düzeyleri ortalamalarından istatistiksel olarak ileri derecede anlamlı olarak yüksek tespit edildi (p<0,0001). Malign olguların TFPI düzeyleri ortalamaları kontrol grubu olguların ortalamalarından istatistiksel olarak ileri derecede anlamlı olarak yüksek tespit edildi (p<0,0001). ncak kontrol grubu ve benign olguların TFPI düzeyleri arasında istatistiksel olarak fark tespit edilmedi (p>0,05) ( Tablo 2). Tablo 2: Olguların TFPI düzeylerinin ortalama değerleri TFPI Ortalama (Ü/ml) Benign 0,081 (0,040 0,178) (n = 27) Malign (n = 32) Kontrol (n = 14) 0,116 (0,09 0,181) 0,074 (0,029 0,120) Malign ve benign grubunda TFPI ortalamasının p değeri < 0,0001 Malign ve kontrol grubunda TFPI ortalamasının p değeri <0,0001 Grafik 1 de sırası ile benign, malign ve kontrol gruplarında serum TFPI düzeylerinin dağılımı görülmektedir. 38

39 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 be nign malign kontrol 0,04 0,08 0,12 0,16 tfpi Grafik 1: Benign, malign ve kontrol gruplarında serum TFPI düzeylerinin dağılımı. Grafik 2 de malign olgularda serum TFPI düzeyleri dağılımı izlenmektedir.

6 5 4 3 2 1 Std. Dev =,04 Mean =,117 0 N = 32,00,038,063,088,113,138,163,188,050,075,100,125,150,175 TPFI TFPI Grafik 2: Malign olgularda serum TFPI düzeylerinin histogramı 40

ROC curve 1 0,9 0,8 0,7 0,11 0,09 0,10 0,08 0,07 sensitivity 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,12 0,13 0,14 0,15. 0,1 0 0,17-0,16 0,18 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1-spesifisity Grafik 3: TFPI ROC eğrisi Malign olgularda serum TFPI düzeylerine göre ROC eğrisi grafik 3 te görülmektedir. Tablo 3 de malign olgularda sensitivite ve spesifite değerlerine göre TFPI cut-off değerleri görülmektedir. TFPI düzeyi sınırı 0,07 ng/ml olarak alındığında malignite tanısında sensitivite %100, spesifite %41,67 olarak; 0,18 ng/ml olarak alındığında sırasıyla %0 ve %100 olarak tespit edilmiştir. Malign olgularda TFPI düzeyi cutt-of değeri %81,25 sensitivite ve %83,33 spesifite ile 0,10 olarak hesaplanmıştır. 41

Tablo 3: TFPI düzeylerine göre sensitivite ve spesifite değerleri Cut- Off Sensitivite Spesifite 0,07 100 41,67 0,08 93,75 58,33 0,09 87,50 75,00 0,10 81,25 83,33 0,11 75,00 87,50 0,12 62,50 91,67 0,13 43,75 91,67 0,14 31,25 91,67 0,15 25,00 91,67 0,16 6,25 95,83 0,17 6,25 95,83 0,18 0 100 Malign olgular içinde non-metastatik (evre 1-2) olan grubun (n=21) serum TFPI düzeyleri (0,106 Ü/ml), metastatik (evre 3-4) olan grubun (n=11) serum TFPI düzeylerinden (0,135 Ü/ml) düşük olup istatistiksel olarak anlamlı fark saptandı (p=0.031) (Tablo 4) 42

değerleri Tablo 4 : Metastaz durumuna göre olguların TFPI düzeylerinin ortalama Metastatik 0,135 (n=11) Non-metastatik 0,106 (n=21) Benign 0,081 (n = 27) TFPI Ortalama (Ü/ml) Olgular organ spesifik patolojilerine göre ele alındığında ise; Over tümörlü malign olgularda (n=17) TFPI düzeylerinin ortalaması (0,131 Ü/ml), over tümörlü benign olguların (n=25) TFPI düzeylerinin ortalamasından (0,084 Ü/ml) yüksek olarak tespit edildi (Tablo 5). 43

Tablo 5 : Over tümörlü olguların TFPI düzeylerinin ortalama değerleri TFPI Ortalama (Ü/ml) Benign 0,084 (n = 25) Malign 0,131 (n = 17) Over tümörlü benign olguların (n=25), kendi alt histolojik tiplerine göre TFPI ortalama değerleri; basit kistlerde 0,081 Ü/ml, seröz kistadenomlarda 0,081 Ü/ml, dermoid kistlerde 0,072 Ü/ml, endometriyomada ise 0,119 Ü/ml olarak hesaplandı (tablo 6). 44

Tablo 6 : Benign over tümörlü olgularda histolojik tiplemeye göre TFPI düzeylerinin ortalama değerleri TFPI Ortalama (Ü/ml) Basit kist 0,081 (n = 9) Dermoid kist 0,072 (n = 5) Endometriyoma 0,119 (n= 3) Seröz kistadenom 0,081 (n = 8) Uterin patolojiye sahip benign olguların (n=2) TFPI ortalama değerleri 0,053 Ü/ml, endometriyal maligniteli olguların (n=10) TFPI ortalama değerleri 0,105 Ü/ml, serviks maligniteli olgularda (n=4) TFPI ortalama değerleri 0,104 Ü/ml, olarak hesaplandı (tablo 7) 45

Tablo 7 : Uterin patolojili olguların TFPI düzeylerinin ortalama değerleri TFPI Ortalama (Ü/ml) Benign (Myom) 0,053 (n = 2) Malign (Endometriyum) 0,105 (n = 10) Malign (Serviks) 0,104 (n = 4) Malign olgularla benign ve kontrol grubu olgularının D-dimer düzeyleri grafik 4 te görülmektedir. 46

300,00 ddimer 200,00 100,00 0,00 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 be nign m align kontrol Grafik 4: Benign, malign, kontrol grubu olgularının D-dimer düzeyleri Malign olguların D-dimer ortalaması (381,93 ng/ml) kontrol grubu olgularının ortalamasından (107,71 ng/ml) anlamlı olarak yüksek saptanmıştır (p=0,002). Malign olguların D-dimer ortalaması, benign olguların ortalamasından ( 298,19 ng/ml) yüksek olarak saptanmış olup istatistiksel olarak anlamlı fark saptanmamıştır ( p=0,587). (Tablo 8) Tablo 8: Malign olgularla kontrol ve benign grupların D-dimer değerlerinin ortalamaları karşılaştırılması Malign Benign p Kontrol p ( n=32 ) ( n=27 ) ( n=14 ) D-dimer (ng/ml) 381,93 298,19 0,587 107,71 0,002 47

Malign olgular içinde non-metastatik (evre 1-2) olan grubun (n=21) serum D-dimer düzeyleri, metastatik (evre 3-4) olan grubun (n=11) serum D- dimer düzeyleri ile karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı fark tespit edilmedi (p=0.05). Over tümörlü malign olgularda, D-dimer düzeylerinin ortalaması (1313 ng/ml), over tümörlü benign olguların D-dimer ortalamasından (165 ng/ml) yüksek olarak tespit edildi (tablo 9). Tablo 9: Over tümörlü olguların D-dimer düzeylerinin ortalama değerleri Benign 165 (n = 25) Malign 1313 (n = 17) D-dimer Ortalama (ng/ml) Over tümörlü benign olguların, kendi alt histolojik tiplerine göre D-dimer ortalama değerleri; basit kistlerde 96 ng/ml, seröz kistadenomlarda 138 ng/ml, 48

dermoid kistlerde 315 ng/ml, endometriyomada ise 190 ng/ml olarak hesaplandı (tablo 10) Tablo 10: Benign over tümörlü olgularda histolojik ayrıma göre D- dimer düzeylerinin ortalama değerleri Basit kist 96 (n = 9) Dermoid kist 315 (n = 5) Endometriyoma 190 (n= 3) Seröz kistadenom 138 (n = 8) D-dimer Ortalama (ng/ml) Uterin patolojiye sahip benign olguların D-dimer ortalama değerleri 1833 ng/ml; endometriyal maligniteli olguların, D-dimer ortalama değerleri 302 ng/ml; serviks maligniteli olgularda ise D-dimer ortalama değerleri 72.25 ng/ml olarak hesaplandı (tablo 11) 49

değerleri Tablo 11: Uterin patolojili olguların D-dimer düzeylerinin ortalama Benign (Myom) 1838 (n = 2) Malign (Endometriyum) 302 (n = 10) Malign (Serviks) 72.25 (n = 4) D-dimer Ortalama (ng/ml) 50

TRTIŞM Uzun süredir kanser hastalarında, kan pıhtılaşma sistem aktivasyonu ilgi alanı olmuştur. Son zamanlarda bu aktivasyonun kanser büyümesinde özellikle de metastatik oluşumlarda olası rolü tartışılmaktadır. Mevcut bulgular, ileri evre solid tümörlerin pek çok tipinde plazma TFPI aktivitesinin sıklıkla yüksek düzeylerde bulunduğunu göstermektedir. Kanser hastalarında yüksek plazma TFPI düzeyleri, yüksek intravasküler TFPI düzeylerinin bir göstergesidir (111). Malignite, vakaların çoğunda artmış trombin üretimi ile ilişkilidir. Koagülasyon aktive olduğunda, koagülasyon faktörlerinin tükenmesine yol açar ve DIC gelişir. Kanserde DIC genelde düşük derecede veya kronik formdadır (112). Iversen ve arkadaşlarının yaptığı bir çalışmada, FXa-TFPI kompleksinin ve FXa yapımının in vitro koagülasyonda dört kat arttığı gösterilmiştir. Kanser olgularının plazma örneklerinde bu kompleksin sağlıklı gruptan iki, hematolojik maligniteli gruptan dört kez yüksek olduğu bulunmuştur (113). Maligniteli pekçok hastada koagülasyon aktivasyon bulguları görülmektedir. Iversen ve arkadaşları solid tümörlü hastalarda, fibrin monomerlerini ve D-dimer düzeylerini yüksek olarak bulmuş ve bunu kanser hücreleri tarafından TF salınımının ve FX aktivasyonunun bir göstergesi olarak 51

kabul etmişlerdir. Kanserdeki yüksek TFPI düzeylerinin, koagülasyon aktivasyon derecesi ile doğrudan ilişkili olduğu hipotezi öne sürülmüştür (113). TFPI seviyeleri, kanser hastalarında evre ilerledikçe artmakta, zıt olarak diğer koagülasyon inhibitörleri ise azalmaktadır (108). Farklı hücre kültürlerinde TFPI üretiminde artış gösterilmiştir (114). Đmmünolojik çalışmalar, kolon kanseri ve malign melanom gibi tümör dokularında TFPI ilişkisini göstermede yetersiz kalmıştır. TFPI akciğerin skuamöz hücreli karsinomu ve akciğerin adenokarsinomu etrafındaki stromada saptanmıştır (115). mirkhosravi ve arkadaşlarının çalışmasında deneysel metastaz gelişmesinde pıhtılaşma aktivasyonunun rolü olduğu yönünde bulguları mevcuttur. TF nin metastazdaki etkisi anjiogenezle birlikte ortaya çıkmasıyla açıklanmaktadır. Çalışmada, TFPI düzeylerinin primer tümör gelişimini azaltmaması anjiogenez blokajında TFPI aktivitesinin major rolde olmadığı tartışmasını açmıştır. Şimdiki bilgilerle TFPI nın antimetastatik olarak olası etkilerinin kesin yapılmış deneysel çalışmalarla tespit edilmesi gerekir. Gerçekten belki de rolü deneysel çalışmalarda düşünülenden farklı bir şekildedir. mirkhosravi ve arkadaşlarının çalışması, Fisher ve arkadaşlarının çalışması ile uzlaşmaktadır: TFPI ekstraselüler alana geçmekte ve bu geçiş, TF / FVIIa kompleksinin tümör hücre adezyon ve migrasyonunun başlatılmasında etkili rol oynayabilmektedir. Bu bakış açısıyla TFPI prometastatik de olabilir, kan dolaşımında TFPI antikoagülan ve antimetastatik, ekstraselüler alana salındığında ise proinvaziv ve prometastatik olabilir (100). 52